CN108676883A - 一种淋巴瘤miRNA芯片、制备方法、检测方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种淋巴瘤miRNA芯片、制备方法、用途、检测的方法以及含有淋巴瘤miRNA芯片的试剂盒,其中该芯片包含HIV‑DLBCL(艾滋病相关性弥漫大B细胞淋巴瘤)和HIV‑RH(艾滋病患者淋巴结反应性增生)组织表达谱分析的39个表达差异有统计学意义的miRNA,为进一步研究差异表达miRNA在HIV‑DLBCL发病机制中的作用及其靶基因的生物学效应奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因芯片技术领域,具体涉及一种淋巴瘤miRNA芯片、制备方法、检测方法和用途。
背景技术
人免疫缺陷病毒感染/获得性免疫缺陷综合征相关淋巴瘤[humanimmunodeficiency virus(HIV)/acquired immunodeficiency syndrome(AIDS)-relatedlymphoma]简称ARL,是一组与HIV感染有关的淋巴组织异质性肿瘤。近年来流行病学资料显示,HIV相关淋巴组织肿瘤已逐渐取代Kaposi肉瘤,成为最为常见的AIDS相关恶性肿瘤。据估计,HIV/AIDS患者发生淋巴瘤的相对危险性是普通人群的60-200倍。ARL具有独特的临床特征,包括涵盖几乎所有的B细胞类型,倾向系统性播散和结外器官病变,临床经常呈侵袭性进展。ARL亚型多样性可能与以下因素有关:(1)HIV感染和免疫监视系统的破坏;(2)病毒感染:EB病毒感染或其他病毒的感染;(3)基因突变;(4)细胞因子调节失调;(5)组织起源不同。肿瘤发生是多基因突变、多步骤积累的过程,揭示肿瘤的DNA/RNA变化是肿瘤研究的重要手段。
淋巴瘤的标本难以收集,主要原因是由于活检后一经确诊,病人不再进行手术治疗,而是非手术的化放疗,致标本来源非常困难。由于ARL组织来源稀少而珍贵,导致研究工作受到极大限制,经文献检索,我国仅见ARL散发病例报道。主要原因:(1)艾滋病伴发淋巴瘤大多为中晚期患者,取材存在风险性,患者及家属不愿在知情同意书上签字;(2)临床医师不愿意冒取材所面临的种种风险,一旦考虑艾滋病伴发淋巴结肿大,首先采取抗结核治疗,无效患者则采取试验性化疗方法来推断诊断。AIDS及其相关肿瘤是人类探讨肿瘤形成与免疫监视系统关系的独特模型,对ARL的认识、临床表现、病理诊断及鉴别诊断、分子发病机制以及治疗已经成为医学研究面临的实际问题。
基因芯片所揭示的重要信息,如某些信号转导通路已经被确认为肿瘤治疗标靶并进入临床测试阶段。miRNA芯片的检测原理就是,用Cy-3对总RNA样品进行标记,然后与miRNA芯片杂交,通过扫描芯片上绿光信号的强度,计算出该样品中miRNA的表达量,从而了解该样品中哪些miRNA的表达量出现了异常。然而,基因/RNA芯片技术在ARL中的研究和应用目前还是一项空白。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种淋巴瘤miRNA芯片,用以解决现有技术中缺少检测HIV感染相关性弥漫大B细胞淋巴瘤患者组织中miRNA表达谱的专用miRNA芯片,该芯片包含HIV-DLBCL(艾滋病相关性弥漫大B细胞淋巴瘤)和HIV-RH(艾滋病患者淋巴结反应性增生)组织表达谱分析的39个表达差异有统计学意义的miRNA,为进一步研究差异表达miRNA在HIV-DLBCL发病机制中的作用及其靶基因的生物学效应奠定了基础。
为实现上述目的,本发明的技术方案为:
一种淋巴瘤miRNA芯片,所述miRNA芯片包括固相载体和有序固定在固相载体上的miRNA探针,所述的miRNA探针中包括SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:39所示的序列。
上述淋巴瘤miRNA芯片中,所述固相载体可以选择硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃片或硅片。
上述淋巴瘤miRNA芯片中,所述互补结合区是与SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:39所示的序列互补的序列。
