KR101613709B1 - 뇌암의 침윤 및 이동 억제용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 예방, 치료용 또는 암 전이 억제용 약제학적 조성물 및 암 치료제 또는 전이 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 암 세포 주변의 간엽유사줄기세포에서의 C5α 유전자의 발현 또는 C5α의 생성을 억제하는 경우 암 세포의 침윤 및 이동이 억제되는 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료 및 암 전이를 억제하는 데 이용될 수 있다.

Description

뇌암의 침윤 및 이동 억제용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Compositions for Inhibiting Invasion and Migration of Brain Cancer}

본 발명은 뇌암의 침윤 및 이동을 억제함으로써 암을 예방 또는 치료하거나, 암의 전이를 억제하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

간엽줄기유사세포(Mesenchymal stem like cells)는 다능성(multipotent) 미분화 세포로서 다양한 형태의 세포로 분화 할 수 있다. 이러한 특징으로 세포 치료제로서의 가능성을 갖고 많은 연구가 진행되어지고 있는 실정이다. 하지만 암과의 상호작용을 통한 그 역할은 밝혀지지 않은 상태이다.

신체는 방어체계를 제어하고 자극하는 신호물질(분비인자)을 통하여 선천성 면역반응 및 적응 면역반응을 일으킨다. 이러한 분비인자들은 당단백질이며, 펩타이드 중 하나이다. 분비인자는 많은 종류의 세포에서 방출되며 신경전달물질 및 호르몬과 유사한 화학적 신호를 보내기도 한다. 각 분비인자들은 세포 표면의 특이적 수용기에 결합할 수 있으며, 세포 내의 신호를 전달함으로써 세포기능을 바꾸는 역할을 한다. 보통 분비인자는 면역반응에 관여를 한다고 알려져 있지만, 실질적으로 암세포에 영향을 줄 수 있다는 보고가 최근 급격히 밝혀지고 있는 추세이다.

최근 Friedl P et al., Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147(5):992-1009(2011)에 세포외 기질 및 종양조직에 혼재된 스트로마 세포, 마이엘로이드 세포 및 혈관형성세포 등의 다양한 세포 유형들은 종양 증식, 침윤, 이동 및 전이 등의 각 단계에 특이적인 종양 미세환경 형성을 위하여 서로 다르게 다양한 영향을 미칠 것으로 예측되어 사이토카인을 위주로 하는 몇몇 분비인자들의 역할이 밝혀졌지만, 이들 세포 유형 각각의 악성화 단계 특이적인 미세환경 형성 조절 기전 및 악성화 단계 특이적인 미세환경 형성을 위한 암줄기세포 또는 암세포와 미세환경 형성 세포간의 상호작용 기전은 구체적으로 규명되지 않고 있다. 또한, Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol . 8(9):726-36, Inflammation joins the "niche". Cancer Cell. 14(5):347-9 및 Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment. Cell Stem Cell. 8(5):482-5 등의 논문을 통하여 면역염증세포, 스트로마 세포, 혈관형성세포, 간엽세포(mesenchymal cells) 및 암줄기세포로부터 분화된 다양한 종류의 암세포 등과의 상호작용으로 암줄기세포 특이적인 미세환경 (Niche)을 유지하는데, 이들 미세환경 형성세포들은 성장인자(growth factors)나 사이토카인(cytokine)을 포함하는 다양한 인자들을 분비하거나 혈관신생을 유도하기도 하여 암줄기세포가 생존하고 증식하기 적합한 환경을 제공한다고 알려져 있다.

종래의 암 치료방법은 암세포 자체의 신호기작과 분비물질에 대하여 초점이 맞추어져 실험이 진행되어지고 있었다. 또한, 그러한 결과들로 현재 사용되어지고 있는 항암제의 대부분은 암세포의 신호 또는 암세포의 특성을 표적으로 하는 경우가 많다. 하지만 이러한 치료방법에도 불구하고, 암은 쉽게 치료되지 못하고 재발이 일어나고 있으며 다른 부위로의 전이가 일어나고 있어 보다 본질적인 치료방법이 요구됨에 따라 암의 악성화, 전이 및 재발의 원인으로 판단되는 암세포의 주변 환경을 타겟으로 암을 치료하고자 하는 치료프로토콜 개발에 관심이 높아지고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 암의 예방 및 치료제, 그리고 암의 전이 억제제를 개발하기 위하여 암 자체의 신호기작이나 분비물질이 아닌 암의 주변환경으로부터 분비되는 분비 인자에 대한 연구를 수행하였다. 그 결과, 골수-간엽줄기유사세포에서는 발현되지 않고 뇌암-간엽줄기유사세포에서만 발현하는 사이토카인인 C5α가 암 세포의 침윤 및 이동을 억제함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 암 예방, 치료용 또는 암 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 암 치료제 또는 전이 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 C5α 유전자의 발현 또는 C5α의 생성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 예방, 치료용 또는 암 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공한다:

본 발명자들은 암의 예방 및 치료제, 그리고 암의 전이 억제제를 개발하기 위하여 암 자체의 신호기작이나 분비물질이 아닌 암의 주변환경으로부터 분비되는 분비 인자에 대한 연구를 수행하였다. 그 결과, 골수-간엽줄기유사세포에서는 발현되지 않고 뇌암-간엽줄기유사세포에서만 발현하는 사이토카인인 C5α가 암 세포의 침윤 및 이동을 억제함을 확인하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 유효성분은 본 발명의 C5α 유전자의 발현을 억제하는 siRNA, shRNA, miRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 본 발명의 유효성분은 C5α의 유전자 발현 또는 C5α 단백질의 생성을 감소시킴으로써, 암 세포의 침윤 및 이동을 저해하여 암을 예방, 치료하거나 암의 전이를 억제하는 효과를 나타낼 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉-다운 방법으로서 또는 유전자 치료 방법으로 제공된다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는 센스 가닥(본 발명의 C5α mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(본 발명의 C5α mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다.

siRNA 말단 구조는 C5α 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자 내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 발명의 siRNA는 생체 내 핵산 분해효소에 의한 빠른 분해를 막기위해 화학적으로 변형된 형태일 수 있다. siRNA가 쉽게 분해되지 않도록 안정하고 저항적이도록 하기위한 siRNA의 화학적 변형 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. siRNA의 화학적 변형에 가장 많이 사용되는 방식은 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 수식 방법(modification)이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 C5α 유전자의 발현을 억제하는 siRNA, shRNA, miRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 4868번째 내지 4894번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 C5α 유전자의 발현을 억제하는 siRNA는 서열목록 제2서열 내지 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 C5α 유전자의 발현을 억제하는 siRNA는 서열목록 제2서열 및 제3서열; 서열목록 제4서열 및 제5서열; 또는 서열목록 제6서열 및 제7서열을 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 C5α 유전자의 발현을 억제하는 siRNA는 서열목록 제2서열 내지 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로 구성된다. 본 발명의 다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 C5α 유전자의 발현을 억제하는 siRNA는 서열목록 제2서열 및 제3서열; 서열목록 제4서열 및 제5서열; 또는 서열목록 제6서열 및 제7서열로 구성된다. 상기 서열목록 제2서열, 제4서열 및 제6서열은 센스 가닥의 서열이고, 상기 서열목록 제3서열, 제5서열 및 제7서열은 안티센스 가닥의 서열이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "shRNA(short hairpin RNA)" 는 45 내지 70 뉴클레오티드의 길이를 가지는 단일가닥의 RNA로서 타겟 유전자 siRNA 염기서열의 센스와 상보적인 논센스 사이에 3-10개의 염기 링커를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후 플라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노 바이러스(adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 루프가 있는 헤어핀 구조의 shRNA가 만들어지고 세포 내의 다이서(dicer)에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 C5α 유전자의 발현을 억제하는 siRNA는 서열목록 제8서열 또는 제9서열을 포함한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 C5α 유전자의 발현을 억제하는 siRNA는 서열목록 제8서열 및 제9서열을 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 C5α 유전자의 발현을 억제하는 siRNA는 서열목록 제8서열 또는 제9서열로 구성된다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 C5α 유전자의 발현을 억제하는 siRNA는 서열목록 제8서열 및 제9서열로 구성된다. 상기 서열목록 제8서열은 센스 가닥의 서열이고, 상기 서열목록 제9서열은 안티센스 가닥의 서열이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "miRNA(microRNA)"는 21-25 뉴클레오타이드의 단일 가닥 RNA 분자로서, 타겟 mRNA의 파쇄 또는 해독단계에서의 억제를 통하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 조절물질이다. 이러한 miRNA는 두 단계의 프로세싱으로 이루어진다. 최초의 miRNA 전사체(primary miRNA)가 핵 안에서 Drosha라는 RNaseⅢ 타입 효소에 의해 70-90 염기 정도의 스템-루프 구조, 즉 premiRNA로 만들어지고, 이후 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)라는 효소에 의해 절단되어 21-25 염기의 성숙한 miRNA로 만들어진다. 이렇게 생성된 miRNA는 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억압자(post-transcriptional gene suppressor)로써 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도한다. miRNA는 다양한 생리학적 현상 및 질환에 관여한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "안티센스 올리고뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 C5α 유전자에 상보적이고 C5α 유전자 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, C5α mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 암은 뇌암이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 암-간엽줄기유사세포에 작용한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 간엽줄기유사세포는 뇌암-간엽줄기유사세포이다.

