CN104903452A

CN104903452A - 用于在植物中诱导无融合生殖的改进的方法

Info

Publication number: CN104903452A
Application number: CN201380062634.3A
Authority: CN
Inventors: 蒂莫西·沙贝勒; 乔斯·M·科拉
Original assignee: Leibniz Institute For Plant Genetics And Crop Research (ipk)
Current assignee: Leibniz Institute For Plant Genetics And Crop Research (ipk)
Priority date: 2012-11-29
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2015-09-09
Also published as: BR112015012345A2; AU2013351252A1; MX2015006796A; US20150299727A1; PH12015501132A1; EP2925868A1; CA2892561A1; WO2014083047A1; US20180179552A1; ZA201503737B

Abstract

本发明涉及用于诱导植物的无融合生殖的方法、用于产生无融合生殖植物的方法以及由其获得的植物和植物种子。

Description

用于在植物中诱导无融合生殖的改进的方法

描述

本发明涉及用于在植物中诱导无融合生殖的方法、用于产生无融合生殖植物的方法以及由此获得的植物和植物种子。

开花植物中的无融合生殖被定义为由胚珠的母本组织以无性方式形成种子，避免了减数分裂和受精的过程，引起胚芽发育(Bicknell和Koltunow,2004)。因此，由以无融合生殖方式形成的种子产生的植物与它们的祖代在基因上是相同的。一般来说，无融合生殖的特征在于未减数的卵细胞在没有减数分裂的情况下产生(无减数无配子生殖)，所述未减数的卵细胞进行孤雌发育成胚芽，所述胚芽与母本植物在基因上是相同的。有性的一些方面可以被维持，这是因为受精(即假受精)在很大程度上对于具有平衡的母本与父本基因组比率的功能性胚乳(即胚芽的滋养组织)的产生来说是必要的。

在植物中经由种子进行的自然发生的营养、非有性繁殖也被称作无融合生殖，是主要存在于一些多倍体非栽培物种中的植物的遗传控制繁殖机制。各种类型的无融合生殖，特别是配子体型和孢子体型可以被区分。在也被称为不定胚生殖的孢子体型无融合生殖中，体细胞胚并不是从配子体发育，而是直接从珠心、子房壁或珠被的细胞发育。来自周围细胞的体细胞胚侵袭有性子房，这些体细胞胚中的一个竞争过其它体细胞胚和有性胚芽，并且利用所产生的胚乳。

配子体型无融合生殖是无性种子形成的一种自然发生的类型，借此克隆母本基因型的后代由未以减数分裂方式减数的胚囊，即雌配子体产生。大部分的配子体型无融合生殖物种见于菊科(Asteraceae)、蔷薇科(Rosaceae)以及禾本科(Poaceae)中，其中它们已独立地并且反复地出现。多倍性、兼性无融合生殖(一种个体内存在有性和无融合生殖种子产生这两者)、以及无减数胚珠相对于有性胚珠的发育更快是这些分类群中的大多数之间所共有的性状。

无融合生殖源自于有性繁殖，并且对于有性植物来说必须取得以下三个独立的发育步骤才能以无融合生殖方式产生种子：未减数的大孢子的形成，这意味着与母本植物的体细胞具有相同的倍性的胚囊由未以减数分裂方式减数的大孢子(二倍性孢子形成、无减数无配子生殖)或由珠心细胞(无孢子生殖)形成；在不存在受精的情况下随后由未减数的卵细胞发育胚芽(孤雌生殖)；以及双核中央细胞受精以形成功能性胚乳(假受精)。术语“无减数无配子生殖”涵盖了无孢子生殖和二倍性孢子形成这两者。以无减数方式产生的胚芽因此经由母系接受它的整个基因组。由于这些组分处在独立的遗传控制下，因此很难在考虑随机突变的情况下设想所有这三者如何可以在有性的祖代中一致地演化，这是因为任何单个步骤的表达将降低它的有性载体的适应性。已被广泛接受的是，无融合生殖种子发育由有性发育途径的失调所引起，所述失调将在多个基因座上同时表现。在野生的无融合生殖分类群中，假设这种协调的失调受到由杂交和/或多倍性所引起的整体调节变化的影响(Grossniklaus,2001,从有性到无融合生殖：分子和遗传学方法(From sexuality to apomixis:Molecular and geneticapproaches)，《无融合生殖的繁荣：从机制到遗传工程化》(The floweringof apomixis:From Mechanisms to Genetic Engineering)中,168-211)。

最近的报道在筷子芥属(Boechera)的显微解剖的胚珠中对无减数无配子生殖的基因表达(意指未减数配子的形成)进行分析，并且能够在发育的特定阶段，即大孢子母细胞(MMC)阶段鉴定出相当大量的在有性胚珠与无减数胚珠之间差异表达的等位基因。进一步的研究集中于在有性胚珠和无减数胚珠中在一系列的发育阶段期间基因表达谱的异时性(Sharbel等人,2009,The Plant Journal,58,870-882；Sharbel等人,2010,The Plant Cell,22,655-671)。然而，尽管现有技术预期地展示了通过特定的分子标记对无融合生殖胚珠和有性胚珠进行表征，但它并未提供任何有关如何在所需的植物中以可靠的并且可预见的方式，特别是借助于常规的基因转移技术来诱导无融合生殖的提示。

