CN101605901B

CN101605901B - 植物miRNA、其芯片及用途

Info

Publication number: CN101605901B
Application number: CN2008800026220A
Authority: CN
Inventors: 薛红卫; 薛良交; 张晶晶
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2007-01-18
Filing date: 2008-01-18
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2028-01-18
Also published as: CN101225394A; CN101605901A

Abstract

本发明公开了一类新的分离自植物的miRNA，所述的miRNA选自：序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137所示的miRNA或与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137任一所示序列互补的miRNA。本发明还提供了所述的miRNA的前体以及在植物细胞内可被转录成前体miRNA的多核苷酸构建物。本发明还公开了一种利用所述miRNA制成的芯片、含有所述芯片的试剂盒以及利用所述的miRNA芯片检测植物中miRNA表达谱的方法。

Description

植物miRNA、其芯片及用途

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域，更具体地，本发明涉及一种植物miRNA，其前体及其用途，本发明还涉及含所述植物miRNA的芯片及其用途。

背景技术

miRNA(micro RNA，微RNA)是一组不编码蛋白质的短序列单链RNA，长约22nt。miRNA基因主要单个或成簇地位于基因组的非编码区内。目前人们已发现的miRNA约为数千个，大部分功能未知。据目前的研究显示，miRNA执行一种转录后调节机制，在蛋白表达过程中扮演重要角色。miRNA通过不完全碱基互补的方式与mRNA相应的区域结合，从而抑制蛋白质的翻译；在植物中，其还可以降解mRNA。通常一个基因可以被多个miRNA所调节，同时一个miRNA也可以调节多个mRNA。

miRNA表达具有高度的保守性、时序性和组织特异性。研究表明miRNA参与了几乎所有的生命活动，并起着重要作用，在动物中，包括：细胞发育、造血、脂肪代谢、器官生成、凋亡、细胞增殖与分化及肿瘤的发生。在植物中，miRNA影响了叶的极性，花器官的决定，开花时间以及对胁迫的反应等。此外，在某些病毒中也发现有miRNA表达。

在植物细胞中，转录形成的miRNA前体首先折叠成茎环结构，然后在DCL1的作用下剪切形成成熟的miRNA。在不同的植物组织、器官和不同的发育时期，miRNA的表达谱是不同的，对miRNA表达谱的研究将对miRNA生物功能的研究起到巨大的推动作用。

尽管目前已经在生物体中发现了一些miRNA，然而这些miRNA仅占生物体中存在的miRNA中相当少的一部分，并且研究人员对于这些miRNA的功能还了解很少。并且，现有对miRNA表达谱的研究多采用Northern杂交或miRNA克隆的方法，需要大量的总RNA样品，而且费时费力，研究进展缓慢。

因此，本领域迫切需要进一步地分离miRNA，且更为重要的是开发合适的途径，以研究miRNA的表达谱以及它们对于生物体的调节作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物miRNA基因、含有所述miRNA的芯片及用途。

在本发明的第一方面，提供一种分离的miRNA，所述的miRNA选自：

(i)具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137所示序列的miRNA；

(ii)与(i)限定的任一序列互补的miRNA；或

(iii)与(i)或(ii)限定的任一序列有0-5个碱基差异的miRNA。

在本发明的一个优选例中，所述的miRNA分离自禾本科植物。

在本发明的另一优选例中，所述的植物是水稻。

在本发明的另一优选例中，所述的miRNA在植物细胞内能够与至少一条RNA(如mRNA)的至少一部分序列互补。

在本发明的第二方面，提供一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在植物细胞内剪切并表达成所述的miRNA。

在本发明的另一优选例中，所述的前体miRNA选自：

(i)具有SEQ ID NO：138-SEQ ID NO：274所示序列的前体miRNA；或

(ii)与(i)限定的任一序列互补的前体miRNA；或

(iii)与(i)或(ii)限定的任一序列在其所对应的成熟miRNA的序列区域同源度达70％以上(优选80％以上，更优选90％，进一步优选95％以上)。

在本发明的第三方面，提供一种分离的或人工构建的多核苷酸，所述的多核苷酸含有对应于所述前体miRNA序列的序列。

在另一优选例中，所述的多核苷酸可被植物细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可在植物细胞内被剪切且表达成所述的miRNA。

在另一优选例中，所述的“多核苷酸的序列对应于前体miRNA序列”是指该多核苷酸的序列是前体miRNA序列所对应的DNA序列，如RNA序列是“AU”则DNA序列是“AT”。

在本发明的另一优选例中，所述的多核苷酸含有式Ⅰ所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式Ⅰ，

式Ⅰ中，

Seq_正向为可在植物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在植物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列。

