CN104774837A - 9种植物微小核糖核苷酸及其应用 - Google Patents
9种植物微小核糖核苷酸及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
9种植物微小核糖核苷酸及其应用,属于药物技术领域。本发明提供了芸香科植物来源的9种microRNA序列及其前体序列,以及这9种microRNA在肿瘤、非酒精性脂肪肝疾病治疗中的用途。
Description
技术领域
本发明属于药物技术领域,具体涉及9种植物微小核糖核苷酸及其应用。
背景技术
微小核糖核酸(MciroRNA,miRNA)是一类特殊的非编码单链小分子RNA,由19~25个核苷酸组成,是近10年来生物学研究的热点。大量研究证实,动物体内的miRNA可通过抑制靶mRNA翻译而降低相应蛋白合成,广泛参与细胞活动的一系列生理及病理活动过程,包括细胞发育、细胞调亡、细胞代谢、肿瘤形成、病毒感染及免疫应答等。miRNA作为调控细胞功能的关键因子,其与人体疾病的发生发展密切相关。当生物体体内 Dicer 酶缺失或不足时,内源性 miRNA 无法正常生成,从而导致干细胞的丢失和细胞周期的改变、早期胚胎体致死和器官发育异常。因此,miRNA可作为疾病早期诊断及预后的生物标志物,亦可作为药物干预的新靶点和新途径。
由于miRNA 不仅在基因位置上保守,序列上也呈现出高度的同源性。一些植物内源性的核苷酸类物质通过日常饮食吸收进入体内后,可被体内的Dicer 酶剪切,产生一类类似于miRNA的核苷酸类物质,进而影响人体mRNA的表达。近年来,植物miRNA被证实是一类新的药效物质,可跨界调控人体基因大豆、玉米(根、叶及种子)、大枣中的一些miRNA均可以通过日常饮食吸收进入血内,并具有一定的组织分布选择性。牛奶中也含有大量的具有免疫调控功能的miRNA。相对于动物来源的miRNA,植物来源的miRNA由于其基因编码末端本身是2-O-甲基化修饰的,其化学结构更为稳定,即使采用高碘酸钠、福尔马林等强氧化剂、强腐蚀剂进行处理,其结构亦不产生影响;即使经过了高温蒸煮、消化系统的代谢等过程,植物来源miRNA的结构依然没有发生变化,不被降解,仍然可以在血液中检出,在种间的“穿梭”仍能保持稳定的状态,表明了植物miRNA结构的高度稳定性。
由此我们推测,miRNA也可能是中药的活性成分之一,并且不同于以往中药或中药活性成分进入人体调节其他分子的作用机制,中药miRNA可以直接调节人体mRNA表达。因此,利用miRNA技术多个视角探讨研究中医药具有广阔的前景。为了验证这些检测到的植物miRNA序列的确来源于植物,对人/小鼠血清的total RNA进行高碘酸钠处理,对人/小鼠血清中检测到的几个植物miRNA进行miRNA测序和qPCR鉴定。由于高碘酸钠为强氧化剂,能够氧化动物来源的miRNA的2’、3’位自由羟基,导致动物来源的miRNA在进行miRNA测序和qPCR时不被检测到或者检测丰极低。植物来源的miRNA由于其末端本身是2-O-甲基化修饰的,高碘酸钠处理对对其结构不产生影响,所以在进行miRNA测序和qPCR时其检测表达量几乎不产生变化。从而证明几个miRNA的确来源于植物。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明的目的在于设计提供9种来源于植物的治疗肿瘤和非酒精性脂肪肝疾病的microRNA及其应用的技术方案。
所述的用于制备治疗肿瘤和非酒精性脂肪肝疾病的药物,其特征在于包含9种植物microRNA的任一种,所述的9种植物microRNA分别为csi-miR3952、csi-miR482b、gma-miR393a、csi-miR482c、gma-miR396a、gma-miR159a、csi-miR172a、csi-miR530a、cca-miR167。
所述的用于制备治疗肿瘤、非酒精性脂肪肝疾病的药物,其特征在于9种植物microRNA 的RNA包含如下序列:csi-miR3952核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,csi-miR482b核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,gma-miR393a核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,csi-miR482c核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示,gma-miR396a核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,gma-miR159a核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示,csi-miR172a核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示,csi-miR530a核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示,cca-miR167核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
所述的用于制备治疗肿瘤、非酒精性脂肪肝疾病的药物,其特征在于9种植物microRNA 的前体RNA包含如下序列:csi-miR3952前体核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示,csi-miR482b前体核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示,gma-miR393a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示,csi-miR482c前体核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示,gma-miR396a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示,gma-miR159a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示,csi-miR172a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示,csi-miR530a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示,cca-miR167前体核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
所述的9种植物microRNA中任一种或几种在制备治疗肿瘤、非酒精性脂肪肝疾病的药物中的应用,所述的9种植物microRNA分别为csi-miR3952、csi-miR482b、gma-miR393a、csi-miR482c、gma-miR396a、gma-miR159a、csi-miR172a、csi-miR530a、cca-miR167。
