JP3190042B2 - 核マトリックス蛋白液アッセー - Google Patents

核マトリックス蛋白液アッセー

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、一般に体液可溶性核マトリックス蛋白の細
胞性マーカーとしての使用に関する。より具体的には、
本発明は、体液可溶形として細胞から遊離する内部の核
マトリックス蛋白および/またはそのフラグメントのレ
ベルを測定することによって、組織内の細胞死の度合い
を測定する方法に関する。
細胞死は、組織の病気または損傷の結果としても、ま
た健常な組織のホメオスタシスの働きとしても生じる。
組織内細胞死亡率における検出可能な変化は、したがっ
て組織状態の目安を提供することができる。例えば健常
な成長組織では、細胞死亡率における変化は、新しい発
育段階を表す。また別に、成人組織の細胞死における突
然の変化は、該組織に対する損傷を知らせ、また損傷の
種類についての情報を提供する。以前は、組織の生存度
の臨床的評価には、臨床症状の提示および、組織サンプ
ル中の細胞の形態観察、および/または組織/器官サイ
ズの変化を測定することによる細胞死の間接的算出が必
要な組織自体の肉眼的精査が要求された。一方、形態観
察における当該技術分野の状況は著しく進歩したが、異
常な組織所見についての信頼性は、異常細胞が被験組織
サンプルの部分を成すことを必要とする。したがって、
この方法によって初期段階の悪性腫瘍を検出することは
特に困難である。細胞または組織の生存度を生化学的評
価によって解釈することもまた一般に困難である。これ
はまず第一に、サンプル中の生細胞と緊密に混じり合っ
ている個々の細胞の中で、多くの場合、細胞死は発生す
るからである。
組織学または組織の生検によらない、組織内の細胞死
の度合いを測定する信頼に足る方法が必要とされてい
る。特に有用な方法は、細胞死亡率が体液アッセーで測
定できるものであろう。体液アッセーにおいて組織特異
的細胞死を正確に測定することができるということは、
組織の発育および細胞動態学の研究の他、様々な多くの
臨床利用に大きなインパクトを与えるであろうと期待さ
れる。例えば、本方法は、細胞死を伴う疾病または損傷
の進行をモニターするために、影響を受けた組織の治療
効果のモニターと同様用いることができる。本方法はま
た、影響を受けていない、正常な組織に対する治療の影
響をモニターするためにも用いることができる。さら
に、本方法は、化合物の細胞毒性を調べるためにも用い
ることができる。
最近、通常では高度に不溶性の内部核マトリックス蛋
白を細胞から抽出、分離する方法が開示された。内部核
マトリックス蛋白は核マトリックスの境界内にある蛋白
で、“内部”核マトリックス蛋白と呼ばれ、実質的にク
ロマチン蛋白、および“外部”核マトリックス蛋白とひ
とまとめに呼ばれる中間フィラメントを含まない(Penm
anら、米国特許第4882268号を参照;その内容は参考文
献として本明細書に含まれる)。この方法では、細胞核
を分離し、細胞骨格蛋白およびクロマチンを除去し、
“核マトリックス”を分離して、核マトリックスの内部
および外部成分を分離する。核マトリックス−中間フィ
ラメント複合体は、細胞の全蛋白の5%未満および全DN
Aの6%未満で構成される特異的な細胞蛋白分画を含
む。内部核マトリックスは、全細胞蛋白のおよそ1%ま
たは1%未満を含む。それは細胞のタイプにより異なる
多くの蛋白を含み、さらに従来技術ではこれまで検出で
きなかった細胞タイプ特異的、癌化特異的蛋白を含むタ
イプ特異的抗原を特に豊富に含んでいる。それはまた、
ラミナおよび核ポァー複合体蛋白を含んでいる。該分離
方法は、実質的に全ての他の細胞構成物からの分離を達
成するために核マトリックス固有の特性を利用する。こ
の方法は簡単、迅速で再現性があり、非常に純度が高
く、実質的に全ての細胞タイプに利用できる。
ペンマン(Penman)らの方法は、抗体作成を可能にす
る十分な純度をもつ細胞タイプ特異的、癌化特異的内部
核マトリックス蛋白の当該技術による同定および分離を
可能にした。これらの抗体は、米国特許出願第214022号
(1988年6月30日出願、米国特許第 号として発
行予定、その内容は参考文献として本明細書に含まれて
いる)に開示されているように、続いてサンプル中の細
胞タイプ特異的内部核マトリックス蛋白を検出するため
に用いることができる。該特許出願明細書および本明細
書で用いられているように、“細胞タイプ”という用語
は、種々の異なる組織、例えば神経組織、神経膠組織、
筋、肝、間葉織、並びに上皮性および内皮性細胞の種々
のタイプの細胞の他、悪性細胞形およびウイルス感染ま
たは他の因子により引き起こされた変化した遺伝子発現
像を有する細胞を指すものと理解される。
本発明の目的は、体液可溶性内部核マトリックス蛋白
の液中レベルを測定することによって、体液アッセーに
おいて細胞死の度合いを測定する方法を提供することで
ある。本発明の別の目的は、細胞から遊離し細胞適合液
中に存在する体液可溶性内部核マトリックス蛋白を定量
する方法を提供することである。本発明のまた別の目的
は、影響を受けている組織の細胞死の度合いを測定する
ことによって治療を評価し、また細胞死を伴う疾病の進
行を調べる方法を提供することである。本発明のまた別
の目的は、細胞死を誘発する化合物の能力を評価するこ
とによって化合物の毒性を調べる方法を提供することで
ある。本発明のさらにまた別の目的は、真核細胞から体
液可溶性核マトリックス蛋白の遊離を誘発する方法を提
供することである。本発明のこれらおよび他の目的並び
に特徴は以下の記載および請求の範囲から明らかとなる
であろう。
発明の要旨 内部核マトリックス蛋白またはその可溶性フラグメン
トが細胞死が進行している細胞から可溶形として遊離さ
れるということが今や見出された。ここで用いられてい
るように、“細胞死”とは、アポプトーシス(“計画
的”細胞死)および壊死の両方を含むと理解される。さ
らにまた、内部核マトリックス蛋白のこれら可溶形を液
体中で定量でき、これを組織中の細胞死の度合いおよび
死亡率を測定するために用いることができることが分か
った。また本発明の方法は、進行中の細胞死の種類を識
別するために用いることもできる。溶液中に体液可溶形
としてこれらの蛋白および蛋白フラグメントが存在する
ことは予期されないことである。なぜならば、該分子は
標準的な生理的条件下では不溶性の核複合体部分を含む
からである。死滅しつつある細胞から可溶形として遊離
されるこれらの蛋白の発見は、液体アッセーにおける組
織特異的細胞死の生化学的モニターとして可溶性の内部
核マトリックス蛋白を用いることを可能にした。本方法
は迅速かつ定量的であり、細胞および組織の生存度を評
価するため、疾病および/またはその治療の進展を評価
するため、未知の化合物の細胞毒性を評価するため、さ
らに細胞死の動的変化を研究するために用いることがで
きる。本発明はまた、細胞からの内部核マトリックス蛋
白を精製するためのまた別の方法を提供する。
本発明の方法は、細胞から遊離される体液可溶性内部
核マトリックス蛋白またはそのフラグメントの濃度を検
出し、さらにこの濃度を既知のスタンダードと比較する
ことを含む。体液サンプル中のこれら蛋白の濃度は、当
該組織中の細胞死の度合いを表すであろう。液体サンプ
ルは不連続な間隔で採集され、さらに、例えば免疫アッ
セーの手段によって検出される。続いて特徴的な蛋白の
濃度が、細胞死亡率の変化を表す濃度の変化を用いて比
較される。さらに、ある種の蛋白を細胞タイプ特異的お
よび/または細胞死タイプ特異的なものとして同定する
ことができる。典型的な体液には血液、血清、血漿、
尿、精液、脊髄液、唾液、腹水、腹腔液、痰、組織スワ
ブおよび身体滲出物(例えば乳房滲出液)が含まれる。
本発明の一具体例では、該方法は、疾病の進行を評価
するために用いることができる。例えば、該方法は、悪
性腫瘍(例えば上皮性腫瘍、腺腫、肉腫、リンパ腫また
は骨髄腫)の進行をモニターするために用いることがで
きる。ここでは、悪性細胞から遊離される可溶性核マト
リックス蛋白レベルを定量することによって、悪性組織
の細胞死亡率をモニターすることができる。また別に、
該方法は、細胞死の変化をもたらす、例えば組織の萎
縮、過形成、硬変、低酸素症、虚血および良性腫瘍の成
長から生じる組織の異常の進行をモニターするためにも
また用いることができる。損傷組織もまたこの方法で評