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补，式Ⅰ所示的结构在转入植物细胞后，形成式Ⅱ所示的二级结构：

式Ⅱ，

式Ⅱ中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间的基本上互补的关系。

在另一优选例中，Seq_正向和Seq_反向并非完全互补，可以存在一些错配，或者突起。

在本发明的第四方面，提供一种抑制目的基因表达的方法，所述的方法包括步骤：

(1)提供一种分离的或人工构建的多核苷酸，所述的多核苷酸含有对应于所述的前体miRNA序列的序列，所述的前体miRNA可被植物细胞剪切且加工成miRNA，所述的miRNA能够与该目的基因对应的mRNA的至少一部分序列互补的miRNA、或者与非编码蛋白的RNA的至少一部分序列互补；

(2)将(1)中所述的多核苷酸导入到植物细胞中，从而通过剪切目的基因或者抑制基因翻译的方式来抑制所述目的基因的功能。

在本发明的第五方面，提供所述的miRNA、前体miRNA或多核苷酸的用途，用于制备抑制或者调节目的基因表达的组合物。

在本发明的第六方面，提供一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸。

在本发明的第七方面，提供一种植物细胞，它是选自下组：

(a)用所述的载体转化或转染的细胞；或

(b)用所述的多核苷酸转化或转染的细胞。

在本发明的第八方面，提供一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：

固相载体；以及

有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQID NO：1-SEQ ID NO：137所示的部分或全部序列。

在另一优选例中，所述的特异性地对应于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137所示的部分或全部序列是指与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137所示的部分或全部序列互补的序列，或包括且不限于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137所示的部分或全部序列。

在本发明的另一优选例中，所述的寡核苷酸探针含有：

互补结合区；和/或

与固相载体相连的连接区。

在本发明的另一优选例中，所述的连接区是可任选的，也即所述的互补结合区可与固相载体直接相连。

在本发明的另一优选例中，所述的“特异性地对应于”指在严紧杂交条件下，所述的探针能够与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137的核酸序列的杂交；更佳地，所述的探针的互补结合区的序列与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137的核酸序列完全互补。

在本发明的另一优选例中，所述的寡核苷酸探针的互补结合区是：与选自SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137所示的序列互补(更优选的，为完全互补)的序列。

在本发明的另一优选例中，所述寡核苷酸探针由20-80个碱基组成。

在本发明的另一优选例中，用于检测miRNA的表达谱；或用于检测miRNA对于植物生长或发育的调节方式。

在本发明的第九方面，提供一种检测植物中miRNA表达谱的方法，包括步骤：

(1)提供分离自植物的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；

(2)将(1)的RNA与所述的芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成“寡核苷酸探针-RNA”二元复合物；和

(3)检测(2)形成的二元复合物的标记物，从而确定植物中相应的miRNA的表达谱。

在本发明的另一优选例中，在步骤(1)中，在设置标记物前还包括步骤：从RNA样品中富集小片段RNA(small RNA)。

在本发明的另一优选例中，所述的小片段RNA的长度为10-100bp(更优选的为15-60bp)。

在本发明的另一优选例中，所述的标记物选自：荧光素或其衍生物(如FITC、Cy3、Cy5等)，地高辛(DIG)，生物素(Bio)，碱性磷酸酶(AP)，辣根过氧化物酶(HRP)。

在本发明的另一优选例中，所述的标记物与所述的RNA的3’端相连接。

在发明的第十方面，提供一种试剂盒，所述的试剂盒中含有所述的miRNA芯片。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了水稻中花11品种的苗、叶、根、胚乳、胚中miRNA基因的表达模式；图中，比色板指示着miRNA的表达强度，所示的-2.0(蓝色)-0(黑色)-2.0(黄色)表示miRNA表达的由弱到强的变化，越靠近2.0表示表达越强。越靠近-2.0表示表达越弱。

图2显示了本发明的芯片的一种杂交效果图。

图3显示了osmiRNA3对于植物基因表达影响的PCR电泳检测结果。

具体实施方式

本发明人经过长期而广泛的研究，首次从水稻的不同发育阶段的种子中分离获得一类新的miRNA，这些miRNA能够特异性结合到mRNA的相应部位，影响相应的mRNA的转录作用，从而影响相应的基因的表达。因此，本发明提供的miRNA可对于植物生长、发育产生影响。并且，本发明人还针对这些miRNA开发了一种miRNA芯片，该miRNA芯片可用于研究miRNA的表达谱以及miRNA对于植物生长发育中各种事件的调节作用，并且消耗样品少、操作方便高效。基于此完成了本发明。

miRNA

如本文所用，所述的“植物(或作物)”包括但不限于：禾本科植物(如水稻)、豆科植物等。此外，所述的植物还可包括林业作物、乔木、花卉植物等。优选的，所述的植物是指任何携带本发明所提供的miRNA(其序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137所示)或携带与所述的miRNA具有较高同源性(如具有80％同源性或更高)的miRNA，或其mRNA的表达可被本发明所提供的miRNA所影响的植物的总称。

