CN101225394A - 植物miRNA及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类新的分离自植物的miRNA，所述的miRNA选自：序列如SEQ ID NO：1－SEQ ID NO：137所示的miRNA或与SEQ ID NO：1－SEQ ID NO：137任一所示序列互补的miRNA。本发明还提供了所述的miRNA的前体以及在植物细胞内可被转录成前体miRNA的多核苷酸构建物。

Description

植物miRNA及其用途

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域，更具体地，本发明涉及一种植物miRNA，其前体及其用途。

背景技术

miRNA(micro RNA)是一组不编码蛋白质的短序列单链RNA，长约22nt。miRNA基因主要单个或成簇地位于基因组的非编码区内。目前人们已发现的miRNA约为数千个，大部分功能未知。据目前的研究显示，miRNA执行一种转录后调节机制，在蛋白表达过程中扮演重要角色。miRNA通过不完全碱基互补的方式与mRNA相应的区域结合，从而抑制蛋白质的翻译；在某些植物中，其还可以降解mRNA。通常一个基因可以被多个miRNA所调节，同时一个miRNA也可以调节多个mRNA。

miRNA表达具有高度的保守性、时序性和组织特异性。研究表明miRNA参与了几乎所有的生命活动，并起着重要作用，在动物中，包括：细胞发育、造血、脂肪代谢、器官生成、凋亡、细胞增殖与分化及肿瘤的发生。此外，在某些病毒中也发现有miRNA表达。

在植物细胞中，转录形成的miRNA前体首先折叠成茎环结构，然后在DCL1的作用下剪切形成成熟的miRNA。在不同的植物组织、器官和不同的发育时期，miRNA的表达谱是不同的，对miRNA表达谱的研究将对miRNA生物功能的研究起到巨大的推动作用。

尽管目前已经在生物体中发现了一些miRNA，然而这些miRNA仅占生物体中存在的miRNA中相当少的一部分，并且研究人员对于这些miRNA的功能还了解很少。

因此，本领域迫切需要进一步地分离miRNA，以研究miRNA的表达谱以及它们对于生物体的调节作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物miRNA基因及其用途。

在本发明的第一方面，提供一种分离的miRNA，所述的miRNA选自：

(i)序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137所示的miRNA；

(ii)与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137任一所示序列互补的miRNA。

在本发明的一个优选例中，所述的miRNA分离自禾本科植物。

在本发明的另一优选例中，所述的植物是水稻。

在本发明的另一优选例中，所述的miRNA在植物细胞内能够与至少一条mRNA的至少一部分序列互补。

在本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸可被植物细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可在植物细胞内被剪切且表达成所述的miRNA。

在本发明的另一优选例中，所述的多核苷酸含有式I所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向                式I，

式I中，

Seq_正向为可在植物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在植物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列。

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补，

式I所示的结构在转入植物细胞后，形成式II所示的二级结构：

式II，

式II中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

在本发明的另一优选例中，所述的miRNA具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137任一所示的序列；或者

所述的前体miRNA具有SEQ ID NO：138-SEQ ID NO：274任一所示的序列。

在本发明的第三方面，提供一种抑制目的基因表达的方法，所述的方法包括步骤：

(1)提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸可被植物细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被植物细胞剪切且加工成能够与该目的基因对应的mRNA的至少一部分序列互补的miRNA；

(2)将(1)中所述的多核苷酸导入到植物细胞中，从而通过剪切目的基因或者抑制基因翻译的方式来抑制所述目的基因的功能。

在本发明的另一优选例中，所述的miRNA具有选自SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137任一所示的序列。

在本发明的第四方面，提供所述的miRNA的用途，用于制备抑制或者调节目的基因表达的组合物。

在本发明的第五方面，提供一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸。

在本发明的第六方面，提供一种植物细胞，它是选自下组：

(a)用所述的载体转化或转染的细胞；或

(b)用所述的多核苷酸转化或转染的细胞。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了水稻中花11品种的种子、叶、根、胚乳、胚中miRNA基因的表达模式；图中，比色板指示着miRNA的表达强度，所示的-2.0(蓝色)-0(黑色)-2.0(黄色)表示miRNA表达的由弱到强的变化，越靠近2.0表示表达越强。越靠近-2.0表示表达越弱。