进一步地,上述淋巴瘤miRNA芯片中,所述探针还包含1-5个错配碱基。
本发明还公开了上述淋巴瘤miRNA芯片的制备方法,具体包括如下步骤:
(1)首先合成miRNA探针;
(2)将步骤(1)的miRNA探针配成溶液;具体用TE将miRNA探针溶解成100μM的原液,原液再用TE稀释成20μM;
(3)把miRNA探针溶液点在固相载体上;
(4)将miRNA探针固定在固相载体上。
并且上述步骤中,进一步地,在固定完成后,还可以用封闭液对miRNA芯片进行封闭。
进一步地,本发明的还提供一种淋巴瘤miRNA芯片的用途,就是用于检测HIV感染相关性弥漫大B细胞淋巴瘤患者组织中miRNA表达谱,为进一步研究差异表达miRNA在HIV-DLBCL发病机制中的作用及其靶基因的生物学效应奠定基础。
另一方面,本发明还提供一种上述淋巴瘤miRNA芯片进行检测的方法,具体包括如下步骤:
(1)提取诊断为HIV感染相关性弥漫大B细胞淋巴瘤患者的术后石蜡包埋组织标本的总RNA;
(2)对总RNA的浓度进行测定;并在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳;
(3)对所述总RNA进行标记;然后与所述miRNA芯片进行杂交,形成“寡聚糖探针-RNA”二元复合物;
(4)再对杂交后的芯片进行图像扫描;检测形成的二元复合物,从而确定淋巴瘤相应的miRNA的表达谱。
进一步地,步骤(3)对总RNA进行标记时,标记可以选自荧光素标记、酶标记、放射性元素标记、发光标记或化学标记。
更进一步地,作为本发明的优选方案,步骤(3)中杂交时间为50~200min,温度为30~60℃,更优选为,杂交时间为120min,温度为42℃。
在本发明的第三个方面,本发明还提供了一种试剂盒,这种试剂盒含有淋巴瘤miRNA芯片。
本发明具有如下优点:
本发明的芯片包含用于HIV-DLBCL(艾滋病相关性弥漫大B细胞淋巴瘤)和HIV-RH(艾滋病患者淋巴结反应性增生)组织表达谱分析的39个表达差异有统计学意义的miRNA,为进一步研究差异表达miRNA在HIV-DLBCL发病机制中的作用及其靶基因的生物学效应奠定了基础。
附图说明
图1是HIV-DLBCL组exp1样本的miRNA芯片杂交后扫描图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。下列实施例中如未注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件进行。
实施例
一、淋巴瘤miRNA的获取
1、石蜡包埋病理标本处理:EP管经0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水浸泡过夜后,高温高压灭活DEPC。制备厚度为8μm的石蜡组织切片8~10张,置于EP管中保存。
2、RNA的提取
将石蜡组织标本进行脱蜡处理后,采用TRIZOL法(试剂为美国InvitrogenlifeTechnologies公司产品)提取总RNA,异丙醇沉淀法浓缩RNA,采用紫外分光光度计(美国Nanodrop2000公司产品)测定RNA的浓度和纯度,琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。
3、miRNA的提取和标记
(1)用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得miRNA,具体操作按照相应说明书。样品用T4RNA连接酶标记步骤依照Thomson的方法。miRNA标记方法大致如下:1.4μgmiRNA和500ng 5’-磷酸盐-胞嘧啶-尿嘧啶cy3-3’(Dharmacon,Chicago,USA)及2单位T4RNAligase(NEB,Ipswich,USA),于4℃孵育2小时。每份miRNA样品均设等量的相应阴性对照。
(2)标记的RNA用0.3M醋酸钠和2.5倍体积的乙醇进行沉淀,再用15μl含3×SSC、0.2%SDS和15%甲酰胺的杂交液重悬,所有的杂交重复两次,杂交用LifterSlipTM(Erie,PAUSA)以保证杂交液在芯片和盖片之间均匀流动。