实际上，在鉴定控制无融合生殖的分子遗传机制中的主要困难之一在于几乎所有的无融合生殖体的基因组均具有多倍性和杂合性这两种性质。尽管已付出了相当大的努力，包括深入的功能性分子分析，来分析无融合生殖现象的根本分子体制，但迄今为止以单独地对任一种效应的影响进行控制仍然是一项挑战，这两者都可能具有不同的调节后果。

针对可控制的更可再现的性状对无融合生殖进行工程化将在植物改良和栽培品种开发中提供许多优势。无融合生殖将提供纯育、种子繁殖的杂种。控制无融合生殖因此将极大地有助于并且促进植物育种人员固定并且可靠地繁殖作物植物中的遗传杂合性和相关的杂种优势的能力。此外，无融合生殖可以缩短并且简化常规的育种过程，以使得可以避免自体受精和后代测试以产生理想的基因组合或使理想的基因组合稳定。

无融合生殖的受控使用因此必然将简化商业杂种种子生产。具体来说，将消除对物理隔离商业杂种生产场地的需要，可供使用的陆地均可以被用于使杂种种子生长而不是在授粉媒介与雄性不育系之间隔开，并且最终将消除维持亲本系种子储备的需要。

无融合生殖将提供具有独特的基因组合的基因型作为栽培品种的用途，这是因为无融合生殖基因型是纯育的而与杂合性无关。基因或基因的群组因此可以在超级基因型中被固定。来自有性-无融合生殖杂交的每一种优越的无融合生殖基因型均有可能成为栽培品种。无融合生殖因此将允许植物育种人员针对诸如高度、种子和饲草质量以及成熟之类的特征开发出具有特定的稳定性状的栽培品种。

因此，无融合生殖在农业中的应用被认为是一种重要的使能技术，它将极大地有助于作物植物中的遗传杂合性和相关的杂种优势的固定和可靠的繁殖(Spillane,2004,Nat Biotech 22(6),687-691)。

然而，所有这些依赖于经由无融合生殖来生产种子的潜在益处目前均在很大程度上由于将无融合生殖能力工程化到所关注的植物中的问题而尚未实现。

US 2002/0069433 A1公开了用于提高新一代植物的营养繁殖概率的方法，其中以转基因方式使编码在由体细胞胚芽发生受体激酶触发的信号转导级联中起作用的蛋白质的基因表达。US 2008/0155712 A1公开了用于在植物，特别是玉米中鉴定，特别是通过基因组定位来鉴定负责无融合生殖发育的序列的方法。WO 99/35258 A1公开了来自狼尾草属(Pennisetum)的无孢子生殖特异性基因组区域的核酸标志物。US 7,541,514 B2公开了由有性植物通过对特定的植物品系进行选择、采集以及育种而产生无融合生殖植物的方法。

所述公开内容都没有提供可以容易用于基因转移方法中以可控制的并且低成本的方式在植物中获得无融合生殖的方法。

本发明的根本技术问题因此在于提供克服上文所示的问题的方法，特别是提供例如借助于重组基因技术，特别是借助于重组DNA转移技术将无融合生殖引入到植物中的方法，特别是提供在植物中，特别是以可控制的、可预见的、可靠的、容易的并且有成本效益的方式诱导无融合生殖以及获得无融合生殖植物的方法。

本发明通过提供独立权利要求的教导，特别是通过提供在植物中诱导无融合生殖的方法、产生无融合生殖植物的方法以及由此获得的植物来解决它的根本问题。

因此，本发明涉及用于产生转基因无融合生殖植物的方法，所述方法包括下列步骤：

a)提供植物细胞，

b)将所述植物细胞用含有至少一种外源性核苷酸序列元件的至少一种植物载体转化以获得转基因植物细胞，所述转基因植物细胞包含所述至少一种外源性核苷酸序列元件并且所述转基因植物细胞包含编码反式作用无融合生殖效应子的核苷酸序列、顺式作用调节元件以及在所述顺式作用调节元件控制下的编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列，其中所述反式作用无融合生殖效应子能够与所述顺式作用调节元件相互作用并且其中所述顺式作用调节元件包含选自以下的至少一种调节核苷酸核心序列：

SEQ ID No.66或67中的任一个的ATHB-5结合位点、SEQID No.68至73中的任一个的LIM-1结合位点、SEQ ID No.74或75中的任一个的SORLIP1AT结合位点、SEQ ID No.76或77中的任一个的SORLIP2AT结合位点、以及SEQ ID No.78或79中的任一个的POLASIG1结合位点，以及

c)使所述转化的植物细胞再生成表现出无融合生殖的转基因植物。

因此，本发明提供了用于产生转基因无融合生殖植物的方法。这些方法包括一系列工艺步骤a)、b)以及c)，在优选的实施方案中由一系列工艺步骤a)、b)以及c)组成。进行所述工艺步骤a)、b)以及c)还适合于在植物中诱导无融合生殖。因此，本发明还涉及用于在植物中诱导无融合生殖的方法，所述方法特别是由上文所示的步骤a)、b)以及c)组成，包括上文所示的步骤a)、b)以及c)。对于这样的教导，本发明的下列技术考虑因素均适用，并且对于本领域技术人员来说是明显的。