本发明提供了一类从植物中发现的miRNA，植物miRNA可从前体miRNA加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一股在60-330bp之间。通常，前体miRNA可在植物细胞内被剪切成成熟的miRNA分子。

本发明的一个方面提供一种植物的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一种RNA分子，被从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(一股约22个核苷酸)，然而也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。植物来源的miRNA是在植物细胞中由前体miRNA加工获得的miRNA。

植物来源的miRNA也可被从植物细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

miRNA通常是由前体miRNA加工而来的，因此，本发明的另一方面关于可在植物细胞中被加工产生miRNA的前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)。并且，所述的前体miRNA也是可从植物中被分离的。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。前体miRNA可被植物细胞剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。

如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一股地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有0、1、2、3、4、5、8、9个不匹配的核苷酸。如本文所用，“互补”的序列通常是指将5’-3’方向的序列转换为其3’-5’方向的序列(如5’ATCG 3’→GCTA)，然后再取其互补序列(如GCTA→5’CGAT 3’)。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

如本文所用，“植物miRNA表达谱”是指显示植物组织或细胞中miRNA的表达情况的展示图谱。

如本文所用，植物小RNA(small RNA)是指植物细胞内的长度在18-26之间的非编码RNA，它们以RNA的形式发挥作用；miRNA是小RNA的一种，可从所述的小RNA中鉴定出一部分miRNA，miRNA的特征是产生于一个转录本，这个转录本折叠形成茎环结构，miRNA来自茎结构中的某一侧。

如本文所用，“小片段RNA”是指从植物总RNA中分离到的长度在10-100bp的RNA分子的混合物。

本发明人采用大规模平行信号测序系统(MPSS)，从水稻不同发育阶段的种子中分离、鉴定出大量新的miRNA。

具体而言，本发明人从野生型水稻中花11的种子中提取总RNA分离出18-26nt的小RNA(small RNA)，将小RNA克隆入载体后，用MPSS技术分析得到Signature序列，屏蔽掉可能为接头来源的序列，并将可信性较低的序列去除。

接着，本发明人用BLAST程序(NCBI)比较所有的Signature序列和水稻基因组序列(TIGR，4.0版)，把Signature序列定位到水稻染色体上，剔除在基因组上没有匹配的序列。以Rfam数据库(TIGR)为参考，去除rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等。为了鉴别剩下的序列中的miRNA，以400bp的窗口(window)在基因组上选取包含这些序列的前体序列(前体miRNA)，用RNAfold软件预测其二级结构。同时满足以下几个标准的为miRNA：①miRNA定位在前体结构的某一臂上(5’或3’)，并且前体结构自由能最低；②以miRNA为中心的25nt中，错配数不得大于7；③前体结构中没有大的环状结构。

这些被鉴定出来的miRNA的序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137所示。所述的前体miRNA的序列如SEQ ID NO：138-SEQ ID NO：274所示。

对这些miRNAs的表达模式研究表明，这些miRNA集中在种子中表达。将miRNA前体基因或者成熟miRNA直接放入表达载体中，转化植物后可在植物体内形成有茎环结构的前体，然后被加工修饰形成成熟miRNAs，进而抑制或影响基因的表达，从而达到对基因进行修饰的目标。

此外，本发明还提供了在严格条件下能够与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137所限定的序列杂交且具有与植物细胞内至少一种mRNA的至少一部分序列互补功能的miRNA；或者，与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137任一所示序列有95％以上同源性且具有与植物细胞内至少一种mRNA的至少一部分序列互补功能的miRNA。

根据本发明所提供的植物miRNA序列，可设计出在被导入植物中后可被植物加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物。因此，本发明提供了一种分离的或人工构建的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被植物细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被植物细胞裂解且表达成所述的miRNA。根据本发明提供的miRNA或前体miRNA来设计所述的多核苷酸(构建物)是本领域技术人员可了解的，通常可使该构建物包含对应于所述前体miRNA序列的核苷酸序列或与所述前体miRNA序列互补的核苷酸序列，从而当被导入植物后，可形成所述前体miRNA或其互补形式，之后被加工成miRNA。RNA的碱基(A、U、C、G)与DNA的碱基(A、T、C、G)的对应形式或互补方式是本领域已知的。

