CN105273071B - OsRUS1蛋白及其编码基因在控制水稻分蘖角度及分蘖数中的应用 - Google Patents

OsRUS1蛋白及其编码基因在控制水稻分蘖角度及分蘖数中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了OsRUS1蛋白及其编码基因在控制水稻分蘖角度及分蘖数中的应用。该OsRUS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因如SEQ ID NO.2所示。本发明的发明人发现OsRUS1蛋白具有控制水稻分蘖角度及分蘖数的功能，其过量表达将导致株型松散，分蘖减少，稻穗变长。可通过对OsRUS1蛋白及其编码基因进一步研究水稻的分蘖机制或信号通路；也可以通过抑制或促进OsRUS1蛋白的表达量，得到株型松散或株型紧凑的水稻品种。

Description

OsRUS1蛋白及其编码基因在控制水稻分蘖角度及分蘖数中的 应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，特别涉及OsRUS1蛋白及其编码基因在控制水稻分蘖角度及分蘖数中的应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，超过半数的人口以稻米为主食。上世纪六十年代的绿色革命极大地提高了水稻产量，解决了当时的全球粮食危机。但是，随着人口的持续增长以及耕地面积的锐减，粮食安全已经成为全球性的问题，因而培育更高产稳产的水稻品种成为了增加粮食安全性的重要途径。而在影响水稻产量的诸多因素中，水稻的分蘖角度及分蘖数通过影响水稻对太阳光有效利用及有效穗数，因而是影响水稻单产的重要农艺性状，历来受到众多水稻育种家的重视。
分蘖是水稻生长发育过程中形成的一种特殊分枝特性，其发生可以被划分为分蘖芽形成和分蘖芽伸长生长两个过程，分蘖芽的形成不受外界因素影响,而形成后的伸长生长受到多种因素调控(Li XY等.Control of tillering in rice.Nature,2003,422:618-621)。水稻每片叶的叶腋里能形成一个分蘖芽，通常只有位于茎杆基部不伸长节间上的腋芽才可以进行伸长形成分蘖，而位于茎杆上部伸长节间上的腋芽一般不能伸长，而是进入休眠状态。因而水稻的分蘖数量不仅取决于形成分蘖芽的数目，更取决于能够伸长的分蘖芽数目。在主茎上形成的分蘖称为一级分蘖，一级分蘖茎杆基部可以再长出分蘖，形成二级分蘖，以此类推，水稻中一般以一级和二级分蘖为主，而更高级别的分蘖则较少发生(李学勇等.水稻分蘖的分子机理研究.中国科学院院刊,2003,4:274-276)。
目前，通过研究分蘖异常的水稻突变体，克隆到了一系列调控分蘖的关键基因。研究这些突变体，发现水稻的moc1和lax(Li X等.Control of tillering in rice.Nature,2003,422:618-621；Komatsu K等Major regulators of shoot branching in rice.PNAS,2003,100:11765-11770)突变体是一类腋生分生组织发生受阻，从而使得植株的分蘖数目较少；还有水稻的tb1/fc1和dwarf等(Minakuchi K等.FINE CULM1(FC1)works downstreamof strigolactones to inhibit the outgrowth of axillary buds in rice.Plant andCell Physiology,2010,51:1127-1135；Ishikawa S等.Suppression of tiller budactivity in tillering dwarf mutants of rice.Plant and Cell Physiology,2005,46:79-86；Arite T等,An RMS1/MAX4/DAD1 ortholog,controls lateral bud outgrowthin rice.Plant Journal,2007,51:1019-1029；Arite T等,A strigolactone-insensitivemutant of rice,shows an accelerated outgrowth of tillers.Plant and CellPhysiology,2009,50:1416-1424；Zou J等.The rice HIGH-TILLERING DWARF1 encodingan ortholog of Arabidopsis MAX3 is required for negative regulation of theoutgrowth of axillary buds.Plant Journal,2006,48:687-698；Lin H等.DWARF 27,aniron-containing protein required for the biosynthesis of strigolactones,regulates rice tiller bud outgrowth.Plant Cell,2009,21:1512-1525)，这一类突变体是腋芽的抑制机制有缺陷，从而造成植株的分枝或分蘖数目的增加。