本发明的方法教导了提供植物细胞，特别是来自有性繁殖植物的植物细胞，以及将所述植物细胞用含有至少一种外源性核苷酸序列元件的至少一种植物载体转化以获得转基因植物细胞，所述转基因植物细胞意指除了步骤a)中所提供的植物细胞中内源性地存在的遗传物质之外，植物细胞还包含至少一种外源性核苷酸序列元件，所述至少一种外源性核苷酸序列元件因此在步骤a)中所提供的所述植物细胞中并不天然存在或并不天然存在于特定的基因组位置处。通过植物载体被转移到植物细胞中的所述至少一种外源性核苷酸序列元件是编码反式作用无融合生殖效应子的核苷酸序列、顺式作用调节元件，特别是启动子，最优选地含有调节核苷酸核心序列的启动子，或包含这两者。在优选的实施方案中，所述外源性核苷酸序列元件包含与编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列功能性地并且可操作地连接的顺式作用调节元件。经过所述载体转化的转基因植物因此接受被稳定地整合到它的基因组中的所述至少一种外源性核苷酸序列元件。

在工艺步骤b)中所获得的转基因植物细胞包含编码反式作用无融合生殖效应子的核苷酸序列、顺式作用调节元件以及编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列，其中所述编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列处在所述顺式作用调节元件的调节控制下，特别是在转录控制下，并且其中至少编码反式作用无融合生殖效应子的核苷酸序列或任选地与编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列可操作地连接的顺式作用调节元件已在工艺步骤b)中被转化到所述植物细胞中。因此，这两种上文所示的核苷酸序列中的至少一种是被引入到所要转化的植物细胞中的外源性核苷酸序列。

反式作用无融合生殖效应子在特别优选的实施方案中是反式作用转录因子，特别是DNA结合转录因子。

在本发明的优选的实施方案中，用于转化步骤(a)中所提供的植物细胞的植物载体包含编码所述反式作用无融合生殖效应子的核苷酸序列或包含所述顺式作用调节元件的核苷酸序列或这两者作为外源性核苷酸序列元件。因此，本发明假定作为在步骤b)中通过转化植物细胞所获得的转基因植物细胞的特征的外源性核苷酸序列元件是编码反式作用无融合生殖效应子的核苷酸序列或包含顺式作用调节元件，特别是本发明的所谓的“调节核苷酸核心序列”的核苷酸序列，或这两者。在一个特别优选的实施方案中，在所述植物载体含有顺式作用调节元件的情况下，它还包含与所述顺式作用调节元件可操作地连接的具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列。因此，工艺步骤b)的当前所获得的转基因植物细胞的特征在于存在转基因核苷酸序列，所述转基因核苷酸序列包含反式作用无融合生殖效应子、转基因顺式作用调节元件，特别是本发明的调节核苷酸核心序列，或这两者，并且其中所述核苷酸序列并非内源性地存在于步骤a)中所提供的植物细胞中或并非存在于在转化步骤之后所实现的所述特定的基因组位置处。

本发明的教导是基于本申请的发明人的以下贡献：在转化的植物细胞中，特别是以增加表达的方式，提供本发明的特定的反式作用无融合生殖效应子允许在植物细胞中诱导无融合生殖表型。因此，在本发明的一个实施方案中，假定将所述植物细胞用至少一种植物载体转化，所述植物载体包含编码反式作用无融合生殖效应子的核苷酸序列，所述核苷酸序列优选地处在调节序列，特别是强组成型或诱导型启动子的控制之下，特别是允许表达与野生型表达相比有所增加。因此，这种编码反式作用无融合生殖效应子的核苷酸序列在植物细胞中被转化、整合并且表达之后将优选地允许表达有所增强或改良以及产生反式作用无融合生殖效应子，以允许，在优选的实施方案中连同与编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列可操作地连接的顺式作用调节元件一起允许所需的无融合生殖表型产生。优选地与编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列可操作地连接的顺式作用调节元件可以是内源性存在的核苷酸序列或可以是外源性转基因核苷酸序列元件本身。

在一个实施方案中，本发明的包含至少一种调节核苷酸核心序列的优选地与DEDDh核酸外切酶可操作地连接的特定的顺式作用调节元件的引入引起所述核酸外切酶在通过本发明获得的转基因植物的胚珠中表达并且从而为本发明的植物提供了无融合生殖表型。本发明因此教导了特定的反式作用无融合生殖效应子与特定的顺式作用调节元件，特别是本发明的调节核苷酸核心序列的特定的相互作用。