価できるが、この組織損傷には、例えば膜作用性化学物
質および毒素によって生じる直接的細胞損傷、または直
接的な物理的損傷(例えば加温療法、低酸素症および虚
血/再潅流、放射線または補体介在性自己融解)により
生じるものを含む。
本発明のまた別の具体例では、該方法は治療の効能を
モニターするために用いることができる。ここでは、治
療剤または治療方法(例えば放射線治療)が患者に与え
られ、その後、予め定めた間隔で患者から得た体液サン
プル中の可溶性核マトリックス蛋白またはそのフラグメ
ントの濃度が検出される。続いてこの濃度を互いに比較
し、さらに、治療前に調べたサンプル中のそれと比較す
る。比較サンプル間において検出された1つまたは2つ
以上の内部核マトリックス蛋白の濃度の違いは、該治療
の効果を表すであろう。例えば、選択的に悪性細胞を破
壊することができる治療剤は、腫瘍細胞から有利あれる
可溶性核マトリックス蛋白の増加をもたらし、悪性細胞
の数が減少するにつれ、検出されるこれら蛋白レベルも
その後減少するであろう。該方法は、正常な、影響を受
けていない組織の生存度に対する与えられた治療の影響
を調べるためにも用いることができる。例えば、多数の
癌治療(放射線療法および化学療法を含む)は、急速に
増殖する細胞集団を標的とし、したがって、骨髄原始細
胞集団および内臓上皮細胞のような正常に増殖している
細胞集団にも影響を与える。これらの細胞集団に対する
治療の影響は、これらの細胞から遊離される可溶性内部
核マトリックス蛋白をモニターすることによって評価で
きる。各組織について細胞タイプ特異的蛋白がモニター
されるならば、ただ1個の体液サンプルが影響を受けて
いる組織と正常組織の両方の生存度についての情報を提
供することができると期待される。同様に、該方法は、
正常組織を治療の影響から保護するようにデザインされ
た相補的治療剤の効果を調べるためにも用いることがで
きる。
本発明のまた別の具体例では、該方法は、発生する細
胞死のタイプを調べ、さらにその動的変化を研究するた
めに用いることができる。例えば、アポプトーシスまた
は壊死が進行している細胞によって専ら可溶形で遊離さ
れる核マトリックス蛋白または蛋白フラグメントが同定
されるかもしれない。続いて、これら蛋白または蛋白フ
ラグメントの遊離速度を、細胞死の動的変化を調べるた
めに測定できる。
本発明のまた別の具体例では、該方法は、細胞から遊
離される可溶性内部核マトリックス蛋白または蛋白フラ
グメントレベルをモニターすることによって、細胞培養
の状態を調べ、および/または化合物の細胞毒性を調べ
るために用いることができる。最後に、該方法はまた、
アポプトーシスを誘発することができる化合物(例えば
サイトカイン)を用いて、完全な細胞から体液可溶性内
部核マトリックス蛋白を遊離させるために用いることが
できる。特に有用なサイトカインはTNF(腫瘍壊死因
子)である。本発明のこの具体例は、特定の内部核マト
リックス蛋白の識別を強化するために用いることができ
る。それはまた、可溶性内部核マトリックス蛋白または
蛋白フラグメントを分離するプロトコールの一部分とし
て用いることができる。抗体産生のための抗原決定基と
して有用な既知または新規な蛋白と同様、新規な核マト
リックス蛋白がこの方法で得ることができる。最後に、
本発明の方法は、癌の化学療法剤として有用な候補化合
物を同定するためのプロトコールの一部分として用いる
ことができる(以下を参照)。
本発明のこれらおよび他の具体例並びに特色は、以下
の明細書の記載、図面および請求の範囲から明らかとな
ろう。
図面の簡単な説明 図1は、種々の正常および悪性組織サンプル上清で定
量した体液可溶性内部核マトリックス蛋白レベルの一覧
表である。
図2は、癌患者および正常な血液供与者から分離した
血清で定量した体液可溶性内部核マトリックス蛋白レベ
ルの一覧表である。
図3は、壊死細胞およびアポプトーシス細胞からのこ
れら核マトリックス蛋白遊離に続いて、22/18および41/
7の抗体組み合わせによって検出した可溶性核マトリッ
クス蛋白のグラフである。
図4(AおよびB)は、培養細胞から遊離された可溶
性核マトリックス蛋白に対するTNF(腫瘍壊死因子)の
影響を表すグラフである。
図5は、核マトリックス蛋白遊離と細胞密度との相関
性を示すグラフである。
図6は、41/7の抗体組み合わせによって検出された可
溶性核マトリックス蛋白の遊離とTNF量との相関性を示
すグラフである。
図7は、ドキソルビシンの可溶性核マトリックス蛋白
遊離および細胞生存度に対する影響を表すグラフであ
る。
詳細な説明 以下の説明では、細胞から液体中に遊離する体液可溶
性内部核マトリックス蛋白を測定することによって細胞
死を測定する一般方法が開示される。該方法は、実質的
に純粋な内部核マトリックス蛋白調製物(ここではNM調
製物と呼ぶ)を作製するために、内部核マトリックス蛋
白を選択すること、および核マトリックス蛋白特異的抗
体を作製するためにこの調製物を使用することを含む。
好ましくは、抗体は細胞タイプ特異的である。抗体はま
た、細胞死タイプ特異的である。次に、血清を含む種々
の液体アッセーにおいて、これらの抗体を用いて細胞死
を測定するために有用なアッセーをデザインする方法が
開示される。細胞から可溶形としてこれらの蛋白を遊離
させる方法もまた開示される。
生物学的に関連性のある細胞死のメカニズムは、基本
的には組織学的研究を基にしてアポプトーシスまたは壊
死のいずれかに分類される。この2つのメカニズムは、
一般的には機能的および形態的に区別される。アポプト
ーシスは一般には、単一細胞の凝固性壊死という特徴を
示し、いわゆる“計画的”(“programmed")細胞死と
理解される。それは、非同時的態様で個々の細胞に特徴
的な影響を与え、一般に炎症反応を伴わない。アポプト
ーシスは、胚および胎児の発育に伴って起こる細胞の計
画的巣状排除において、さらに成人では器官および組織
の大きさを調節するために必要である。アポプトーシス
は、種々の悪性新生物の場合と同様、病的な組織萎縮に
おいて、さらに一連の障害性薬剤(その多くはDNA損傷
を伴う)、例えば放射線、加温療法、並びに種々の発癌
剤および癌の化学療法剤に曝した後で認められる。細胞
介在性免疫反応もまたアポプトーシスを誘発すると考え
られ、この細胞死のメカニズムは細胞介在性免疫による
組織破壊が強調される疾病(いわゆる自己免疫疾患、硬
変および肝炎などを含むいろいろなウイルス疾患を含
む)とも深く関連している。
対照的に、壊死は一般には、環境条件における激烈な
障害性変化によってもたらされた死の後に生じる、細胞
構造の進行性の変性を指すと考えられる。壊死は典型的
には近隣の細胞群に影響を与え、さらに、通常炎症反応
が隣接する生存組織に生じる。多くの既知の壊死例で
は、重篤な低酸素症および虚血に続く、インビトロで自
己融解を起こしている組織の細胞崩壊、および重篤な加
温療法または種々の膜作用性化学物質、毒素および活性
酸素代謝物に曝露した後の細胞崩壊が顕著である。
形態学的には、壊死細胞は、水膨れをおこし、エオジ
ン好性細胞質および不明瞭な細胞境界を有するように見
える傾向がある。アポプトーシスが進行している細胞
は、クロマチン凝縮および膜結合性アポプトーシス小体
(apoptotic body)の形成という特徴を有する。
全ての真核細胞(植物および動物)は、細胞質によっ
て囲まれた核を有する。核は蛋白と結合したDNAを含
み、これはクロマチンと呼ばれる。その結合蛋白ととも
に、クロマチンは核物質の主要な部分を構成する。クロ
マチンは、ここでは内部核マトリックスと呼ばれてい
る、核の内部蛋白組織によって組み立てられている。非
常に不溶性の内部核マトリックス蛋白を細胞から抽出し
選択的に精製する方法が最近分かった(米国特許第4882
268号(本明細書には参考文献として含まれる)参
照)。さらにまた、ある種の内部核マトリックス蛋白は
組織および細胞タイプ特異的であり、それらの発現は癌
化特異的または疾病特異的態様で影響を受ける細胞にお
いて変化しえることが分かった。発現パターンにおける
この変化は、異常な細胞の増殖を検出し同定するため、
特に悪性腫瘍を検出するための理想的なマーカーになる
(USSN第214022号(1988年6月30日出願)米国特許第
号の予定;本明細書には参考文献として含まれ
る)。米国特許第4882268号および第4885236号で開示さ