研究发现一些分枝调控相关的基因大部分都属于基因家族成员，它们形成多个遗传通路参与水稻分蘖的调控，主要包括MOC1通路(Li XY等.Control of tillering in rice.Nature,2003,422:618-621),LAX通路(Komatsu M等.The LAX1 and FRIZZY PANICLE 2 genes determine theinflorescence architecture of rice by controlling rachis-branch and spikeletdevelopment.Developmental Biology,2001,231:364-373；Komatsu K等.Majorregulators of shoot branching in rice.PNAS,2003,100:11765-11770；Oikawa T等.Two-step regulation of LAX PANICLE1 protein accumulation in axillarymeristem formation in rice.Plant Cell,2009,21:1095-1108)和独脚金酮信号途径(strigolactones,SLs)(Gomez-Roldan V等.Strigolactone inhibition of shootbranching.Nature,2008,455:189-194；Umehara M等.Inhibition of shoot branchingby new terpenoid plant hormones.Nature,2008,455:195-200)。
分蘖不仅决定水稻的形态建成，也直接影响水稻穗数，因此是影响水稻单产的一个重要农艺性状。目前研究水稻分蘖发生的分子机制已经成为植物遗传与发育研究领域中的热点。水稻MOC1、LAX1、LAX2等分蘖控制基因的克隆以及独脚金酮信号通路的发现，都是近年来植物形态建成特别是侧枝形成研究领域中的重要进展，使我们对植物分枝发育的调控机制的认识不断深入，同时为采用基因工程技术培育高产水稻品种奠定了重要基础。
水稻分蘖角度是指植株主茎与分蘖之间的夹角(周劲松等.水稻分蘖性状的分子遗传研究进展.江西农业学报,2006,l8(1):80-84)，它既是决定水稻株型的主要因素之一，也是构成水稻理想株型和高产育种的重要农艺性状之一，在水稻高产育种中具有重要的意义。水稻分蘖角度的研究包括生理生态研究、基础生物学研究，以及遗传基因研究，这些研究从不同视角揭示并剖析了水稻分蘖角度的本质，为进一步深入开展水稻分蘖角度的研究以及利用分子改良技术在育种上的应用奠定了基础。
但由于分蘖角度的动态可变性和不易精准测量等原因，现在对分蘖角度的定义以及类型的划分并没有统一的标准。不同的分蘖角度定义主要由测量的时期及方式不同所造成的。徐云碧等(早籼稻品种分蘖角度的遗传分析.浙江农业学报,1993,5(1):1-5)将分蘖角度定义为抽穗前主茎与分蘖之间的夹角。谢元璋等(粳稻品种分蘖性状的遗传研究.安徽农业科学,1994,22(4):319-322)将分蘖角度定义为第一级分蘖的第一号分蘖与主茎间的夹角与第二号分蘖与主茎间的夹角的平均数。一般认为分蘖角度依其外观可分为束集型、紧凑型、松散型三类，据此张龙步等(水稻田间试验方法与测定技术.沈阳:辽宁科学技术出版社,1992,36-37)认为分蘖期时分蘖角度小于20°为束集型，分蘖角度在21-32°为紧凑型，分蘖角度大于33°为松散型。
