CN100335655C - 一种检测小分子rna的寡核苷酸微阵列芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的展示miRNA表达谱的方法,该方法包括以下步骤:(1)将合成的miRNA的反义寡核苷酸探针制成微阵列芯片;(2)将样品中的RNA分子3’端氧化为双醛基,然后利用酰肼标记分子给miRNA分子作标记;(3)使步骤(2)获得的样品与步骤(1)制得的微阵列芯片杂交,然后检测所述标记。本发明还提供了一种检测miRNA的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地说,本发明涉及一种检测小分子RNA的方法及用于该方法的试剂盒。
背景技术
小分子RNA(microRNA,下文简称“miRNA”)是一类约为22核苷酸大小的非编码RNA,它通过特异识别靶信使RNA(mRNA)调控其靶mRNA的表达。在不同的组织、器官和不同的发育时期,miRNA的表达谱是不同的,它可能在各种生物发育和生理活动中起重要的调节作用。miRNA的错误表达会导致癌症等疾病的产生(He&Hannon,Nat Rev.Genet.5(2004):522-531)。对miRNA表达谱的研究将对miRNA生物功能的研究起到巨大的推动作用。
现有对miRNA表达谱的研究多采用Northern杂交或miRNA克隆的方法,需要大量的总RNA样品,而且费时费力。DNA微阵列芯片技术的高通量、平行分析的性质使其可以同时监测成千上万种mRNA表达的差异。Krichevsky et al.(RNA 9(2003):1274-1281)在膜上制作了一种miRNA检测阵列,将miRNA标记上同位素,与检测阵列杂交后用放射自显影进行检测。膜上DNA阵列有其固有不足,加上采用同位素分析,费时费力。Liu et al.(PNAS 101(2004):9740-9744)制作了一种基于玻璃片基的miRNA展示微阵列,标记方式采用生物素标记的随机引物反转录miRNA,芯片与带有生物素标记的miRNA的cDNA杂交后利用荧光分子标记的链霉亲合素进行检测。但是,通过反转录产生的cDNA并不能准确反映miRNA丰度的差异,尤其是采用随机引物更容易带来许多干扰。
为了克服上述缺点,本领域中仍然需要提供一种新的展示miRNA表达谱的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的展示miRNA表达谱的方法,该方法包括以下步骤:(1)将合成的miRNA的反义寡核苷酸探针制成微阵列芯片;(2)将样品中的RNA分子3’端氧化为双醛基,然后利用酰肼标记分子给miRNA分子作标记;(3)使步骤(2)获得的样品与步骤(1)制得的微阵列芯片杂交,然后检测所述标记。
本发明另一方面还提供了一种检测miRNA的试剂盒,该试剂盒包含:
微阵列芯片,所述芯片上有合成的miRNA的反义寡核苷酸;氧化剂;酰肼标记分子;以及按照本发明上述方法进行检测的说明书。
本发明通过直接标记和检测RNA分子,有效地避免了采用反转录、转录等方法形成RNA代表产物而引起的对RNA分子丰度的扭曲反映(Cole et al.,Nucleic Acid Res.32(2004):e86);该方法具有灵敏度高、检测动态范围大、可半定量分析等特点;并且具有所需样品少(所需的总RNA仅为微克级)、操作简单、成本低的优点。
附图简述
图1是miRNA检测微阵列示意图,其中图1A显示了标记RNA 3’端的反应机理;图1B显示了标记了的miRNA的检测机理。
图2显示了利用本发明的miRNA检测微阵列,通过量子点检测水稻幼苗叶片中11种miRNA的结果,其中A)表示检测微阵列示意图;B)表示检测得到的图像;C)表示数据处理后的检测结果,其中上图代表一个微阵列内四个小阵列的相应miRNA的信号强度(实心圆)及平均值(折线的端点);下图代表四个重复微阵列的相应miRNA的信号强度(空心圆)及平均值(折线的端点)。