所述的应用,其特征在于9种植物microRNA 的RNA包含如下序列:csi-miR3952核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,csi-miR482b核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,gma-miR393a核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,csi-miR482c核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示,gma-miR396a核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,gma-miR159a核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示,csi-miR172a核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示,csi-miR530a核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示,cca-miR167核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
所述的应用,其特征在于9种植物microRNA 的前体RNA包含如下序列:csi-miR3952前体核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示,csi-miR482b前体核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示,gma-miR393a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示,csi-miR482c前体核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示,gma-miR396a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示,gma-miR159a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示,csi-miR172a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示,csi-miR530a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示,cca-miR167前体核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
本发明一方面提供了一种治疗肿瘤和非酒精性脂肪肝疾病的药物,该药物具有抗肿瘤细胞增殖,改善肝脏脂肪积聚,本发明另一方面确定了一种治疗肿瘤和非酒精性脂肪肝疾病的药物的应用,其可作为治疗肺癌、结肠癌、非酒精性脂肪肝炎。
附图说明
图1 miRNA抑制 HepG2 细胞脂肪变性。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例1:miRNA的筛选及鉴定
选择新鲜或阴干的桔皮,分别用于喂食小鼠和miRNA 测序(3个生物学重复)。两组ICR小鼠(18~20 g),共计6只,分别禁食8 h后,对照组禁食不禁水,实验组灌食桔皮匀浆液。于给药2 h后采集相应小鼠血液,分离血浆,分别提取total RNA。质检合格后制备文库,采用Illumina Hiseq2000进行样本测序分析。根据测序结果,选择在桔皮miRNA测序中发现并有较高表达丰度,在喂食小鼠饲料的小鼠血浆miRNA测序中未发现,在灌食桔皮组的小鼠血浆miRNA测序中发现并有较高表达丰度的miRNA,这些miRNA作为植物来源的miRNA在小鼠体内发挥生物学功能的可能性很大。对于这些植物来源的miRNA(选择10-15个表达丰度相对高的),通过qPCR分别在小鼠灌食桔皮的血浆miRNA和桔皮miRNA进行鉴定。最终选择csi-miR3952、csi-miR482b、gma-miR393a、csi-miR482c、gma-miR396a、gma-miR159a、csi-miR172a、csi-miR530a、cca-miR167为桔皮中存在的,并可吸收入血的miRNA。比较其表达量在喂食桔皮小鼠血浆中随着时间变化的趋势,基本判定这些miRNA是来自于桔皮。
实施例2:抗肿瘤药效试验
1. 体外抗肿瘤实验
1.1 对肿瘤细胞增殖的影响
取培养3~4d处于指数生长期的培养细胞一瓶,加入适量的0.25%Trypsin-EDTA液,使贴壁细胞脱落,用10%胚牛血清的RPMI 1640培养基配成1×104个细胞/ml悬液。取96孔平板,每孔加细胞悬液100μL,置37℃、5%CO2及100%湿度培养箱中培养24h后,每孔加入不同浓度的通过化学方法合成的csi-miR3952、csi-miR482b、gma-miR393a、csi-miR482c、gma-miR396a、gma-miR159a、csi-miR172a、csi-miR530a、cca-miR167(csi-miR3952核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,csi-miR482b核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,gma-miR393a核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,csi-miR482c核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示,gma-miR396a核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,gma-miR159a核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示,csi-miR172a核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示,csi-miR530a核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示,cca-miR167核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示,csi-miR3952前体核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示,csi-miR482b前体核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示,gma-miR393a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示,csi-miR482c前体核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示,gma-miR396a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示,gma-miR159a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示,csi-miR172a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示,csi-miR530a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示,cca-miR167前体核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示),每个浓度设5个复孔,同时设溶剂对照组和阳性对照组(紫杉醇)。继续置培养箱培养48 h。MTT用无血清RPMI1640培养基配成1mg/ml溶液,每孔加50μl,37℃温浴4h,去上清液,加入200μl DMSO,振摇5min,以相应试剂为空白,用酶标仪于490nm处读取各小孔的吸光度。以溶剂对照组处理的肿瘤细胞为对照组,计算药物对肿瘤细胞的抑制率。