作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式Ⅰ，

式Ⅰ中，

Seq_正向为可在植物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在植物细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

式Ⅰ所示的结构在转入植物细胞后，形成式Ⅱ所示的二级结构：

式Ⅱ，

式Ⅱ中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述；

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间的基本上互补的关系。

本发明还提供一种抑制目的基因表达的方法，所述的方法包括步骤：

(1)提供一种分离的或人工构建的多核苷酸，所述的多核苷酸可被植物细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被植物细胞剪切且加工成能够与该目的基因对应的mRNA的至少一部分序列互补的miRNA；

(2)将(1)中所述的多核苷酸导入到植物细胞中，从而抑制所述目的基因的功能。

在本发明中，将所述的多核苷酸构建物导入到植物细胞中，该多核苷酸构建物在体内被转录成前体miRNA，之后所述的前体miRNA被加工成miRNA，所述的miRNA可与相应的mRNA的部分序列相互补，从而抑制该mRNA相应的目的基因的表达。所述植物细胞再生成植物后，该转基因植物中相应的目的基因的表达与野生型不同。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA或与其互补的序列，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主可以是任何适合于携带所述表达载体并能够将所述表达载体传递给植物细胞的宿主。优选的，所述的宿主为农杆菌。

本发明人的深入研究发现，本发明的miRNA具有良好的抑制植物中相应的靶基因表达的作用。例如，SEQ ID NO：58具有抑制水稻中含SPX结构域蛋白(LOC_Os04g48390)的表达。也即其靶基因为含SPX结构域蛋白。SPX蛋白因含有SYG1、PHO81、向异和多变的反向病毒受体(XPR1)中保守的结构域而得名。这类蛋白在植物的缺磷反应中发挥重要作用。四季豆(Phaseolus vulgaris L.)中含有SPX结构域的PvIDS4-like基因在磷缺乏的环境中被调节。拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，含有SPX结构域的PHO1蛋白在根中负责将无机磷向木质部运输。因此通过调节SEQ ID NO：58(osmiRNA3)的表达可以影响SPX基因的丰度，进而形成对低磷环境有不同响应的植物植株。比如通过阻遏miRNA作用的发挥来提高SPX蛋白的丰度，增加植物根系吸收、转运无机磷的能力，使植物得以在低磷环境中成活。

根据常规miRNA靶基因的预测方法，用软件分析结果显示，osmiRNA110(SEQ ID NO：7)的靶基因为ARF-GAP(LOC_Os08g42530)，ARF-GAP可以通过调节生长素的内流，影响水稻根的发育。过量表达ARF-GAP可以减少水稻侧根的个数，降低水稻主根和不定根的长度。因此可以通过影响ARF-GAP的表达来，调节水稻根的发育；

osmiRNA115(SEQ ID NO：10)的靶基因是含MIP家族通道蛋白的蛋白(MIP familychannel proteins containing protein，LOC_Os02g51110)，MIP(major intrinsicprotein)为主要内在蛋白，水孔蛋白，在干旱胁迫和盐胁迫过程中发挥重要作用。因此，可以通过调节MIP，可影响植物的耐旱性。

osmiRNA169(SEQ ID NO：27)的靶基因是氧化还原酶，短链脱氢酶/还原酶家族蛋白(oxidoreductase，short chain dehydrogenase/reductase family protein，LOC_Os04g40730)。该蛋白在次生代谢过程中有重要作用，已经报道的短链脱氢/还原酶在强心肝苷，吗啡等代谢过程中起作用。调节短链脱氢/还原酶的表达，在调控这些次生代谢产物的合成有重要意义。

osmiRNA215(SEQ ID NO：34)的靶基因是细胞色素P450 78A11(Cytochrome P45078A11，LOC_Os10g26340)。其由PLASTOCHRON1(PLA1)基因编码，控制着第一叶原基形成和第二叶原基形成之间的间隙，同时影响着植物的发育期。该基因的下调会使植株在相同时期内产生更多的叶。

osmiRNA294(SEQ ID NO：55)的靶基因是铵转运子2(LOC_Os02g34580)。该蛋白负责植物根部对铵的吸收，可以通过调节铵转运蛋白的表达来影响植物对氮肥的吸收能力。

osmiRNA320(SEQ ID NO：64)的靶基因是非特异性脂转移蛋白前体(LOC_Os11g02400)。该蛋白可以结合磷脂，糖脂，脂肪酸和类固醇等脂类分子，辅助这些分子的转运，在植物种子中的储藏蛋白中含量较多。调节非特异脂转运蛋白的含量对提高种子的营养价值有重要意义。