图3显示了利用本发明的miRNA检测微阵列,通过胶体金-银增强法检测水稻幼苗中11种miRNA的结果,其中A)表示检测得到的图像;B)表示数据处理后的检测结果,实心圆代表一个微阵列内四个小阵列的相应miRNA的信号强度,折线的端点为其平均值。
图4显示了miRNA微阵列的检测限量和检测动态范围,其中:A)表示50微摩尔探针制作的微阵列与不同浓度的生物素标记的miRNA杂交的检测图像。miRNA的浓度标示于检测图像的上方,单位为皮摩尔。B)表示点的荧光强度与生物素标记的miRNA的浓度的关系。
具体实施方案
具体而言,本发明提供了一种新的展示miRNA表达谱的方法,其基本原理是基于RNA与其固定在芯片上的反义寡核苷酸探针特异性结合,并利用RNA 3’-端可直接标记上高性能荧光发色团,从而达到皮摩尔级检出水平。该方法包括以下步骤:(1)将合成的miRNA的反义寡核苷酸探针制成微阵列芯片;(2)将样品中的RNA分子3’端直接进行荧光标记,包括将其氧化为双醛基,然后利用酰肼标记分子给miRNA分子作标记;(3)使步骤(2)获得的样品与步骤(1)制得的微阵列芯片杂交,然后检测所述标记。
在步骤(1)中,根据待检测miRNA已知序列,利用本领域常规的技术合成其反义寡核苷酸探针。在实施例中具体采用了水稻幼苗miRNA为研制模型,然而本领域技术人员应当理解,本发明并不局限于这些具体的miRNA,而是适用于任何已知的miRNA。反义寡核苷酸的长度可以与待检测miRNA的长度一样,也可不一样,只要该反义寡核苷酸能在一定的杂交条件下与待检测miRNA杂交即可。所得反义寡核苷酸可通过化学偶联程序等常规技术直接连接到芯片载体上,但也可通过臂或接头间接连接在芯片载体上,制成微阵列芯片。在另一实施方案中,所述反义寡核苷酸探针可以直接合成在芯片载体上。
对于待检测的RNA样品,首先用氧化剂对其进行氧化处理,以使RNA分子的3′端氧化成双醛基团。作为氧化剂,一个较佳的例子是高碘酸钠。然而,本领域技术人员也可以采用其它合适的氧化剂。在另一较佳的实施方案中,可在氧化前对所述RNA样品进行处理以富集小分子RNA。然后,使经氧化处理的RNA分子样品与酰肼标记分子反应,从而使标记物连接在RNA分子的3′端上。适用于本发明的标记物是生物素或荧光探针。本发明所用的术语“酰肼标记分子”指由酰肼、标记物、以及任选的偶联酰肼和标记物的间隔臂形成的化合物分子。在一个较佳的实施方案中,所述酰肼标记分子是Biotin-X-hydrazide(购自Sigma公司)。如图1A中所示反应机理,酰肼标记分子中的酰肼基团与前述氧化形成的双醛基团发生反应,从而将生物素直接连接在RNA分子的3′端。
在步骤(3)中,使步骤(1)制得的样品与步骤(2)获得的样品充分杂交,以使样品中的miRNA与微阵列芯片上的与之对应的反义寡核苷酸探针杂交。杂交条件可由本领域技术人员根据常规技术来具体确定。杂交后,可用偶联了链霉亲和素的量子点来检测,也可用偶联了链霉亲和素的胶体金颗粒辅以银增强的方法来进行检测。关于用偶联了链霉亲和素的胶体金颗粒辅以银增强的方法来进行检测的方法,可参见“胶体金-银增强方法检测蛋白质芯片”,阮康成、梁汝强、谭翠燕,中国申请2003101220829。具体而言,胶体金-银增强检测方法包括步骤:使芯片与带有偶联配对物(如链霉亲和素)的胶体金溶液混合,形成由芯片上的杂交物与胶体金构成的复合物;将芯片与银增强溶液混合,使银离子在金的催化下形成金属银,生成的金属银又可以自催化更多的银离子还原为金属银。然后充分洗涤,中止银增强反应。银增强时间的选择以及芯片表面的清洁度十分重要。然后,置普通低倍显微镜下用普通数码相机拍照。测算每个点的灰度值,进行数据分析。用于上述检测的胶体金和特异识别分子可用常规方法制备和偶联,或者直接购买商品化试剂。银增强溶液是商品化试剂(购自Sigma公司),图像获取可以用普通数码相机配合普通显微镜。
