JP4274856B2 - Ｄｎａとｄｎａ結合タンパク質との反応を検出する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との反応を検出する方法に関し、特に蛍光相関分光計(fluorescence correlation spectroscopy：FCS)を用いた検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
特許文献１（特許第3169610号公報）は、二本鎖DNA中の選択されたテスト配列に結合し得る分子をスクリーニングする方法を記載する。
特許文献２（特許第2953783号公報）は、遺伝子転写レベルで活性な医薬の有効な同定方法を記載する。
特許文献３（特開2001-321199号公報）は、生物学的資料中のDNA結合タンパク質を定量する方法を記載する。
特許文献４（特開2003-88369号公報）は、蛍光相関分光法(FCS)を利用してDNAエンドヌクレアーゼ活性を検出する方法、および分子量の大小と並進拡散時間(translational diffusion time)の大小との関係を記載する。特許文献５（特表2002-543414号公報）は、試料中の蛍光分子又は他の粒子を特徴付ける方法、および蛍光強度多重(multiple)分布分析(FIMDA)および蛍光自己たたみ込み(autoconvoluted)強度分布分析(FACID)から並進拡散時間が得られることを記載する。
【０００３】
【特許文献１】
特許第3169610号公報
【特許文献２】
特許第2953783号公報
【特許文献３】
特開2001-321199号公報
【特許文献４】
特開2003-88369号公報
【特許文献５】
特表2002-543414号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来技術のうち、特許文献２（特許第2953783号公報）、特許文献３（特開2001-321199号公報）および特許文献４（特開2003-88369号公報）に記載される各検出方法は、特定の配列、または特定の配列を有する分子を検出する際に、放射性同位元素を用いたり、電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などを行うので、操作が煩雑で検出結果を得るまでに時間がかかる問題がある。
特許文献４（特開2003-88369号公報）および特許文献５（特表2002-543414号公報）は、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との反応を検出する方法については記載しない。
【０００５】
本発明の目的は、簡便にかつ短時間で、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との反応を検出する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する本発明の特徴は、蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを含む溶液および転写因子TFIIDを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。本発明によれば、溶液の混合と蛍光相関分光法による計測により並進拡散時間を求めるための情報が得られ、放射性同位元素の利用や電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などの煩雑な操作を行わずに、二本鎖ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質である転写因子TFIIDとの反応を簡便に短時間で得ることができる。
また、サンプル中の二本鎖ＤＮＡの濃度が２ｎＭ〜５ｎＭである溶液を用いて各実験を行うと、FCS測定の際にコンフォーカルボリュームにおける粒子数は２〜５となり、精度よくFCS測定が行え、二本鎖DNAとDNA結合タンパク質との結合反応が精度良く検出できる。特に、コンフォーカルボリュームにおける粒子数が２〜３でも精度良い検出ができるので、多量の二本鎖ＤＮＡやＤＮＡ結合タンパク質を用意できない場合や、少量のサンプルだけで検出結果を得たい場合にも、本発明の検出方法は適している。
【０００７】
本発明の他の特徴は、蛍光標識を付加された二本鎖ＤＮＡを含む溶液、転写因子TFIIDおよび転写因子TFIIBを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにあり、転写因子TFIIBを加えることによって、反応物の並進拡散時間が大きくなるので、結合がより精度良く検出できる。また、さらに抗TFIIB抗体を加えることによって、反応物の並進拡散時間がさらに大きくなるので、結合がより精度良く検出できる。
二本鎖ＤＮＡに転写因子FTIIDが結合する配列が含まれているか検出する場合は、二本鎖ＤＮＡに蛍光標識を付加して請求項１から３の方法を行い、結合が検出されれば二本鎖ＤＮＡに転写因子FTIIDが結合する配列が含まれることになる。
また、溶液中に転写因子FTIIDが含まれているか検出する場合は、この溶液と、転写因子FTIIDが結合する配列を有しかつ蛍光標識された二本鎖DNAとを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求める。このとき、転写因子TFIIBを添加するか、または、転写因子TFIIBおよび抗TFIIB抗体を添加することにより、転写因子TFIIDの存在を精度良く検出することができる。
【０００８】
本発明の他の特徴は、検出の対象である溶液と転写因子AP-1が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを含む溶液とを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。この特徴によれば、溶液の混合と蛍光相関分光法による計測により並進拡散時間を求めるための情報が得られ、放射性同位元素の利用や電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などの煩雑な操作を行わずに、二本鎖ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質である転写因子AP-1との反応を簡便に短時間で得ることができる。
【０００９】
本発明の他の特徴は、検出の対象である二本鎖ＤＮＡを含む溶液、転写因子AP-1、および転写因子AP-1が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。
この特徴によれば、溶液の混合と蛍光相関分光法による計測により並進拡散時間を求めるための情報が得られ、放射性同位元素の利用や電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などの煩雑な操作を行わずに、二本鎖ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質である転写因子AP-1との反応を簡便に短時間で得ることができる。
【００１０】
本発明の他の特徴は、検出の対象である溶液と転写因子が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとを混合する際に、検出の対象である溶液の量を段階的に増加して、各段階で蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。細胞核抽出物中の転写因子AP-1を検出する場合は、蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとして転写因子AP-1が結合する結合サイトを有する二本鎖ＤＮＡを用い、細胞核抽出物の溶液の量を段階的に増加して混合する。細胞核抽出物中の転写因子NF-κBを検出する場合は、蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとして転写因子NF-κBが結合する結合サイトを有する二本鎖ＤＮＡを用い、細胞核抽出物の溶液の量を段階的に増加して混合する。
【００１１】
本発明の他の特徴は、細胞に腫瘍壊死因子TNF-αを添加してから細胞核抽出を行い、この細胞核抽出物と蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。HeLa細胞の核抽出物中の転写因子AP-1を検出する場合は濃度50ng/mlの腫瘍壊死因子TNF-αで30分間刺激し、HeLa細胞の核抽出物中の転写因子AP-1を検出する場合は15分間刺激するとよい。腫瘍壊死因子TNF-αの刺激によって細胞核抽出物中の転写因子が活性化し、二本鎖DNAとの結合がしやすくなるので、精度良く転写因子を検出することができる。
【００１２】
本発明の他の特徴は、細胞にAPDCを添加した後に腫瘍壊死因子TNF-αを添加してから細胞核抽出を行い、この細胞核抽出物と転写因子AP-1が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖DNAとを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。本発明によれば、細胞核抽出の際にAPDCおよび腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激を行うことによって、転写因子AP-1が活性化し二本鎖DNAとの結合がしやすくなるので、精度良く転写因子AP-1を検出することができる。APDCによる刺激時間は2時間、腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激時間は30分間であるとよい。
【００１３】
本発明の他の特徴は、細胞の核抽出物中の転写因子NF-κBと、転写因子NF-κBが結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとの反応生成物の並進拡散時間から細胞の核抽出物中の転写因子NF-κBを検出するにあたって、細胞に腫瘍壊死因子TNF-αのみで刺激を行った場合の反応生成物の並進拡散時間と、APDC(Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate)および腫瘍壊死因子TNF-αの刺激を行った場合の反応生成物の並進拡散時間とを比較することにある。腫瘍壊死因子TNF-αは転写因子NF-κBを活性化し、APDCは転写因子NF-κBの活性化を抑制するので、腫瘍壊死因子TNF-αのみで刺激を行った場合に並進拡散時間が大きければ、細胞核抽出物に転写因子NF-κBが含まれると言え、精度良く転写因子NF-κBを検出することができる。
【００１４】
また、FCS測定の際にコンフォーカルボリュームにおける粒子数は２〜５であれば、精度よくFCS測定が行え、二本鎖DNAとDNA結合タンパク質との結合反応が精度良く検出できる。特に、コンフォーカルボリュームにおける粒子数が２〜３でも精度良い検出ができるので、多量の二本鎖ＤＮＡやＤＮＡ結合タンパク質を用意できない場合や、少量のサンプルだけで検出結果を得たい場合にも、本発明の検出方法は適している。
また、本発明によれば、精製していない細胞核抽出物のようなクルード(crude)な試料を用いても、二本鎖DNAと転写因子との結合反応が精度良く検出できる。また、転写因子が結合する本来の二本鎖DNAと1塩基またな2塩基しか違いのない二本鎖DNAを添加しても、本来の二本鎖DNAと転写因子との結合反応が妨げられずに反応生成物が検出できるので、FCSによるこれらの測定方法は、細胞核抽出物などのクルードなサンプル中に存在する特定のDNA結合タンパク質（転写因子、核内レセプターなど）を検出するのに有用である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の様態では、DNAとDNA中の特定配列部分に結合するタンパク質(以下DNA結合タンパク質と呼ぶ)との結合を検出するための様々な実験を行う。実験の目的別に実施例として説明する。実験では生体分子の反応過程後にＦＣＳ測定を行って、生体分子の並進拡散時間を求める。
並進拡散時間の大小は分子量の大小を示すので、反応の前後で並進拡散時間を比較することにより、分子量の増加または減少がわかる。分子量の増加は生体分子間の結合反応を、分子量の減少は生体分子の分解反応を、分子量の維持は生体分子に結合も分解も無かったことを示す。
従って、DNAとDNA結合タンパク質との反応の前後でDNAの並進拡散時間の増加を検出することにより、DNAとDNA結合タンパク質との結合反応を検出することができる。
【００１６】
【実施例】
各実施例の実験内容と実験結果の概要を表１〜４に示し、後に各実施例を説明する。
【００１７】
【表１】
【００１８】
【表２】
【００１９】
【表３】
【００２０】
【表４】
【００２１】
（実施例１）
本実施例ではＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質である転写因子TFIIDおよび転写因子TFIIBとの結合反応を検出する。
DNAとして、図５に示す二本鎖ＤＮＡ１０を用いる。二本鎖ＤＮＡ１０は、5’末端に蛍光標識４(TAMRAラベル)をラベル済みのオリゴＤＮＡ１１と、オリゴＤＮＡ１１に相補的な拡散配列を持つオリゴＤＮＡ１２とからなる。二本鎖ＤＮＡ１０は転写因子TFIIDおよび転写因子TFIIBの結合する結合サイト１６であるＴＡＴＡＡ配列(相補配列はＡＴＡＴＴ配列)を有する。
DNA結合タンパク質として、TBP(TATA binding protein、TATA結合タンパク質)を含む転写因子TFIID１、および転写因子TFIIB２を用いる。さらに、転写因子TFIIB２に結合する抗体として抗TFIIB抗体３を用いる。
転写因子TFIID１、転写因子TFIIB２および抗TFIIB抗体３として以下のものを用いる。