(3)将杂交室放在杂交仪BioMixerTMII上(CapitalBio Corp,Beijing,China)于42℃水浴杂交过夜,之后用洗液洗两遍。
按照上述步骤筛选出39条用于HIV-DLBCL和HIV-RH组织表达谱分析并且有统计学意义的miRNA,其序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:39所示所示。
二、淋巴瘤miRNA芯片的制备
1、探针的设计与合成
将miRNA序列(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:39)转换成反向互补序列,根据产生序列的GC比等特征在序列两端加上10-20nt的连接序列;核心序列不同,连接序列也不同。连接序列可以是随机的,但连接序列和核心序列形成的探针满足以下条件:
1)探针序列中,同一种核苷酸(A、C、G、T)的数量不超过序列总数的50%。
2)任何连续的A、T或C、G的数量不能超过序列总数的25%。
3)G、C含量占序列总数的40%-60%。
4)探针序列不能自杂交,即探针序列中互补片段的长度不能超过探针长度的30%。
为使合成的探针稳定地结合在玻片上,采用常规的方法在合成后探针的5’端进行糖基修饰。
2.将合成的miRNA探针配成溶液;
用TE将miRNA探针溶解成100μM的原液,原液再用TE稀释成20μM,临点样前用spotting solution对半稀释成10μM,进行点样。
3、先将固相载体的表面进行烷基化修饰,以提高结合能力。采用常规的芯片点样方法进行点样,为了检测杂交试验的可重复性,每个探针在玻片上点3-6个杂交点。
4、将miRNA探针固定在固相载体上;
5、最后还可以用封闭液对miRNA芯片进行封闭。
三、淋巴瘤miRNA芯片的杂交
将RNA溶于16μL杂交液中(15%甲酰胺;0.2%SDS;3×SSC;50×Denhardt’s),于42℃杂交120min。杂交结束后,先在42℃左右含0.2%SDS,2×SSC的液体中洗4min,而后在0.2×SSC液体中室温洗4min。
四、芯片杂交后扫描
将芯片插入ScanArray 3000扫描仪中根据点样位置进行扫描,并使用Imagene软件分析杂交结果。
五、结果分析
1.RNA质量鉴定
核酸测定仪检测显示,各样本OD260/280值在1.8到2.1之间,OD260/230值高于1.8。琼脂糖凝胶电泳显示所有样本18S和28S的核糖体RNA条带清晰未见弥散,未见DNA和蛋白质污染。结果表明各样本RNA无降解,质量合格,符合miRNA芯片检测的要求。
2.miRNA芯片杂交扫描结果及信号相关性分析
芯片杂交后扫描图像显示,所有芯片信号和背景清晰,扫描软件显示信噪比高。各样本使用单色荧光基团标记,光点清晰(图1),组内各样本之间杂交信号相关系数较高。
采用芯片上每个位点的杂交信号相关性来初步判定芯片杂交的实验质量以及样品之间的性质差异。结果显示,组内各样本之间杂交信号相关系数较高,表明组内样本的生物学性质相似,实验重复性好(表1、2);组间相关系数则反映出样本的差异性,由于实验组和对照组标本中仅有少数miRNA的表达发生明显改变,使得杂交信号偏移,本研究的结果(表3)显示实验组和对照组样本间相关系数约为0.956,符合标准。
表1 HIV-DLBCL组内芯片关联系数矩阵表
表2 HIV-RH组内芯片关联系数矩阵表
表3 HIV-DLBCL与HIV-RH组间芯片关联系数矩阵表
3.HIV-DLBCL和HIV-RH组织miRNA表达谱分析
miRNA芯片实验结果按照HIV-DLBCL组与HIV-RH组的miRNA表达量比值>3或<0.35为标准,共筛选出39个表达差异具有统计学意义的miRNA:23个miRNA表达上调(表4),16个miRNA表达下调(表5)。其中miR-4492、miR-208b-3p、miR-4738-3p、miR-4674在HIV-DLBCL组织中显著上调,miR-4453、miR-363-3p显著下调(表达变化大于5倍)。
表4 HIV-DLBCL vs HIV-RH表达上调的miRNA
表5 HIV-DLBCL vs HIV-RH表达下调的miRNA