具体实施方式

本发明人经过长期而广泛的研究，首次从水稻的不同发育阶段的种子中分离获得一类新的miRNA，这些miRNA能够特异性结合到mRNA的相应部位，影响相应的mRNA的转录作用，从而影响相应的基因的表达。因此，本发明提供的miRNA可对于植物生长、发育产生影响。基于此完成了本发明。

如本文所用，所述的“植物(或作物)”包括但不限于：禾本科植物(如水稻)、豆科植物等。此外，所述的植物还可包括林业作物、乔木、花卉植物等。优选的，所述的植物是指任何携带本发明所提供的miRNA(其序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137所示)或携带与所述的miRNA具有较高同源性(如具有80％同源性或更高)的miRNA，或其mRNA的表达可被本发明所提供的miRNA所影响的植物的总称。

本发明提供了一类从植物中发现的miRNA，植物miRNA可从前体miRNA加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在60-330bp之间。通常，前体miRNA可在植物细胞内被剪切成成熟的miRNA分子。

本发明的一个方面提供一种植物的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一种RNA分子，被从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(一般约22个核苷酸)，然而也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。植物来源的miRNA是在植物细胞中由前体miRNA加工获得的miRNA。

植物来源的miRNA也可被从植物细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

miRNA通常是由前体miRNA加工而来的，因此，本发明的另一方面关于可在植物细胞中被加工产生miRNA的前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)。并且，所述的前体miRNA也是可从植物中被分离的。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。

前体miRNA可被植物细胞剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有0、1、2、3、4、5、8、9个不匹配的核苷酸。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明人采用大规模平行信号测序系统，从水稻不同发育阶段的种子中分离、鉴定出大量新的miRNA。

具体而言，本发明人从野生型水稻中花11的种子中提取总RNA分离出18-26nt的小RNA(small RNA)，将小RNA克隆入载体后，用MPSS技术分析得到Signature序列，屏蔽掉可能为接头来源的序列并将可信性较低的序列过滤掉。

接着，本发明人用BLAST程序(NCBI)把Signature序列定位到水稻染色体上，剔除在基因组上没有匹配的序列。以Rfam数据库(TIGR)为参考，去除rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等。为了鉴别剩下的序列中的miRNA，以400bp的窗口(window)在基因组上选取包含这些序列的前体序列(前体miRNA)，用RNAfold软件预测其二级结构。同时满足以下几个标准的为miRNA：①miRNA定位在前体结构的某一臂上(5’或3’)，并且前体结构自由能最低；②以miRNA为中心的25nt中，错配数不得大于7；③前体结构中没有大的环状结构。

这些被鉴定出来的miRNA的序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137所示。所述的前体miRNA的序列如SEQ ID NO：138-SEQ ID NO：274所示。

对这些miRNAs的表达模式研究表明，这些miRNA集中在种子中表达。将miRNA前体基因或者成熟miRNA直接放入表达载体中，转化植物后可在植物体内形成有茎环结构的前体，然后被加工修饰形成成熟miRNAs，进而抑制或影响基因的表达，从而达到对基因进行修饰得目标。

此外，本发明还提供了在严格条件下能够与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137所限定的序列杂交且具有与植物细胞内至少一种mRNA的至少一部分序列互补功能的miRNA；或者，与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137任一所示序列有95％以上同源性且具有与植物细胞内至少一种mRNA的至少一部分序列互补功能的miRNA。

根据本发明所提供的植物miRNA序列，可设计出在被导入植物中后可被植物加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被植物细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被植物细胞裂解且表达成所述的miRNA。

作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向            式I，

式I中，

Seq_正向为可在植物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在植物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

式I所示的结构在转入植物细胞后，形成式II所示的二级结构：

式II，

式II中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述；

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

本发明还提供一种抑制目的基因表达的方法，所述的方法包括步骤：

(1)提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸可被植物细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被植物细胞剪切且加工成能够与该目的基因对应的mRNA的至少一部分序列互补的miRNA；