【００２２】
【表５】
【００２３】
＜二本鎖ＤＮＡ１０の作成と調整＞
まず、検出実験に用いる二本鎖ＤＮＡ１０を準備する。二本鎖ＤＮＡ１０を準備するために以下のものを用いる。
【００２４】
【表６】
【００２５】
STEバッファー中でオリゴＤＮＡ１１およびオリゴＤＮＡ１２を反応させ、95℃で5分間加熱した後、20℃までゆっくり冷却する。次いで、PCR機器内または室温放置でアニーリングする。アニーリングした反応液にエキソヌクレアーゼＩおよびMgCl2を添加し、37℃で1時間反応させる。添加量は反応液100μlに対してそれぞれ1μlである。その後、反応液を精製キットMERmaid SPIN(BIO社 101)によって精製し、オリゴＤＮＡ１１とオリゴＤＮＡ１２とからなる二本鎖DNA１０をdWで抽出する。
抽出した二本鎖DNA１０を蛍光相関分光法(FCS)で測定し、粒子数(n)が20程度になるようにdWで希釈し、二本鎖DNA１０の溶液を作る（溶液中の二本鎖DNA１０の濃度は２ｎＭ〜５ｎＭとなる）。粒子数(n)が20程度の二本鎖DNAの溶液を用いて各実験を行うと、FCS測定の際にコンフォーカルボリュームにおける粒子数は２〜５となり、精度よくFCS測定が行え、二本鎖DNAとDNA結合タンパク質との結合反応が精度良く検出できる。
【００２６】
実験１−１．TFIID結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と転写因子TFIID、転写因子TFIIBおよび抗TFIIB抗体の反応実験
図１に実験１−１の手順と生成物の概略を示す。FCS測定は各反応後に、波長543nm、出力100μWのレーザー光を1回に15秒照射する条件で5回行った。
【００２７】
(1)未反応の二本鎖DNA１０のＦＣＳ測定
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、室温を30分間静置した後、FCS測定して並進拡散時間を求める。
【００２８】
【表７】
【００２９】
【表８】
【００３０】
【表９】
【００３１】
DNA結合タンパク質は添加されていないのでDNA-タンパク複合体は形成せず、二本鎖DNA１０は未反応のままである。
【００３２】
(2)二本鎖DNA１０と転写因子TFIID１との反応
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、室温を30分間静置した後、FCS測定して並進拡散時間を求める。転写因子TFIIDは予めTFIID用バッファーで25ng/μlに調整しておく。
【００３３】
【表１０】
【００３４】
生成物は二本鎖DNA１０の結合サイト１６に転写因子TFIID１が結合したDNA-タンパク複合体である。
【００３５】
(3)(2)の反応済み溶液と転写因子TFIIB２との反応
(2)の反応済み溶液20μlに、85ng/μlの転写因子TFIIB２を1μl加え、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、室温を20分間静置した後、FCS測定して並進拡散時間を求める。
生成物は二本鎖DNA１０の結合サイト１６に転写因子TFIID１と転写因子TFIIB２が結合したDNA-タンパク複合体である。
【００３６】
(4)(3)の反応済み溶液と抗TFIIB抗体３との反応
(3)の反応済み溶液20μlに、抗TFIIB抗体３を1μl加え、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、室温を20分間静置した後、FCS測定して並進拡散時間を求める。
生成物は二本鎖DNA１０の結合サイト１６に転写因子TFIID１と転写因子TFIIB２が結合し、さらに転写因子TFIIB２に抗TFIIB抗体３が結合したDNA-タンパク複合体である。
【００３７】
実験１−２．TFIID結合配列を持たないＤＮＡ(蛍光標識有り)と転写因子TFIID、転写因子TFIIBおよび抗TFIIB抗体の反応実験
二本鎖DNA10の代わりに、転写因子TFIIDと結合する結合サイト１６を含まない二本鎖大腸菌由来ランダム配列ＤＮＡ１７を用いて、実験１−１(1)〜(4)と同様の反応実験を行った。
【００３８】
図８に実験１−１および１−２での生成物の並進拡散時間を示す。二本鎖DNA１０を用いた実験１−１では、反応前の二本鎖DNA１０の並進拡散時間に比べて、各反応後のDNA-タンパク複合体の並進拡散時間が大きくなっており、二本鎖DNA１０と転写因子TFIID１、転写因子TFIIB２および抗TFIIB抗体３とが結合したことが確認できた。一方、二本鎖大腸菌由来ランダム配列ＤＮＡ１７を用いた実験１−２では、いずれも並進拡散時間の変化はほとんどなく、DNA結合タンパク質との結合は確認できなかった。特に、転写因子TFIID１、転写因子TFIIB２および抗TFIIB抗体３の3つのタンパク質すべてが結合したDNA-タンパク複合体の並進拡散時間は他のDNA-タンパク複合体の並進拡散時間よりも著しく大きい。
【００３９】
従って、転写因子TFIID１および転写因子TFIIB２の結合サイト１６が蛍光標識DNAに存在するか否か検出する場合には、転写因子TFIID１、転写因子TFIIB２および抗TFIIB抗体３のすべてをDNA溶液に添加し、DNA-タンパク複合体をFCS測定して並進拡散時間を求めることにより、結合サイト１６の存在を精度良く検出することができる。
また、DNA結合タンパク質の溶液に転写因子TFIID１が存在するか否か検出する場合には、結合サイト１６を有する蛍光標識二本鎖DNA１０とともに、転写因子TFIIB２および抗TFIIB抗体３を反応液に添加し、DNA-タンパク複合体をFCS測定して並進拡散時間を求めることにより、転写因子TFIID１の存在を精度良く検出することができる。
【００４０】
（実施例２）
本実施例ではＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質である転写因子AP-1との結合反応について、転写因子AP-1の濃度依存を検出する。
DNAとして、図６に示す二本鎖ＤＮＡ２０を用いる。二本鎖ＤＮＡ２０は、5’末端に蛍光標識４(TAMRAラベル)を有するオリゴＤＮＡ２１と、オリゴＤＮＡ２１に相補的な核酸配列を持つオリゴＤＮＡ２２とからなる。二本鎖ＤＮＡ２０は転写因子AP-1の結合する結合サイト２６であるＴＧＡＧＴＣＡ配列(相補配列はＡＣＴＣＡＧＴ配列)を有する。
DNA結合タンパク質として次の転写因子AP-1５を用いる。
【００４１】
【表１１】
【００４２】
＜二本鎖ＤＮＡ２０の作成と調整＞
まず、検出実験に用いる二本鎖ＤＮＡ２０を準備する。二本鎖ＤＮＡ２０を準備するために以下のものを用いる。
【００４３】
【表１２】
【００４４】
STEバッファー中でオリゴＤＮＡ２１およびオリゴＤＮＡ２２を反応させ、95℃で5分間加熱した後、20℃までゆっくり冷却する。次いで、PCR機器内または室温放置でアニーリングする。アニーリングした反応液にエキソヌクレアーゼＩおよびMgCl2を添加し、37℃で1時間反応させる。添加量は反応液100μlに対してそれぞれ1μlである。その後、反応液をMERmaid SPIN(BIO社 101)によって精製し、オリゴＤＮＡ２１とオリゴＤＮＡ２２とからなる二本鎖DNA２０をdWで抽出する。
抽出した二本鎖DNA２０を蛍光相関分光法(FCS)で測定し、粒子数(n)が20〜30程度になるようにdWで希釈し、二本鎖DNA２０の溶液を作る。
未標識の二本鎖DNA２４は、オリゴＤＮＡ２１(蛍光標識４をラベル済み)の代わりに同じ配列で蛍光標識していないオリゴＤＮＡを用いて、二本鎖DNA２０と同様にして作成・抽出する。抽出した二本鎖DNA２４を吸光度（OD260値）を測定し、OD260値が20となるようにdWで希釈し、二本鎖DNA２４の溶液を作る。
【００４５】
実験２−１．AP-1結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と転写因子AP-1との反応実験。濃度が異なる転写因子AP-1を添加して実験。
図２に実験２−１の手順と生成物の概略を示す。以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、34℃で1時間反応後、FCS測定して並進拡散時間を求める。FCS測定は各反応後に、波長543nm、出力100μWのレーザー光を1回に15秒照射する条件で5回行った。
【００４６】
【表１３】
【００４７】
【表１４】
【００４８】
濃度0ng/μlの転写因子AP-1５を用いた反応では、DNA結合タンパク質は添加されていないのでDNA-タンパク質複合体は存在せず、二本鎖DNA２０は未反応のままである(図２の(1)を参照)。反応後の生成物は二本鎖DNA２０の結合サイト２６に転写因子AP-1５が結合したものである(図２の(2)を参照)。未反応の二本鎖DNA２０と各転写因子AP-1５濃度のときの生成物について、FCS測定の結果を表１５に示す。
【００４９】
【表１５】
【００５０】
結転写因子AP-1の濃度が600ng/μlのときに生成物の並進拡散時間が大きく伸び、濃度依存性が認められた。転写因子AP-1の濃度が300ng/μlまでと比較して、600ng/μlから1500ng/μlまでの並進拡散時間との差は小さいので、二本鎖DNA２０と転写因子AP-1５との結合が600ng/μlで飽和に達していると言える(図９参照)。
また、並進拡散時間が432μsである未反応の二本鎖DNA２０(K1)と、並進拡散時間が862.4μsである生成物(K2)との存在比は、転写因子AP-1の濃度が600ng/μl以上でほぼ一定なので、濃度600ng/μlで十分に結合反応が生じており、そして飽和転写因子AP-1の濃度が1500ng/μlの場合には、一定濃度の二本鎖DNA２０に対する転写因子AP-1の結合が飽和状態にあると考えられる(図１０参照)。
【００５１】
実験２−２．AP-1結合配列を持つ二本鎖DNA(未標識)を添加した場合のAP-1結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と転写因子AP-1との反応実験。二本鎖DNA(未標識)濃度を段階的に変えて実験。
図３に実験２−２の手順と生成物の概略を示す。配列は二本鎖DNA20と同じであるが未標識二本鎖DNA２４を添加する二本鎖DNAとして用いる。転写因子AP-1５の濃度は、実験２−１で十分に結合反応が生じていた600ng/μｌとする。
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、34℃で1時間反応後、FCS測定して並進拡散時間を求める。FCS測定は各反応後に、波長543nm、出力100μWのレーザー光を1回に15秒照射する条件で5回行った。
【００５２】
【表１６】
【００５３】
実験２−３．AP-1結合配列を持たないＤＮＡ(未標識)と転写因子AP-1との反応実験。AP-1結合配列を持たないＤＮＡ(未標識)濃度を段階的に変えて実験
図４に実験２−３の手順と生成物の概略を示す。配列がAP-1結合配列を持たない二本鎖大腸菌由来ランダム配列で、蛍光標識されていない二本鎖DNA１８を添加する二本鎖DNAとして用いる。転写因子AP-1５の濃度は、実験２−１で十分に結合反応が生じている600ng/μｌとする。
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、34℃で1時間反応後、FCS測定して並進拡散時間を求める。FCS測定は各反応後に、波長543nm、出力100μWのレーザー光を1回に15秒照射する条件で5回行った。
【００５４】
【表１７】
【００５５】
実験２−２の結果から、二本鎖DNA２０ろ転写因子AP-1 ５とのDNA-タンパク複合体の並進拡散時間は、未標識二本鎖DNA２４を添加することで、未反応ＤＮＡの並進拡散時間に近づいた。従って、二本鎖ＤＮＡ２０と転写因子AP-1５との結合が阻害されることが確認できた(図３の(2)、図１１参照)。
また、実験２−３の結果から、二本鎖ＤＮＡ２０と転写因子AP-1５とのDNA-タンパク複合体の並進拡散時間は、未標識二本鎖ＤＮＡ１８を添加しても未反応DNAの並進拡散時間には近づかなかった(図４の(2)、図１１参照)。
以上の実験２−２および実験２−３で行われた競合アッセイの結果から、転写因子AP-1は、二本鎖ＤＮＡの特異的な配列に結合することが証明された。
【００５６】
タンパク質の溶液中に転写因子AP-1が含まれるか検出する場合、蛍光標識をラベルされた二本鎖DNA２０を含む溶液に、タンパク質の溶液を段階的に添加して生成物をFCS測定し、並進拡散時間を求めれば、転写因子AP-1の存在を検出することができる。
【００５７】
（実施例３）
本実施例ではＤＮＡと細胞核抽出物内の転写因子との結合反応について、細胞核抽出物の濃度依存を検出する。DNAとして、実施例２で用いた二本鎖ＤＮＡ２０を用いる。
【００５８】
＜細胞から核抽出物を生成する＞
細胞から核抽出物を生成するために以下のものを用いる。
【表１８】
【００５９】
HeLa細胞を10cmディッシュにコンフルエントの状態にする。PBS(-)で2回洗浄後、0.5%FCS/DMEMに交換し、TNF-α100ng/mlで刺激する。刺激から2時間後の細胞をPBS(-)で2回洗浄後、下記の操作を行い核抽出物を得る。
▲１▼1mlの氷温低浸透圧溶解バッファーにスクレーパーで回収する。バッファーは、pH7.4で10mMのHEPES、10mMのKCl、1.5mMのジチオスレイトール、E-64含有プロテアーゼ阻害剤混合物、ロイペプチン、ペプスタチンA、ベスタチン、アプロチニンを含む。
▲２▼15分後、氷温でインキュベートし、0.05%NP-40を添加する。その後、4℃で1分間、1000gで遠心分離する。
▲３▼核ペレットが集められ、100μlの高浸透圧抽出バッファー中に再混濁される。バッファーは、pH7.4で20mMのHEPES、0.4mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、10%のグリセロール、0.5mMのジチオスレイトール、E-64含有プロテアーゼ阻害混合剤、ロイペプチン、ペプスタチンA、ベスタチン、アプロチニンを含む。