水稻从最初的在胚芽鞘中形成的分蘖芽到最终的分蘖成穗，外界生长环境如光照、气候、栽培和秧田管理技术等，以及营养物质供给对水稻分蘖角度的形成以及大小会产生不同的影响。Myers等(Gravitropic sign reversal-a fundamental feature of thegravitropic perception or response mechanisms in some plant organs.Journal ofExperimental Botany,1994,45:77-83)提出，植物分蘖角度的形成受到光照的调控。于亚辉等(不同栽培条件下水稻分蘖角度动态变化分析.中国农学通报,2006,22(2):179-181)以3个不同穗型品种(沈农606、沈农256及辽盐16)为材料，研究在不同肥力条件下对这些水稻品种的分蘖角度的影响，显示了肥力的变化会影响到植株的生长量以及分蘖数，同时也使植株的体积发生了改变，进而影响到了分蘖角度。激素调控也是影响水稻分蘖角度大小的一个重要内在因素。在水稻分蘖角度的形成及变化过程中生长素的分布是不均匀的,而且因其极性运输的特性，在水稻分蘖角度的形成上起着很重要的调节作用(Li PJ等.LAZY1controls rice shoot gravitropism through regulating polar auxintransport.Cell Research,2007,17:402-410)。Cui等(Gibberellin-regulated XET isdifferentially induced by auxin in rice leaf sheath bases during gravitropicbending.Journal of Experimental Botany,2005,56(415):1327-1334)认为赤霉素(GA3)在水稻植株茎蘖基部有积累，促进了茎蘖的向地生长，而且Auxin通过促进GA3的合成来调控茎蘖的向地生长。同时GA3可通过调控XET(xyloglucan endotransglycosylase)基因的表达，增加细胞壁的组成成分木葡聚糖，从而促进细胞的增长和伸长。
随着对水稻分蘖角度遗传研究的深入，目前有两种观点：一种认为水稻分蘖角度属于质量性状遗传，而另一种则认为水稻分蘖角度受数量性状位点(QTLs)控制。在质量性状遗传研究方面，随着分子标记的不断完善，及基因定位和克隆技术的不断提升，目前已经克隆到5个控制水稻分蘖角度形成的基因，分别是la(Takahashi M.Linkage groups andgene schemes of some striking morphological characters in Japanese rice.RiceGenetics and Cytogenetics.1963:215-236)、er(Takahashi M,等.Characterexpression and caudal genes of some mutants in rice plant.Fac Agr HokkaidoUniv.,1968,55(4):496-512)、TAC1(Yu BS等.TAC1,a major quantitative trait locuscontrolling tiller angle in rice.The Plant Journal,2007,52(5):891-898)、PROG1(Tan LB等.Control of a key transition from prostrate to erect growth in ricedomestication.Nature Genetics,2008,40(11):1360-1364)和Spk(t)(Yamamoto T等.Genetic analysis of spreading stub using indica/japonica backcrossedprogenies in rice.Breeding Science,1997,47:141-144)。
la和er为隐形基因，前者控制分蘖的平卧生长，后者控制分蘖的直立生长。Yu等(2007)利用一个株型松散的籼稻品种“IR24”，与株型紧凑的导入系粳稻品种“IL55”(来自于粳稻品种“Asominori”)杂交，从F2代分离群体中通过图位克隆的方法，获得一个控制水稻分蘖角度的主效QTL新基因Tiller Angle Controlling(TAC1)。通过对TAC1过量表达和RNAi转基因株系株型的观察发现，TAC1上调表达会导致水稻植株分蘖角度增大，而下调表达则导致分蘖角度减小。经过GUS组织染色发现，TAC1在茎节部、分蘖基部不伸长节、节部与叶鞘交接部位的叶鞘枕处都有表达。Tan等(2008)克隆到控制野生稻匍匐生长习性的基因PROSTRATE GROWTH 1(PROG1)。Yamamoto等(1997)认为源于籼稻Kasalath的显性单基因Spk(t)控制株型，增加了水稻的分蘖角度，使水稻呈现散生性状。