2. 体内抗肿瘤实验
2.1 对Lewis肺癌小鼠瘤重的影响
取C57BL/6小鼠110只,雌雄各半,随机分组,分别为模型组,阳性组,以及9个植物miRNA,每个给药治疗一组。每组10只。将制备好的1×107/ml肿瘤细胞混悬液按每只0.2 mL接种于小鼠右侧腋窝皮下。接瘤后第7天开始连续尾静脉注射给药7 d。miRNA分别皮下注射给药50μg/只,0.2 ml/次,1次/d。模型组给同体积蒸馏水,阳性组给同体积紫杉醇 (20 mg/kg)。停药后第2天剥瘤称重,计算抑瘤率。
抑瘤率=(模型组平均瘤重-给药组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100%
2.2 对A549肺癌小鼠瘤重的影响
取6-8周龄的雄性裸小鼠,随机分组,分别为模型组,阳性组,以及9个植物miRNA,每个给药治疗一组,每组10只。适应性饲养3天后,于每只小鼠腋下注入1×106/ml的A549细胞,继续饲养14天左右,至肿瘤长至100-200cm3体积,进行药物治疗。阳性组给予紫杉醇20 mg/kg;miRNA分别皮下注射给药50μg/只,0.2 ml/次,1次/d。连续给药7天,停药后第2天处死裸小鼠,剥瘤称重,计算抑瘤率。采用western blot技术,检测肿瘤组织相关凋亡基因的表达情况。
2.3 对HT29结肠癌小鼠瘤重的影响
取6-8周龄的雄性裸小鼠,随机分组,分别为模型组,阳性组,以及9个植物miRNA,每个给药治疗一组,每组10只。适应性饲养3天后,于每只小鼠腋下注入1×106/ml的HT29细胞,继续饲养14天左右,至肿瘤长至100-200cm3体积,进行药物治疗。阳性组给予紫杉醇20 mg/kg;miRNA分别皮下注射给药50μg/只,0.2 ml/次,1次/d。连续给药7天,停药后第2天处死裸小鼠,剥瘤称重,计算抑瘤率。采用western blot技术,检测肿瘤组织相关凋亡基因的表达情况。
3结果
3.1 对肿瘤细胞生长的体外抑制作用
分别经过9个植物miRNA处理48h后,不同肿瘤细胞的生长受到不同程度的抑制,在给予50 nmol/ml的质量浓度范围内, 除SGC-7901细胞外,gma-miR396、gma-miR393a、csi-miR530a、cca-miR167、csi-miR3952对人肺腺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG-2、人结肠癌细胞HT29、SW480均显示了较强的体外抗肿瘤细胞抑制活性,但此9个植物miRNA对人胃癌细胞SGC-7901相对而言抑制作用较弱,证明此9个植物存在一定的肿瘤抑制活性差异及选择性适宜治疗肿瘤类型。从倒置显微镜下观察细胞形态, gma-miR396、gma-miR393a、csi-miR530a、cca-miR167、csi-miR3952作用后,肿瘤细胞除了增殖受到抑制外,也出现了大量的凋亡细胞,表现为胞浆浓缩、体积缩小、核碎裂呈小块、形成明显的凋亡小体(被Y叮橙染成黄色),证明gma-miR396、gma-miR393a、csi-miR530a、cca-miR167、csi-miR3952可能通过诱导凋亡的途径发挥肿瘤抑制作用。
表1 miRNA处理48 h后对肿瘤细胞生长的抑制率
3.2 对荷瘤小鼠瘤重的影响
表2 miRNA对瘤荷小鼠瘤重的影响
与模型组比较,*P<0.05
由表3可知,gma-miR396、gma-miR393a、csi-miR530a、cca-miR167、csi-miR3952对实体型肿瘤生长均有明显的抑制作用,能显著抑制Lewis鼠源肺癌、A549人肺癌、HT29人结肠癌细胞在小鼠体内的生长,但其余4个miRNA的疗效相对较差。
实施例3:抗非酒精性脂肪肝药效试验
1体外细胞模型建立及给药
HepG2细胞用含10%胎牛血清的MEM培养基,于37℃、含5% CO2的二氧化碳培养箱中培养。待培养皿中的细胞生长密度达到约80%,用胰酶消化,计数后接种于96孔板中,每孔3000个细胞,分别加50 nmol/ml植物miRNA在培养箱中培养24 h。将4 mmol/L油酸溶于无菌PBS中,按1∶9的比例加入到含4%无脂肪酸BSA的培养基溶液中,60℃摇床震摇过夜,以1∶1比例加入HepG2细胞培养液中。共培养24 h后用油红O染色,光镜下观察细胞胞浆内变化。同时以相同的方式培养细胞和药物处理,采用南京建成试剂盒,测定测定miRNA孵育24 h的模型细胞内甘油三酯含量及CPT1A酶活性。每组处理 5个重复。
2.结果
表3 miRNA对HepG2细胞甘油三酯代谢的影响
与模型组比较,*P<0.05
为了明确此9个植物miRNA对 NAFLD的潜在治疗作用,本实验利用油酸孵育 HepG2细胞,建立脂肪变性肝细胞模型,用此9个植物miRNA分别进行干预。实验结果表明,此9个植物miRNA可不同程度的减轻脂肪变性的 HepG2 细胞模型脂滴沉积,减少甘油三酯的含量。其中,已gma-miR396、gma-miR393a、csi-miR530a、cca-miR167、csi-miR3952的作用显著,与模型组相比具有统计学差异(P<0.05)。由附图1可以看出,模型组 HepG2 细胞的胞浆内有被染成桔红色的颗粒状脂滴。 而给予miRNA后,可不同程度的降低细胞内的桔红色脂滴数量。证明,此9个植物miRNA可降低细胞脂质沉积,具有潜在的治疗NAFLD作用。
肉毒碱棕榈酰转移酶Ⅰ(CPT1)位于线粒体外膜上,是脂肪酸氧化的限速酶。它有两种亚型,位于肝脏上的称为 CPT1A。它能催化长链脂酰CoA与肉碱合成脂酰肉碱,后者即可在线粒体内膜的肉碱-脂酰肉碱转位酶的作用下,通过内膜进入线粒体基质内,参与脂肪酸的β氧化。文献报道,非酒精性脂肪肝人群 CPT1A表达减少,适当增加 CPT1A可以降低肝脏甘油三酯的水平。因此,CPT1A活性增强在降低肝脏脂质沉淀上起重要作用。本实验表明,此9个植物miRNA可不同程度的增加CPT1A酶活性(其中gma-miR396、gma-miR393a、csi-miR530a、cca-miR167、csi-miR3952的作用最强),从而激活脂肪酸的β氧化,抑制脂肪酸的合成,减轻肝细胞甘油三酯含量。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省医学科学院
<120> 9种植物微小核糖核苷酸及其应用
<130> 1
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
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Claims (6)