れた方法にしたがって、内部核マトリックス蛋白は選択
的に精製され、細胞サンプル中のこれら蛋白の存在を検
出するために用いることができる抗体作製のための抗原
決定要素として、または、破壊細胞の細胞性の残屑部分
として用いることができる。
内部核マトリックス蛋白を分離するための詳細な記述
は米国特許出願(USSN)第214022号(1988年6月30日出
願、米国特許第 号の予定;本明細書には参考文献
として含まれる(上記参照))に開示されている。概略
すれば、この分離工程は以下を含む: 1.細胞を分離する。
2.非イオン性界面活性剤−生理的塩類溶液で膜脂質およ
び可溶性蛋白を抽出することによって核および細胞骨格
から可溶性細胞蛋白を分離する。
3.0.25Mの硫酸アンモニウム(pH6.8)、界面活性剤−デ
オキシコール酸ナトリウム溶液、または他の穏和な抽出
緩衝液のいずれかで工程2の不溶性細胞物質を可溶化す
ることによって、核から細胞骨格蛋白を分離する。
4.生理的緩衝液中のDNA分解酵素(DNアーゼ)IおよびR
NA分解酵素(RNアーゼ)によって工程3の不溶性物質を
消化して核マトリックスからクロマチンを分離し、さら
に、DNA含有ヌクレオゾームをpH6.8で緩衝させた0.25M
硫酸アンモニウムまたは他の穏和な抽出緩衝液で溶出さ
せる。
5.5および10Mの間(好ましくは8M)の尿素または他の
適切な可溶化剤を含む緩衝液に工程4の不溶性物質を溶
解させて、内部核および“外部”核マトリックス蛋白を
分離し、さらに、生理的緩衝液中に透析して外部蛋白を
凝集させる。
ここで用いられるこの工程の変形では、細胞骨格蛋白
およびクロマチンは、工程2の不溶性物質をDNアーゼお
よびRNアーゼで消化し、続いて0.25Mの硫酸アンモニウ
ム(pH6.8)で抽出することによって一緒に除去され
る。さらに、内部核蛋白の精製は、HPLC、FPLC、クロマ
トフォーカシングなどを含む当業者に既知の標準的方法
を用いて実施できる。
該マトリックス調製物は、いくつかの生化学的基準に
よれば生化学的に、さらに形態学的に純粋である。夾雑
物を含まないということは、ゲル電気泳動によるマトリ
ックス蛋白の鮮明で詳細な分析を可能にする。NM調製物
のエレクトロフェログラムによれば異なる細胞タイプは
著しく異なるパターンを示すことが先に明らかにされ
た。これらのパターンは固有で、特異的で再現性があ
る。さらに、このパターンは、細胞のタイプに特有の1
つまたは2つ以上の蛋白の選別を可能にし、抗原決定要
素として有用であることも分かった(例えば、米国特許
第4882268号および米国特許出願第214022号参照)。そ
の中で示されているように、細胞タイプの識別物として
有用な個々のマトリックス蛋白は、しばしば細胞の全蛋
白の0.01%未満を含んでいる。続いてこれらの蛋白に対
して作製された抗体を、サンプル中の細胞タイプ特異的
核マトリックス蛋白を同定するために用いることができ
る。さらに、これらの蛋白に対して作製された抗体を、
進行している細胞死のタイプを識別するために用いるこ
とができる(以下を参照)。
上記に示したように、本発明の方法は、液体中に細胞
から遊離された可溶性内部核マトリックス蛋白を定量す
ることによって細胞死にモニターすることを含む。当業
者には理解されるように、該蛋白を特異的に識別し定量
するいずれの方法も考慮される。溶液中の蛋白を識別す
る現在の技術は免疫アッセーの手段によるもので、この
場合、問題の蛋白と特異的に結合する抗体が溶液中の蛋
白を識別するために用いられ、形成された結合複合体の
量が続いて求められる。
抗体による方法はよく知られており、文献にも記載さ
れている。それらの調製についてのより詳細な記載は、
例えば、実践免疫学(Practical Immunology:W.R.Butt
編,Marcel Dekker社刊、ニューヨーク、1984)に見出さ
れる。概略すれば、適切な動物に抗体産生を誘発するた
めに十分な条件下で該動物を免疫原調製物で免疫するこ
とによって、NM調製物中の1つまたは2つ以上の蛋白に
対して抗体を作製することができる。モノクローナル抗
体(単クローン抗体)は、適切な抗体産生細胞(例えば
脾臓またはリンパ節細胞)をミエローマ細胞と融合さ
せ、標準的な技術を用いて免疫原ソース(例えば細胞株
または特定の細胞タイプ決定要素)に対する核反応性に
ついて融合生成物をスクリーニングすることによって続
いて得ることができる。特定の細胞タイプ決定要素につ
いてスクリーニングするための詳細なプロトコールは、
米国特許出願第214022号(上記に参考文献として含まれ
る)に記載されている。
体液可溶性核マトリックス蛋白を定量するための現時
点で好ましい方法は、該蛋白を内部核マトリックス蛋白
特異的抗体で検出するものである。この抗体は起源とし
て単クローン抗体でも多クローン(polyclonal)抗体で
もよく、さらに、標準的方法で作製することができる。
免疫原として用いられる核マトリックス蛋白は、ペンマ
ンら(Penmanら、米国特許第4882268号;以下を参照)
によって記載された方法で調製することができる。また
別に、内部核マトリックス蛋白は、ここに記載したよう
に細胞から可溶形として遊離させ、その上清から選択的
に取り出すことによって分離できる。蛋白または蛋白フ
ラグメントはまた、標準的な組換え体(リコンビナン
ト)DNA技術を用いて核酸から組み換えにより発現させ
ることができる。続いてこれらの蛋白の1つまたは2つ
以上に対する抗体を標準的な方法を用いて作製する。そ
れから、その特異的核マトリックス蛋白に抗体を特異的
に結合させることができる条件下で、体液サンプルに抗
体を曝し、形成される複合体量を検出する。
様々な異なる免疫アッセーの形態が現在存在するが、
細胞から遊離される体液可溶性内部核マトリックス蛋白
を定量するためにそのいずれも利用できる。利用可能な
種々の免疫アッセーフォーマットのうち、最も鋭敏なも
のの1つはサンドイッチ法である。この方法では、問題
の分析物と結合することができる2つの抗体が用いられ
る:1つは固形支持体に固定され、1つは溶液中に遊離し
ているが、容易に検出できるある種の化学化合物で標識
されている。第二の抗体のために用いることができる化
学標識の例は、放射性同位元素、蛍光化合物および酵素
または、反応物もしくは酵素基質に曝したとき発色生成
物もしくは電気化学的に活性な生成物を生じる他の分子
を含む。分析物(例えば体液可溶性内部核マトリックス
蛋白または蛋白フラグメント)を含むサンプルをこのシ
ステムに適用した場合、該分析物は固定抗体および標識
抗体のいずれにも結合する。その結果が支持体表面の
“サンドイッチ”免疫複合体である。未結合のサンプル
成分およびおよび過剰の標識抗体を洗い流し、支持体表
面の分析物と結合した標識抗体を測定することによっ
て、該分析物を検出することができる。サンドイッチ免
疫アッセーは、良好な検出限界を有する標識を用いるな
らば、非常に特異的で、かつ極めて鋭敏である。免疫ア
ッセーのデザイン、理論およびプロトコールの詳細な説
明は、実践免疫学(Practical Immunology:W.R.Butt編,
Marcel Dekker社刊、ニューヨーク、1984)を含む当該
技術分野のいろいろなテキストに記載されている。
免疫アッセーデザインの考案には、特異的に結合した
抗体−抗原複合体が非特異的な相互反応から確実に区別
できる、それらの抗原に対して十分に高い結合特異性を
有する抗体(単クローンまたは多クローン抗体)の調製
を含む。抗体の結合特異性が高いほど、検出可能な抗原
の濃度は低くなる。第二の抗体につける標識の選択は所
望の検出限界に依存する。酵素アッセー(ELISA)は典
型的には、酵素付加複合体と酵素基質との相互反応によ
って形成される発色生成物の検出を可能にするものであ
る。また別の標識は放射性または蛍光性標識を含む。今
日までに知られている最も鋭敏な標識は化学ルミネッセ
ンス標識で、この場合、反応物との相互反応は光の発生
をもたらす。有用な標識は、アクリジウムエステルまた
は化学ルミネッセンス酵素のような化学ルミネッセンス
分子を含むが、この場合、反応物は酵素基質である。例
えば、アクリジウムエステルがアルカリ性ペルオキシダ
ーゼ溶液と反応するとき、強い発光が放射され、他の標
識によって提供される検出限界の100倍から10000倍の検
出限界の増加が可能になる。さらに、その反応は迅速で
ある。化学ルミネッセンスおよび免疫アッセーについて