水稻的分蘖角度是一个复杂的发育性状，容易受到外界环境的影响，因而通常也被认为受数量性状位点(QTLs)的控制。Li等(RFLP facilitated analysis of tiller andleaf angles in rice.Euphytica,1999,109:79-84)认为除了定位于第9染色体RZ228与RG667之间的控制分蘖角度的主基因Ta外，还有四个QTL(QTA1、QTA2、QTA5和QTA8)。钱前等(水稻分蘖角度的QTLs分析，遗传学报，2001，28(1)：29-32)利用分蘖角度差异显著的一对籼粳亲本杂交F1代花培加倍获得的DH群体构建分子图谱进行数量性状座位(QTLs)分析研究后，分别在第9染色体上检测到与分蘖角度有关的两个QTLs(QTA-9a和QTA-9b)，同时在12染色体上也检测一个QTL(QTA-12)。
因此，获得更多控制分蘖的基因和蛋白不仅有利于水稻分蘖机制的研究，也有利于水稻育种。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供OsRUS1蛋白在控制水稻分蘖角度及分蘖数中的应用。
本发明的另一目的在于提供OsRUS1编码基因在控制水稻分蘖角度及分蘖数中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：OsRUS1蛋白在控制水稻分蘖角度及分蘖数中的应用，是基于本发明发明人发现氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的OsRUS1蛋白具有控制水稻分蘖角度及分蘖数的功能，其过量表达将导致株型松散，分蘖减少，稻穗变长，因此，可通过其进一步研究水稻的分蘖机制或信号通路；也可以通过抑制或促进所述的OsRUS1蛋白的表达量，得到株型紧凑或株型松散的水稻品种。
上述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的OsRUS1蛋白的编码基因，依据密码子规则有多种核苷酸序列，优选的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的编码基因可用于研究水稻的分蘖机制或信号通路，以及用于水稻育种。
所述的编码基因在用于水稻育种时，根据预期目的对其进行应用，如下：
(1)株型松散的水稻品种的获得：将所述的编码基因构建于植物表达载体上，将得到的重组植物表达载体转入水稻中进行表达，得到株型松散的水稻品种；
(2)株型紧凑的水稻品种的获得：设计抑制所述的编码基因表达的小分子物质，转入水稻中，得到株型紧凑的水稻品种。
步骤(1)中所述的植物表达载体优选pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301或pBI121。
所述的植物表达载体还可以使用增强子，包括翻译增强子或者转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或是邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的读码框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构区域。
为了便于对转基因植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物体内表达的且能产生变化的酶或是发光化合物基因(如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物基因(如庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除锈剂基因、抗潮霉素基因等)。
所述的将得到的重组植物表达载体转入水稻中进行表达可以通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导转化、农杆菌介导等常规生物学方法将得到的重组植物表达载体转化到植物细胞或者组织中。被转化的宿主植物可以是水稻或其它作物。
步骤(2)中所述的小分子物质主要指RNAi，包括siRNA、miRNA、dsRNA。
所述的RNAi可直接通过人工合成RNA形式后转入水稻中；或是合成DNA的形式，构建于植物表达载体中，转入水稻中。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明发明人利用水稻基因组信息，克隆得到一个编码含有DUF647结构域蛋白的基因，名为OsRUS1，能够对水稻基因OsRUS1进行过量表达和RNAi沉默表达，利用农杆菌转化的方法获得转基因水稻。