本发明基本上是基于代表所谓的apollo基因的核酸分子或其必要的和特定的部分，所述apollo基因意指“无融合生殖相关基因座(Apomixis linked locus)”。所述基因，特别是它的编码序列对apollo蛋白质进行编码，所述apollo蛋白质在植物胚珠中表达后会引起无融合生殖种子产生。

本发明有利地使用了呈分离和纯化形式的多核苷酸，特别是编码能够在植物中诱导无融合生殖的蛋白质，即apollo蛋白质，的多核苷酸，以及能够充当所述编码序列的调节元件的多核苷酸。此外，本发明是基于以下教导：植物，特别是它们的基因组内源性地包含编码所述能够诱导无融合生殖的apollo蛋白质的核苷酸序列，在下文中也被称为“多核苷酸”或“多核苷酸序列”以及它的调节元件，在下文中也被称为“内源性地存在编码能够在植物中诱导无融合生殖的蛋白质的多核苷酸”。因此，例如以SEQ ID No.37、40、43、46、49或52所指定的编码序列和调节序列这两者通常以各种等位基因状态内源性地存在于它们在植物中，特别是十字花科(Brassicaceae)，优选地筷子芥属中的天然和原始的基因组环境中，并且引起有性或无融合生殖表型在植物中的产生。然而，在天然存在的有性繁殖的植物中，所述核苷酸序列(呈它们的有性等位基因状态，在下文中也被称作“有性等位基因”)，如SEQ ID No.46、49或52中的核苷酸序列在所述植物的胚珠中受到阻遏、抑制、或未被激活、或失活(这意指不表达)，从而阻止无融合生殖。相比之下，所述多核苷酸(呈它的无融合生殖等位基因状态，在下文中也被称作“apo等位基因”)，如SEQ ID No.37、40或43中的多核苷酸在无性繁殖的植物的胚珠中被诱导或去阻遏、或并未失活，这意指表达，所述植物意指无融合生殖植物。

具体来说，本发明是基于如下的教导：在有性繁殖的植物的植物胚珠中，内源性存在的编码具有无融合生殖诱导能力的apollo蛋白质的基因在所述组织中被抑制、阻遏、未被激活、或失活，并且因此需要被激活以产生无融合生殖植物。在有性繁殖植物和无融合生殖植物这两者中，呈无融合生殖等位基因形式和有性等位基因形式的apollo基因的编码区在功能上是等同的。它们的表达的差异是由于它们的调节元件不同，优选地如SEQ ID No.55至62和65至119中所指定。具体来说，无融合生殖调节元件，优选地SEQ ID No.55、57、58、59以及107至119中所给出的启动子序列的特征尤其在于特定的启动子插入序列的存在，最优选地为SEQ ID No.66至79中的任一个的调节核苷酸核心序列的存在，所述调节核苷酸核心序列引起与所述调节元件连接的编码元件在胚珠中表达。

本发明中所用的有性调节元件的特征尤其在于不存在这种启动子插入序列，特别是不存在上文所指定的调节核苷酸核心序列，例如SEQID No.65，特别是不存在为SEQ ID No.66至79中的任一个的核苷酸核心序列。优选地，有性调节元件，优选地启动子尤其被表示为存在调节元件，即具有如SEQ ID No.80至85中所给出的以及如SEQ ID No.56、60、61、62以及86至106中所给出的启动子序列中所含的核苷酸序列的调节核苷酸靶序列，并且提供了体细胞基因表达，但没有提供在胚珠中的表达，这可能是由于在所述组织中受到抑制。

具体来说，本发明因此提供了教导以修饰，特别是激活或诱导，这意指得到在胚珠中表达的编码apollo蛋白质的核苷酸序列以实现具有所需表型，特别是无融合生殖表型的植物。这可以优选地通过将植物用本发明的调节核苷酸核心序列转化来实现，所述调节核苷酸核心序列诱导编码能够诱导无融合生殖的本发明蛋白质，这意指apollo蛋白质的转基因或内源性存在的多核苷酸在所述植物中表达。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中顺式作用调节元件中所含的调节核苷酸核心序列是ATHB-5、LIM-1、SORLIP1AT、SORLIP2AT或POLASIG1的转录结合位点(在下文中，也被称为“TBS”或转录因子结合位点)。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中顺式作用调节元件是转基因顺式作用调节元件。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中将步骤a)中所提供的植物细胞在步骤b)中用植物载体转化，所述植物载体含有包含顺式作用调节元件的外源性核苷酸序列元件，特别是核苷酸序列。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中包含顺式作用调节元件的外源性核苷酸序列元件另外包含编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明还涉及用于产生转基因无融合生殖植物的方法，特别是根据上文，所述方法包括下列步骤：

m)提供有性繁殖植物的植物细胞，所述植物细胞包含在顺式作用调节元件控制之下的编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列，

n)通过形成至少一种调节核苷酸核心序列来对控制所述编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列的所述顺式作用调节元件进行修饰，所述调节核苷酸核心序列将被包含在所述顺式作用调节元件中并且选自以下：SEQ ID No.66或67中的任一个的ATHB-5结合位点、SEQ ID No.68至73中的任一个的LIM-1结合位点、SEQ ID No.74或75中的任一个的SORLIP1AT结合位点、SEQ ID No.76或77中的任一个的SORLIP2AT结合位点、以及SEQ ID No.78或79中的任一个的POLASIG1结合位点，以及

o)使在步骤n)中所获得的植物细胞再生成表现出无融合生殖的转基因植物，所述植物细胞含有新形成的至少一种调节核苷酸核心序列。

在优选的实施方案中，控制有性繁殖植物的植物细胞中所含的编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列的顺式作用调节元件是所述有性繁殖植物中所述DEDDh核酸外切酶的野生型顺式作用调节元件，特别是有性apollo基因的顺式调节元件。因此，所述顺式作用调节元件最优选地含有至少一种调节核苷酸靶序列，但不含调节核苷酸核心序列。