▲４▼15分後、氷温でインキュベートし、4℃で1分間、1000gで遠心分離する。
▲５▼上澄みを核抽出物として得、タンパク質定量キットを用いて核抽出物の含有タンパク量を定量する。核抽出物はスモールスケールで分注して-80℃以下で保存する。
【００６０】
＜Poly dI-dCコポリマーの調整＞
二本鎖DNA20に目標タンパク質以外の物質が付着しないように、核抽出物にコポリマーを加える。コポリマーとしてPoly dI-dC（Sigma製 P-4929）を用いる。コポリマーを以下のように調整する。
▲１▼再生バッファーにコポリマーを10mg/mlの濃度になるように混濁し、1.5ml容量のマイクロ遠心チューブに入れる。再生バッファーは、50mMのNaCl、pH8.0で10mMのTris-HCl、pH8.0で1mMのEDTAを含む。
▲２▼コポリマーを超音波セッティング４で20秒間超音波処理し、均一な長さにする。
▲３▼コポリマーを90℃で10分間熱した後、室温までゆっくり冷却する。
▲４▼5μlずつ分注して-20℃で保存する。
▲５▼使用前に45μlの蒸留水を加えて、1mg/mlの濃度にする。
【００６１】
実験３−１．AP-1結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出物濃度を段階的に変えて実験。
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、34℃で1時間反応後、FCS測定して並進拡散時間を求める。FCS測定は各反応後に、波長543nm、出力100μWのレーザー光を1回に15秒照射する条件で5回行った。
【００６２】
【表１９】
【００６３】
0ngの細胞核抽出物を用いた反応では、DNA結合タンパク質は添加されていないのでDNA-タンパク複合体は存在せず、二本鎖DNA２０は未反応のままである。反応後の生成物は二本鎖DNA２０に細胞核抽出物中に含まれるDNA結合タンパク質が結合したものである。未反応の二本鎖DNA２０および細胞核抽出物が各濃度のときの生成物について、FCS測定の結果を表２０に示す。
【００６４】
【表２０】
【００６５】
細胞核抽出物の濃度の増加と共に、生成物の並進拡散時間が増加し、細胞核抽出物の濃度が30μgで最大となる濃度依存性が認められた。(図１２参照)
また、二本鎖DNA２０に転写因子AP-1がc-Jun/c-Junのホモダイマーで結合してDNA−タンパク複合体が構成されていると仮定した場合、分子量の3乗根と並進拡散時間は比例するからDNA−タンパク複合体の分子量から求めて、DNA−タンパク複合体の並進拡散時間が1113.0μsとなる。並進拡散時間が1113.0μsである反応生成物の存在割合と並進拡散時間が658.5μsである未反応の二本鎖DNA２０の存在割合との合計が略100%である。従って、この実験での反応生成物は細胞核抽出物中の転写因子AP-1が二本鎖DNA２０に結合したものであると言える。(図１３参照)
【００６６】
実験３−２．NF-κB結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出物濃度を段階的に変えて実験。
DNAとして、図７に示す二本鎖ＤＮＡ３０を用いる。二本鎖ＤＮＡ３０は、5’末端に蛍光標識４(TAMRAラベル)を有するオリゴＤＮＡ３１と、オリゴＤＮＡ３１に相補的な核酸配列を持つオリゴＤＮＡ３２とからなる。二本鎖ＤＮＡ３０は転写因子NF-κBの結合する結合サイト３３であるＧＧＧＧＣＴＴＴ配列(相補配列はＣＣＣＣＴＧＡＡＡ配列)を有する。
二本鎖ＤＮＡ３０は100nMのオリゴＤＮＡ３１(蛍光標識)と100nMのオリゴＤＮＡ３２を用いて、二本鎖ＤＮＡ２０と同様にして作成する（実施例２を参照）。以下のものを用いて、実験３−１と同様に結合反応実験を行い、反応生成物をFCS測定して並進拡散時間を求める。
【００６７】
【表２１】
【００６８】
【表２２】
【００６９】
実験３−１の場合と同様に、濃度0μgの細胞核抽出物を用いた反応では、DNA結合タンパク質は添加されていないのでDNA-タンパク複合体は存在せず、二本鎖DNA３０は未反応のままである。反応後の生成物は二本鎖DNA３０に細胞核抽出物中に含まれるDNA結合タンパク質が結合したものである。未反応の二本鎖DNA３０および細胞核抽出物が各濃度のときの生成物について、FCS測定の結果を表２３に示す。
【００７０】
【表２３】
【００７１】
本実験でも、実験３−１の場合と同様に、細胞核抽出物の濃度の増加と共に、生成物の並進拡散時間が増加し、細胞核抽出物の濃度が30μgで最大となり、濃度依存性が認められた。(図１４参照)
また、反応生成物が二本鎖DNA３０と転写因子NF-κBとの結合生成物で、*p50/p50による結合とp50/p65による結合が平均的に存在していると仮定した場合、反応生成物の並進拡散時間が1468.7μsとなる。並進拡散時間が1468.7μsである反応生成物の存在割合と並進拡散時間が568.7μsである未反応の二本鎖DNA３０の存在割合を図１５に示す。各存在割の合計は略100%である。従って、この実験での反応生成物は細胞核抽出物中の転写因子NF-κBが二本鎖DNA３０に結合したものであると言える。
【００７２】
細胞核抽出物に転写因子が含まれるか検出する場合、実施例２で説明したのと同様に、転写因子が結合する結合サイトを有し、かつ蛍光標識をラベルされた二本鎖DNAを含む溶液に、細胞核抽出物を段階的に添加して生成物をFCS測定し、並進拡散時間を求めることにより、転写因子の存在を検出することができる。また、FCS測定結果、DNA-タンパク複合体の分子量および未反応二本鎖DNAの分子量から、DNA-タンパク複合体と未反応二本鎖DNAとのおおよその存在比を検出することができる。
細胞核抽出物に転写因子AP-1が含まれるか検出する場合には、二本鎖DNAとして転写因子AP-1が結合する結合サイト２６を有しかつ蛍光標識をラベルされた二本鎖DNA２０を、細胞核抽出物に転写因子NF-κBが含まれるか検出する場合には、二本鎖DNAとして転写因子NF-κBが結合する結合サイト３３を有しかつ蛍光標識をラベルされた二本鎖DNA３０を用いる。細胞核抽出物の添加量が増加すると共に並進拡散時間が大きくなり、最大値を取った後に並進拡散時間が減少すれば、転写因子が細胞核抽出物中に含まれることになる。
【００７３】
（実施例４）
本実施例ではＤＮＡと細胞核抽出物中の転写因子AP-1との結合反応を、競合DNAを添加した競合アッセイを行うことによって検出する。
【００７４】
実験４−１．AP-1結合配列を持つ二本鎖DNA(未標識)を添加した場合のAP-1結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖DNA(未標識)濃度を段階的に変えて実験。
配列が二本鎖DNA２０と同じであるが蛍光標識されていない二本鎖DNA２４を添加する二本鎖DNAとして用いる。細胞核抽出物の濃度は、実験３−１で十分に結合反応が生じていた30μgとする。
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、34℃で1時間反応後、FCS測定して並進拡散時間を求める。FCS測定は各反応後に、波長543nm、出力100μWのレーザー光を1回に15秒照射する条件で5回行った。
【００７５】
【表２４】
【００７６】
実験４−２．AP-1結合配列と一部異なる配列を持つ二本鎖DNA(未標識)を添加した場合のAP-1結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖DNA(未標識)濃度を段階的に変えて実験。
配列が二本鎖DNA２０と一部異なっていて蛍光標識されていない二本鎖DNA２５を添加する二本鎖DNAとして用いる。二本鎖DNA２５は二本鎖DNA２０の結合サイト２６部分が2塩基だけ異なっている配列である（図６参照）。二本鎖DNA２５を用いて実験４−１と同様に実験を行った。
【００７７】
実験４−３．AP-1結合配列を持たない二本鎖DNA(未標識)を添加した場合のAP-1結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖DNA(未標識)濃度を段階的に変えて実験。
配列がAP-1結合配列を持たない二本鎖大腸菌由来ランダム配列で、未標識の二本鎖DNA１８を添加する二本鎖DNAとして用いる。二本鎖DNA１８を用いて実験４−１と同様に実験を行った。
【００７８】
図１６に実験４−１から４−３の結果を示す。実験４−１の結果から、蛍光標識で確認できる生成物すなわち二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物中のDNA結合タンパク質とが結合してできたDNA-タンパク複合体の並進拡散時間は、未反応の二本鎖ＤＮＡ２０の並進拡散時間と比較して大きな伸びは無かった。従って、二本鎖ＤＮＡ２４を添加することにより、二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物中の転写因子AP-1５との結合が阻害されることが確認できた。
また、実験４−２の結果から、二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物との結合生成物の並進拡散時間は、二本鎖DNA２５を添加した場合と競合DNAが含まれていない場合とで略同程度である。従って、二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物中の転写因子AP-1５との反応について、二本鎖ＤＮＡ２０と2塩基しか差がない二本鎖DNA２５による結合阻害は認められなかった。
また、実験４−３の結果から、二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物との結合生成物の並進拡散時間は、二本鎖ＤＮＡ１８を添加した場合と競合DNAが含まれていない場合とで略同程度である。従って、二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物中の転写因子AP-1５との反応について、二本鎖ＤＮＡ１８による結合阻害は認められなかった。
以上の実験４−１から４−３で行われた競合アッセイの結果から、細胞核抽出物中の転写因子AP-1は、細胞核抽出物に含まれるＤＮＡの特異的な配列に結合することが証明された。
【００７９】
（実施例５）
本実施例ではＤＮＡと細胞核抽出物中の転写因子NF-κBとの結合反応を、競合DNAを添加した競合アッセイを行うことによって検出する。
【００８０】
実験５−１．NF-κB結合配列を持つ二本鎖DNA(未標識)を添加した場合のNF-κB結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖DNA(未標識)濃度を段階的に変えて実験。
配列が二本鎖ＤＮＡ３０と同じであるが蛍光標識されていない二本鎖DNA３４を添加する二本鎖DNAとして用いる。細胞核抽出物の濃度は、実験３−１で十分に結合反応が生じていた30μgとする。
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、34℃で1時間反応後、FCS測定して並進拡散時間を求める。FCS測定は各反応後に、波長543nm、出力100μWのレーザー光を1回に15秒照射する条件で5回行った。
【００８１】
【表２５】
【００８２】
実験５−２．NF-κB結合配列と一部異なる配列を持つ二本鎖DNA(未標識)を添加した場合のNF-κB結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖DNA(未標識)濃度を段階的に変えて実験。
配列が二本鎖DNA３０と一部異なり蛍光標識されていない二本鎖DNA３５を添加する二本鎖DNAとして用いる。二本鎖ＤＮＡ３５は二本鎖DNA３０の結合サイト３３部分が１塩基だけ異なっている配列である（図７参照）。二本鎖ＤＮＡ３５を用いて実験５−１と同様に実験を行った。
【００８３】
実験５−３．NF-κB結合配列を持たない二本鎖DNA(未標識)を添加した場合のNF-κB結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖DNA(未標識)濃度を段階的に変えて実験。
配列がNF-κB結合配列を持たない二本鎖大腸菌由来ランダム配列で、蛍光標識されていない二本鎖DNA１８を添加する二本鎖DNAとして用いる。二本鎖DNA１８を用いて実験５−１と同様に実験を行った。
【００８４】
図１７に実験５−１から５−３の結果を示す。実験５−１の結果から、蛍光標識で確認できる生成物すなわち二本鎖ＤＮＡ３０と細胞核抽出物中のDNA結合タンパク質とが結合してできたDNA-タンパク複合体の並進拡散時間は、未反応の二本鎖ＤＮＡ３０の並進拡散時間と比較して大きな伸びは無かった。従って、競合二本鎖ＤＮＡ３４を添加することにより、二本鎖ＤＮＡ３０と細胞核抽出物中の転写因子AP-1５との結合が阻害されることが確認できた。
また、実験５−２の結果から、二本鎖ＤＮＡ３０と細胞核抽出物との結合生成物の並進拡散時間は、二本鎖ＤＮＡ３５を添加した場合と何も加えない場合とで略同程度である。従って、二本鎖ＤＮＡ３５と細胞核抽出物中の転写因子NF-κBとの反応について、二本鎖ＤＮＡ３０と1塩基しか差がない二本鎖ＤＮＡ３５による結合阻害は認められなかった。
また、実験５−３の結果から、二本鎖ＤＮＡ３０と細胞核抽出物との結合生成物の並進拡散時間は、二本鎖ＤＮＡ１８を添加した場合と競合DNAが含まれていない場合とで略同程度である。従って、二本鎖ＤＮＡ３０と細胞核抽出物中の転写因子NF-κBとの反応について、二本鎖ＤＮＡ１８による結合阻害は認められなかった。