2虽然在拟南芥中发现了AtRUS1基因，但是还不完全明确其在拟南芥中的生物学功能；特别是拟南芥不存在象水稻那样的分蘖特性，RUS1基因在调控植物分蘖角度及分蘖数方面的功能完全未有研究和报道。在对获得的OsRUS1转基因水稻植株进行观察发现，过量表达的株系株型松散，分蘖减少，稻穗变长；而RNAi转基因株系株型紧凑(束集型)，分蘖增加，稻穗变短，结实率减小。可见OsRUS1基因对水稻分蘖及分蘖角度等有显著的影响，这对阐明基因的生物学功能有重要意义。
3虽然目前已克隆到了一些控制植物分蘖的基因，但对植物分蘖的分子机理仍不清楚，而本发明克隆的水稻基因OsRUS1能够控制水稻的分蘖数及分蘖角度，这对植物分蘖的分子机理研究将有很大推动作用。
4获得转基因突变株的分蘖数及分蘖角度都有明显的变化，说明该基因对改变分蘖效果明显，通过基因工程技术提高或者减弱该基因的表达量能够控制水稻的分蘖数及分蘖角度，从而有利于形成理想株型，达到增产的目的。
附图说明
图1是克隆OsRUS1 ORF全长序列PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图2是植物表达载体的结构示意图；其中，A为超表达载体pXW-UbiN-BamHI-OsRUS1ORF-HindIII-GFP-MluI；B为RNAi载体pYL RNAi-OsRUS1。
图3是OsRUS1基因超表达及RNAi的遗传转化与检测结果图；其中，a-f为含相应植物表达载体的农杆菌EHA105侵染中花11胚性愈伤获得转基因水稻株系的过程图；g为转pXW-UbiN-BamHI-OsRUS1 ORF-HindIII-GFP-MluI超表达的独立株系和转pYL RNAi-OsRUS1干涉的独立株系的PCR检测结果图。
图4是定量PCR分析转基因植株中OsRUS1的表达水平图。
图5是试验田中WT、OsRUS1超表达及RNAi转基因株系的表型照片图。
图6是试验田中WT、OsRUS1超表达及RNAi转基因株系的分蘖数、分蘖角度、穗长及结实率的统计结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实例1
1、水稻OsRUS1基因的克隆
根据MSU/TIGR水稻基因组数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)提供的关于OsRUS1基因的cDNA序列设计引物，OsRUS1 ORF-F1：(5′-AGGATCCATGTCCTCCTCGCAATCTCT-3′，下划线为BamHI的酶切位点)OsRUS1 ORF-R1(5′-GAAGCTTGAAGGAGCATCTCCTATGCG-3′；下划线为HindIII的酶切位点)
总RNA的提取选用粳稻品种中花11(或称ZH11，中国农业科学院作物科学研究所培育的一个公开推广应用的水稻品种)，待水稻幼苗长至3-4叶期后，提取幼苗叶片的总RNA。提取试剂采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)，提取方法按照上述TRIZOL试剂的说明书进行操作。利用反转录酶M-MLV(购自TaKaRa公司)将其反转录合成cDNA，据TaKaRa公司反转录试剂的说明书操作)，反应条件为：65℃5min，冰浴冷却5min；45℃30min，99℃5min。以反转录得到的cDNA为模板，在引物OsRUS1 ORF–F1和OsRUS1 ORF–R1的引导下，用高保真聚合酶KOD Plus(购自Toyobo公司)扩增OsRUS1基因获得ORF全长片段。PCR反应结束后，利用1％的琼脂糖凝胶进行电泳(结果如图1所示)，回收并纯化大约1800bp左右的片段，将该片段利用T4 DNA连接酶(购自TaKaRa公司)连接到克隆载体pMD18-T-Simple上(购自TaKaRa公司)，4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，筛选得到的阳性克隆，并利用碱裂解法提取阳性克隆中的载体质粒，获得载体pMD18-T-Simple-BamHI-OsRUS1 ORF-HindIII，同时送至中美泰和生物科技有限公司广州分公司测序，结果表明，该DNA片段的序列如SEQID NO.2所示与水稻基因组数据库中的片段一致，其编码如SEQ ID NO.1所示序列的蛋白，在其ORF两端引入了合适的限制内切酶位点。
2、OsRUS1基因植物超表达载体pXW-UbiN-BamHI-OsRUS1 ORF-HindIII-GFP-MluI的构建：