在本发明的上下文中，术语“形成至少一种调节核苷酸核心序列”指的是顺式作用调节元件中至少一个核苷酸的插入或缺失或所述顺式作用调节元件中至少两个核苷酸的倒位，以产生，这意指形成至少一种调节核苷酸核心序列。

根据上述教导，顺式作用调节元件被修饰，特别是突变以含有本发明的至少一种调节核苷酸核心序列，所述调节核苷酸核心序列在步骤m)中所提供的植物细胞中并不天然存在于所述位置或根本不存在。所述突变可以是一个或多个另外的核苷酸序列的插入、至少一个核苷酸的缺失或现有核苷酸序列的倒位以在顺式作用调节元件中提供至少如上文所示的调节核苷酸核心序列。

在一个实施方案中，步骤n)中的所述修饰，特别是突变是由顺式调节元件的全部或部分的诱发突变所引起或与顺式调节元件的全部或部分的诱发突变有关，例如重组、重复、缺失、切除、插入或倒位，所述顺式调节元件内源性地存在于apollo基因的有性等位基因中并且与能够在植物胚珠中诱导无融合生殖的多肽的编码序列可操作地连接，所述修饰允许所述多肽表达，从而在植物中引起无融合生殖。

x)提供有性繁殖植物的植物细胞，所述植物细胞包含在顺式作用调节元件控制之下的编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列，

y)通过使所述顺式作用调节元件中所含的并且选自SEQ IDNo.80至85中的任一个的至少一种调节核苷酸靶序列突变，例如缺失来对控制编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列的顺式作用调节元件进行修饰：，以及

z)使在步骤y)中所获得的植物细胞再生成表现出无融合生殖的转基因植物，所述植物细胞含有所述至少一种调节核苷酸靶序列的缺失。

在本发明的上下文中，术语“使至少一种调节核苷酸靶序列突变”指的是调节核苷酸靶序列中至少一个核苷酸的插入或缺失或所述调节核苷酸靶序列中至少两个核苷酸的倒位。使至少一种调节核苷酸靶序列突变因此具有如下的作用：核苷酸序列由于所述突变而相对于步骤x)中所提供的植物细胞中所存在的原始的至少一种调节核苷酸靶序列有至少一个核苷酸不同。

在一个实施方案中，步骤y)中进行的所述修饰，特别是突变是由调节核苷酸靶序列的全部或部分的诱发突变所引起或与调节核苷酸靶序列的全部或部分的诱发突变有关，例如重组、重复、缺失、切除、插入或倒位，所述调节核苷酸靶序列内源性地存在于apollo基因的有性等位基因中并且与能够在植物胚珠中诱导无融合生殖的多肽的编码序列可操作地连接，所述修饰允许所述多肽表达，从而在植物中引起无融合生殖。

本发明因此允许并且使得能够通过修饰，特别是诱导，在下文中还被称为激活内源性存在的编码能够诱导有性植物的无融合生殖的蛋白质的核苷酸序列的内源性存在的调节元件表达来诱导植物的无融合生殖，这是例如通过使所述调节核苷酸靶序列突变，特别是切除、插入、重复或倒位以使它完全缺失或使它移到另一基因组位置来对所述内源性存在的调节核苷酸靶序列进行结构修饰来实现的。所述结构修饰可以优选地通过用于突变的任何手段来实现，例如辐射、使用化学试剂或使用被引入到植物细胞中的核苷酸序列，特别是DNA分子，这尤其意指在有性繁殖的植物的胚珠中序列能够在结构上干扰所述调节核苷酸靶序列并且所述序列可以是转座子或任何其它能够干扰，例如重组或插入所述调节核苷酸靶序列中的序列。

在本发明的另一个实施方案中，提供了用于产生转基因无融合生殖植物的方法，特别是根据上文，所述方法包括上文所示的工艺步骤x)、y)、n)以及z)。因此，在这个实施方案中，通过形成至少一种调节核苷酸核心序列以及通过使至少一种调节核苷酸靶序列缺失(如本发明中所示)来使控制编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列的顺式作用调节元件突变。