以上の実験５−１から５−３で行われた競合アッセイの結果から、細胞核抽出物中の転写因子NF-κBは、細胞核抽出物に含まれるＤＮＡの特異的な配列に結合することが証明された。
【００８５】
（実施例６）
本実施例では、細胞核内の転写因子の活性化について、細胞核抽出の際の腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激依存を検出する。具体的には、腫瘍壊死因子TNF-αを用いてHeLa細胞を刺激し、時間経過による細胞核内の転写因子AP-1および転写因子NF-κBについて活性化の程度を検出する。HeLa細胞をPMA（phorbol 12-myristate 13-acetate、フォルボール12-ミリスチン酸13-酢酸）やサイトカインなどで刺激していない状態でも、ある程度の活性を有する転写因子AP-1および転写因子NF-κBがHeLa細胞の核内に存在することが知られている。
【００８６】
実験６−１．AP-1結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出の際の腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激時間が異なる細胞核抽出物を用いて実験。
50ng/mlの腫瘍壊死因子TNF-αを添加して、0,15,30,60,120,180分間刺激した各HeLa細胞から核抽出物を生成した。（生成方法は実施例３を参照）核抽出物の濃度は20μgとした。
以下のものを用いて、実験３−１と同様に結合反応実験を行う。
【００８７】
【表２６】
【００８８】
図１８に刺激時間に対する生成物の並進拡散時間を示す。二本鎖DNA２０(標識済み)と腫瘍壊死因子TNF-αで30分間刺激した細胞核抽出物との結合反応物の並進拡散時間が最も大きく、実験３−１における核抽出物濃度が20μgのときの反応物の並進拡散時間とほぼ同等の値である。従って、30分の刺激時間で細胞核抽出物中の転写因子AP-1が十分に活性化されたと言える。
【００８９】
実験６−２．NF-κB結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出の際の腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激時間が異なる細胞核抽出物を用いて実験。
実験６−１と同様に、50ng/mlの腫瘍壊死因子TNF-αを添加して、0,15,30,60,120,180分間刺激した各HeLa細胞から核抽出物を生成した。
以下のものを用いて、実験３−２と同様に結合反応実験を行う。
【００９０】
【表２７】
【００９１】
図１９に刺激時間に対する生成物の並進拡散時間を示す。二本鎖DNA３０(標識済み)と腫瘍壊死因子TNF-αで15分間刺激した細胞核抽出物との結合反応物の並進拡散時間が最も大きく、実験３−２における核抽出物濃度が20μgのときの反応物の並進拡散時間とほぼ同等の値である。従って、15分の刺激時間で細胞核抽出物中の転写因子NF-κBが十分に活性化されたと言える。
【００９２】
細胞核抽出物に転写因子AP-1が含まれるか検出する場合、50ng/mlの腫瘍壊死因子TNF-αを細胞に添加して30分間刺激してから細胞核抽出を行い、この細胞核抽出物と二本鎖DNA２０とを結合反応させ、FCS測定し、並進拡散時間を求めることにより、転写因子の存在を検出することができる。また、細胞核抽出物に転写因子NF-κBが含まれるか検出する場合には、50ng/mlの腫瘍壊死因子TNF-αを細胞に添加して15分間刺激するとよい。
【００９３】
（実施例７）
本実施例では、細胞核内の転写因子の活性化について、細胞核抽出の際のAPDC(Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate)および腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激依存を検出する。具体的には、APDCおよび腫瘍壊死因子TNF-αを用いてHeLa細胞を刺激し、細胞核内の転写因子AP-1および転写因子NF-κBについて活性化の程度を検出する。APDCは、転写因子AP-1の活性化を促進する一方で、転写因子NF-κBの活性化を抑制すると言われている。
APDCを添加した2時間後に、腫瘍壊死因子TNF-αを添加して30分間刺激したHeLa細胞から核抽出物を生成する。核抽出物の濃度が5,10,20μgであるものを用意する。細胞への刺激は次の2つの場合で行う。
(i)腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激だけを30分間行う場合。腫瘍壊死因子TNF-αの濃度は0,10,25,50ng/mlである。
(ii)APDCを添加した2時間後に腫瘍壊死因子TNF-αを添加して30分間刺激した場合。50ng/mlの腫瘍壊死因子TNF-αに対し、APDCの濃度は10,100,200μMである。
【００９４】
実験７−１．AP-1結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出の際の腫瘍壊死因子TNF-α添加濃度およびAPDC添加濃度が異なる細胞核抽出物を用いて実験。
次のものを用いて、実験３−１と同様に結合反応実験を行う。
【００９５】
【表２８】
【００９６】
図２０に各刺激条件に対する生成物の並進拡散時間を示す。生成物の並進拡散時間は腫瘍壊死因子TNF-αの濃度およびAPDCの量による刺激依存が見られた。特に、APDCによる刺激と腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激との両方の刺激を行った場合で、50ng/mlの腫瘍壊死因子TNF-αに対し、APDCの濃度が100μMおよび200μMであるときに生成物の並進拡散時間が大きい。従って、これらの濃度の組み合わせのときに、細胞核抽出物中の転写因子AP-1が最も活性化されたと言える。
【００９７】
実験７−２．NF-κB結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出の際の腫瘍壊死因子TNF-α添加濃度およびAPDC添加濃度が異なる細胞核抽出物を用いて実験。
次のものを用いて、実験３−２と同様に結合反応実験を行う。
【００９８】
【表２９】
【００９９】
図２１に各刺激条件に対する生成物の並進拡散時間を示す。生成物の並進拡散時間は腫瘍壊死因子TNF-αの濃度およびAPDCの量による刺激依存が見られた。特に、腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激のみを行った場合で、腫瘍壊死因子TNF-αの濃度が50ng/mlであるときに生成物の並進拡散時間が大きく、このとき細胞核抽出物中の転写因子NF-κBが最も活性化されたと言える。
実験７−１および７−２の結果から、APDCは腫瘍壊死因子TNF-αによる転写因子AP-1の活性化を促進し、転写因子NF-κBの活性化を抑制することが証明された。
【０１００】
細胞核抽出物に転写因子AP-1が含まれるか検出する場合、APDCを添加した2時間後に腫瘍壊死因子TNF-αを添加して30分間刺激してから細胞核抽出を行い、この細胞核抽出物と二本鎖DNA２０とを結合反応させ、FCS測定し、並進拡散時間を求めることにより、転写因子の存在を検出することができる。50ng/mlの腫瘍壊死因子TNF-αに対し、APDCの濃度を100μM以上200μM以下であるとよい。
また、細胞核抽出物に転写因子NF-κBが含まれるか検出する場合には、腫瘍壊死因子TNF-αのみで刺激を行った場合の並進拡散時間と、APDCおよび腫瘍壊死因子TNF-αの刺激を行った場合の並進拡散時間とを比較することによって、精度良く転写因子NF-κBを検出することができる。腫瘍壊死因子TNF-αのみで刺激を行った場合に並進拡散時間が大きければ細胞核抽出物に転写因子NF-κBが含まれると言える。
【０１０１】
上述した各実施例で示したように、試料の混合と蛍光相関分光法(FCS)による計測により、並進拡散時間を求めるための情報が得られ、放射性同位元素の利用や電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などの煩雑な操作を行わずに、検出結果を簡便に短時間で得ることができる。また、精製していない細胞核抽出物のようなクルード(crude)な試料を用いても、二本鎖DNAと転写因子とのDNA-タンパク複合体が精度良く検出できる。また、転写因子が結合する本来の二本鎖DNAと1塩基またな2塩基しか違いのない二本鎖DNAを添加しても、本来の二本鎖DNAと転写因子との結合反応が妨げられずにDNA-タンパク複合体が検出できるので、FCSによるこれらの測定方法は、細胞核抽出物などのクルードなサンプル中に存在する特定のDNA結合タンパク質（転写因子、核内レセプターなど）を検出するのに有用である。また、サイトカインの刺激による転写因子の時間経過による発現量、APDCの効果も精度良く検出できる。
【０１０２】
上述した各実施例では、生成物の並進拡散時間を求めるために蛍光相関分光法(FCS)を用いたが、蛍光相関分光法(FCS)の代わりに、蛍光強度分布解析法（Fluorescence Intensity Multiple Distribution Analysis）を用いてもよい。
【０１０３】
【発明の効果】
本発明によれば、溶液の混合と蛍光相関分光法による計測により並進拡散時間を求めるための情報が得られ、放射性同位元素の利用や電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などの煩雑な操作を行わずに、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との反応を簡便に短時間で得ることができる。
また、本発明によれば、精製していない細胞核抽出物のようなクルード(crude)な試料を用いても、二本鎖DNAと転写因子との結合反応が精度良く検出できる。また、転写因子が結合する本来の二本鎖DNAと1塩基またな2塩基しか違いのない二本鎖DNAを添加しても、本来の二本鎖DNAと転写因子との結合反応が妨げられずに反応生成物が検出できるので、FCSによるこれらの測定方法は、細胞核抽出物などのクルードなサンプル中に存在する特定のDNA結合タンパク質（転写因子、核内レセプターなど）を検出するのに有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実験１−１の手順と生成物の概要を示す図。
【図２】実験２−１の手順と生成物の概要を示す図。
【図３】実験２−２の手順と生成物の概要を示す図。
【図４】実験２−３の手順と生成物の概要を示す図。
【図５】各実験で用いるＤＮＡを示す図。
【図６】各実験で用いるＤＮＡを示す図。
【図７】実施例２の対物レンズ１１付近を示す図。
【図８】実験１−１および１−２での各反応後の生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図９】実験２−１での転写因子AP-1濃度に対する生成物の並進拡散時間のグラフ。
【図１０】実験２−１での転写因子AP-1濃度に対する未反応物(K1)と反応生成物(K2)との存在比を示すグラフ。
【図１１】実験２−２での二本鎖DNA(未標識)濃度に対する生成物の並進拡散時間、およびAP-1結合配列を持たないＤＮＡ(未標識)濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１２】実験３−１での細胞核抽出物濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１３】実験３−１での細胞核抽出物濃度に対する未反応物および生成物の存在比を示すグラフ。
【図１４】実験３−２での細胞核抽出物濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１５】実験３−２での細胞核抽出物濃度に対する未反応物および生成物の存在比を示すグラフ。
【図１６】実験４−１から４−３での各二本鎖DNA(未標識)濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１７】実験５−１から５−３での各二本鎖DNA(未標識)濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１８】実験６−１での刺激時間に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１９】実験６−２での刺激時間に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図２０】実験７−１でのTNF-α添加濃度およびAPDC添加濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図２１】実験７−２でのTNF-α添加濃度およびAPDC添加濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【符号の説明】
１…転写因子TFIID、２…転写因子TFIIB、３…抗TFIIB抗体、４…蛍光標識、５…転写因子AP-1、１０…二本鎖ＤＮＡ、１１…オリゴＤＮＡ、１２…オリゴＤＮＡ、１６…結合サイト、１７…二本鎖ＤＮＡ、１８…二本鎖ＤＮＡ、２０…二本鎖ＤＮＡ、２１…オリゴＤＮＡ、２２…オリゴＤＮＡ、２４…二本鎖ＤＮＡ、２５…二本鎖ＤＮＡ、２６…結合サイト、２６’…２塩基異なる結合サイト、３０…二本鎖ＤＮＡ、３１…オリゴＤＮＡ、３２…オリゴＤＮＡ、３３…結合サイト、３３’…１塩基異なる結合サイト、３４…二本鎖ＤＮＡ、３５…二本鎖ＤＮＡ。
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との反応を検出する方法に関し、特に蛍光相関分光計(fluorescence correlation spectroscopy：FCS)を用いた検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