(1)含合适酶切位点的GFP片段的获得：根据GFP序列设计引物GFP-F1(5′-TCAAGCTTATTCAGTAAAGGAGAAGAA-3′，下划线为HindIII的酶切位点)和GFP-R1(5′-GCACGCGTCTATTTGTATAGTTCATCCAT-3′，下划线为MluI的酶切位点)。以50ng/μg的pBI221-GFP为模板，在引物GFP–F1和GFP–R1的引导下，用高保真聚合酶KOD Plus(购自Toyobo公司)扩增GFP全长片段。PCR反应结束后，利用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收并纯化大约700bp左右的片段，将该片段利用T4 DNA连接酶(购自TaKaRa公司)连接到克隆载体pMD18-T-Simple上(购自TaKaRa公司)，4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，筛选得到的阳性克隆，并利用碱裂解法提取阳性克隆中的载体质粒，获得载体pMD18-T-Simple-HindIII-GFP-MluI，同时送至中美泰和生物科技有限公司广州分公司测序确认。
(2)超表达载体pXW-UbiN-BamHI-OsRUS1 ORF-HindIII-GFP-MluI的装载：分别将空表达载体pRNAi-Ubi(已在文献“植物RNA干涉载体的构建及其在水稻基因表达沉默中的应用.分子植物育种,2006,4(5)：621-626”公开)用BamHI/MluI双酶切，将测序确认的pMD18-T-Simple-BamHI-OsRUS1 ORF-HindIII用BamHI/HindIII双酶切，将测序确认的pMD18-T-Simple-HindIII-GFP-MluI用HindIII/MluI双酶切。分别切胶回收BamHI/MluI酶切的p RNAi-Ubi、BamHI-OsRUS1 ORF-HindIII和HindIII-GFP-MluI目标片段，按1：2：2的比例用T4 DNA连接酶4℃连接过夜后，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，使用载体上启动子Ubi的一个末端正向引物Ubi-1947-F(5′-TTTGTCGATGCTCACCCTGT-3′)和OsRUS1ORF-R1进行PCR筛选，从阳性克隆中提取质粒并测序验证，将获得的超表达载体命名为pXW-UbiN-BamHI-OsRUS1 ORF-HindIII-GFP-MluI(图2A)，将其转入农杆菌EHA105中备用。
3、OsRUS1干涉载体pYL RNAi-OsRUS1的构建：
(1)干涉正向片段的扩增与装载：根据生物信息学分析，选取特异的OsRUS1 ORF(1-505)的片段为干涉片段，设计引物OsRUS1 ORF-R2(5′-AAAGCTTACCGGCCTTCTCCGCATC-3′；下划线为HindIII酶切位点)。以测序确认的pMD18-T-Simple-BamHI-OsRUS1 ORF-HindIII为模板，引物为OsRUS1 ORF-F1和OsRUS1 ORF-R2，用高保真聚合酶KOD Plus(购自Toyobo公司)扩增获得OsRUS1基因干涉正向片段。PCR反应结束后，利用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收并纯化大约500bp左右的片段，将该片段利用T4 DNA连接酶(购自TaKaRa公司)连接到克隆载体pMD18-T-Simple上(购自TaKaRa公司)，4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，筛选得到阳性克隆，并利用碱裂解法提取质粒，获得载体pMD18-T-Simple-BamHI-OsRUS1 ORF(1-505)-HindIII，送至中美泰和生物科技有限公司广州分公司测序确认。将空载体pRNAi-Ubi和测序确认的pMD18-T-Simple-BamHI-OsRUS1 ORF(1-505)-HindIII分别用BamHI/HindIII双酶切。分别切胶回收BamHI/HindIII酶切的pRNAi-Ubi、BamHI-OsRUS1 ORF(1-505)-HindIII目标片段，按1：7的比例用T4 DNA连接酶4℃连接过夜后，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，使用载体上启动子Ubi的一个末端正向引物Ubi-1947-F和OsRUS1 ORF-R2进行PCR筛选，从阳性克隆中提取质粒并测序验证，将获得的中间载体命名为pYL-UbiN-BamHI-OsRUS1 ORF(1-505)-HindIII。