(2)将(1)中所述的多核苷酸导入到植物细胞中，从而抑制所述目的基因的功能。

在本发明中，将所述的多核苷酸构建物导入到植物细胞中，该多核苷酸构建物在体内被转录成前体miRNA，之后所述的前体miRNA被加工成miRNA，所述的miRNA可与相应的mRNA的部分序列相互补，从而抑制该mRNA相应的目的基因的表达。所述植物细胞再生成植物后，该转基因植物中相应的目的基因的表达与野生型不同。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主可以是任何适合于携带所述表达载体并能够将所述表达载体传递给植物细胞的宿主。优选的，所述的宿主为农杆菌。

此外，利用本发明所述的miRNA序列，还可以点制miRNA芯片研究其表达谱以及miRNAs的调节方式，具有很高的应用价值。通过利用所述的miRNA制备的miRNA芯片，可分析miRNA基因的表达模式，可了解植物中相应的基因对胁迫等(比如：干旱，高盐等)的调节情况；可设计相应的策略，调节和修饰靶基因，来提高对胁迫等环境的适应能力，或者形成具有较好农艺性状的基因修饰作物。此外，利用miRNA芯片还可进行作物育种的分子筛选。根据miRNA芯片的杂交结果，可有针对性地筛选具有某种表达模式的植株，并选育成稳定品系。提高育种的选择效率。

本发明的主要优点在于：

从水稻的不同发育阶段的种子中分离获得一类新的miRNA，这些miRNA能够特异性结合到mRNA的相应部位，影响相应的mRNA的转录作用，从而影响相应的基因的表达。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1 miRNA的获得

1.RNA抽提

选用粳稻中花11号，在人工气候室(光周期为：28℃光照12小时与22℃黑暗12小时)中栽培，3个月完成整个生命周期。

播种后60天开花，分别在开花后3天、6天、9天、12天采收水稻种子。种子材料液氮中研磨后，用TRIZOL试剂盒，按照TRIZOL试剂盒自带的说明书提取总RNA。

2.small RNA序列的获得和筛选

用20％PAGE胶回收18～26nt的small RNA，把small RNA克隆入测序载体Tag vector pMBS I(购自Solexa公司)后，用MPSS技术测序得到Signature序列，屏蔽掉可能为接头来源的序列部分，所用方法是：将全长的Signature序列和测序载体序列比较，序列3’端和载体完全匹配的认为是载体序列，并将可信性较低(如测序信号很低等)的序列过滤掉。

3.miRNA的鉴定

用BLAST程序(NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov)把small RNA Signature序列定位到水稻染色体上(TIGR注释信息，www.tigr.org)，剔除在基因组上没有匹配的序列。

以Rfam数据库(TIGR注释信息，www.tigr.org)为参考，去除rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等。

在剩下的small RNA序列中，为了鉴别其中的miRNA，本发明人用Perl语言(www.perl.com)编写了一个脚本程序，以400bp的窗口(window)在基因组上选取包含所述small RNA的前体序列，用RNAfold软件(www.tbi.univie.ac.at)预测其二级结构。同时满足以下几个标准的small RNA被鉴定为miRNA：

①miRNA定位在前体结构的某一臂上(5’或3’)，并且前体结构自由能最低；

②以miRNA为中心的25nt中，错配数不得大于7；

③前体结构的茎上没有大的环状结构。

4.结果

通过前述筛选，获得137条新的成熟miRNA，如SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：137(表1)所示。这些miRNA的前体miRNA的序列如SEQ ID NO：138-SEQID NO：274(表2)所示。

表1

表2

表2中各序列的特点是可以形成茎环结构，表1中各成熟的miRNA来自表2中相应的茎环结构的茎的其中一侧。并且，表2中的miRNA的前体与表1中的各miRNA是一一对应的，对应关系如下：

实施例2miRNA对于植物基因表达的影响

用miRNA基因特异的引物，以基因组DNA为模板，经过PCR获得miRNA基因(即前体miRNA)片段。将上述片段克隆至双元载体pBI101(购自Clontech公司)的多克隆位点上，并通过常规的根农杆菌法将重组载体转化水稻幼胚，诱导幼胚分化成水稻植株。

用植物的抗性筛选标记潮霉素抗性，筛选转化的植物，检测转化植株中miRNA对靶基因的修饰作用，并可通过与野生型植株进行对比来区别转化植株的表型变化。

实施例3水稻中花11的多种组织中的miRNA表达谱的测定

(1)制备miRNA芯片

将表1提供的miRNA序列转换成反向互补序列，根据产生序列的GC比等特征在序列两端加上10-20nt的连接序列；核心序列不同，连接序列也不同。连接序列可以由程序随机产生，连接序列和核心序列形成的探针满足以下条件：