본 명세서의 용어 "간엽줄기유사세포"는 제대혈과 골수에 존재하는 골세포, 연골세포, 근육세포 및 섬유세포 등 골격계 세포로 분화되는 줄기세포인 중간엽줄기세포와 유사한 특징을 가진 세포를 의미한다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 C5α는 암 세포에서 분비되는 인자가 아니라 간엽줄기유사세포에서 분비되며, 뇌암-간엽줄기유사세포에서 본 발명의 C5α 유전자 발현이 증가함을 확인하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 C5α 유전자의 발현 또는 C5α의 생성을 억제하는 물질은 암 세포의 침윤(invasion) 및 이동(migration)을 억제한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 암 세포의 침윤 및 이동은 대조군에 대하여 10-80%, 20-80%, 30-80%, 40-80%, 40-70% 또는 40-60% 억제된다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 암 세포의 침윤 및 이동은 대조군에 대하여 20-70%, 30-70%, 30-60% 또는 35-60% 억제된다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 암 세포의 침윤은 대조군에 대하여 50-80%, 50-70% 또는 50-60% 억제된다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 암 세포의 이동은 대조군에 대하여 30-50%, 35-50% 또는 40-50% 억제된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 비강내 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여하며, 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 비경구 투여인 경우에는 비강내 주입이 적합하다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 혹은 1회 투여량은 0.000001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 암 치료제 또는 전이 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 뇌암환자로부터 분리된 간엽줄기유사세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 시험물질 처리된 간엽줄기유사세포에서의 C5α 유전자의 발현 또는 C5α의 생성을 분석하는 단계에서, 상기 C5α 유전자의 발현 또는 상기 C5α의 생성이 대조군에 대하여 감소되는 경우 상기 시험물질을 암 치료제 또는 전이 억제제로 판단한다.

본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 뇌암환자로부터 분리된 간엽줄기유사세포에 시험물질을 처리하는 단계

본 발명에 따르면, 우선 뇌암환자로부터 분리된 간엽줄기유사세포에 시험물질을 처리한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 동물은 포유류에 해당하는 동물을 모두 포함하며, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 동물은 인간이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 간엽줄기유사세포는 암-간엽줄기유사세포이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 간엽줄기유사세포는 뇌암-간엽줄기유사세포이다.

단계 (b): 시험물질 처리된 간엽줄기유사세포에서의 C5 α 유전자의 발현 또는 C5 α의 생성을 분석하는 단계

단계 (a) 실시 이후, 단계 (a)의 시험물질 처리된 간엽줄기유사세포의 본 발명의 C5α 유전자의 발현 또는 C5α의 생성을 분석한다. 본 발명의 C5α 유전자의 발현 또는 C5α의 생성이 시험물질 처리되지 않은 간엽줄기유사세포인 대조군에 대하여 감소되는 경우 상기 시험물질을 암 치료제 또는 전이 억제제로 판단할 수 있다.

본 발명의 암 치료제 또는 전이 억제제의 스크리닝 방법은 상술한 암 예방, 치료용 또는 암 전이 억제용 약제학적 조성물과 대상 질병 및 관련 사이토카인인 C5α를 공통으로 하기 때문에, 상기 약제학적 조성물과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 암 예방, 치료용 또는 암 전이 억제용 약제학적 조성물 및 암 치료제 또는 전이 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

(b) 본 발명에 따르면, 암 세포 주변의 간엽유사줄기세포에서의 C5α 유전자의 발현 또는 C5α의 생성을 억제하는 경우 암 세포의 침윤 및 이동이 억제되는 효과를 나타낸다.

(c) 따라서, 본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료 및 암 전이를 억제하는 데 이용될 수 있다.