特許文献１（特許第3169610号公報）は、二本鎖DNA中の選択されたテスト配列に結合し得る分子をスクリーニングする方法を記載する。
特許文献２（特許第2953783号公報）は、遺伝子転写レベルで活性な医薬の有効な同定方法を記載する。
特許文献３（特開2001-321199号公報）は、生物学的資料中のDNA結合タンパク質を定量する方法を記載する。
特許文献４（特開2003-88369号公報）は、蛍光相関分光法(FCS)を利用してDNAエンドヌクレアーゼ活性を検出する方法、および分子量の大小と並進拡散時間(translational diffusion time)の大小との関係を記載する。特許文献５（特表2002-543414号公報）は、試料中の蛍光分子又は他の粒子を特徴付ける方法、および蛍光強度多重(multiple)分布分析(FIMDA)および蛍光自己たたみ込み(autoconvoluted)強度分布分析(FACID)から並進拡散時間が得られることを記載する。
【０００３】
【特許文献１】
特許第3169610号公報
【特許文献２】
特許第2953783号公報
【特許文献３】
特開2001-321199号公報
【特許文献４】
特開2003-88369号公報
【特許文献５】
特表2002-543414号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来技術のうち、特許文献２（特許第2953783号公報）、特許文献３（特開2001-321199号公報）および特許文献４（特開2003-88369号公報）に記載される各検出方法は、特定の配列、または特定の配列を有する分子を検出する際に、放射性同位元素を用いたり、電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などを行うので、操作が煩雑で検出結果を得るまでに時間がかかる問題がある。
特許文献４（特開2003-88369号公報）および特許文献５（特表2002-543414号公報）は、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との反応を検出する方法については記載しない。
【０００５】
本発明の目的は、簡便にかつ短時間で、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との反応を検出する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する本発明の特徴は、蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを含む溶液および転写因子TFIIDを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。本発明によれば、溶液の混合と蛍光相関分光法による計測により並進拡散時間を求めるための情報が得られ、放射性同位元素の利用や電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などの煩雑な操作を行わずに、二本鎖ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質である転写因子TFIIDとの反応を簡便に短時間で得ることができる。
また、サンプル中の二本鎖ＤＮＡの濃度が２ｎＭ〜５ｎＭである溶液を用いて各実験を行うと、FCS測定の際にコンフォーカルボリュームにおける粒子数は２〜５となり、精度よくFCS測定が行え、二本鎖DNAとDNA結合タンパク質との結合反応が精度良く検出できる。特に、コンフォーカルボリュームにおける粒子数が２〜３でも精度良い検出ができるので、多量の二本鎖ＤＮＡやＤＮＡ結合タンパク質を用意できない場合や、少量のサンプルだけで検出結果を得たい場合にも、本発明の検出方法は適している。
【０００７】
本発明の他の特徴は、蛍光標識を付加された二本鎖ＤＮＡを含む溶液、転写因子TFIIDおよび転写因子TFIIBを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにあり、転写因子TFIIBを加えることによって、反応物の並進拡散時間が大きくなるので、結合がより精度良く検出できる。また、さらに抗TFIIB抗体を加えることによって、反応物の並進拡散時間がさらに大きくなるので、結合がより精度良く検出できる。
二本鎖ＤＮＡに転写因子FTIIDが結合する配列が含まれているか検出する場合は、二本鎖ＤＮＡに蛍光標識を付加して請求項１から３の方法を行い、結合が検出されれば二本鎖ＤＮＡに転写因子FTIIDが結合する配列が含まれることになる。
また、溶液中に転写因子FTIIDが含まれているか検出する場合は、この溶液と、転写因子FTIIDが結合する配列を有しかつ蛍光標識された二本鎖DNAとを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求める。このとき、転写因子TFIIBを添加するか、または、転写因子TFIIBおよび抗TFIIB抗体を添加することにより、転写因子TFIIDの存在を精度良く検出することができる。
【０００８】
本発明の他の特徴は、検出の対象である溶液と転写因子AP-1が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを含む溶液とを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。この特徴によれば、溶液の混合と蛍光相関分光法による計測により並進拡散時間を求めるための情報が得られ、放射性同位元素の利用や電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などの煩雑な操作を行わずに、二本鎖ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質である転写因子AP-1との反応を簡便に短時間で得ることができる。
【０００９】
本発明の他の特徴は、検出の対象である二本鎖ＤＮＡを含む溶液、転写因子AP-1、および転写因子AP-1が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。
この特徴によれば、溶液の混合と蛍光相関分光法による計測により並進拡散時間を求めるための情報が得られ、放射性同位元素の利用や電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などの煩雑な操作を行わずに、二本鎖ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質である転写因子AP-1との反応を簡便に短時間で得ることができる。
【００１０】
本発明の他の特徴は、検出の対象である溶液と転写因子が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとを混合する際に、検出の対象である溶液の量を段階的に増加して、各段階で蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。細胞核抽出物中の転写因子AP-1を検出する場合は、蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとして転写因子AP-1が結合する結合サイトを有する二本鎖ＤＮＡを用い、細胞核抽出物の溶液の量を段階的に増加して混合する。細胞核抽出物中の転写因子NF-κBを検出する場合は、蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとして転写因子NF-κBが結合する結合サイトを有する二本鎖ＤＮＡを用い、細胞核抽出物の溶液の量を段階的に増加して混合する。
【００１１】
本発明の他の特徴は、細胞に腫瘍壊死因子TNF-αを添加してから細胞核抽出を行い、この細胞核抽出物と蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。HeLa細胞の核抽出物中の転写因子AP-1を検出する場合は濃度50ng/mlの腫瘍壊死因子TNF-αで30分間刺激し、HeLa細胞の核抽出物中の転写因子AP-1を検出する場合は15分間刺激するとよい。腫瘍壊死因子TNF-αの刺激によって細胞核抽出物中の転写因子が活性化し、二本鎖DNAとの結合がしやすくなるので、精度良く転写因子を検出することができる。
【００１２】
本発明の他の特徴は、細胞にAPDCを添加した後に腫瘍壊死因子TNF-αを添加してから細胞核抽出を行い、この細胞核抽出物と転写因子AP-1が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖DNAとを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。本発明によれば、細胞核抽出の際にAPDCおよび腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激を行うことによって、転写因子AP-1が活性化し二本鎖DNAとの結合がしやすくなるので、精度良く転写因子AP-1を検出することができる。APDCによる刺激時間は2時間、腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激時間は30分間であるとよい。
【００１３】
本発明の他の特徴は、細胞の核抽出物中の転写因子NF-κBと、転写因子NF-κBが結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとの反応生成物の並進拡散時間から細胞の核抽出物中の転写因子NF-κBを検出するにあたって、細胞に腫瘍壊死因子TNF-αのみで刺激を行った場合の反応生成物の並進拡散時間と、APDC(Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate)および腫瘍壊死因子TNF-αの刺激を行った場合の反応生成物の並進拡散時間とを比較することにある。腫瘍壊死因子TNF-αは転写因子NF-κBを活性化し、APDCは転写因子NF-κBの活性化を抑制するので、腫瘍壊死因子TNF-αのみで刺激を行った場合に並進拡散時間が大きければ、細胞核抽出物に転写因子NF-κBが含まれると言え、精度良く転写因子NF-κBを検出することができる。
【００１４】
また、FCS測定の際にコンフォーカルボリュームにおける粒子数は２〜５であれば、精度よくFCS測定が行え、二本鎖DNAとDNA結合タンパク質との結合反応が精度良く検出できる。特に、コンフォーカルボリュームにおける粒子数が２〜３でも精度良い検出ができるので、多量の二本鎖ＤＮＡやＤＮＡ結合タンパク質を用意できない場合や、少量のサンプルだけで検出結果を得たい場合にも、本発明の検出方法は適している。
また、本発明によれば、精製していない細胞核抽出物のようなクルード(crude)な試料を用いても、二本鎖DNAと転写因子との結合反応が精度良く検出できる。また、転写因子が結合する本来の二本鎖DNAと1塩基またな2塩基しか違いのない二本鎖DNAを添加しても、本来の二本鎖DNAと転写因子との結合反応が妨げられずに反応生成物が検出できるので、FCSによるこれらの測定方法は、細胞核抽出物などのクルードなサンプル中に存在する特定のDNA結合タンパク質（転写因子、核内レセプターなど）を検出するのに有用である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の様態では、DNAとDNA中の特定配列部分に結合するタンパク質(以下DNA結合タンパク質と呼ぶ)との結合を検出するための様々な実験を行う。実験の目的別に実施例として説明する。実験では生体分子の反応過程後にＦＣＳ測定を行って、生体分子の並進拡散時間を求める。
並進拡散時間の大小は分子量の大小を示すので、反応の前後で並進拡散時間を比較することにより、分子量の増加または減少がわかる。分子量の増加は生体分子間の結合反応を、分子量の減少は生体分子の分解反応を、分子量の維持は生体分子に結合も分解も無かったことを示す。
従って、DNAとDNA結合タンパク質との反応の前後でDNAの並進拡散時間の増加を検出することにより、DNAとDNA結合タンパク質との結合反応を検出することができる。
【００１６】
【実施例】
各実施例の実験内容と実験結果の概要を表１〜４に示し、後に各実施例を説明する。
【００１７】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
（実施例１）
本実施例ではＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質である転写因子TFIIDおよび転写因子TFIIBとの結合反応を検出する。
DNAとして、図５に示す二本鎖ＤＮＡ１０を用いる。二本鎖ＤＮＡ１０は、5’末端に蛍光標識４(TAMRAラベル)をラベル済みのオリゴＤＮＡ１１と、オリゴＤＮＡ１１に相補的な拡散配列を持つオリゴＤＮＡ１２とからなる。二本鎖ＤＮＡ１０は転写因子TFIIDおよび転写因子TFIIBの結合する結合サイト１６であるＴＡＴＡＡ配列(相補配列はＡＴＡＴＴ配列)を有する。
DNA結合タンパク質として、TBP(TATA binding protein、TATA結合タンパク質)を含む転写因子TFIID１、および転写因子TFIIB２を用いる。さらに、転写因子TFIIB２に結合する抗体として抗TFIIB抗体３を用いる。
転写因子TFIID１、転写因子TFIIB２および抗TFIIB抗体３として以下のものを用いる。
【００２２】
【表５】
＜二本鎖ＤＮＡ１０の作成と調整＞
まず、検出実験に用いる二本鎖ＤＮＡ１０を準備する。二本鎖ＤＮＡ１０を準備するために以下のものを用いる。
【００２４】
【表６】