1)探针序列中，同一种核苷酸(A、C、G、T)的数量不能超过序列总数的50％；

2)任何连续的A、T或C、G的数量不能超过序列总数的25％；

3)G、C含量占序列总数的40％-60％；

4)探针序列不能自杂交，即探针序列中互补片段的长度不能超过探针长度的30％。

为使合成的探针稳定的结合在玻片上，采用常规的方法在合成后探针的5’端进行糖基修饰。

先将玻片的表面进行烷基化修饰，以提高结合能力。采用常规的芯片点样方法进行点样，为了检测杂交试验的可重复性，每个探针在玻片上点3-6个杂交点。

(2)提取植物组织small RNA

Trizol一步法提取组织的总RNA，通过异丙醇沉淀法浓缩RNA，用分光光度计定量，甲醛变性凝胶电泳质检总RNA的质量。取50-100μg总RNA用Ambion’s miRNA Isolation Kit(Cat#.1560)分离small RNA。利用常规标记方法(T4 RNA连接酶标记法)进行标记，标记底物是cy3，然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于与芯片杂交。

(3)杂交

将RNA溶于16μL杂交液中(15％甲酰胺；0.2％SDS；3×SSC；50×Denhardt’s)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗4min，而后在0.2×SSC液体中室温洗4min。

玻片甩干后即可用于扫描。

(4)表达谱测定

A.miRNA表达数据的处理

准备水稻中花11的多种组织(包括：种子、叶、根、胚乳、胚)，采用常规方法分别分离small RNA，采用实施例2制备的芯片，根据实施例3中的方法进行芯片杂交，获得每个组织中的所有miRNA的表达结果。各种组织需要生物重复和技术重复。

B.miRNA表达谱的编制

用相关软件，将所有数据归一化处理。用整张芯片所有信号中为数相等的方法规一化。计算相同组织所有miRNA信号的平均值。

用TIGR的MeV v3.1显示所有miRNA在不同组织中的表达情况，编制成miRNA表达谱。结果如图1所示。

由表达图谱结果显示，大部分miRNA的表达具有组织特异性，集中在一到两个组织中表达，提示miRNA在特异的组织行使功能。另外，大部分miRNA在胚乳中表达都很低，和基因mRNA的表达模式相似。因此可以通过影响miRNA的表达模式，来很大程度上改变目标基因的表达模式，而起到改变作物农艺性状等的目的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种分离的miRNA，其特征在于，所述的miRNA选自：

(i)序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137所示的miRNA；或

(ii)与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137任一所示序列互补的miRNA。

2.如权利要求1所述的miRNA，其特征在于，所述的miRNA分离自禾本科植物。

3.如权利要求1所述的miRNA，其特征在于，所述的植物是水稻。

4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸可被植物细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可在植物细胞内被剪切且表达成权利要求1所述的miRNA。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸含有式I所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向    式I，

式I中，

Seq_正向为可在植物细胞中表达成权利要求1所述的miRNA的核苷酸序列，

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在植物细胞中表达成权利要求1所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列。

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补，

式I所示的结构在转入植物细胞后，形成式II所示的二级结构：

式II，

式II中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

6.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，

所述的miRNA具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137任一所示的序列；或者所述的前体miRNA具有SEQ ID NO：138-SEQ ID NO：274任一所示的序列。

7.一种抑制目的基因表达的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1)提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸可被植物细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可在植物细胞内被剪切且加工成能够与该目的基因对应的mRNA的至少一部分序列互补的miRNA；

(2)将(1)中所述的多核苷酸导入到植物细胞中，从而通过剪切目的基因或者抑制基因翻译的方式来抑制所述目的基因的功能。

8.权利要求1所述的miRNA的用途，其特征在于，用于制备抑制或者调节目的基因表达的组合物。

9.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的miRNA，或权利要求4所述的多核苷酸。

10.一种植物细胞，其特征在于，它是选自下组：

(a)用权利要求9所述的载体转化或转染的细胞；或

(b)用权利要求4所述的多核苷酸转化或转染的细胞。

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