도 1은 뇌암 세포 및 간엽줄기유사세포의 공배양에 의항 뇌 암세포의 침윤 및 이동 분석 결과를 나타낸다. 도 1a는 뇌 암세포 X01 및 뇌암의 주위에 존재하는 간엽줄기유사세포(MSLC0504, MSLC0713-2, MSLC0406)를 공배양한 경우 상기 X01 세포의 침윤 및 이동 능력이 증가하였으나, 상기 X01 세포를 골수에서 추출한 간엽줄기유사세포(BM-MSLC)와 공배양한 경우 침윤 및 이동 능력에 변화가 없음을 확인한 결과이다. 도 1b 및 1c는 상기 X01 세포 대신 뇌 암세포 GS11 세포를 사용하여 공배한 경우에도 상기 도 1a와 동일한 결과를 보임을 확인한 결과를 보여준다. 도 1d는 뇌 암세포와 뇌암-간엽줄기유사세포의 공배양 시 중간엽성 세포의 마커인 N-카데린의 발현이 증가함을 보여주는 결과이다. 도 1e는 상기 N-카데린의 발현을 면역형광염색법을 이용하여 관찰한 결과이다. 도 1f는 뇌 암세포와 뇌암-간엽줄기유사세포의 공배양 시 중간엽성 세포에서 이동성 및 침윤성을 조절하는 전사 조절인자인 β-카테닌 및 zeb1 발현 증가를 관찰한 결과이다.
도 2는 동소이식(orthotopic injection) 방법을 이용한 뇌암-간엽줄기유사세포에 의한 뇌 암세포의 이동성 및 침윤성의 증가를 확인한 결과이다. 도 2a는 마우스에 X01 및 뇌암-간엽줄기유사세포를 동시에 심은 군에서 암세포의 크기가 현저히 증가함을 확인한 결과이고, 고 2b는 암 덩어리에서 주변 정상 조직으로 침투된 세포들의 수를 H&E 염색법으로 관찰한 경우에도 X01 및 뇌암-간엽줄기유사세포를 동시에 심은 군에서 침투 정도가 유의성있게 증가됨을 관찰한 결과이다. 상기 침투 세포들은 zeb1의 발현도 증가됨을 조직염색법으로 확인하였다. 도 2c는 MRI 촬영을 통하여 GSC11 세포에서도 X01 세포와 동일한 결과를 나타냄을 확인한 결과이고, 도 2d는 GSC11 단독(GSC11) 및 GSC11+골수-간엽줄기세포군(GSC11+BM-MSC)은 동소이식 후 130일 정도 생존하는데 반해 GSC11+뇌암-간엽줄기유사세포군(GSC11+MSLC0504)은 50일 정도 생존하는 것을 확인하였다.
도 3은 뇌암-간엽줄기유사세포에서 생성된 어떠한 분비인자가 뇌 암세포의 이동성 및 침윤성을 조절하는지를 확인하기 위한 사이토카인 배열 실험 결과이다. 도 3a 및 3b는 뇌암-간엽줄기유사세포와 공배양한 배지에서 C5α, GROα, IL6 및 IL8의 발현이 증가되는 것을 확인한 결과이다. 도 3c 및 3d는 상기 사이토카인의 발현 위치가 뇌 암세포가 아닌 뇌암-간엽줄기세포에서 증가함을 확인한 결과이다. C5α의 경우 X01과 공배양하지 않은 뇌암-간엽줄기유사세포에서도 mRNA 레벨이 높고, X01과 공배양한 후에는 1.5배 정도 증가함을 관찰하였다.
도 4는 각 사이토카인의 siRNA를 이용하여 발현을 억제한 경우의 침윤 및 이동성 분석 결과를 나타낸다. 도 4a는 C5α, GROα, IL6 및 IL8 각각이 억제된 경우 모두 이동성 및 침윤성이 감소되지만, 그 중 C5α의 발현이 억제된 경우 거의 완벽히 이동 및 침윤 능력이 억제되어 뇌암-간엽줄기유사세포가 분비하는 인자 중 C5α가 뇌 암의 침투 능력을 조절하는 주요인자임을 확인하였다. 도 4b는 C5α 중화항체를 농도별로 처리한 경우에도 동일한 현상을 관찰한 결과이고, 도 4c는 C5α shRNA를 사용한 경우에도 동일한 결과를 보임을 확인한 결과이다. 도 4d는 GSC11 세포를 이용한 경우에도 C5α 중화항체 농도 의존적 침윤성 감소를 확인한 결과이며, 도 4e는 서로 다른 서열의 C5α siRNA 2종류로 C5α 발현을 억제한 후 3D 배양한 경우의 결과 역시 동일함을 확인한 결과이다. 도 4f는 N-카데린, β-카테닌 및 zeb1의 발현이 C5α 중화항체 농도 의존적으로 감소하는 경향을 확인한 결과이고, 도 4g는 siRNA를 이용한 경우에도 상기 3가지 단백질의 감소를 확인한 결과이다. 도 4h 및 4i는 C5α 재조합 단백질(rhC5α)을 직접 X01 및 GSC11 세포에 처리한 경우 농도 의존적으로 이동성 및 침윤성이 증가하는 것을 확인한 결과이다.
도 5는 동소이식 방법에 의한 인-비보에서의 C5α에 의한 뇌 암세포의 이동성 및 침윤성의 증가를 확인한 결과이다. 도 5a는 C5α shRNA를 형질주입(transfection)시킨 GA-MSLC와 X01를 함께 주입한 결과 증가되었던 암세포의 크기가 감소되는 것을 확인한 결과이고, 도 5b는 정상 주변조직으로의 암세포의 침투 및 zeb1의 발현이 C5α shRNA에 의해 감소함을 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 뇌 암세포의 침윤(invasion) 및 이동(migration) 분석