STEバッファー中でオリゴＤＮＡ１１およびオリゴＤＮＡ１２を反応させ、95℃で5分間加熱した後、20℃までゆっくり冷却する。次いで、PCR機器内または室温放置でアニーリングする。アニーリングした反応液にエキソヌクレアーゼＩおよびMgCl2を添加し、37℃で1時間反応させる。添加量は反応液100μlに対してそれぞれ1μlである。その後、反応液を精製キットMERmaid SPIN(BIO社 101)によって精製し、オリゴＤＮＡ１１とオリゴＤＮＡ１２とからなる二本鎖DNA１０をdWで抽出する。
抽出した二本鎖DNA１０を蛍光相関分光法(FCS)で測定し、粒子数(n)が20程度になるようにdWで希釈し、二本鎖DNA１０の溶液を作る（溶液中の二本鎖DNA１０の濃度は２ｎＭ〜５ｎＭとなる）。粒子数(n)が20程度の二本鎖DNAの溶液を用いて各実験を行うと、FCS測定の際にコンフォーカルボリュームにおける粒子数は２〜５となり、精度よくFCS測定が行え、二本鎖DNAとDNA結合タンパク質との結合反応が精度良く検出できる。
【００２６】
実験１−１．TFIID結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と転写因子TFIID、転写因子TFIIBおよび抗TFIIB抗体の反応実験
図１に実験１−１の手順と生成物の概略を示す。FCS測定は各反応後に、波長543nm、出力100μWのレーザー光を1回に15秒照射する条件で5回行った。
【００２７】
(1)未反応の二本鎖DNA１０のＦＣＳ測定
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、室温を30分間静置した後、FCS測定して並進拡散時間を求める。
【００２８】
【表７】
【表８】
【表９】
DNA結合タンパク質は添加されていないのでDNA-タンパク複合体は形成せず、二本鎖DNA１０は未反応のままである。
【００３２】
(2)二本鎖DNA１０と転写因子TFIID１との反応
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、室温を30分間静置した後、FCS測定して並進拡散時間を求める。転写因子TFIIDは予めTFIID用バッファーで25ng/μlに調整しておく。
【００３３】
【表１０】
生成物は二本鎖DNA１０の結合サイト１６に転写因子TFIID１が結合したDNA-タンパク複合体である。
【００３５】
(3)(2)の反応済み溶液と転写因子TFIIB２との反応
(2)の反応済み溶液20μlに、85ng/μlの転写因子TFIIB２を1μl加え、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、室温を20分間静置した後、FCS測定して並進拡散時間を求める。
生成物は二本鎖DNA１０の結合サイト１６に転写因子TFIID１と転写因子TFIIB２が結合したDNA-タンパク複合体である。
【００３６】
(4)(3)の反応済み溶液と抗TFIIB抗体３との反応
(3)の反応済み溶液20μlに、抗TFIIB抗体３を1μl加え、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、室温を20分間静置した後、FCS測定して並進拡散時間を求める。
生成物は二本鎖DNA１０の結合サイト１６に転写因子TFIID１と転写因子TFIIB２が結合し、さらに転写因子TFIIB２に抗TFIIB抗体３が結合したDNA-タンパク複合体である。
【００３７】
実験１−２．TFIID結合配列を持たないＤＮＡ(蛍光標識有り)と転写因子TFIID、転写因子TFIIBおよび抗TFIIB抗体の反応実験
二本鎖DNA10の代わりに、転写因子TFIIDと結合する結合サイト１６を含まない二本鎖大腸菌由来ランダム配列ＤＮＡ１７を用いて、実験１−１(1)〜(4)と同様の反応実験を行った。
【００３８】
図８に実験１−１および１−２での生成物の並進拡散時間を示す。二本鎖DNA１０を用いた実験１−１では、反応前の二本鎖DNA１０の並進拡散時間に比べて、各反応後のDNA-タンパク複合体の並進拡散時間が大きくなっており、二本鎖DNA１０と転写因子TFIID１、転写因子TFIIB２および抗TFIIB抗体３とが結合したことが確認できた。一方、二本鎖大腸菌由来ランダム配列ＤＮＡ１７を用いた実験１−２では、いずれも並進拡散時間の変化はほとんどなく、DNA結合タンパク質との結合は確認できなかった。特に、転写因子TFIID１、転写因子TFIIB２および抗TFIIB抗体３の3つのタンパク質すべてが結合したDNA-タンパク複合体の並進拡散時間は他のDNA-タンパク複合体の並進拡散時間よりも著しく大きい。
【００３９】
従って、転写因子TFIID１および転写因子TFIIB２の結合サイト１６が蛍光標識DNAに存在するか否か検出する場合には、転写因子TFIID１、転写因子TFIIB２および抗TFIIB抗体３のすべてをDNA溶液に添加し、DNA-タンパク複合体をFCS測定して並進拡散時間を求めることにより、結合サイト１６の存在を精度良く検出することができる。
また、DNA結合タンパク質の溶液に転写因子TFIID１が存在するか否か検出する場合には、結合サイト１６を有する蛍光標識二本鎖DNA１０とともに、転写因子TFIIB２および抗TFIIB抗体３を反応液に添加し、DNA-タンパク複合体をFCS測定して並進拡散時間を求めることにより、転写因子TFIID１の存在を精度良く検出することができる。
【００４０】
（実施例２）
本実施例ではＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質である転写因子AP-1との結合反応について、転写因子AP-1の濃度依存を検出する。
DNAとして、図６に示す二本鎖ＤＮＡ２０を用いる。二本鎖ＤＮＡ２０は、5’末端に蛍光標識４(TAMRAラベル)を有するオリゴＤＮＡ２１と、オリゴＤＮＡ２１に相補的な核酸配列を持つオリゴＤＮＡ２２とからなる。二本鎖ＤＮＡ２０は転写因子AP-1の結合する結合サイト２６であるＴＧＡＧＴＣＡ配列(相補配列はＡＣＴＣＡＧＴ配列)を有する。
DNA結合タンパク質として次の転写因子AP-1５を用いる。
【００４１】
【表１１】
＜二本鎖ＤＮＡ２０の作成と調整＞
まず、検出実験に用いる二本鎖ＤＮＡ２０を準備する。二本鎖ＤＮＡ２０を準備するために以下のものを用いる。
【００４３】
【表１２】
STEバッファー中でオリゴＤＮＡ２１およびオリゴＤＮＡ２２を反応させ、95℃で5分間加熱した後、20℃までゆっくり冷却する。次いで、PCR機器内または室温放置でアニーリングする。アニーリングした反応液にエキソヌクレアーゼＩおよびMgCl2を添加し、37℃で1時間反応させる。添加量は反応液100μlに対してそれぞれ1μlである。その後、反応液をMERmaid SPIN(BIO社 101)によって精製し、オリゴＤＮＡ２１とオリゴＤＮＡ２２とからなる二本鎖DNA２０をdWで抽出する。
抽出した二本鎖DNA２０を蛍光相関分光法(FCS)で測定し、粒子数(n)が20〜30程度になるようにdWで希釈し、二本鎖DNA２０の溶液を作る。
未標識の二本鎖DNA２４は、オリゴＤＮＡ２１(蛍光標識４をラベル済み)の代わりに同じ配列で蛍光標識していないオリゴＤＮＡを用いて、二本鎖DNA２０と同様にして作成・抽出する。抽出した二本鎖DNA２４を吸光度（OD260値）を測定し、OD260値が20となるようにdWで希釈し、二本鎖DNA２４の溶液を作る。
【００４５】
実験２−１．AP-1結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と転写因子AP-1との反応実験。濃度が異なる転写因子AP-1を添加して実験。
図２に実験２−１の手順と生成物の概略を示す。以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、34℃で1時間反応後、FCS測定して並進拡散時間を求める。FCS測定は各反応後に、波長543nm、出力100μWのレーザー光を1回に15秒照射する条件で5回行った。
【００４６】
【表１３】
【表１４】
濃度0ng/μlの転写因子AP-1５を用いた反応では、DNA結合タンパク質は添加されていないのでDNA-タンパク質複合体は存在せず、二本鎖DNA２０は未反応のままである(図２の(1)を参照)。反応後の生成物は二本鎖DNA２０の結合サイト２６に転写因子AP-1５が結合したものである(図２の(2)を参照)。未反応の二本鎖DNA２０と各転写因子AP-1５濃度のときの生成物について、FCS測定の結果を表１５に示す。
【００４９】
【表１５】
結転写因子AP-1の濃度が600ng/μlのときに生成物の並進拡散時間が大きく伸び、濃度依存性が認められた。転写因子AP-1の濃度が300ng/μlまでと比較して、600ng/μlから1500ng/μlまでの並進拡散時間との差は小さいので、二本鎖DNA２０と転写因子AP-1５との結合が600ng/μlで飽和に達していると言える(図９参照)。
また、並進拡散時間が432μsである未反応の二本鎖DNA２０(K1)と、並進拡散時間が862.4μsである生成物(K2)との存在比は、転写因子AP-1の濃度が600ng/μl以上でほぼ一定なので、濃度600ng/μlで十分に結合反応が生じており、そして飽和転写因子AP-1の濃度が1500ng/μlの場合には、一定濃度の二本鎖DNA２０に対する転写因子AP-1の結合が飽和状態にあると考えられる(図１０参照)。
【００５１】
実験２−２．AP-1結合配列を持つ二本鎖DNA(未標識)を添加した場合のAP-1結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と転写因子AP-1との反応実験。二本鎖DNA(未標識)濃度を段階的に変えて実験。
図３に実験２−２の手順と生成物の概略を示す。配列は二本鎖DNA20と同じであるが未標識二本鎖DNA２４を添加する二本鎖DNAとして用いる。転写因子AP-1５の濃度は、実験２−１で十分に結合反応が生じていた600ng/μｌとする。
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、34℃で1時間反応後、FCS測定して並進拡散時間を求める。FCS測定は各反応後に、波長543nm、出力100μWのレーザー光を1回に15秒照射する条件で5回行った。
【００５２】
【表１６】
実験２−３．AP-1結合配列を持たないＤＮＡ(未標識)と転写因子AP-1との反応実験。AP-1結合配列を持たないＤＮＡ(未標識)濃度を段階的に変えて実験
図４に実験２−３の手順と生成物の概略を示す。配列がAP-1結合配列を持たない二本鎖大腸菌由来ランダム配列で、蛍光標識されていない二本鎖DNA１８を添加する二本鎖DNAとして用いる。転写因子AP-1５の濃度は、実験２−１で十分に結合反応が生じている600ng/μｌとする。
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、34℃で1時間反応後、FCS測定して並進拡散時間を求める。FCS測定は各反応後に、波長543nm、出力100μWのレーザー光を1回に15秒照射する条件で5回行った。
【００５４】
【表１７】
実験２−２の結果から、二本鎖DNA２０ろ転写因子AP-1 ５とのDNA-タンパク複合体の並進拡散時間は、未標識二本鎖DNA２４を添加することで、未反応ＤＮＡの並進拡散時間に近づいた。従って、二本鎖ＤＮＡ２０と転写因子AP-1５との結合が阻害されることが確認できた(図３の(2)、図１１参照)。
また、実験２−３の結果から、二本鎖ＤＮＡ２０と転写因子AP-1５とのDNA-タンパク複合体の並進拡散時間は、未標識二本鎖ＤＮＡ１８を添加しても未反応DNAの並進拡散時間には近づかなかった(図４の(2)、図１１参照)。
以上の実験２−２および実験２−３で行われた競合アッセイの結果から、転写因子AP-1は、二本鎖ＤＮＡの特異的な配列に結合することが証明された。
【００５６】
タンパク質の溶液中に転写因子AP-1が含まれるか検出する場合、蛍光標識をラベルされた二本鎖DNA２０を含む溶液に、タンパク質の溶液を段階的に添加して生成物をFCS測定し、並進拡散時間を求めれば、転写因子AP-1の存在を検出することができる。
【００５７】
（実施例３）
本実施例ではＤＮＡと細胞核抽出物内の転写因子との結合反応について、細胞核抽出物の濃度依存を検出する。DNAとして、実施例２で用いた二本鎖ＤＮＡ２０を用いる。
【００５８】
＜細胞から核抽出物を生成する＞
細胞から核抽出物を生成するために以下のものを用いる。
【表１８】
HeLa細胞を10cmディッシュにコンフルエントの状態にする。PBS(-)で2回洗浄後、0.5%FCS/DMEMに交換し、TNF-α100ng/mlで刺激する。刺激から2時間後の細胞をPBS(-)で2回洗浄後、下記の操作を行い核抽出物を得る。
▲１▼1mlの氷温低浸透圧溶解バッファーにスクレーパーで回収する。バッファーは、pH7.4で10mMのHEPES、10mMのKCl、1.5mMのジチオスレイトール、E-64含有プロテアーゼ阻害剤混合物、ロイペプチン、ペプスタチンA、ベスタチン、アプロチニンを含む。
▲２▼15分後、氷温でインキュベートし、0.05%NP-40を添加する。その後、4℃で1分間、1000gで遠心分離する。
▲３▼核ペレットが集められ、100μlの高浸透圧抽出バッファー中に再混濁される。バッファーは、pH7.4で20mMのHEPES、0.4mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、10%のグリセロール、0.5mMのジチオスレイトール、E-64含有プロテアーゼ阻害混合剤、ロイペプチン、ペプスタチンA、ベスタチン、アプロチニンを含む。
▲４▼15分後、氷温でインキュベートし、4℃で1分間、1000gで遠心分離する。
▲５▼上澄みを核抽出物として得、タンパク質定量キットを用いて核抽出物の含有タンパク量を定量する。核抽出物はスモールスケールで分注して-80℃以下で保存する。
【００６０】
＜Poly dI-dCコポリマーの調整＞