の詳細な説明は、酵素学の手法(Methods in Enzymolog
y;Weekら、(1987)、133:366−387)に記載されてい
る。他の考察はマイクロタイターウェルまたはカラム免
疫アッセーを含む。迅速に反応する標識、例えば化学ル
ミネッセンス標識が用いられる場合は、カラムアッセー
が特に有利かもしれない。標識された複合体はポストカ
ラム検出器に溶出され、これはまた反応物または酵素基
質を含み、直ぐ後の検出のために続いて反応生成物が形
成される。
本発明は以下の非限定的実施例からより理解されるで
あろうが、この実施例では、内部核マトリックス蛋白は
2つの異なる細胞株(乳癌および子宮頸癌細胞)から調
製し、多クローンおよび単クローン抗体を作製して反応
性および感度を調べ、さらに免疫アッセーを血清、並び
に組織および細胞培養上清について実施する。アポプト
ーシスはここでは一般に、細胞を血清非含有培地に置く
か、サイトカイン(例えばTNF)に曝すか、または細胞
を特定の細胞毒性剤に曝すことによって誘発する。壊死
はここでは凍結融解(加温療法)によって誘発する。こ
こで開示された方法およびこれら方法の変形を用いて、
体液または体液適合液(例えば細胞外培養液)を可溶性
核マトリックス蛋白または蛋白フラグメントについて分
析することによって、インビボおよびインビトロで細胞
死を定量およびモニターすることができる。一般に、該
方法は、モニターされ、さらにそれに対してサンプルが
調製されるべき核マトリックス蛋白のための標準(“ド
ースレスポンス”)曲線の調製を含む。初めに示したよ
うに、多数の異なる組織の状態も単一の液体サンプル
で、異なる細胞タイプ特異的核マトリックス決定要素の
サンプル中の濃度を測定することによって評価される。
さらにまた、細胞死を誘発することができる化合物を
用いて、細胞から可溶形の内部核マトリックス蛋白の遊
離を誘発する方法が開示される。現時点で好ましい化合
物は、アポプトーシスを誘発するTNFのようなサイトカ
インを含む。細胞から液体内への内部核マトリックス蛋
白の遊離の誘発は、組織の状態評価を高めることを可能
にする。該方法は、新規な内部核マトリックス蛋白を同
定し精製するため、抗体調製において抗原として使用す
る蛋白および蛋白フラグメントを調製するため、さらに
癌の化学療法において有用な候補化合物を同定するため
(以下を参照)のプロトコールの一部分として有用であ
ろうと思われる。
I.抗体作製 A.核マトリックスの分離 核マトリックス蛋白は、ここでは実質的には米国特許
第4882268号(本明細書にはその内容を参考文献として
含まれる)にしたがって分離される。簡単に記せば、所
望の細胞株を互い接し合うまでT225フラスコで、10%ウ
シ胎児血清(Hazelton)添加ダルベッコー修飾イーグル
培地(DME)(Mediatech社製、ワシントンDC)で増殖さ
せる。続いてこの培地をフラスコから取り除き、細胞を
2度燐酸緩衝食塩水(PBS)(0.1Mリン酸塩、0.15MNaC
l、pH7.4)で洗浄する。続いて、PBS中の0.1%トリプシ
ン/EDTA(Irvine Scientific,サンタアナ、カリフォル
ニア)で37℃15分インキュベートして、洗浄細胞をフラ
スコから除去する。得られた細胞懸濁液を10mlの新しい
培地に取り、1500×gで15分遠心して沈澱させる。続い
て培地を吸引除去し、細胞を再懸濁させ数を数える。細
胞を再度沈澱させ、冷PSB/Majik緩衝液(0.1MNaCl、10m
MMgCl2、10mMトリス、0.5%デオキシコール酸ナトリウ
ム、1.0%Tween−20、1.2mMPMSF,pH7.4)で2度抽出
し、2100×gで15分4℃で遠心する。1×107細胞につ
き10mlのRSB/Majikを用いる。抽出細胞を室温で消化緩
衝液(50mMNaCl、300mM蔗糖、0.5%Triton−X100、10mM
PIPES、3mMMgCl2、1mMEGTA、1.2mMPMSF)に再浮遊させ
る。DNアーゼIおよびRNアーゼA(ベーリンガーマンハ
イム、ドイツ)を100μg/mlの濃度で添加し、溶液を攪
拌しながら20−40分インキュベートする。十分量の2M硫
酸アンモニウムを加えて最終濃度を0.25Mとし、5分後
に溶液を3700×gで15分遠心する。生じた沈殿物を脱集
合緩衝液(8M尿素、20mMMES、1mMEGTA、1.2mMPMSF、0.1
mMMgCl2、1%2−メルカプトエタノール、pH6.6)に再
浮遊させ、4リットルの集合緩衝液(0.15MKCl、25mMイ
ミダゾン、5mMMgCl2、2mMジチオストレイトール、0.125
mMEGTA、0.2mMPMSF、pH7.1)に対して室温で一晩透析す
る。続いて、生じた懸濁液を10000gで1時間超遠心で遠
心分離する。内部核マトリックス蛋白含有上清(ここで
はNM調製物と呼ぶ)を必要となるまで−80℃で凍結保存
する。
ここで開示される実施例では、内部核マトリックス蛋
白は、すべてATCC(ロックビル、メリーランド)から入
手可能な3つのヒト腫瘍細胞株(T−47D(乳癌細胞
株)、ME−180およびCaSki(ともに子宮頸癌細胞株))
から分離された。
B.免疫プロトコール 1.多クローン抗体 多クローン抗血清は、標準的な方法、例えば当該技術
分野で入手可能な多数のテキストに開示され、さらに一
般的に当業者に既知の方法を用いて、NM調製物に対して
作製することができる。この実施例では、始めにフロイ
ントの完全アジュバント(ギブコ社製、グランドアイラ
ンド、ニューヨーク)中のNM調製物で、続いて3ケ月
間、毎月不完全アジュバントとともにNM調製物でウサギ
を免疫した。ウサギ抗血清および融合前のマウス血清を
多クローン抗血清として用い、NM調製物との反応性を標
準的なウェスタンブロット法で示した。
2.単クローン抗体 単クローン抗体もまた、標準的な方法、例えば当該技
術分野で入手可能な多数のテキストに開示され、さらに
一般的に当業者に既知の方法を用いて、NM調製物に対し
て作製することができる。この実施例では、J(The Ja
ckson Laboratory,バーハーバー、メーン)マウスから
生まれたBalb/cを以下の方法で核マトリックス蛋白調製
物で免疫した: (a)リンパ節法:動物の2本の後肢のフットパッドお
よび後方部分に以下のプロトコールを用いて注射する:1
日目、抗原およびフロイントの完全アジュバント;4日
目、後方部分にのみ抗原および食塩水;13日目、動物を
殺処分して膝窩リンパ節を融合のために取り出す。
(b)脾臓法:動物の腹腔内に2週間毎に6−8回注射
し、続いて、殺処分および脾臓摘出の4日前に1度静脈
内に追加免疫する。第1回の注射はフロイントの完全ア
ジュバント、第2回は不完全アジュバント、その後の注
射は食塩水とともに行う。
C.融合 脾臓またはリンパ節細胞のハイブリドーマは、実質的
にはコーラーおよびミルシュタインの方法(Kohler &
Milstein(1975)Nature 256:495)(その内容は本明細
書には参考文献として含まれる)にしたがって融合され
る。簡単に記せば、脾臓またはリンパ節細胞の浮遊液を
ポリエチレングリコール(PEG,ベーリンガーマンハイ
ム)を用いてマウスミエローマ細胞と融合させる。得ら
れた陽性ハイブリドーマを続いて最低3回クローニング
し、単クローン化を達成する。ここで用いたマウスミエ
ローマ細胞株はSP2/0−Ag14またはP3X63Ag8.653(ATCC,
ロックビル、メリーランド)であった。
1.抗体スクリーニング(細胞アッセー/反応性アッセ
ー): ミニホールドIドットブロット装置(Schleicher &
Schuell,ケーン、ニューハンプシャー)および標準的方
法を用いて、ハイブリドーマの増殖陽性ウェルを免疫原
が由来した細胞株に対して核反応性についてスクリーニ
ングすることができる。簡単に記せば、4.5"×3"のニト
ロセルロース片のフィルター膜(0.45μm)(バイオラ
ッド、リッチモンド、カリフォルニア)および2片の同
じ大きさのワットマン3MMの濾紙を蒸留水およびPBSにそ
れぞれ10分浸し、続いてドットブロット装置に集める。
10%DMSO培養液中で凍結保存されていた1×106細胞をP
BSで洗浄し、10mlの細胞浮遊液を真空吸引で1穴(ウェ
ル)当たり100μl加える。続いて細胞を100μlの消化
緩衝液、0.05%のTween−20添加PBS400μl、PBS中の0.