뇌 암세포 및 간엽줄기유사세포의 공배양

뇌 암 환자에서 추출한 뇌 암세포 주변에 존재하는 간엽줄기유사세포가 뇌 암세포의 표현형에 미치는 영향을 알아보기 위하여 공배양 시스템을 사용하였다. 공배양은 0.4 μm의 포어(pore)가 있어 세포는 이동할 수 없으나, 작은 크기의 분비인자들이 이동할 수 있는 6 트랜스웰 챔버(Cat. 3412, Corning Costar, 미국)를 이용하였다. 하위 챔버(bottom chamber)에는 다형성 교아종(GBM: Glioblastoma multiforms) 환자에서 분리한 뇌 암세포인 X01을 1.5×10⁵/2 ml 또는 2×10⁵/2 ml, 상위 챔버(upper chamber)에는 3명의 뇌암 4기 환자에서 추출한 간엽줄기유사세포(Mesenchymal stem like cells) 2×10⁵/1.5 ml를 넣어 72시간 동안 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

간엽줄기유사세포 배양액(CM: conditioned medium) 처리 및 3D 배양(3D culture) 시스템을 이용한 침윤 분석

간엽줄기유사세포에서 생성되는 분비인자에 의한 뇌 암세포의 침윤 능력에 미치는 영향을 알아보기 위하여 뇌 암세포에 간엽줄기유사세포의 배양액을 처리한 후 3D 배양 상에서 뇌 암세포의 침윤 정도를 측정하였다. 우선 60 mm 접시에 간엽줄기유사세포 4×10⁵/2.5 ml을 넣고 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하였다. 그 후 상등액을 4℃에서 3000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 간엽줄기유사세포 배양액(CM)을 회수하였다.

실제 생체 내에 있는 세포외 기질 성분과 유사한 마트리겔(matri-gel, Cat. 354234, BDBiosciences, 미국)을 24 웰에 넣고 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 30분간 굳힌 다음 뇌 암세포를 마트리겔에 로딩(loading)하였다. 그 후 2 ml CM을 처리하여 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포를 전자현미경으로 사진을 찍고 세포가 퍼져나간 면적을 계산하여 침윤 능력을 계산하였다.

세포 침윤성 및 이동성 분석(Boyden chamber motility assay)

세포의 침윤성 및 이동성을 측정하기 위하여 보이든 챔버 분석 키트(Cat. 3422, Corning Costar, 미국)를 이용하여 보이든 챔버 분석(boyden chamber assay)을 실시하였다. 하위 챔버에는 10% FBS 배지를 800 μl 넣었고, 젤라틴을 코팅한 필터가 있는 상위 챔버에 공배양한 세포 2×10⁵/200 μl를 분주 한 후 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 필터 윗부분의 세포를 닦아내고 디프-퀵 용액(Diff-quick solution, Cat. 38721, Sysmex, 일본)으로 염색을 한 후 필터 아래로 이동한 세포들을 임의로 5곳을 지정하여 측정하였다.

뇌 암세포의 침윤성 및 이동성 분석 결과

뇌 암세포와 뇌암 주위의 간엽줄기유사세포를 공배양한 군에서 뇌 암세포의 이동과 침윤능력이 증가하는 것을 확인하였으나, 골수에서 추출한 간엽줄기유사세포는 뇌 암의 이동 및 침윤성에 영향을 주지 않는 것을 관찰하였다. 이로써 골수-간엽줄기유사세포에서는 분비되지 않는 물질이 뇌암-간엽줄기유사세포에서 분비되어 뇌 암세포의 이동 및 침윤에 조절할 수 있음을 확인하였다(도 1a). 이와 같은 현상은 X01에서 뿐만 아니라 뇌암 4기의 다른 환자에서 추출한 뇌 암세포인 GSC11에서도 관찰되었다(도 1b 및 1c).