(2)干涉反向片段的扩增与装载：以测序确认的中间载体pYL-UbiN-BamHI-OsRUS1ORF(1-505)-HindIII为模板，采用通用引物F1(5′-GAGAACGCGTGGTACCCTTGACCATGGTAG-3′；下划线为MluI酶切位点)和通用引物R1(5′-AACTACTGCAGGGCCCTCAGATCTACCATGGTC-3′；下划线为PstI酶切位点)，用高保真聚合酶KOD Plus(购自Toyobo公司)扩增获得OsRUS1基因干涉反向片段。PCR反应结束后，利用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收并纯化大约700bp左右的片段，将该片段利用T4 DNA连接酶(购自TaKaRa公司)连接到克隆载体pMD18-T-Simple上(购自TaKaRa公司)，4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，筛选得到阳性克隆，并利用碱裂解法提取质粒，获得载体pMD18-T-Simple-MluI-OsRUS1 ORF(1-505)-PstI，送至中美泰和生物科技有限公司广州分公司测序确认。将中间载体pYL-UbiN-BamHI-OsRUS1 ORF(1-505)-HindIII和测序确认的pMD18-T-Simple-MluI-OsRUS1 ORF(1-505)-PstI分别用PstI/MluI双酶切。分别切胶回收PstI/MluI酶切的pYL-UbiN-BamHI-OsRUS1ORF(1-505)-HindIII、MluI-OsRUS1 ORF(1-505)-PstI目标片段，按1：7的比例用T4 DNA连接酶4℃连接过夜后，连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，使用载体上启动子Ubi的一个末端正向引物Ubi-1947-F和OsRUS1 ORF-F1进行PCR筛选，从阳性克隆中提取质粒并测序验证，将获得的RNAi载体命名为pYL RNAi-OsRUS1(图2B)，转入农杆菌EHA105中备用
4、OsRUS1超表达和RNAi转基因株系的获得：利用农杆菌介导的方法将步骤2和3得到的含相应植物表达载体的农杆菌EHA105分别转化粳稻品种中花11的成熟胚的愈伤组织，方法如文献所描述(Hiei et al..Efficient transformation of rice(Oryza sativaL.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of theT-DNA.Plant J,1994,6(2):271-282)，经过预分化、分化，得到转化植株，并通过PCR方法鉴定。PCR引物如下：
HPT-F1：5′-CTGAACTCACCGCGACGTCTGTC-3′；
HPT-R1：5，-TAGCGCGTCTGCTGCTCCATACA-3′；
PCR扩增条件为：94℃5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。
经过PCR筛选鉴定为阳性的转基因植株，如图3所示。提取T1代转基因植株叶片基因组DNA进行Southern Blot检测插入基因的拷贝数，选择单拷贝的转基因植株分单株收取种子，然后从各单株收取到的种子中取150-200粒种子发芽后并用潮霉素进行筛选，统计幼苗的死亡与存活数，若没有死亡的单株表明该单株为纯合株系；选择纯合转基因株系和野生型中花11种子萌发，利用木村B营养液培养15-20天，提取总RNA，检测总RNA浓度及完成度后合成cDNA第一链，以水稻Actin基因作为内参基因，加入等量的cDNA模板，在荧光定量PCR仪上扩增Actin基因和OsRUS1基因，结果如图4所示。
所用PCR引物序列如下：
Actin-F：5′-CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA-3′；
Actin-R：5′-CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3′；
OsRUS1-1180-F：5′-CGGATCCAAGTCTTATCAATCGATTCAGCT-3′；
OsRUS1-1282-R：5′-GGGATCCTCTTTGACTGAAGGAACTTGTCC-3′。
1000×木村B营养液(水稻)的配制试剂配方：
贮液1：9.25g KNO3，43.16g Ca(NO3)2·4H2O，溶于400mL蒸馏水，定容至500mL。