基于上述方法,本发明还提供了一种检测miRNA的试剂盒,该试剂盒包含:
微阵列芯片,所述芯片上有合成的miRNA的反义寡核苷酸;氧化剂;酰肼标记分子;以及按照本发明上述方法进行检测的说明书。
在一个较佳的实施方案中,所述试剂盒还可包括用于进行检测的试剂,例如偶联了链霉亲和素的量子点,以及偶联了链霉亲和素的胶体金颗粒等。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件进行。
实例1:
11种合成的水稻幼苗miRNA的反义寡核苷酸(如图2A所示)和1个与已知miRNA都不互补的阴性对照(Negat.Ctrl.)制成miRNA检测微阵列芯片。将富集了小分子量的RNA组分先用高碘酸钠氧化,然后与biotin-X-hydrazide(购自Sigma公司)反应。反应后,用乙醇沉淀生物素标记的RNA。使标记的RNA在杂交溶液中与检测芯片杂交(在50%甲酰胺预杂交/杂交溶液中25℃杂交18小时),然后与偶联了链霉亲合素的量子点反应。经洗涤(于1×SSC/0.5%SDS中在37℃洗10分钟)后,用ScanArray 5000扫描,然后用QuantArray进行归一化分析。结果如图2B和C所示。
实例2:
将步骤(1)中获得的标记的RNA在杂交溶液中与检测芯片杂交,然后与偶联了链霉亲合素的胶体金(购自Sigma公司)反应(胶体金1∶5稀释,取10微升与芯片反应,室温1小时),然后进行银增强20分钟。经洗涤后用普通数码相机拍照,然后用QuantArray进行分析,结果如图3所示。
从图2和图3的结果可以看出,两种方法都给出了相同的miRNA的表达谱,都有很好的重复性。从图4的结果可以看出,用本发明的标记方法miRNA微阵列的检测限量可达39皮摩尔。而且,本发明者相信,在最佳条件下的检测限量可以更低。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲述内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种展示miRNA表达谱的方法,该方法包括以下步骤:
(1)将合成的miRNA的反义寡核苷酸探针制成微阵列芯片;
(2)将样品中的RNA分子3’端氧化为双醛基,然后利用酰肼标记分子给miRNA分子作标记;
(3)使步骤(2)获得的样品与步骤(1)制得的微阵列芯片杂交,然后用偶联了链霉亲和素的量子点来进行检测,或用偶联了链霉亲和素的胶体金颗粒辅以银增强的方法来进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,该方法是基于RNA与其固定在芯片上的反义寡核苷酸探针特异性结合。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在所述步骤(2)中,用高碘酸钠进行所述氧化。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在进行所述氧化前,可对样品中的miRNA作进一步富集。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述标记是生物素。
6.一种检测miRNA的试剂盒,该试剂盒含有:
微阵列芯片,所述芯片上有合成的miRNA的反义寡核苷酸;氧化剂;酰肼标记分子;以及按照权利要求1所述方法进行检测的说明书。
7.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述氧化剂是高碘酸钠,所述酰肼标记分子是生物素酰肼标记分子。
8.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还含有检测试剂,所述检测试剂是偶联了链霉亲和素的量子点,或是偶联了链霉亲和素的胶体金颗粒。
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