1.用于制备治疗肿瘤、非酒精性脂肪肝疾病的药物,其特征在于包含9种植物microRNA的任一种或几种,所述的9种植物microRNA分别为csi-miR3952、csi-miR482b、gma-miR393a、csi-miR482c、gma-miR396a、gma-miR159a、csi-miR172a、csi-miR530a、cca-miR167。
2.如权利要求1所述的用于制备治疗肿瘤、非酒精性脂肪肝疾病的药物,其特征在于9种植物microRNA 的RNA包含如下序列:csi-miR3952核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,csi-miR482b核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,gma-miR393a核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,csi-miR482c核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示,gma-miR396a核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,gma-miR159a核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示,csi-miR172a核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示,csi-miR530a核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示,cca-miR167核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
3.如权利要求1所述的用于制备治疗肿瘤、非酒精性脂肪肝疾病的药物,其特征在于9种植物microRNA 的前体RNA包含如下序列:csi-miR3952前体核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示,csi-miR482b前体核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示,gma-miR393a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示,csi-miR482c前体核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示,gma-miR396a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示,gma-miR159a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示,csi-miR172a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示,csi-miR530a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示,cca-miR167前体核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
4.9种植物microRNA中任一种或几种在制备治疗肿瘤、非酒精性脂肪肝疾病的药物中的应用,所述的9种植物microRNA分别为csi-miR3952、csi-miR482b、gma-miR393a、csi-miR482c、gma-miR396a、gma-miR159a、csi-miR172a、csi-miR530a、cca-miR167。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于9种植物microRNA 的RNA包含如下序列:csi-miR3952核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,csi-miR482b核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,gma-miR393a核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,csi-miR482c核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示,gma-miR396a核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,gma-miR159a核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示,csi-miR172a核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示,csi-miR530a核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示,cca-miR167核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
6.如权利要求4所述的应用,其特征在于9种植物microRNA 的前体RNA包含如下序列:csi-miR3952前体核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示,csi-miR482b前体核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示,gma-miR393a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示,csi-miR482c前体核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示,gma-miR396a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示,gma-miR159a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示,csi-miR172a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示,csi-miR530a前体核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示,cca-miR167前体核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
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田允鸿: "miR-156a通过JAM-A蛋白抑制鼻咽癌细胞株上皮间充质转化", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
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