이동성 및 침윤성이 증가됨은 중간엽 세포의 표현형을 나타내는데 중간엽성 세포의 마커인 N-카데린(N-cadherin)의 단백질 발현을 뇌 암세포와 간엽줄기유사세포를 공배양 후 관찰하였다. 골수-간엽줄기유사세포와 공배양 한 군에서는 N-카데린의 발현에 변화가 없었지만 뇌암-간엽줄기유사세포와 공배양 한 군에서는 N-카데린이 유의성 있게 증가하였다(도 1d). 이러한 N-카데린의 발현을 면역형광염색법을 이용하여 관찰하였다(도 1e). 또한, 중간엽성 세포에서 이동성 및 침윤성을 조절하는 전사 조절인자인 β-카테닌(β-catenin)과 zeb1의 발현 또한 확연히 증가하는 패턴을 웨스턴 블롯팅으로 관찰하였다(도 1f).

인 비보(in-vivo) 실험

세포 내에서 관찰한 뇌암-간엽줄기유사세포에 의한 뇌 암세포의 이동성 및 침윤성의 증가를 동물실험에서도 적용되는지 확인하기 위하여 마우스 뇌에 X01을 심는 동소이식(orthotopic injection) 방법을 이용하였다. 뇌 암세포 및 간엽줄기유사세포를 PBS(phosphate-buffered saline)에 1×10⁵/10 μl, 2×10⁵/10 μl씩 부유시켜 단독 또는 공동으로 마우스 뇌에 동소 주입(orthotopic injection)을 실시하였다. 세포를 주입한 마우스는 2주, 5주 및 8주 간격으로 체중 측정, 생존그래프 기록 및 MRI 촬영을 하였다. 또한, 5주 된 마우스의 뇌를 추출하여 H&E 염색과 zeb1, β-카테닌(β-catenin), N-카데린(N-cadherin) 조직염색을 실시하였다.

X01을 단독으로 이식한 군, X01과 뇌암-간엽줄기유사세포를 동시에 이식한 군, X01과 골수-간엽줄기유사세포를 동시에 이식한 3가지 군으로 실험이 이루어졌고, 4-6주 후 마우스 뇌를 추출하여 암세포의 크기를 관찰하였다.

그 결과, X01과 뇌암-간엽줄기유사세포를 동시에 심은 군에서 암세포의 크기가 확연하게 증가하였고(도 2a), 암 덩어리에서 주변 정상 조직으로 침투(infiltration)된 세포들의 수를 H&E 염색법으로 관찰하였을 때도 X01을 단독으로 이식한 군 및 X01+골수-간엽줄기유사세포를 이식한 군에 비해 X01+뇌암-간엽줄기유사세포를 이식한 군에서 침투된 정도가 유의성있게 증가되어 있음을 관찰하였다(도 2b). 이렇게 침투된 세포들은 중간엽성 세포에서 많이 발현하고 하고 있는 전사조절인자인 zeb1의 발현 또한 증가되어 있음을 조직염색법으로 확인하였다(도 2b).

이와 같은 현상은 X01에서 뿐만 아니라 GSC11에서도 관찰되었는데, GSC11과 뇌암-간엽줄기유사세포를 동시에 이식한 군이 다른 두 군에 비하여 암덩어리의 크기가 확연히 증가하였음을 MRI 촬영을 통해 확인하였고(도 2c), 그에 따라 마우스 생존기간이 상이함을 확인하였다. GSC11을 단독으로 이식한 군 및 GSC11+골수-간엽줄기유사세포를 이식한 군은 동소이식 후 130일 정도 생존한 것에 반해, GSC11+뇌암-간엽줄기유사세포를 이식한 군은 50일 정도 생존하는 것을 관찰할 수 있었다(도 2d).

실시예 2: 뇌 암세포의 이동성 및 침윤성을 조절하는 분비 인자 확인

실시예 1의 뇌암-간엽줄기유사세포와 뇌 암세포를 공배양한 시스템은 세포는 이동할 수 없는 크기인 0.4 μm 포어 크기를 가지고 있는 챔버를 이용한 공배양 시스템이므로 세포에서 생성된 분비인자들만이 이동 가능하다. 따라서 뇌암-간엽줄기유사세포에서 생성된 어떠한 분비인자가 뇌 암세포의 이동성 및 침윤성을 조절하는지를 확인하기 위하여 공배양한 배지(conditioned media)를 회수하여 사이토카인 배열(cytokine array)을 실시하였다.