二本鎖DNA20に目標タンパク質以外の物質が付着しないように、核抽出物にコポリマーを加える。コポリマーとしてPoly dI-dC（Sigma製 P-4929）を用いる。コポリマーを以下のように調整する。
▲１▼再生バッファーにコポリマーを10mg/mlの濃度になるように混濁し、1.5ml容量のマイクロ遠心チューブに入れる。再生バッファーは、50mMのNaCl、pH8.0で10mMのTris-HCl、pH8.0で1mMのEDTAを含む。
▲２▼コポリマーを超音波セッティング４で20秒間超音波処理し、均一な長さにする。
▲３▼コポリマーを90℃で10分間熱した後、室温までゆっくり冷却する。
▲４▼5μlずつ分注して-20℃で保存する。
▲５▼使用前に45μlの蒸留水を加えて、1mg/mlの濃度にする。
【００６１】
実験３−１．AP-1結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出物濃度を段階的に変えて実験。
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、34℃で1時間反応後、FCS測定して並進拡散時間を求める。FCS測定は各反応後に、波長543nm、出力100μWのレーザー光を1回に15秒照射する条件で5回行った。
【００６２】
【表１９】
0ngの細胞核抽出物を用いた反応では、DNA結合タンパク質は添加されていないのでDNA-タンパク複合体は存在せず、二本鎖DNA２０は未反応のままである。反応後の生成物は二本鎖DNA２０に細胞核抽出物中に含まれるDNA結合タンパク質が結合したものである。未反応の二本鎖DNA２０および細胞核抽出物が各濃度のときの生成物について、FCS測定の結果を表２０に示す。
【００６４】
【表２０】
細胞核抽出物の濃度の増加と共に、生成物の並進拡散時間が増加し、細胞核抽出物の濃度が30μgで最大となる濃度依存性が認められた。(図１２参照)
また、二本鎖DNA２０に転写因子AP-1がc-Jun/c-Junのホモダイマーで結合してDNA−タンパク複合体が構成されていると仮定した場合、分子量の3乗根と並進拡散時間は比例するからDNA−タンパク複合体の分子量から求めて、DNA−タンパク複合体の並進拡散時間が1113.0μsとなる。並進拡散時間が1113.0μsである反応生成物の存在割合と並進拡散時間が658.5μsである未反応の二本鎖DNA２０の存在割合との合計が略100%である。従って、この実験での反応生成物は細胞核抽出物中の転写因子AP-1が二本鎖DNA２０に結合したものであると言える。(図１３参照)
【００６６】
実験３−２．NF-κB結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出物濃度を段階的に変えて実験。
DNAとして、図７に示す二本鎖ＤＮＡ３０を用いる。二本鎖ＤＮＡ３０は、5’末端に蛍光標識４(TAMRAラベル)を有するオリゴＤＮＡ３１と、オリゴＤＮＡ３１に相補的な核酸配列を持つオリゴＤＮＡ３２とからなる。二本鎖ＤＮＡ３０は転写因子NF-κBの結合する結合サイト３３であるＧＧＧＧＣＴＴＴ配列(相補配列はＣＣＣＣＴＧＡＡＡ配列)を有する。
二本鎖ＤＮＡ３０は100nMのオリゴＤＮＡ３１(蛍光標識)と100nMのオリゴＤＮＡ３２を用いて、二本鎖ＤＮＡ２０と同様にして作成する（実施例２を参照）。以下のものを用いて、実験３−１と同様に結合反応実験を行い、反応生成物をFCS測定して並進拡散時間を求める。
【００６７】
【表２１】
【表２２】
実験３−１の場合と同様に、濃度0μgの細胞核抽出物を用いた反応では、DNA結合タンパク質は添加されていないのでDNA-タンパク複合体は存在せず、二本鎖DNA３０は未反応のままである。反応後の生成物は二本鎖DNA３０に細胞核抽出物中に含まれるDNA結合タンパク質が結合したものである。未反応の二本鎖DNA３０および細胞核抽出物が各濃度のときの生成物について、FCS測定の結果を表２３に示す。
【００７０】
【表２３】
本実験でも、実験３−１の場合と同様に、細胞核抽出物の濃度の増加と共に、生成物の並進拡散時間が増加し、細胞核抽出物の濃度が30μgで最大となり、濃度依存性が認められた。(図１４参照)
また、反応生成物が二本鎖DNA３０と転写因子NF-κBとの結合生成物で、*p50/p50による結合とp50/p65による結合が平均的に存在していると仮定した場合、反応生成物の並進拡散時間が1468.7μsとなる。並進拡散時間が1468.7μsである反応生成物の存在割合と並進拡散時間が568.7μsである未反応の二本鎖DNA３０の存在割合を図１５に示す。各存在割の合計は略100%である。従って、この実験での反応生成物は細胞核抽出物中の転写因子NF-κBが二本鎖DNA３０に結合したものであると言える。
【００７２】
細胞核抽出物に転写因子が含まれるか検出する場合、実施例２で説明したのと同様に、転写因子が結合する結合サイトを有し、かつ蛍光標識をラベルされた二本鎖DNAを含む溶液に、細胞核抽出物を段階的に添加して生成物をFCS測定し、並進拡散時間を求めることにより、転写因子の存在を検出することができる。また、FCS測定結果、DNA-タンパク複合体の分子量および未反応二本鎖DNAの分子量から、DNA-タンパク複合体と未反応二本鎖DNAとのおおよその存在比を検出することができる。
細胞核抽出物に転写因子AP-1が含まれるか検出する場合には、二本鎖DNAとして転写因子AP-1が結合する結合サイト２６を有しかつ蛍光標識をラベルされた二本鎖DNA２０を、細胞核抽出物に転写因子NF-κBが含まれるか検出する場合には、二本鎖DNAとして転写因子NF-κBが結合する結合サイト３３を有しかつ蛍光標識をラベルされた二本鎖DNA３０を用いる。細胞核抽出物の添加量が増加すると共に並進拡散時間が大きくなり、最大値を取った後に並進拡散時間が減少すれば、転写因子が細胞核抽出物中に含まれることになる。
【００７３】
（実施例４）
本実施例ではＤＮＡと細胞核抽出物中の転写因子AP-1との結合反応を、競合DNAを添加した競合アッセイを行うことによって検出する。
【００７４】
実験４−１．AP-1結合配列を持つ二本鎖DNA(未標識)を添加した場合のAP-1結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖DNA(未標識)濃度を段階的に変えて実験。
配列が二本鎖DNA２０と同じであるが蛍光標識されていない二本鎖DNA２４を添加する二本鎖DNAとして用いる。細胞核抽出物の濃度は、実験３−１で十分に結合反応が生じていた30μgとする。
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、34℃で1時間反応後、FCS測定して並進拡散時間を求める。FCS測定は各反応後に、波長543nm、出力100μWのレーザー光を1回に15秒照射する条件で5回行った。
【００７５】
【表２４】
実験４−２．AP-1結合配列と一部異なる配列を持つ二本鎖DNA(未標識)を添加した場合のAP-1結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖DNA(未標識)濃度を段階的に変えて実験。
配列が二本鎖DNA２０と一部異なっていて蛍光標識されていない二本鎖DNA２５を添加する二本鎖DNAとして用いる。二本鎖DNA２５は二本鎖DNA２０の結合サイト２６部分が2塩基だけ異なっている配列である（図６参照）。二本鎖DNA２５を用いて実験４−１と同様に実験を行った。
【００７７】
実験４−３．AP-1結合配列を持たない二本鎖DNA(未標識)を添加した場合のAP-1結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖DNA(未標識)濃度を段階的に変えて実験。
配列がAP-1結合配列を持たない二本鎖大腸菌由来ランダム配列で、未標識の二本鎖DNA１８を添加する二本鎖DNAとして用いる。二本鎖DNA１８を用いて実験４−１と同様に実験を行った。
【００７８】
図１６に実験４−１から４−３の結果を示す。実験４−１の結果から、蛍光標識で確認できる生成物すなわち二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物中のDNA結合タンパク質とが結合してできたDNA-タンパク複合体の並進拡散時間は、未反応の二本鎖ＤＮＡ２０の並進拡散時間と比較して大きな伸びは無かった。従って、二本鎖ＤＮＡ２４を添加することにより、二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物中の転写因子AP-1５との結合が阻害されることが確認できた。
また、実験４−２の結果から、二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物との結合生成物の並進拡散時間は、二本鎖DNA２５を添加した場合と競合DNAが含まれていない場合とで略同程度である。従って、二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物中の転写因子AP-1５との反応について、二本鎖ＤＮＡ２０と2塩基しか差がない二本鎖DNA２５による結合阻害は認められなかった。
また、実験４−３の結果から、二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物との結合生成物の並進拡散時間は、二本鎖ＤＮＡ１８を添加した場合と競合DNAが含まれていない場合とで略同程度である。従って、二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物中の転写因子AP-1５との反応について、二本鎖ＤＮＡ１８による結合阻害は認められなかった。
以上の実験４−１から４−３で行われた競合アッセイの結果から、細胞核抽出物中の転写因子AP-1は、細胞核抽出物に含まれるＤＮＡの特異的な配列に結合することが証明された。
【００７９】
（実施例５）
本実施例ではＤＮＡと細胞核抽出物中の転写因子NF-κBとの結合反応を、競合DNAを添加した競合アッセイを行うことによって検出する。
【００８０】
実験５−１．NF-κB結合配列を持つ二本鎖DNA(未標識)を添加した場合のNF-κB結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖DNA(未標識)濃度を段階的に変えて実験。
配列が二本鎖ＤＮＡ３０と同じであるが蛍光標識されていない二本鎖DNA３４を添加する二本鎖DNAとして用いる。細胞核抽出物の濃度は、実験３−１で十分に結合反応が生じていた30μgとする。
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、34℃で1時間反応後、FCS測定して並進拡散時間を求める。FCS測定は各反応後に、波長543nm、出力100μWのレーザー光を1回に15秒照射する条件で5回行った。
【００８１】
【表２５】
実験５−２．NF-κB結合配列と一部異なる配列を持つ二本鎖DNA(未標識)を添加した場合のNF-κB結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖DNA(未標識)濃度を段階的に変えて実験。
配列が二本鎖DNA３０と一部異なり蛍光標識されていない二本鎖DNA３５を添加する二本鎖DNAとして用いる。二本鎖ＤＮＡ３５は二本鎖DNA３０の結合サイト３３部分が１塩基だけ異なっている配列である（図７参照）。二本鎖ＤＮＡ３５を用いて実験５−１と同様に実験を行った。
【００８３】
実験５−３．NF-κB結合配列を持たない二本鎖DNA(未標識)を添加した場合のNF-κB結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖DNA(未標識)濃度を段階的に変えて実験。
配列がNF-κB結合配列を持たない二本鎖大腸菌由来ランダム配列で、蛍光標識されていない二本鎖DNA１８を添加する二本鎖DNAとして用いる。二本鎖DNA１８を用いて実験５−１と同様に実験を行った。
【００８４】
図１７に実験５−１から５−３の結果を示す。実験５−１の結果から、蛍光標識で確認できる生成物すなわち二本鎖ＤＮＡ３０と細胞核抽出物中のDNA結合タンパク質とが結合してできたDNA-タンパク複合体の並進拡散時間は、未反応の二本鎖ＤＮＡ３０の並進拡散時間と比較して大きな伸びは無かった。従って、競合二本鎖ＤＮＡ３４を添加することにより、二本鎖ＤＮＡ３０と細胞核抽出物中の転写因子AP-1５との結合が阻害されることが確認できた。
また、実験５−２の結果から、二本鎖ＤＮＡ３０と細胞核抽出物との結合生成物の並進拡散時間は、二本鎖ＤＮＡ３５を添加した場合と何も加えない場合とで略同程度である。従って、二本鎖ＤＮＡ３５と細胞核抽出物中の転写因子NF-κBとの反応について、二本鎖ＤＮＡ３０と1塩基しか差がない二本鎖ＤＮＡ３５による結合阻害は認められなかった。
また、実験５−３の結果から、二本鎖ＤＮＡ３０と細胞核抽出物との結合生成物の並進拡散時間は、二本鎖ＤＮＡ１８を添加した場合と競合DNAが含まれていない場合とで略同程度である。従って、二本鎖ＤＮＡ３０と細胞核抽出物中の転写因子NF-κBとの反応について、二本鎖ＤＮＡ１８による結合阻害は認められなかった。
以上の実験５−１から５−３で行われた競合アッセイの結果から、細胞核抽出物中の転写因子NF-κBは、細胞核抽出物に含まれるＤＮＡの特異的な配列に結合することが証明された。
【００８５】
（実施例６）
本実施例では、細胞核内の転写因子の活性化について、細胞核抽出の際の腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激依存を検出する。具体的には、腫瘍壊死因子TNF-αを用いてHeLa細胞を刺激し、時間経過による細胞核内の転写因子AP-1および転写因子NF-κBについて活性化の程度を検出する。HeLa細胞をPMA（phorbol 12-myristate 13-acetate、フォルボール12-ミリスチン酸13-酢酸）やサイトカインなどで刺激していない状態でも、ある程度の活性を有する転写因子AP-1および転写因子NF-κBがHeLa細胞の核内に存在することが知られている。