osmiRNA349(SEQ ID NO：67)的靶基因是醇溶谷蛋白PPROL 4A前体(LOC_Os05g26750)。该蛋白不溶于水及无水乙醇，但溶于70％-80％乙醇中，组成上的特点是脯氨酸和酰胺较多，非极性侧链原较极性侧链多，主要存在于植物种子中。

osmiRNA410(SEQ ID NO：87)的靶基因是机械敏感型离子通道蛋白(Mechanosensitiveion channel family protein，LOC_Os04g48940)，该蛋白在发育和形态建成中负责将胞外的刺激信号向胞内传递。在拟南芥中机械敏感型离子通道蛋白控制了质体的大小和形状。

osmiRNA442(SEQ ID NO：97)的靶基因是含U-盒结构域蛋白(LOC_Os08g32610)。该蛋白具有E3泛素连接酶活性，在细胞死亡和防御，以及植物对温度胁迫的耐受性上起作用。

osmiRNA72(SEQ ID NO：127)的靶基因是Pentatricopeptide(LOC_Os12g06650)，该蛋白参与叶绿体mRNA的加工。该蛋白的丰度对叶绿体的发育有重要影响。

osmiRNA93(SEQ ID NO：134)的靶基因是单半乳糖二酰甘油合酶(LOC_Os02g55910)，是半乳糖脂代谢过程中的酶，在植物水淹胁迫和磷饥饿反映中发挥作用。

miRNA芯片及用途

此外，利用本发明所述的miRNA序列，还可以点制miRNA芯片研究其表达谱以及miRNAs的调节方式，具有很高的应用价值。

由于检测单一的miRNA在植物中的表达情况效率很低，因此，本发明人根据所述的miRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

本发明所述的miRNA芯片，包括固相载体和有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137所示的序列。

作为本发明的优选方式，所述的探针包含互补结合区，所述的互补结合区的序列与SEQID NO：1-SEQ ID NO：137的核酸序列互补(更优选的，为完全互补)。

作为本发明的优选方式，所述的探针上还含有连接区，所述的连接区用于使探针稳定地固定在固相载体上，所述的连接区可以位于互补结合区的两端，或者也可仅位于互补决定区的一端。当然，在允许的情况下，也可选择将互补决定区直接与固相载体相连接的方式。

作为本发明的更优选方式，所述的连接区还具有调节GC比例的功能，用于调节探针的GC含量，从而使得探针的GC比例为20-80％，更优选的GC比例为40-60％。

因此，本发明的探针由20-80个(更特别的为25-60个)连续碱基组成。为了增强检测信号的强度，提高检测结果的准确率，探针上所述的互补结合区最好位于所在探针的中部。所述探针还可以在其5’端包含糖基修饰。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基、异硫晴酸基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

本发明的miRNA芯片的制备也可采用其它的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science，1997；278680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

作为一个方面，本发明提供了一种通过miRNA芯片检测植物中miRNA表达谱的方法，包括步骤：

(1)提供分离自植物的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；

(2)将(1)的RNA与所述的芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成“寡核苷酸探针-RNA”二元复合物；

从植物组织中提取RNA的方法是本领域技术人员熟知的方法。比如采用Trizol法。

更优选的，在步骤(1)中，在从植物组织中分离出RNA样品后，对RNA样品进行适当处理，以富集具有一定长度的RNA，所述长度一股在10-100之间(小片段RNA)。在经过上述处理后，利用这些小片段RNA进行后续的杂交，这样可提高芯片捕获miRNA的准确性。本领域人员可方便地分离出具有一定片段长度的RNA，比如可采用凝胶电泳法来分离。

对RNA进行标记也是本领域技术人员熟知的方法，其可通过在杂交时加入与RNA特异性结合的标记物的方法实现，所述标记物比如是标记基团。所述的标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC等)、其它荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术，也可以参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔主编，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年；马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

将上述的RNA与miRNA芯片进行杂交时，可以先将miRNA芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。

本发明所述的RNA与miRNA芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。

然后根据标记信号在miRNA芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。

本发明的miRNA可以用于检测miRNA的表达谱；或用于检测miRNA对于植物生长或发育的调节方式。

通过利用所述的miRNA制备的miRNA芯片，可分析miRNA基因的表达模式，可了解植物中相应的基因对胁迫等(比如：干旱，高盐等)的调节情况；可设计相应的策略，调节和修饰靶基因，来提高对胁迫等环境的适应能力，或者形成具有较好农艺性状的基因修饰作物。此外，利用miRNA芯片还可进行作物育种的分子筛选。根据miRNA芯片的杂交结果，可有针对性地筛选具有某种表达模式的植株，并选育成稳定品系。提高育种的选择效率。