사이토카인 배열

뇌 암세포와 뇌암-간엽줄기유사세포를 공배양한 배양액을 회수하여 각각의 사이토카인 단백질 발현을 비교하기 위해 사이토카인 배열 키트(Cat. ARY005, R&D systems, 미국)를 이용하여 사이토카인 배열를 실시하였다. 뇌 암세포와 간엽줄기유사세포 공배양액 1.5 ml을 사이토카인 배열 막(cytokine array membrane)에 로딩한 후 검출 항체(detection antibody)와 반응시키고 스트렙타비딘-HRP와 ECL 용액으로 반응시켜 X-선 필름으로 감광시켰다. 이미지 J 프로그램으로 각 스팟의 밀도를 계산하여 단백질 발현을 산출하였다.

그 결과 뇌암-간엽줄기유사세포와 공배양한 배지에서 C5α, GROα, IL6 및 IL8의 발현이 증가되는 것을 확인하였고, 이것은 골수-간엽줄기유사세포와 공배양한 CM에서는 관찰되지 않는 현상이었다(도 3a 및 3b).

그렇다면 이러한 사이토카인의 발현증가가 뇌 암세포 자체에서 증가하는 것인지, 뇌암-간엽줄기유사세포에서 증가하는 것인지를 알아보기 위하여 공배양 후 각각의 세포에서 mRNA를 추출하여 4가지 사이토카인의 발현을 관찰하였다.

그 결과, 뇌 암세포에서는 상기 4가지 사이토카인 모두 발현 변화가 없었고, X01과 공배양한 뇌암-간엽줄기유사세포에서 사이토카인의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 특이한 것은 C5α의 경우 공배양하지 않은 뇌암-간엽줄기유사세포에서도 mRNA 레벨이 높고, 공배양한 후에는 1.5배 정도 증가함을 관찰하였다(도 3c 및 3d).

뇌 암세포의 침윤성 및 이동성을 증가시키는 사이토카인 확인

상기 단백질 및 mRNA의 발현에 변화가 있는 4가지의 사이토카인 중 어떤 인자가 뇌암-간엽줄기유사세포와 뇌 암세포를 공배양 했을 때 이동성 및 침윤성을 증가시키는지를 확인하기 위하여 각 인자의 siRNA 및 C5α shRNA를 제작하여(Genolution Pharmaceuticals, Inc.에 의뢰하여 제작)로 각각의 사이토카인을 발현을 억제한 후 공배양하여 침윤 및 이동 분석을 실시하였다. 제작한 siRNA 서열은 하기 표 1과 같다.

그 결과, 상기 4가지 사이토카인의 siRNA(서열목록 제2서열, 제3서열 및 서열목록 제10서열 내지 제15서열)가 모두 이동성 및 침윤성에 관여하기는 하지만, 그 중 C5α의 siRNA(서열목록 제2서열 및 제3서열)가 거의 완벽히 침윤 및 이동 능력을 억제하는 것을 관찰하였다. 따라서 뇌암-간엽줄기유사세포가 분비하는 인자 중 C5α가 뇌암의 침투 능력을 조절하는 주요인자임을 확인하였다(도 4a). 또한, C5α 중화항체(neutralizing antibody)를 농도별로 처리한 경우에도 동일한 현상을 관찰하였고(도 4b), C5α shRNA(서열목록 제8서열 및 제9서열)를 사용한 실험에서도 같은 결과를 얻었다(도 4c).

GSC11을 이용하여 실험한 경우 역시 C5α 중화항체 농도 의존적으로 침윤성이 감소됨을 관찰하였다(도 4d). 다른 C5α siRNA(서열목록 제4서열 내지 제7서열)로 C5α 발현을 억제한 후 3D 배양 상에서 관찰한 결과도 동일하였다(도 4e). 또한, 실시예 1에서 뇌암-간엽줄기유사세포와 공배양 후 증가되었던 N-카데린, β-카테닌 및 zeb1의 발현을 관찰한 결과 C5α 중화항체 농도 의존적으로 감소하는 경향을 확인하였고(도 4f), 상기 C5α siRNA(서열목록 제6서열 및 제7서열)를 이용한 실험에서도 상기 N-카데린, β-카테닌 및 zeb1 단백질이 확연히 감소함을 알 수 있었다(도 4g).