【００８６】
実験６−１．AP-1結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出の際の腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激時間が異なる細胞核抽出物を用いて実験。
50ng/mlの腫瘍壊死因子TNF-αを添加して、0,15,30,60,120,180分間刺激した各HeLa細胞から核抽出物を生成した。（生成方法は実施例３を参照）核抽出物の濃度は20μgとした。
以下のものを用いて、実験３−１と同様に結合反応実験を行う。
【００８７】
【表２６】
図１８に刺激時間に対する生成物の並進拡散時間を示す。二本鎖DNA２０(標識済み)と腫瘍壊死因子TNF-αで30分間刺激した細胞核抽出物との結合反応物の並進拡散時間が最も大きく、実験３−１における核抽出物濃度が20μgのときの反応物の並進拡散時間とほぼ同等の値である。従って、30分の刺激時間で細胞核抽出物中の転写因子AP-1が十分に活性化されたと言える。
【００８９】
実験６−２．NF-κB結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出の際の腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激時間が異なる細胞核抽出物を用いて実験。
実験６−１と同様に、50ng/mlの腫瘍壊死因子TNF-αを添加して、0,15,30,60,120,180分間刺激した各HeLa細胞から核抽出物を生成した。
以下のものを用いて、実験３−２と同様に結合反応実験を行う。
【００９０】
【表２７】
図１９に刺激時間に対する生成物の並進拡散時間を示す。二本鎖DNA３０(標識済み)と腫瘍壊死因子TNF-αで15分間刺激した細胞核抽出物との結合反応物の並進拡散時間が最も大きく、実験３−２における核抽出物濃度が20μgのときの反応物の並進拡散時間とほぼ同等の値である。従って、15分の刺激時間で細胞核抽出物中の転写因子NF-κBが十分に活性化されたと言える。
【００９２】
細胞核抽出物に転写因子AP-1が含まれるか検出する場合、50ng/mlの腫瘍壊死因子TNF-αを細胞に添加して30分間刺激してから細胞核抽出を行い、この細胞核抽出物と二本鎖DNA２０とを結合反応させ、FCS測定し、並進拡散時間を求めることにより、転写因子の存在を検出することができる。また、細胞核抽出物に転写因子NF-κBが含まれるか検出する場合には、50ng/mlの腫瘍壊死因子TNF-αを細胞に添加して15分間刺激するとよい。
【００９３】
（実施例７）
本実施例では、細胞核内の転写因子の活性化について、細胞核抽出の際のAPDC(Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate)および腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激依存を検出する。具体的には、APDCおよび腫瘍壊死因子TNF-αを用いてHeLa細胞を刺激し、細胞核内の転写因子AP-1および転写因子NF-κBについて活性化の程度を検出する。APDCは、転写因子AP-1の活性化を促進する一方で、転写因子NF-κBの活性化を抑制すると言われている。
APDCを添加した2時間後に、腫瘍壊死因子TNF-αを添加して30分間刺激したHeLa細胞から核抽出物を生成する。核抽出物の濃度が5,10,20μgであるものを用意する。細胞への刺激は次の2つの場合で行う。
(i)腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激だけを30分間行う場合。腫瘍壊死因子TNF-αの濃度は0,10,25,50ng/mlである。
(ii)APDCを添加した2時間後に腫瘍壊死因子TNF-αを添加して30分間刺激した場合。50ng/mlの腫瘍壊死因子TNF-αに対し、APDCの濃度は10,100,200μMである。
【００９４】
実験７−１．AP-1結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出の際の腫瘍壊死因子TNF-α添加濃度およびAPDC添加濃度が異なる細胞核抽出物を用いて実験。
次のものを用いて、実験３−１と同様に結合反応実験を行う。
【００９５】
【表２８】
図２０に各刺激条件に対する生成物の並進拡散時間を示す。生成物の並進拡散時間は腫瘍壊死因子TNF-αの濃度およびAPDCの量による刺激依存が見られた。特に、APDCによる刺激と腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激との両方の刺激を行った場合で、50ng/mlの腫瘍壊死因子TNF-αに対し、APDCの濃度が100μMおよび200μMであるときに生成物の並進拡散時間が大きい。従って、これらの濃度の組み合わせのときに、細胞核抽出物中の転写因子AP-1が最も活性化されたと言える。
【００９７】
実験７−２．NF-κB結合配列を持つＤＮＡ(蛍光標識)と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出の際の腫瘍壊死因子TNF-α添加濃度およびAPDC添加濃度が異なる細胞核抽出物を用いて実験。
次のものを用いて、実験３−２と同様に結合反応実験を行う。
【００９８】
【表２９】
図２１に各刺激条件に対する生成物の並進拡散時間を示す。生成物の並進拡散時間は腫瘍壊死因子TNF-αの濃度およびAPDCの量による刺激依存が見られた。特に、腫瘍壊死因子TNF-αによる刺激のみを行った場合で、腫瘍壊死因子TNF-αの濃度が50ng/mlであるときに生成物の並進拡散時間が大きく、このとき細胞核抽出物中の転写因子NF-κBが最も活性化されたと言える。
実験７−１および７−２の結果から、APDCは腫瘍壊死因子TNF-αによる転写因子AP-1の活性化を促進し、転写因子NF-κBの活性化を抑制することが証明された。
【０１００】
細胞核抽出物に転写因子AP-1が含まれるか検出する場合、APDCを添加した2時間後に腫瘍壊死因子TNF-αを添加して30分間刺激してから細胞核抽出を行い、この細胞核抽出物と二本鎖DNA２０とを結合反応させ、FCS測定し、並進拡散時間を求めることにより、転写因子の存在を検出することができる。50ng/mlの腫瘍壊死因子TNF-αに対し、APDCの濃度を100μM以上200μM以下であるとよい。
また、細胞核抽出物に転写因子NF-κBが含まれるか検出する場合には、腫瘍壊死因子TNF-αのみで刺激を行った場合の並進拡散時間と、APDCおよび腫瘍壊死因子TNF-αの刺激を行った場合の並進拡散時間とを比較することによって、精度良く転写因子NF-κBを検出することができる。腫瘍壊死因子TNF-αのみで刺激を行った場合に並進拡散時間が大きければ細胞核抽出物に転写因子NF-κBが含まれると言える。
【０１０１】
上述した各実施例で示したように、試料の混合と蛍光相関分光法(FCS)による計測により、並進拡散時間を求めるための情報が得られ、放射性同位元素の利用や電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などの煩雑な操作を行わずに、検出結果を簡便に短時間で得ることができる。また、精製していない細胞核抽出物のようなクルード(crude)な試料を用いても、二本鎖DNAと転写因子とのDNA-タンパク複合体が精度良く検出できる。また、転写因子が結合する本来の二本鎖DNAと1塩基またな2塩基しか違いのない二本鎖DNAを添加しても、本来の二本鎖DNAと転写因子との結合反応が妨げられずにDNA-タンパク複合体が検出できるので、FCSによるこれらの測定方法は、細胞核抽出物などのクルードなサンプル中に存在する特定のDNA結合タンパク質（転写因子、核内レセプターなど）を検出するのに有用である。また、サイトカインの刺激による転写因子の時間経過による発現量、APDCの効果も精度良く検出できる。
【０１０２】
上述した各実施例では、生成物の並進拡散時間を求めるために蛍光相関分光法(FCS)を用いたが、蛍光相関分光法(FCS)の代わりに、蛍光強度分布解析法（Fluorescence Intensity Multiple Distribution Analysis）を用いてもよい。
【０１０３】
【発明の効果】
本発明によれば、溶液の混合と蛍光相関分光法による計測により並進拡散時間を求めるための情報が得られ、放射性同位元素の利用や電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などの煩雑な操作を行わずに、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との反応を簡便に短時間で得ることができる。
また、本発明によれば、精製していない細胞核抽出物のようなクルード(crude)な試料を用いても、二本鎖DNAと転写因子との結合反応が精度良く検出できる。また、転写因子が結合する本来の二本鎖DNAと1塩基またな2塩基しか違いのない二本鎖DNAを添加しても、本来の二本鎖DNAと転写因子との結合反応が妨げられずに反応生成物が検出できるので、FCSによるこれらの測定方法は、細胞核抽出物などのクルードなサンプル中に存在する特定のDNA結合タンパク質（転写因子、核内レセプターなど）を検出するのに有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実験１−１の手順と生成物の概要を示す図。
【図２】実験２−１の手順と生成物の概要を示す図。
【図３】実験２−２の手順と生成物の概要を示す図。
【図４】実験２−３の手順と生成物の概要を示す図。
【図５】各実験で用いるＤＮＡを示す図。
【図６】各実験で用いるＤＮＡを示す図。
【図７】実施例２の対物レンズ１１付近を示す図。
【図８】実験１−１および１−２での各反応後の生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図９】実験２−１での転写因子AP-1濃度に対する生成物の並進拡散時間のグラフ。
【図１０】実験２−１での転写因子AP-1濃度に対する未反応物(K1)と反応生成物(K2)との存在比を示すグラフ。
【図１１】実験２−２での二本鎖DNA(未標識)濃度に対する生成物の並進拡散時間、およびAP-1結合配列を持たないＤＮＡ(未標識)濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１２】実験３−１での細胞核抽出物濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１３】実験３−１での細胞核抽出物濃度に対する未反応物および生成物の存在比を示すグラフ。
【図１４】実験３−２での細胞核抽出物濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１５】実験３−２での細胞核抽出物濃度に対する未反応物および生成物の存在比を示すグラフ。
【図１６】実験４−１から４−３での各二本鎖DNA(未標識)濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１７】実験５−１から５−３での各二本鎖DNA(未標識)濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１８】実験６−１での刺激時間に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１９】実験６−２での刺激時間に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図２０】実験７−１でのTNF-α添加濃度およびAPDC添加濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図２１】実験７−２でのTNF-α添加濃度およびAPDC添加濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【符号の説明】
１…転写因子TFIID、２…転写因子TFIIB、３…抗TFIIB抗体、４…蛍光標識、５…転写因子AP-1、１０…二本鎖ＤＮＡ、１１…オリゴＤＮＡ、１２…オリゴＤＮＡ、１６…結合サイト、１７…二本鎖ＤＮＡ、１８…二本鎖ＤＮＡ、２０…二本鎖ＤＮＡ、２１…オリゴＤＮＡ、２２…オリゴＤＮＡ、２４…二本鎖ＤＮＡ、２５…二本鎖ＤＮＡ、２６…結合サイト、２６’…２塩基異なる結合サイト、３０…二本鎖ＤＮＡ、３１…オリゴＤＮＡ、３２…オリゴＤＮＡ、３３…結合サイト、３３’…１塩基異なる結合サイト、３４…二本鎖ＤＮＡ、３５…二本鎖ＤＮＡ。
Claims (3)
- 蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを含む溶液と転写因子ＴＦＩＩＤとを混合するステップと、
前記転写因子ＴＦＩＩＤを混合した溶液に転写因子ＴＦＩＩＢを混合するステップと、
蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めるステップと
を有することを特徴とする転写因子ＴＦＩＩＤと二本鎖ＤＮＡの結合を検出する方法。 - 前記転写因子ＴＦＩＩＢを混合するステップの後に、
前記転写因子ＴＦＩＩＢを混合した溶液に抗ＴＦＩＩＢ抗体を混合するステップを含むことを特徴とする請求項１の転写因子ＴＦＩＩＤと二本鎖ＤＮＡの結合を検出する方法。 - 前記蛍光相関分光法のコンフォーカルボリューム中における前記蛍光標識された二本鎖ＤＮＡの粒子数が２〜５であることを特徴とする請求項１または２の転写因子ＴＦＩＩＤと二本鎖ＤＮＡの結合を検出する方法。
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