5%無脂肪ドライミルク100μl(カーネーション社製、
非特異的結合を阻止するため)、さらに400μlのPBS T
ween−20で洗浄する。吸引を停止して、増殖しているハ
イブリッドの上清100μlを細胞とともに30分インキュ
ベートする。続いて上清を真空吸引で除去し、細胞を再
び、400μlのPBS Tween−20で洗浄する。吸引を停止
し、1%ウマ血清添加PBS中のヤギ抗マウスビオチン結
合物(例えばVECTASTAIN,Vector Labs,バーリンガム、
カリフォルニア)100μlを各ウェルに添加し、15分イ
ンキュベートする。続いて細胞を400μlのPBS Tween−
20で洗浄し、ベクタステインのアビジン−HRP基質とと
もに3分インキュベートする。反応を流水で停止させ、
装置から膜を取り出し、水に浸す。続いて、膜を2枚を
ガラスプレートに顕微鏡スライド用樹脂を用いて挟み、
顕微鏡下で調べる。核染色陽性を示すウェルは陽性と考
えられ、これらのハイブリッドを選択し、さらにクロー
ニングする。
2.組織の免疫組織化学 凍結組織クリオスタット切片標本およびアビジン/ビ
オチン過酸化物染色方法を用いて、陽性クローンをヒト
組織反応性について調べることができる(ベクタステイ
ンエリートABCキット、ベクターラボラトリーズ、バー
リンガム、カリフォルニア)。
3.腹水作製 0.5mlのプリステン(Pristane,2,6,10,14テトラメチ
ルペンタデカン)を腹腔内に注射することによってマウ
スにプリステインプライミングを施す。7から10日後、
血清非含有培養液1mlに5×106の細胞を含むものを腹腔
内に注射する。続いて腹水液を2度各マウスから採集
し、混合する。抗NM単クローン抗体をマウス腹水からプ
ロテインG精製(Genex Corp.,ガイザースバーグ、メリ
ーランド)によって精製し、必要となるまで4℃で保存
する。
D.抗体のビオチン化 抗体を標準的な技術によって標識することができる。
これらの実施例では、抗体は通常の方法でビオチン化さ
れる。簡単に記せば、精製抗体(ここではマウス腹水か
ら精製された抗NM単クローン抗体)を0.1M重炭酸ソーダ
(pH8.4)に対して一晩透析し、濃度を1.0mg/mlに調節
する。DMSO中のビオチン−X−NHS(0.5ml、カルビオケ
ム社製、サンディエゴ、カリフォルニア)1.5mg/mlを抗
体溶液5mlに加え、暗室で揺らせながら2時間室温で反
応させる。2Mのトリス−塩酸(pH8.0、0.5ml)を加え、
さらに30分インキュベートする。1%BSA含有PBS−メル
チオレート(0.01%)を続いて加え(5ml)、混合物をP
BS−メルチオレートに対して3度透析する。
II.アッセー A.免疫アッセーサンドイッチ法(ELISA) 標準的な免疫アッセーを実施し、抗原結合用、交差反
応アッセー用、さらにアッセーモニター用のドースレス
ポンス曲線を作製する。データは標準的NM抗原調製物を
用いて作製し、体液をアッセーするときにリファレンス
スタンダードとして用いる。これらの実施例では、ELIS
Aおよび放射性免疫アッセーの両方が実施された。
1.免疫アッセー(ウェルアッセー) マイクロタイタープレート(イムロンII、ダイナテッ
ク社製、Chantilly、バージニア)をPBS中の5から15μ
g/mlの精製抗体でpH7.4で1時間または一晩被覆し、そ
の後300μlのPBSで3度洗浄する。続いてプレートをPB
S中の10%正常ヤギ血清で室温で1時間ブロックし、さ
らに300μlのPBSで3度洗浄する。
ウェル当たり100μlのサンプルをピペットで分注
し、室温で1時間インキュベートしてサンプルを測定し
た。1.25から10μg/mlのビオチン化抗体100μlを各ウ
ェルに加え、室温で1時間インキュベートし、さらに30
0μlのPBSで3度洗浄した。1:1000希釈のストレプトア
ビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ結合体の100μl
(The Binding Site Ltd.,バーミンガム、イギリス)を
各ウェルに加え、1時間インキュベートし続いてPBSで
洗浄した。100μlのペルオキシダーゼ基質(クエン
酸、燐酸、OPD−H2O2)を各ウェルに加え、20分インキ
ュベートした。ウェルに1MのH2SO4を50μl加えて反応
を停止させた。光学密度を490nmでプレートリーダーで
読み取った。
NM抗原の濃度は、NMのリファレンス濃度を作製し、未
知サンプルと比較するための標準希釈曲線を作製して求
めた。
2.IRMA(免疫放射能測定アッセー) (a)ストレプトアビジンの沃素付加 0.05Mリン酸塩溶液(pH7.4)2μl中のストレプトア
ビジン10μg(シグマ社製、シンシナチ)を、遠心用マ
イクロチューブに入れた0.25Mのリン酸塩溶液(pH7.4)
10μlに加え、10μl中の1mCiの125I(NEN−DUPONT、
ウィルミントン、デラウェア)を加えた。直ちに蒸留水
50ml中の100mgクロラミン−T三水和物(シグマ社製)
の10μlを加えて混合し、25秒反応させた。反応は、0.