因此，在一个实施方案中，本发明假定通过突变过程对有性胚珠中抑制因子的结合位点的干扰(这尤其意指缺失)以使所述位点在植物胚珠中不再由所述抑制因子所识别，但在优选的实施方案中由激活因子所识别，从而使繁殖过程变成无融合生殖。在一个实施方案中，对抑制因子结合位点，优选地调节核苷酸靶序列进行干扰足以由有性apollo等位基因产生无融合生殖apollo等位基因。在另一个实施方案中，在有性apollo等位基因中形成激活因子结合位点，优选地调节核苷酸核心序列以形成无融合生殖apollo等位基因足以获得无融合生殖表型。在另一个实施方案中，干扰抑制因子结合位点以及形成激活因子结合位点这两者(任选地所述这两个位点均处在相同的位置)足以产生无融合生殖表型。在另一个实施方案中，对抑制因子结合位点的干扰以及激活因子结合位点的形成在本发明的顺式调节元件的不同位点处发生。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中有性apollo等位基因的顺式作用调节元件中所含的核苷酸靶序列是Dof2、Dof3或PBF的转录结合位点。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中将步骤a)、x)或m)中所提供的植物细胞用植物载体转化，所述植物载体含有包含编码反式作用无融合生殖效应子的核苷酸序列的外源性核苷酸序列元件。

在特别优选的实施方案中，编码反式作用无融合生殖效应子的外源性核苷酸序列包含调节元件，特别是控制所述反式作用无融合生殖效应子表达的启动子，特别是包含提供所述效应子的高效率、组成型或诱导型表达的启动子。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述反式作用无融合生殖效应子是过表达的反式作用无融合生殖效应子。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述反式作用无融合生殖效应子是转录因子，特别是ATHB-5、LIM-1、SORLIP1AT、SORLIP2AT或POLASIG1。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述转录因子是遗传修饰的转录因子，所述转录因子例如提供提高的转录效率。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列包含选自以下的核苷酸序列：a1)SEQ ID No.22至54中的任一个中所限定的多核苷酸，或其完全互补链，特别是SEQ ID No.23、25、27、28、29、30、33、35、37、38、40、41、43、44、47、50或53中的任一个中所限定的多核苷酸，或其完全互补链；b1)编码具有SEQ ID No.1至21中的任一个中所限定的氨基酸序列的多肽的多核苷酸或其完全互补链，优选地编码具有SEQ ID No.4至9、SEQ ID No.13至15或SEQ IDNo.19至21中的任一个中所限定的氨基酸序列的多肽的多核苷酸或其完全互补链；以及c1)与a1)或b1)中所限定的核酸序列或其完全互补链具有大于70％的序列同一性程度的多核苷酸变体，优选地其中所述序列同一性是基于整个序列并且是通过BLAST分析，优选地在NCBI数据库中，特别是通过空位分析(GAP analysis)，使用50的空位权重和3的长度权重来确定。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列包含选自以下的核苷酸序列：a2)SEQ ID No.22、23、27、28、32、33中的任一个中所限定的多核苷酸或其完全互补链，优选地SEQ ID No.23、28或33中的任一个中所限定的多核苷酸或其完全互补链；b2)编码具有SEQ ID No.4、5、6中的任一个中所限定的氨基酸序列的多肽的多核苷酸或其完全互补链；以及c2)与a2)或b2)中所限定的核酸序列或其完全互补链具有大于70％的序列同一性程度的多核苷酸变体，优选地其中所述序列同一性是基于整个序列并且是通过BLAST分析，优选地在NCBI数据库中，特别是通过空位分析，使用50的空位权重和3的长度权重来确定。

在优选的实施方案中，本发明还使用了上文所示的编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸的特征尤其在于在所述序列的外显子，即第五外显子中存在至少一个特定的重复标记序列并且表示核苷酸节段重复。优选地，所述重复标记核苷酸序列在SEQ ID No.64中给出并且它的相应氨基酸序列在SEQ ID No.63中给出。

在实施方案中，本发明还涉及用于鉴定植物中的无融合生殖效应子的方法，其中在DNA-蛋白质结合测定中使用选自以下的核苷酸序列以鉴定与所述核苷酸序列结合的蛋白质：SEQ ID No.66或67中的任一个的ATHB-5结合位点、SEQ ID No.68至73中的任一个的LIM-1结合位点、SEQ ID No.74或75中的任一个的SORLIP1AT结合位点、SEQ ID No.76或77中的任一个的SORLIP2AT结合位点、以及SEQ IDNo.78或79中的任一个的POLASIG1结合位点。

在实施方案中，本发明还涉及根据本发明的方法中的任一种所产生的转基因无融合生殖植物。

在实施方案中，本发明还涉及来自根据上文的植物的转基因植物材料。

本发明的“调节核苷酸核心序列”(它的存在可用于产生所需的无融合生殖表型)在优选的实施方案中是转录因子结合位点，特别是转录结合位点，并且特别优选地选自ATHB-5、LIM-1、SORLIP1AT、SORLIP2AT以及POLASIG1的结合位点。因此，所述调节核苷酸核心序列位于编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列的顺式作用调节元件中，并且在甚至更优选的实施方案中位于下列具体鉴定的位置处。这些位置在本文中是关于SEQ ID No.27给出的。