检测试剂盒

本发明还提供一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的芯片。所述的试剂盒可用于检测miRNA的表达谱；或用于检测miRNA对于植物生长或发育的调节方式。

更优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。所述的芯片图像分析软件比如：BaiO公司的BaiO ArrayDoctor 2.0，Media Cybernetics公司的Arraypro 4.0，由哈佛大学生物统计系Cheng Li、Wing Wong等联合开发的dChip(DNA-Chip Analyzer)，由TIGR开发的微阵列分析软件包MultiExperiment Viewer(MeV v3.1)。

本发明的主要优点在于：

(1)从水稻的不同发育阶段的种子中分离获得一类新的miRNA，这些miRNA能够特异性结合到mRNA的相应部位，影响相应的mRNA的翻译，或者指导mRNA的剪切，从而影响相应基因的作用。

(2)根据从植物中分离获得的一类新miRNA，设计探针，制备成芯片，从而为研究miRNA的表达谱以及miRNA对于植物的调节作用提供了便捷的途径，也为作物育种过程中，针对miRNA的分子标记的筛选提供有力工具。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1miRNA的获得

1.RNA抽提

选用粳稻中花11号，在人工气候室(光周期为：28℃光照12小时与22℃黑暗12小时)中栽培，3个月完成整个生命周期。

播种后60天开花，分别在开花后3天、6天、9天、12天采收水稻种子。种子材料液氮中研磨后，用TRIZOL试剂盒，按照TRIZOL试剂盒自带的说明书提取总RNA。

2.小RNA(small RNA)序列的获得和筛选

用20％PAGE胶回收18～26nt的small RNA，把small RNA克隆入测序载体Tag vectorpMBS I(购自Solexa公司)后，用MPSS技术测序得到Signature序列，屏蔽掉可能为接头来源的序列部分，所用方法是：将全长的Signature序列和测序载体序列比较，序列3’端和载体完全匹配的认为是载体序列，并将可信性较低(如测序信号很低等)的序列过滤掉。

3.miRNA的鉴定

用BLAST程序(NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov)把small RNA Signature序列定位到水稻染色体上(TIGR注释信息，www.tigr.org)，剔除在基因组上没有匹配的序列。

以Rfam数据库(www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/)为参考，去除rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等。

在剩下的small RNA序列中，为了鉴别其中的miRNA，本发明人用Perl语言(www.perl.com)编写了一个脚本程序，以400bp的窗口(window)在基因组上选取包含所述small RNA的前体序列，用RNAfold软件(www.tbi.univie.ac.at)预测其二级结构。同时满足以下几个标准的small RNA被鉴定为miRNA：

①miRNA定位在前体结构的某一臂上(5’或3’)，并且前体结构自由能最低；

②以miRNA为中心的25nt中，错配数不得大于7；

③前体结构的茎上没有大的环状结构。

4.结果

通过前述筛选，获得137条新的成熟miRNA，如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137(表1)所示。这些miRNA的前体miRNA的序列如SEQ ID NO：138-SEQ ID NO：274(表2)所示。

表1

表2

表2中各序列的特点是可以形成茎环结构，表1中各成熟的miRNA来自表2中相应的茎环结构的茎的其中一侧。并且，表2中的miRNA的前体与表1中的各miRNA是一一对应的，对应关系如下：

miRNA miRNA前体

SEQ ID NO：1→SEQ ID NO：138；

SEQ ID NO：2→SEQ ID NO：139；

SEQ ID NO：3→SEQ ID NO：140；

SEQ ID NO：136→SEQ ID NO：273；

SEQ ID NO：137→SEQ ID NO：274。

实施例2本发明的miRNA在其他物种中miRNA同源分析

将新获得的成熟miRNA序列与miRNA数据库(miRBase，http://microrna.sanger.ac.uk)中的所有序列比较，发现本发明的miRNA中有15个miRNA与数据库中的miRNA具有相似性(见表3)。其中SEQ ID NO：58与拟南芥中的ath-miR827相似性最强。而本发明的其它122个miRNA没有发现同源基因，它们可能是水稻中特有的，或是在其他物种中存在却还没有被在先发现。

表3

实施例3本发明的miRNA的靶基因分析

用Patscan软件将所有的miRNA序列与水稻的cDNA数据库(TIGR，4.0版)比较，如果miRNA与cDNA的错配少于6bp，就计算这对miRNA与cDNA的错配分数。错配分数的计算方法参见Allen等的文献。具体描述如下：从成熟miRNA 5’端算起，完全匹配(即A：T或G：C匹配)分数为0，第2到10位的G：U匹配分数为1，其他错配情况分数为2，碱基的突起分数为2；在第1位以及10位以后，错配情况的分数是第2到10位分数的一半。如果miRNA与cDNA的错配分数不大于4，则认为这个cDNA是miRNA的靶基因。