05Mのリン酸塩溶液(pH7.4)50ml中の40mgシステアミン
(2−メルカプトエチルアミン)(シグマ)および5mgK
Iの50μlを20秒混合して停止させた。PBS(pH7.4)中
の1%BSAの0.5mlを加え、BSAPBS緩衝液で予め平衡化し
た10mlのセファデックスG−100カラム(ファルマシ
ア、スェーデン)で材料を分画した。0.5mlずつ30分画
を採集し、各分画の10μlをBSA/PBS緩衝液1mlで希釈し
た。希釈した分画の100μlを125I用LKBガマカウンター
セットで計測した。比活性を計測したが、通常85から10
0μCi/μgであった。蛋白ピークの中央の分画をサンド
イッチ免疫アッセーに用いた。
(b)放射性免疫アッセーサンドイッチ法 取り外し式マイクロタイターウェル(Microtaiter br
eakaway well)(Immulon II Removawell strip,ダイナ
テック、Chantilly,バージニア)を被覆し、ELISAアッ
セーの場合のようにブロック処理を施した。サンプル
(スタンダードまたは血清)は、100μlをウェル中で
室温でインキュベートし、プレート洗浄器で300μlのP
BSで3度洗浄し、さらにビオチン化抗体(10%ヤギ血清
中の2−10μg/ml)で室温で1時間インキュベートさ
せ、再び洗浄することによって日常的に測定される。結
合したビオチン化抗体は、125I−ストレプトアビジンで
検出される。100μl中の200000から300000cpm(77%計
測効率)を各ウェルに加え、室温で1時間インキュベー
トし、再び洗浄する。結合分画は、LKBガンマカウンタ
ーで放射活性を計測することによって検出される。リフ
ァレンス用調製物で得られたカウントと比較することに
よって濃度を決定することができる。
B.NMのドットブロット検出 抗体のNM蛋白との反応性は、標準的な方法および装置
(例えばSchleicher & Schuell)を用いてドットブロ
ット検出アッセーによって評価できる。ニトロセルロー
ス膜をトリス緩衝食塩水(TBS、50mMトリス、150mMNaC
l、pH7.6)に浸し、NM調製物を様々な蛋白濃度で一連の
ウェルにアプライし、室温で1時間インキュベートする
(例えば、10μg/ml、1μg/mlおよび100ng/mlのT−47
D NM上清)。ブロックしたウェルをその後200μlのTB
Sで2度洗浄し、続いてTBS中の10%正常ヤギ血清100μ
lで1時間室温でブロックする。ブロックしたウェルを
続いて200μlのTBSで2度洗浄し、調べようとする核反
応性抗体を含む培養上清100μlをそれぞれのウェルに
加え、室温で1時間インキュベートする。続いてウェル
を200μlのTBSで2度洗浄し、アルカリ性フォスファタ
ーゼ結合ヤギ抗マウスIgG(バイオラッド、リッチモン
ド、カリフォルニア)の100μlを一連の希釈(例えば
1:1000、1:5000、または1:10000)でそれぞれのウェル
に加え、1時間反応させる。続いて200μlのTBSで2度
ウェルを洗浄し、その後レバミゾール(ベクター社製、
Corpus Christi、テキサス)含有トリス緩衝液中の酵素
基質(BCIP/NBT,Kirkgaard & Perry,ガイザ−スバー
グ、メリランド、例えば100μl)を加える。一般に15
分のインキュベートで十分である。反応は蒸留水で希釈
して停止させ、生成物を検出することができる。
III.死細胞からの可溶性抗原の調製(血清枯渇) 細胞株を標準的な技術で組織培養フラスコで互いに接
し合うまで増殖させる。続いて培養液を血清非含有培養
液に置き換え、5%CO2を含む37℃インキュベーターに
細胞株により7から14日静置する。培養の終わりに培養
液を採集し、14000×gで遠心し細胞残屑(デブリ)を
除去して上清を凍結保存する。
ヒトの組織(正常および腫瘍)を用いる場合、可溶性
内部核マトリックス蛋白は同様な態様で遊離させること
ができる。組織をドナーから摘出し、摘出後10分から4
時間以内で液体窒素中で瞬間凍結し、必要となるまで−
70℃で保存する。使用するばかりのときに、組織が解凍
するにつれ、層状気流フード中で無菌的にこれを0.1か
ら0.3cm角に小間切れにし、ファンギゾンおよびゲンタ
マイシンを含む血清非含有培養液の入ったT150フラスコ
に入れる。一般に、2−4gの組織をT150フラスコの100m
l培養液につき使用する。続いて、組織を含むフラスコ
を5%CO2下で37℃で4−7日間培養する。培養後、培
養液をフラスコから採集し、14000×gで20分遠心し、
上清を−20℃で必要となるまで保存する。
IV.代表的アッセー 反応性分析 抗核マトリックス反応性についての免疫ブロット実験
を、T−47D核マトリックスに対して作製した単クロー
ン抗体を用いて実施し、T−47D抗原について強い反応
性を有するものを同定した。これら同定されたものの中
では、3抗体が際立っており、ここでは200−4、203−
37および304−41と呼ぶ。すべての抗体は陽性反応を示
した。反応の強さはより高濃度の二次抗体で最も強く、
抗原の非存在下では反応は認められなかった。
同じアッセー条件を用いてこれら3抗体(200−4、2
03−37および304−41)はすべて、T−47D死細胞の上清
との反応性を示したが、培養液単独では反応せず、細胞
培養上清への可溶性抗原の遊離を明示した。陰性コント
ロールとして用いた抗−KLH(キーホールリンペットヘ
モシアニン)単クローン抗体は消耗上清との反応性を示
さず、該抗体反応の特異性を確認した。同様な結果が、
核マトリックス蛋白に対して作製された多クローンウサ
ギ抗血清を用いて得られた。
下の表Iは、異なる子宮頸癌細胞株の2つのNM抗原調
製物対して作製された異なる抗体を用いて実施されたア
ッセーの結合結果を示している。100−シリーズ抗体はM
E−180のNM免疫原に対して作製されたものであり;300−
シリーズはCaSKi−NM免疫原に対して作製されたもので
ある。
表から分かるように、調べた36の組み合わせのうち12
例が陽性反応を生じた。陽性反応は、2つの抗体が同一
分子の異なるエピトープと反応することを示している。
ただ1つの抗体、302−18がそれ自体との組み合わせで
反応した。
ドースレスポンスアッセー 最初のサンドイッチアッセーは、抗体200.34および20
0−4を用いて、ペンマンとフェイの方法で分離した核
マトリックス蛋白について(表II)、さらに死細胞の細
胞培養上清について(表III)得られた。細胞株T−47D
を両実験のための抗原ソースとして用いたが、これらの
アッセー条件でドースレスポンス曲線が得られることが
明らかとなった。
表IIは、標準的ELISA免疫アッセーおよび精製NM(ペ
ンマンらの方法で精製)を用いて得られたデータを示
す。表IIIは、同一条件ではあるが抗原ソースとして死
細胞を用いて得られたデータを示している。両実験につ
いて抗原ソースとして細胞株T−47Dを用い、さらに、
ドットプロットアッセーによってT−47D抗原と強い反
応性をもつことが先に示された2つの抗体(Ab200−3
4、固相;Ab200−4,可溶抗原)を用いた。
このデータは、これらのアッセー条件を用いて信頼で
きるドースレスポンス曲線が作製でき、溶液中の可溶性
NM抗原を定量することができることを示している。この
プロトコールにしたがって、体液可溶性核マトリックス
蛋白および蛋白フラグメントを検出および定量する能力
について、他の抗体組み合わせを調べることができる。
抗原ソースとしてME−180細胞培養上清を用いた、こ
れらの抗体組み合わせの2つのドースレスポンス評価の
結果が下記の表IVに示されている。各アッセーは組織培
養上清中の抗原のドース依存検出を示しているが、これ
は、該アッセーが死細胞から遊離される可溶性内部核マ
トリックス蛋白を定量することができることを明示して
いる。
次に、内部核マトリックス蛋白の定量について、種々
の死滅腫瘍組織の上清で調べた。ここでは腫瘍および正
常組織を上記に述べたように培養液中で死滅させた。種
々の構成のサンドイッチアッセーで上清を調べた。結果
を図1に示すが、ここでは、基準としてME−180抗原を
使用しすべての値は単位/gmで表されている。図1から
分かるように、抗原は死滅組織の各々から遊離され、3
つのアッセーで異なる抗原が測定される。期待されたよ