在优选的实施方案中，ATHB-5转录结合位点(SEQ ID No.66和67)位于顺式调节序列内并且参照SEQ ID No.27，位于(+)链(在下文中也被称作“正义”链或“正”链)中的位置62至70处。

在特别优选的实施方案中，LIM-1转录结合位点(SEQ ID No.68、69以及70)位于顺式调节序列中并且参照SEQ ID No.27，位于(+)链中的位置43至54处。最优选地，LIM-1转录结合位点位于(-)链(在下文中也被称作“反义”链或“负”链)中并且由SEQ ID No.71、72或73表示。

在另一个优选的实施方案中，SORLIP1AT转录结合位点(SEQ IDNo.74)位于顺式调节序列内并且参照SEQ ID No.27，位于(+)链中的位置51至55处。最优选地，SORLIP1AT转录结合位点存在于(-)链中并且由SEQ ID No.75呈现。

在另一个优选的实施方案中，SORLIP2AT转录结合位点(SEQ IDNo.76)位于顺式调节序列内并且关于SEQ ID No.27，位于(+)链中的位置53至57处。最优选地，SORLIP2AT转录结合位点存在于(-)链中并且由SEQ ID No.77表示。

在另一个优选的实施方案中，POLASIG1转录结合位点(SEQ IDNo.78)位于顺式调节序列内并且关于SEQ ID No.27，位于(+)链中的位置64至69处。最优选地，POLASIG1转录结合位点存在于(-)链中并且由SEQ ID No.79表示。

在本发明的另一个实施方案中，假定对有性繁殖植物，特别是apollo基因的有性等位基因进行修饰以使编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列的顺式作用调节元件中存在的转录因子结合位点，特别是转录结合位点突变，特别是干扰、缺失或功能性失活并且其中所述结合位点在下文中还被称作“调节核苷酸靶序列”，优选地选自转录因子Dof2、Dof3以及PBF的转录因子结合位点。优选地，在有性等位基因中使所述调节核苷酸靶序列突变，优选地干扰，优选地缺失以产生apo等位基因。最优选地，关于SEQ ID No.32，所述缺失的位置在下文中给出。

有性等位基因中所含的并且要被干扰以获得apo等位基因的核苷酸靶序列在Dof2(SEQ ID No.80)的情况下存在于位置59至69处，优选地存在于(-)链(SEQ ID No.81)上；在Dof3(SEQ ID No.82)的情况下存在于位置60至65处，优选地存在于(-)链(SEQ ID No.83)上；以及在PBF(SEQ ID No.84)的情况下存在于位置61至65处，优选地存在于(-)链(SEQ ID No.85)上(关于SEQ ID No.32给出)。

本申请的发明人鉴定出所述顺式调节元件并且揭示含有无融合生殖特异性多态性的apollo基因的启动子(TGGCCCGTGAAGTTTATTCC)(SEQ ID No.65)在(+)链上的特征在于在所有的有性等位基因中均不存在的ATHB-5转录因子的转录结合位点(agtTTATTc)(SEQ IDNo.67)。相同的多态性在(-)链中产生Lim1的TBS(aagaggaGGTGG)(SEQ ID No.70)、SORLIP1AT的TBS(GTGGC)(SEQ ID No.74)、SORLIP2AT的TBS(GGCCC)(SEQ ID No.76)以及POLASIG1的TBS(TTTATT)(SEQ ID No.78)。本发明的有性等位基因在该区域中在(-)链上含有Dof2/Dof3的TBS(ttGCTTTaaaa(SEQ ID No.80)和TGCTTT(SEQ ID No.82))和PBF的TBS(GCTTT)(SEQ ID No.84)。上文中的大写字母表示不变的核苷酸，而小写字母表示可变的核苷酸。

不受理论所束缚，看来在有性筷子芥属基因型中，apollo基因在叶片中以任何等位基因形式被活跃地表达或去阻遏，但是它在进入减数分裂的胚珠中被特异性地阻遏或没有被激活；并且在无融合生殖筷子芥属中，apollo基因在叶片中也是以任何等位基因形式被活跃地表达或去阻遏，但是它在进入无减数无配子生殖的胚珠中由于5'UTR中的多态性的存在而没有被阻遏或失活。对5'UTR区上的转录因子结合位点进行的序列分析揭示在apo等位基因中，多态性完全地或部分地含有ATHB-5、LIM-1、SORLIP1AT、SORLIP2AT以及POLASIG1转录因子的特异性TBS。相反，在有性等位基因中，由无融合生殖特异性多态性所占据的区域含有Dof2、Dof3以及PBF转录因子的特异性TBS。

ATHB-5是I类HDZip(同源异型域-亮氨酸拉链)蛋白质，所述蛋白质是介导在幼苗建植期间ABA对生长的抑制作用的ABA反应性的正调节因子。还已经在对拟南芥长角果上的cDNA-AFLP进行分析时，发现ATHB-5进行母系表达。

LIM-1是广泛的转录因子，已经在许多模式植物，如大豆(Glycinemax)、百脉根(Lotus japonicus)、烟草(Nicotiana tabacum)以及拟南芥中被检测到，它的功能仍不为人熟知。