经过预测共有79个miRNA找到靶向的cDNA，其它的没有靶向编码蛋白质cDNA的miRNA可能通过调节非编码蛋白来发挥作用。一些miRNA有多个靶基因。

分析预测出靶基因的miRNA，它们的靶基因如表4。

表4

实施例4osmiRNA3对于植物基因表达的影响

设计针对osmiRNA3(SEQ ID NO：58)基因特异的引物。克隆能经加工形成osmiRNA3前体(SEQ ID NO：195)的多聚核苷酸所用的引物如下：

osmiRNA3-pri-s：5’TCTACGCTCATCATCTCCACCT 3’(SEQ ID NO：275)；

osmiRNA3-pri-a：5’TAAGCACACGGAGACGGCGATT 3’(SEQ ID NO：276)。

以基因组DNA为模板，经过PCR获得包含osmiRNA3前体对应的DNA片段，osmiRNA3前体对应的DNA序列位于克隆出的DNA片段的中部。常规方法将上述片段克隆至双元载体pCAMBIA1301(CAMBIA公司)的多克隆位点内，并通过常规的根农杆菌法将重组载体转化水稻幼胚，诱导幼胚分化成水稻植株。具体操作如下：

取授粉后10～14天(DAP)左右的幼胚，去除种壳，用浓度75％乙醇处理3min后，用8％次氯酸钠溶液消毒20min，再用无菌水冲洗3～4次，滤纸吸干后，用镊子挤出胚，接种于培养基26℃暗培养4～7天。选取1～2mm黄白色致密的愈伤组织用作农杆菌转化。

挑取已培养好的转化有表达载体的EHA105(参见Hood，E.E.等，Transgenic Res.，1993，2，208-218)单菌落，接种到含50mg/L卡那霉素的YEP培养液中，28℃、110r/min，过夜振荡培养至OD600约1.0，将培养好的过夜菌液分装至离心管中，5000r/min离心10min，然后将沉淀用AAM培养基(其中加100μmol/L乙酰丁香酮)重悬。并立即浸染愈伤组织，浸泡时间为20～30min。愈伤组织与农杆菌共培养2～3天后，转入MS2培养基(含35mg/L潮霉素和250mg/L头孢)筛选2周左右。新长出的抗性愈伤组织转移至含50mg/L潮霉素和250mg/L头孢的MS2培养基继代2次，每次2周左右。经3次继代后的抗性愈伤组织转入NB1培养基，置暗处预分化1周，再转入NB2培养基光照培养分化幼芽，待幼芽长至2～3cm时转入1/2MS生根培养基，随后转入温室。

用植物的抗性筛选标记潮霉素抗性，筛选转化的植物，用含有30μg/ml潮霉素的水萌发T0代转化种子，如果种子可以正常萌发生根，则水稻种子是转化子。提取转基因植株的RNA，用RT-PCR的方法分别检测osmiRNA3前体和其靶基因的表达情况。

根据Invitrogen公司的Trizol reagent操作说明书进行样品总RNA抽提。常规方法合成cDNA第一链。通过RT-PCR的方法检测miRNA前体和其靶基因的表达。

RT-PCR检测osmiRNA3表达所用的引物如下：

osmiRNA3-rt-s：5’TACCCATGAACCTGTTTTG 3’(SEQ ID NO：277)

osmiRNA3-rt-a：5’GAACTTGTTTGCTGATGGT 3’(SEQ ID NO：278)

用RT-PCR检测osmiRNA3靶基因LOC_Os04g48390的引物如下：

osspx-rt-s：5’AAGAGTTCAGACACGGCACAG 3’(SEQ ID NO：279)

osspx-rt-a：5’GAGTGATGTTGAGCAGGAGGT 3’(SEQ ID NO：280)

用水稻的cDNA为模板，用osmiRNA3前体和其靶基因特异的引物进行PCR扩增，同时用内标Actin基因的特异引物进行扩增。根据Actin 26个循环和28个循环的扩增情况，表明RNA上样量一致。而不同转基因植株中的miRNA表达量不同，其中2，4，5三个株系miRNA的表达被提高。相应地，这三个株系的miRNA的靶基因被下调。表明可以用调节miRNA表达的方法来调节其靶基因的表达(图3)。

实施例5水稻中花11的多种组织中的miRNA表达谱的测定

(1)制备miRNA芯片

将表1提供的miRNA序列(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：137)转换成互补序列，根据产生序列的GC比等特征在序列两端加上10-20nt的连接序列；核心序列不同，连接序列也不同。连接序列可以由程序随机产生，连接序列和核心序列形成的探针满足以下条件：