4.靶基因预测及功能分析
由于在表达变化差异显著的miRNA中,miR-4492、miR-4738-3p、miR-4674、miR-4453的研究甚少,国内外尚无其功能的文献报道,因此我们分别选取上调的miR-208b-3p及下调的miR-363-3p进行靶基因预测。为减少假阳性比率,只保留miRWalk、Targetscan、miRanda中至少两种软件预测得到的基因作为靶基因。借助GO和KEGG数据库,进一步对靶基因的显著性生物学功能及参与的信号转导通路进行分析,结合文献检索,最终共筛选出6个与肿瘤发生发展相关的靶基因:miR-208b-5p的靶基因CDKN1A、NLK、SMAD4及miR-363-3p的靶基因E2F3、FOXG1、TBX3(表6)。
表6预测与HIV-DLBCL发生发展相关的靶基因
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 大理大学第一附属医院
<120> 一种淋巴瘤miRNA芯片、制备方法和用途
<130> 2018
<160> 39
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> RNA
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Claims (10)
1.一种淋巴瘤miRNA芯片,其特征在于,所述miRNA芯片包括固相载体和有序固定在固相载体上的miRNA探针,所述的miRNA探针中包括SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:39所示的序列。
2.根据权利要求1所述的淋巴瘤miRNA芯片,其特征在于,所述固相载体为硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃片或硅片。
3.根据权利要求1所述的淋巴瘤miRNA芯片,其特征在于,所述miRNA探针包括互补结合区,所述互补结合区是与SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:39所示的序列互补的序列。
4.根据权利要求1或3所述的淋巴瘤miRNA芯片,其特征在于,所述探针还包含1-5个错配碱基。
5.一种如权利要求1所述淋巴瘤miRNA芯片的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:
(1)合成权利要求1所述的miRNA探针;
(2)将步骤(1)所述的miRNA探针配成溶液;具体用TE将miRNA探针溶解成100μM的原液,原液再用TE稀释成20μM;
(3)把miRNA探针溶液点在固相载体上;
(4)将miRNA探针固定在固相载体上。
6.如权利要求1所述淋巴瘤miRNA芯片的用途,其特征在于,用于检测HIV感染相关性弥漫大B细胞淋巴瘤患者组织中miRNA表达谱。
7.一种应用权利要求1所述淋巴瘤miRNA芯片进行检测的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)提取诊断为HIV感染相关性弥漫大B细胞淋巴瘤患者的术后石蜡包埋组织标本的总RNA;
(2)对总RNA的浓度进行测定;并在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳;
(3)对所述总RNA进行标记;然后与所述miRNA芯片进行杂交,形成“寡聚糖探针-RNA”二元复合物;
(4)再对杂交后的芯片进行图像扫描;检测形成的二元复合物,从而确定淋巴瘤相应的miRNA的表达谱。
8.根据权利要求7所述淋巴瘤miRNA芯片进行检测的方法,其特征在于,步骤(3)对总RNA进行标记时,标记选自荧光素标记、酶标记、放射性元素标记、发光标记或化学标记。
9.根据权利要求7所述淋巴瘤miRNA芯片进行检测的方法,其特征在于,步骤(3)中杂交时间为50~200min,温度为30~60℃。
10.一种含有权利要求1所述淋巴瘤miRNA芯片的试剂盒。
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