うに、腫瘍組織中の死細胞の増加は、癌組織対正常組織
として定量される平均抗原値におけるより高い値として
反映されている。さらに、抗原量の顕著な違いが異なる
組織原で認められ、上清に存在する可溶性抗原は細胞タ
イプ特異的態様で変化することを示している。
図2は、癌患者および健常な血液ドナーの血清サンプ
ルを用いて実施された類似の実験結果を示している。図
1のように、ME−180細胞抗原が基準であった。結果は
単位/mlで示されている。血清中に抗原を希釈し、続い
て溶液中の蛋白を定量するコントロール実験により、血
清はアッセーに殆どまたは全く影響を与えないことが示
されている。図2から分かるように、図1に示した結果
のように、癌患者の血清サンプルはより高い細胞死亡率
を示し、これは正常な血清サンプルで検出される抗原レ
ベルと比較してこれらサンプルで検出される抗原が定量
的に明らかに高いレベルであることによって示されてい
る通りである。
アポプトーシスおよび壊死 1.この実施例では、アポプトーシスおよび壊死の両方が
誘発され、核マトリックス蛋白の遊離に対するこの損傷
の影響が調べられた。この実験では、ME−180細胞(子
宮頸部組織培養細胞株)を血清非含有培養液に懸濁させ
た。壊死は、細胞を−20℃で一晩凍結することによって
アリコートに誘発した。細胞は5%CO2下で7日間37℃
で壊死を進行させた。アポプトーシスは、第二のアリコ
ートに5%CO2下で7日間37℃で血清を枯渇させて誘発
した。続いて各アリコートの上清を採集し、302−22/30
2−18(“22/18")および204−41/107−7(“41/7")
の抗体組み合わせを用いて免疫放射能測定アッセーで調
べた。図3に示したように、22/18アッセーはアポプト
ーシス特異性を示している:壊死細胞(凍結)と比べて
10倍以上の22/18抗原がアポプトーシス細胞(血清枯
渇、非凍結)から遊離される。対照的に、41/7アッセー
では壊死細胞およびアポプトーシス細胞の両方から実質
的に等しく遊離される抗原が測定された。
2.この実施例では、アポプトーシスはMCF7細胞(乳癌細
胞株、ATCC,ロックビル、メリーランド)を腫瘍壊死因
子(TNFα)に曝して誘発させた。MCF7細胞は、35mlの
5%ウシ胎児血清およびサーキシテンド(SerXtend)添
加ダルベッコー修飾培地(DME)を入れた12個のT−25
フラスコに撒いた。この細胞を37℃で5%CO2で60−70
%の密集状態まで増殖させた。細胞上清を取り出し、6
個ずつ2つのグループに分けた。
グループ1:コントロール、細胞上清を新鮮培養液に交換
した。
グループ2:TNF、細胞上清を500U/mlのリコンビナントヒ
トTNF−α(Cellular Products,Inc.バッファロー、ニ
ューヨーク)を含む新鮮培養液に交換した。
異なる間隔(2時間、8時間、24時間、48時間および
72時間)で、上清を取り出し、1200rpmで遠心し、−80
℃凍結した。付着したままの細胞はスライドに用い、PA
P−染色を施した(標準的細胞染色技術を利用)。22/18
または302.29/107.07(“29/7")の抗体組み合わせを用
いて上清を免疫放射能測定アッセーで測定した。図4で
分かるように、TNFによる細胞処理は、TNF曝露後まもな
く(20時間までに)核マトリックス蛋白を上清中に遊離
させ、一方未処理細胞からは遊離しない。図4Aは22/18
の組み合わせによるアッセーで、図4Bは29/7の組み合わ
せによるアッセーである。さらに、染色細胞の組織学的
検査により、TNF処理細胞は特徴的なアポプトーシス
(クロマチン凝縮、細胞質膨潤)を示していることが確
認された。
ドース対密度実験 ここでは、MCF7細胞(乳癌、付着性)は、DME完全培
地(5%ウシ胎児血清+サーキシテンド)中で1ステー
ジ用セルファクトリー(one stage cell factory)(Nu
nc)で5%CO2、37℃で増殖させた。続いて、この細胞
を採集し、ファンギゾンおよびゲンタマイシンを含む血
清非含有最小必要培地(MEM)に再懸濁させ、数を数え
て、35mlの血清非含有培養液を入れたT150フラスコに種
々の細胞密度を撒いた。
細胞を37℃、5%CO2で7日間死滅させた。上清を取
り出し1000rpmで遠心して細胞片を除去した。22/18を用
いて免疫放射能アッセーで、さらに41/7抗体組み合わせ
を用いてELISAで調べた。
調べたすべての核マトリックス蛋白について、遊離は
本質的に細胞密度と直接関係していた(図5参照)。こ
れらの予備的なデータが、核マトリックス蛋白の遊離は
不変で定量的であり、検出値は細胞数と相関性があるこ
とを示唆しているように、この結果は意義深いものであ
る。
細胞毒性試薬の分析 1.この実験では、41/7核マトリックス蛋白の遊離に対す
るTNFの濃度増加の影響を調べた。組織培養液中で37
℃、5%CO2で増殖中のMCF7組織培養細胞を、該組織培
養液をTNF含有培養液と置き換えることによって、異な
るTNF濃度に曝した。図6に示すように、41/7核マトリ
ックス蛋白の量および遊離速度は添加TNF量と相関し、
特に1.0単位/ml TNFより大きい量で相関する(図6)。
2.この実験では、可溶性核マトリックス蛋白の細胞外液
への遊離に対する既知の癌化学療法剤(ドキソルビシ
ン、シグマ社)の影響を測定した。
生細胞の標準曲線はMCF7細胞(乳癌、付着性)で作製
した。一切の細胞増殖を防止するために0.5μg/mlのマ
イトマイシンC(シグマ社、シンシナチ)を含む2mlのD
ME完全培養液(5%ウシ胎児血清+サーキシテンド)を
入れた6穴(ウェル)プレートに細胞を撒いた。
37℃で一晩培養した後、200μlの3−〔4,5ジメチル
チアゾル−2−4〕2,5−ジフェニル(テトラゾリウム
ブロミド)(MTT)のストック溶液(燐酸緩衝食塩水中
の5mg/mlのMTT、シグマ社)を各ウェルに加えた。プレ
ートを37℃、5%CO2で4時間インキュベートした後、
上清を吸引して除き、4mlのDMSO(ジメチルスルホキシ
ド)を加え、残存結晶体を可溶化した。これを取り出
し、この吸引を分光光度計でDMSOのみのブランクに対し
て562nmで調べた。
細胞は以下のようにドキソルビシンで処理した:MCF7
細胞を2mlのDME完全培養液を入れた6穴プレートに1.3
×105細胞/穴の密度で撒いた。37℃で5%CO2で72時間
増殖させた後、上清を吸引して除去し、450nMのドキソ
ルビシン含有DME完全培養液と交換した。
1、24、48、72および96時間で、上清を取り出し後で
アッセーするために−20℃で凍結した。上清を2mlの新
鮮DME完全培養液に交換した後、生細胞の数を標準曲線
の場合と同じ方法で求めた。41/7の抗体組み合わせを用
いて、細胞上清をELISAで測定した。このELISAで得たド
ース値を標準曲線データとともに作表し、残存生細胞の
測定と核マトリックス蛋白の遊離との間の相関性を調べ
た(図7)。
図7で明らかなように、細胞生存度は遊離核マトリッ
クス蛋白と反比例しているようであった。
TNF−誘発核マトリックス蛋白の遊離 本発明はまた、NM調製物を細胞から適切な薬剤(例え
ばTNF)を用いて可溶形でそれらを遊離させることによ
って調製するためにも用いることができる。一般に、細
胞毒性試薬の分析プロトコールと同様なプロトコール
を、蛋白遊離を誘発するために用いることができる。細
胞を実質的に密集状態まで増殖させ、続いて上清を250U
/ml TNF、DME完全培養液で置き換える。適切な培養期間
後、上清を取り出し、可溶性核マトリックス蛋白を標準
的な蛋白分離法(例えば、陽イオン交換カラムによるク
ロマトグラフィーまたは免疫親和性カラムのようなアフ
ィニティーカラム)によって溶液から抽出する。一旦精
製して、このNM調製物は使用直前まで凍結溶液として保
存することができる。そのように調節したNM蛋白は免疫
アッセー標準物として、さらに、単クローンおよび多ク
ローン抗体の作製のために用いることができる。他の化
合物と結合する能力を測定し、したがって特定の核マト
リックス蛋白の核機能と干渉することができる化合物を
識別するために、これらの蛋白を用いることができると
いうこともまた提案される。特異的に結合し、さらに例
えば癌特異的核マトリックス蛋白と干渉することができ
る化合物は、癌の化学療法剤として有用であるかもしれ