다음으로 C5α 단백질을 직접 뇌 암세포인 X01 및 GSC11에 각각 처리하여 침윤성 및 이동성 분석을 실시한 결과 C5α 재조합 단백질 농도 의존적으로 이동성 및 침윤성이 증가하는 것을 관찰하였다(도 4h 및 4i).

이와 같은 결과를 종합할 때, C5α가 뇌 암세포의 침윤능력을 증가시키는데 중요한 인자임을 알 수 있었다.

인 비보( in - vivo ) 실험

세포 내에서 관찰한 뇌암-간엽줄기유사세포에서 분비하는 사이토카인인 C5α에 의한 뇌 암세포의 이동성 및 침윤성의 증가가 인 비보 시스템에서도 적용되는지 여부를 확인하기 위하여 마우스 뇌에 뇌 암세포를 이식하는 동소이식 방법을 이용하였다.

C5α의 발현을 억제하기 위하여 C5α shRNA를 형질주입(transfection)시킨 GA-MSLC와 X01을 함께 주입한 결과 증가되었던 암세포의 크기가 C5α shRNA에 의해 감소되는 것을 확인하였고(도 5a), 정상 주변조직의 침투가 C5α shRNA에 의해 감소되는 것을 확인하였다(도 5b). zeb1의 발현 역시 감소하는 현상을 나타내었다(도 5b).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Pharmaceutical Compositions for Inhibiting Invasion and Migration of Brain Cancer <130> PN140165 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5480 <212> DNA <213> C5a <400> 1 tatatccgtg gtttcctgct acctccaacc atgggccttt tgggaatact ttgtttttta 60 atcttcctgg ggaaaacctg gggacaggag caaacatatg tcatttcagc accaaaaata 120 ttccgtgttg gagcatctga aaatattgtg attcaagttt atggatacac tgaagcattt 180 gatgcaacaa tctctattaa aagttatcct gataaaaaat ttagttactc ctcaggccat 240 gttcatttat cctcagagaa taaattccaa aactctgcaa tcttaacaat acaaccaaaa 300 caattgcctg gaggacaaaa cccagtttct tatgtgtatt tggaagttgt atcaaagcat 360 ttttcaaaat caaaaagaat gccaataacc tatgacaatg gatttctctt cattcataca 420 gacaaacctg tttatactcc agaccagtca gtaaaagtta gagtttattc gttgaatgac 480 gacttgaagc cagccaaaag agaaactgtc ttaactttca tagatcctga aggatcagaa 540 gttgacatgg tagaagaaat tgatcatatt ggaattatct cttttcctga cttcaagatt 600 ccgtctaatc ctagatatgg tatgtggacg 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gaccgaaucu uguuucc 27 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL6 siRNA sense <400> 12 cuuaauaaag aaauacauuu u 21 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL6 siRNA antisense <400> 13 uugaauuauu ucuuuaugua a 21 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL8 siRNA sense <400> 14 gaaauuauug uaaagcuuuu u 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL8 siRNA antisense <400> 15 uucuuuaaua acauuucgaa a 21

Claims (11)

1. C5α 유전자의 발현 또는 C5α의 생성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 뇌암 예방, 치료용 또는 뇌암 전이 억제용 약제학적 조성물로서, 상기 C5α 유전자의 발현 또는 C5α의 생성을 억제하는 물질은 서열목록 제2서열 내지 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 siRNA 또는 서열목록 제8서열 또는 제9서열을 포함하는 shRNA이고, 상기 약제학적 조성물은 뇌암-간엽줄기유사세포에 작용하는 약제학적 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제 1 항에 있어서, 상기 서열목록 제2서열 내지 제7서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 siRNA 또는 서열목록 제8서열 또는 제9서열을 포함하는 shRNA는 암 세포의 침윤(invasion) 및 이동(migration)을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 암 세포의 침윤 및 이동은 대조군에 대하여 10-80%을 억제되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
10. 다음 단계를 포함하는 뇌암 치료제 또는 전이 억제제의 스크리닝 방법:
    (a) 동물로부터 분리된 뇌암-간엽줄기유사세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 시험물질 처리된 뇌암-간엽줄기유사세포의 C5α 유전자의 발현 또는 C5α의 생성을 분석하는 단계에서, 상기 C5α 유전자의 발현 또는 상기 C5α의 생성이 대조군에 대하여 감소되는 경우 상기 시험물질을 뇌암 치료제 또는 전이 억제제로 판단한다.
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 간엽줄기유사세포는 뇌암-간엽줄기유사세포인 것을 특징으로 하는 방법.

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