贮液2：67.50g MgSO4·7H2O，7.95g K2SO4，24.1g(NH4)2SO4，溶于400mL蒸馏水，定容至500mL。
贮液3：12.4g KH2PO4，溶于400mL蒸馏水，定容至500mL。
贮液4：5.57g FeSO4·7H2O，溶于200mL蒸馏水，7.45g Na2EDTA溶于200mL蒸馏水，两者混匀，定容至1000mL。
贮液5：0.9g MnCl2·4H2O，0.11g ZnSO4·7H2O，0.04g CuSO4·5H2O，1.43g H3BO3，0.09g(NH4)6Mo7O24·4H2O，溶于400mL蒸馏水，定容至500mL。
使用时按1/1000的比例加贮液，用HCl调pH值至4.5-4.8。
实施例2
利用土培法培育秧苗，待苗长至4叶期时，移栽至实验田。三本插秧，规模为4行×12珠，株距×行距为13.5×25cm，常规肥水管理。待苗进入分蘖期后开始进行分蘖角度的统计，进入抽穗后，统计分蘖数。到后期统计穗长及结实率(图6)。
通过OsRUS1超表达载体(图2A)和RNAi载体(图2B)构建，利用农杆菌介导的水稻胚性愈伤转化获得了大量的转基因株系(图3)，所得到的两个独立纯合转基因株系中，过表达转基因株系在核酸表达水平较野生型各提高了19倍和17倍，而两个独立RNAi沉默表达转基因株系较野生型各降低了0.5倍和0.4倍(图4)。种植大田后的表型如图5(WT为野生型)所示，从图中可看出，过表达转基因株系的株型比较松散，RNAi转基因株系的株型紧凑。统计结果表明，过量表达植株的分蘖略少于野生型，分蘖角度比野生型植株的大；而RNAi植株的分蘖比野生型植株的多，分蘖角度比野生型植株的小(图6A和图6B)。量表达OsRUS1的转基因植株稻穗长度比野生型的长，而RNAi的转基因植株稻穗长度较野生型的短(图6C)；RNAi植株的结实率与野生型植株有很大的差异(图6D)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.OsRUS1蛋白在控制水稻分蘖角度及分蘖数中的应用，其特征在于：所述的OsRUS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；通过所述的OsRUS1蛋白进一步研究水稻的分蘖机制或信号通路；或者通过抑制或促进所述的OsRUS1蛋白的表达量，得到株型紧凑或株型松散的水稻品种。
2.根据权利要求1所述OsRUS1蛋白在控制水稻分蘖角度及分蘖数中的应用，其特征在于：所述的OsRUS1蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.OsRUS1蛋白的编码基因在控制水稻分蘖角度及分蘖数中的应用，其特征在于：将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码基因用于研究水稻的分蘖机制或信号通路，以及用于水稻育种。
4.根据权利要求3所述的编码基因的应用，其特征在于：所述的编码基因在用于水稻育种时，根据预期目的对其进行应用，如下：
（1）株型松散的水稻品种的获得：将所述的编码基因构建于植物表达载体上，将得到的重组植物表达载体转入水稻中进行表达，得到株型松散的水稻品种；
（2）株型紧凑的水稻品种的获得：设计抑制所述的编码基因表达的小分子物质，转入水稻中，得到株型紧凑的水稻品种。
5.根据权利要求4所述的编码基因的应用，其特征在于：所述的植物表达载体为pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301或pBI121。
6.根据权利要求5所述的编码基因的应用，其特征在于：所述的植物表达载体还包含如下元件中的至少一种：增强子、在植物体内表达的且能产生变化的酶基因或是发光化合物基因、具有抗性的抗生素标记物基因和抗化学试剂标记基因。
7.根据权利要求6所述的编码基因的应用，其特征在于：
所述的在植物体内表达的且能产生变化的酶基因或是发光化合物基因为β-葡糖醛酸糖苷酶GUS基因或荧光素酶基因；
所述的具有抗性的抗生素标记物基因为庆大霉素标记物基因或卡那霉素标记物基因；
所述的抗化学试剂标记基因为抗除锈剂基因或抗潮霉素基因。
8.根据权利要求4所述的编码基因的应用，其特征在于：（2）中所述的小分子物质为RNAi。
9.根据权利要求8所述的编码基因的应用，其特征在于：所述的RNAi直接通过人工合成RNA形式后转入水稻中；或是合成DNA的形式，构建于植物表达载体中，转入水稻中。
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