ない。
本発明は、本発明の精神または必須の特徴から外れる
ことなくまた別の明確な形で具体化できよう。したがっ
て、ここに示されている実施例は、全ての局面において
単なる例示であって、これに限定されるとは考えられ
ず、本発明の範囲は前述の記載によるよりはむしろ添付
の請求の範囲によって求められ、請求の範囲に匹敵する
ものの意味および範囲内で生じるすべての変更は、した
がって本請求の範囲内に含まれると考えられる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ミラー,トーマス,イー アメリカ合衆国 02038 マサチューセ ッツ,フランクリン,オーク ストリー ト 701 (56)参考文献 特表 昭63−502484(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) G01N 33/53 G01N 33/50 BIOSIS(DIALOG)

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】アポプトーシスや壊死などによる組織中の
    細胞死の度合いを定量する方法であって、該方法が次の
    工程 (a)当該組織の細胞から遊離された細胞残屑(debri
    s)を含む体液サンプルなどの液体サンプルを準備す
    る、 (b)該サンプルを、体液可溶性核マトリックス蛋白ま
    たはその可溶性蛋白フラグメントを検出する手段と接触
    する、および (c)該サンプル中の体液可溶性核マトリックス蛋白ま
    たはその可溶性フラグメントの単位容量当たりの量を測
    定する、なお、当該量は当該組織中の細胞死の度合いを
    表わすものである、 からなる細胞死の度合いを定量する方法。
  2. 【請求項2】細胞死に関連した疾病の状態を評価するた
    めに使用する請求の範囲第1項の方法であって、該方法
    がさらに次の工程 (d)少なくとも1つの新鮮なサンプルを用いて工程
    (a)、(b)および(c)を、間隔をあけて繰り返
    す、および (e)前記それぞれのサンプル中の体液可溶性核マトリ
    ックス蛋白または可溶性蛋白フラグメントの測定された
    量を比較する、なお、当該比較量の減少は細胞死の減少
    を表わすものであり、また比較量の増加は細胞死の増加
    を表すものである、 からなる細胞死に関連した疾病の状態を評価するために
    使用する方法。
  3. 【請求項3】前記疾病が、癌、肉腫、リンパ腫または骨
    髄腫などの悪性腫瘍である請求の範囲第2項の方法。
  4. 【請求項4】放射線療法または化学療法などの治療の効
    能を評価するために使用する請求の範囲第1項の方法で
    あって、該方法がさらに次の工程 (d)治療薬または治療処置を患者に施す、 (e)新鮮なサンプルを用いて工程(a)、(b)およ
    び(c)を繰り返す、および (f)前記それぞれのサンプル中の体液可溶性核マトリ
    ックス蛋白または可溶性蛋白フラグメントの測定された
    量を比較する、なお、前記比較量の変化が前記治療薬ま
    たは治療処置の効果を表すものである、 からなる治療の効能を評価するために使用する方法。
  5. 【請求項5】前記治療が、細胞死を誘発する請求の範囲
    第4項の方法。
  6. 【請求項6】前記治療薬または治療処置が、癌の治療薬
    または治療処置である請求の範囲第4項の方法。
  7. 【請求項7】工程(a)で準備された前記サンプルが、
    血液、血清、血漿、尿、精液、脊髄液、腹水、腹腔液、
    唾液、痰、組織スワブ、および乳房滲出物などの身体滲
    出物から選ばれる体液である請求の範囲第1項から第4
    項の方法。
  8. 【請求項8】前記工程(b)が、次の工程 (1)体液からなる前記サンプルを、当該核マトリック
    ス蛋白に特異的なモノクローナル抗体などの抗体に、当
    該サンプル中の当該蛋白またはその可溶性フラグメント
    への当該抗体の特異的結合をさせるのに十分な条件下で
    曝す、および (2)当該特異的結合により形成された抗体−核マトリ
    ックス蛋白複合体の量を測定する からなる請求の範囲第1項、第2項または第4項の方
    法。
  9. 【請求項9】前記核マトリックス蛋白−特異的抗体が、 (a)細胞から核マトリックス蛋白を選択的に得る、お
    よび (b)当該核マトリックス蛋白に対する抗体を調製する ことによって得られる請求の範囲第8項の方法。
  10. 【請求項10】工程(b)で調製される前記抗体が、ポ
    リクローナル血清からなる請求の範囲第9項の方法。
  11. 【請求項11】工程(b)で調製される前記抗体が、工
    程(a)の選択された核マトリックス蛋白に対するモノ
    クローナル抗体からなる請求の範囲第9項の方法。
  12. 【請求項12】化合物の細胞毒性を評価する方法であっ
    て、該方法が次の工程 (a)液体培地中で細胞サンプルを被験化合物に曝す、 (b)当該細胞からその液体培地中に遊離された液体可
    溶性核マトリックス蛋白またはその可溶性蛋白フラグメ
    ントの単位容量当たりの量を測定する、および (c)工程(b)で測定された当該液体可溶性核マトリ
    ックス蛋白またはその可溶性蛋白フラグメントの量を、
    当該化合物に曝さずに前記細胞から遊離された前記液体
    可溶性核マトリックス蛋白またはその可溶性フラグメン
    トの単位容量当たりの量とを比較する、なお、当該化合
    物に曝した前記細胞から遊離された量と、当該化合物に
    曝さない場合に前記細胞から遊離された量を比較した場
    合の増加が当該化合物の細胞毒性のレベルを表わすもの
    である、 からなる化合物の細胞毒性を評価する方法。
  13. 【請求項13】前記核マトリックス蛋白が、前記細胞に
    特有のものである請求の範囲第1項または第12項の方
    法。
  14. 【請求項14】前記疾病が、組織の過形成、硬変、低酸
    素症、虚血または補体介在性自己融解(complement−me
    diated autolysis)を誘発するか、あるいは前記疾病が
    自己免疫疾患またはウイルス疾患である請求の範囲第2
    項の方法。
  15. 【請求項15】前記細胞死が、化学物質、毒素または直
    接的な身体の損傷などの直接的な細胞損傷から生じる請
    求の範囲第1項の方法。
  16. 【請求項16】個体中の悪性腫瘍を検出する方法であっ
    て、該方法が次の工程 (a)当該個体の体液サンプルを、体液可溶性核マトリ
    ックス蛋白またはその体液可溶性蛋白フラグメントと特
    異的に結合する結合性蛋白に接触する、 (b)当該サンプル中の、当該結合性蛋白により結合さ
    れた体液可溶性核マトリックス蛋白またはその体液可溶
    性フラグメントの量を測定する、および (c)当該体液可溶性核マトリックス蛋白またはその体
    液可溶性フラグメントの量を、前記悪性腫瘍を表わす既
    知の値と比較する、なお、前記サンプル中の前記体液可
    溶性核マトリックス蛋白またはその体液可溶性フラグメ
    ントの量が、前記既知の値との比較において、当該個体
    中の当該悪性腫瘍の存在を表わすものである、 からなる個体中の悪性腫瘍を検出する方法。
  17. 【請求項17】前記体液サンプルが、血液、血清、血
    漿、尿、精液、脊髄液、腹水、腹腔液、唾液、痰、なら
    びに乳房滲出物からなる群から選ばれる請求の範囲第16
    項の方法。
  18. 【請求項18】前記悪性腫瘍が、癌、肉腫、リンパ腫ま
    たは骨髄腫からなる群から選ばれる請求の範囲第16項の
    方法。
  19. 【請求項19】前記悪性腫瘍が、乳房、肺、前立腺、膀
    胱、子宮(cervical)、卵巣、結腸(colon)及び結腸
    直腸の(colorectal)組織からなる群から選ばれる組織
    の悪性腫瘍である請求の範囲第16項の方法。
  20. 【請求項20】前記結合性蛋白が、抗体である請求の範
    囲第16項の方法。
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