1)探针序列中，同一种核苷酸(A、C、G、T)的数量不能超过序列总数的50％；

2)任何连续的A、T或C、G的数量不能超过序列总数的25％；

3)G、C含量占序列总数的40％-60％；

4)探针序列不能自杂交，即探针序列中互补片段的长度不能超过探针长度的30％。

为使合成的探针稳定的结合在玻片上，采用常规的方法在合成后探针的5’端进行糖基修饰。

芯片的点制：先将玻片的表面进行烷基化修饰，以提高结合能力。采用常规的芯片点样方法进行点样，为了检测杂交试验的可重复性，每个探针在玻片上点3-6个杂交点。

(2)提取植物组织small RNA

Trizol一步法提取组织的总RNA，通过异丙醇沉淀法浓缩RNA，用分光光度计定量，甲醛变性凝胶电泳质检总RNA的质量。取50-100μg总RNA用Ambion’s miRNA Isolation Kit(Cat#.1560)分离长度约在10-100bp的小片段RNA。利用常规标记方法(T4RNA连接酶标记法)进行标记，标记底物是cy3，然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于与芯片杂交。

(3)杂交

将RNA溶于16μL杂交液中(15％甲酰胺；0.2％SDS；3×SSC；50×Denhardt’s)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗4min，而后在0.2×SSC液体中室温洗4min。

玻片甩干后即可用于扫描。图2显示了扫描后的杂交结果的局部。

杂交结果的分析：采用常规的芯片信号读取仪器，将扫描的图像信号转换为数字信号，并进行信号校正，去除坏点和弱点的信号值。用相关软件分析miRNA基因表达的差异情况。所述的芯片分析软件比如：由哈佛大学生物统计系Cheng Li、Wing Wong等联合开发的dChip(DNA-Chip Analyzer)，和TIGR推出的微阵列分析软件包MultiExperiment Viewer(MeVv3.1)。分析表达差异情况的方法描述如下：根据不同组织将芯片数据分组，每组之间的数据用ANOVA检验的方法，统计分析不同组间的差异情况。P值设定为小于0.05。

(4)表达谱测定

A.miRNA表达数据的处理

准备水稻中花11的多种组织(包括：种子、叶、根、胚乳、胚)，采用常规方法分别分离小片段RNA，采用前述制备的芯片，根据前述的方法进行芯片杂交，获得每个组织中的所有miRNA的表达结果。各种组织需要生物重复和技术重复。

B.miRNA表达谱的编制

用相关软件，将所有数据归一化处理。用整张芯片所有信号中为数相等的方法规一化。计算相同组织所有miRNA信号的平均值。

用TIGR的MeV v3.1显示所有miRNA在不同组织中的表达情况，编制成miRNA表达谱。结果如图1所示。

由表达图谱结果显示，大部分miRNA的表达具有组织特异性，集中在一到两个组织中表达，提示miRNA在特异的组织行使功能。另外，大部分miRNA在胚乳中表达都很低，和基因mRNA的表达模式相似。因此可以通过影响miRNA的表达模式，来很大程度上改变目标基因的表达模式，而起到改变作物农艺性状等的目的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种分离的miRNA，其特征在于，所述的miRNA是：

(i)SEQ ID NO：58所示序列的miRNA。

2.如权利要求1所述的miRNA，其特征在于，所述的miRNA分离自禾本科植物。

3.如权利要求2所述的miRNA，其特征在于，所述的植物是水稻。

4.一种分离的或人工构建的前体miRNA，其特征在于，所述的前体miRNA能在植物细胞内剪切并表达成权利要求1所述的miRNA；所述的前体miRNA是：

(i)SEQ ID NO：195所示序列的前体miRNA。

5.一种分离的或人工构建的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的序列是权利要求4所述的前体miRNA序列的DNA序列。

6.如权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的结构如式I所示：

Seq_正向-X-Seq_反向式I，

式I中，

Seq_正向为在植物细胞中表达成权利要求1所述的miRNA的核苷酸序列，

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为在植物细胞中表达成权利要求1所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补，

式I所示的结构在转入植物细胞后，形成式II所示的二级结构：

式II中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间的基本上互补的关系。

7.一种抑制目的基因表达的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1)提供一种分离的或人工构建的多核苷酸，所述的多核苷酸的序列是权利要求4所述的前体miRNA序列的DNA序列；

8.权利要求1所述的miRNA的用途，其特征在于，用于制备抑制或者调节目的基因表达的组合物。

9.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的miRNA，或权利要求5所述的多核苷酸。