SORLIP1AT和SORLIP2AT是在拟南芥属(arabidopsis)中的光诱导型启动子中过度表现的序列。SORLIP1是最过度表现的并且似乎具有非链依赖性。

POLASIG1序列是在大部分的mRNA前体当中高度保守的标准核苷酸序列(AAUAA)。这是涉及3'端信号转导区域从mRNA前体中裂解的裂解和多聚腺苷酸化特异性因子(CPSF)的信号。这个靶标对于位于负链上的ORF来说是有意义的。

Dof(DNA结合单指)是共有具有一个Cys2/Cys2锌指基序的高度保守的并且独特的DNA结合域的植物蛋白家族。许多基因启动子已经与Dof蛋白相关，但是它们的调节机制和生理功能仍难以捉摸。在玉米中，Dof2主要在叶片、茎以及根部表达，并且它已经被证实用作转录阻遏因子。在水稻中，OsDof3在发芽期间响应于赤霉酸(GA)而特异性地表达于小盾片和胚乳中。在拟南芥属中，母系表达的AtDof3.7涉及对种子发芽的控制。

PBF(醇溶谷蛋白盒结合因子)结合活性已经在玉米胚乳核中被检测到，并且它与亮氨酸拉链(bZIP)转录因子Opaque 2(O2)的组合在调节22kDa的玉米醇溶蛋白基因表达(mRNA和蛋白质表达限于胚乳)中是重要的。

因此，本发明提供了有利的手段和方法来诱导植物的无融合生殖。本发明中所使用的多核苷酸，特别是编码能够诱导无融合生殖的蛋白质的那些多核苷酸可以用于在植物细胞中被转化以产生包含所述外源性引入的多核苷酸，在植物胚珠中表达所述多核苷酸并且从而产生无融合生殖表型和无融合生殖植物的植物。在一个特别优选的实施方案中，这可以通过使用多核苷酸，优选地SEQ ID No.22至54，优选地SEQ ID No.23、25、27、28、29、30、33、35、37、38、40、41、43、44、47、50或53，特别是SEQ ID No.23、25、28、30、33、35、38、41、44、47、50或53中的任一个中所限定的多核苷酸来实现，在由于包含本发明的至少一种调节核心序列的顺式调节元件的存在而提供在胚珠中的表达的启动子控制之下，所述多核苷酸编码能够在植物胚珠中诱导无融合生殖的蛋白质，优选地SEQ ID No.4至21，优选地SEQ ID No.4至9、SEQ ID No.13至15或SEQ ID No.19至21中的任一个中所限定的蛋白质。

因此，在本发明的优选的方面，分离的核酸分子包含用于诱导无融合生殖的多核苷酸，特别是如本文所具体公开的多核苷酸或多核苷酸变体，所述多核苷酸编码能够在植物中，特别是在植物胚珠中诱导无融合生殖的蛋白质，特别是编码具有能够在植物胚珠中诱导无融合生殖，特别是无减数无配子生殖的特异性核酸外切酶活性的蛋白质，并且其中所述其特异性多核苷酸变体可以有利地用于被转移到植物中，特别是植物细胞中，被稳定地整合到它的基因组中并且可以优选地在所获得的转化的植物的胚珠中表达以产生转基因无融合生殖转基因植物，所述植物产生无融合生殖种子。在本发明的优选的实施方案中，假定将编码如下的蛋白质的多核苷酸转移到植物中以允许所述多核苷酸在允许在胚珠中表达的启动子的控制下表达，所述蛋白质能够诱导植物的无融合生殖并且如共有SEQ ID No.1至9，优选地SEQ IDNo.4至9，最优选地SEQ ID No.4或7，最优选地SEQ ID No.5或8，最优选地SEQ ID No.6或9中的任一个中所指定并且特别是如特异性SEQ ID No.10至21，优选地SEQ ID No.13至15或19至21中的任一个中所指定，所述启动子包含顺式调节元件，所述顺式调节元件包含本发明的至少一种调节核心序列，从而在胚珠中产生所需的apollo蛋白。

本发明还提供了如下的多核苷酸，所述多核苷酸能够充当调节元件，优选地顺式调节元件，并且可以用于转化植物细胞并且借此所述能够充当调节元件的多核苷酸对编码能够诱导无融合生殖的蛋白质的内源性存在的基因的调节元件进行结构修饰以使所述基因的内源性存在的调节元件去阻遏(这意指激活)，从而允许能够诱导无融合生殖的蛋白质表达并且产生具有无融合生殖表型的植物。这种特定的方法是基于本发明的以下发现：编码能够诱导无融合生殖的蛋白质的基因在野生型植物中也存在，然而，但是没有被激活，这意指没有被诱导，并且因此在有性繁殖的植物的胚珠中不表达。不受理论所束缚，在野生型有性繁殖的植物中，内源性存在的编码能够诱导无融合生殖的蛋白质的基因的表达被抑制或失活，这最有可能是由于编码蛋白质的区域的调节元件受到抑制。因此，在一个实施方案中，本发明教导了在结构上干扰编码能够在植物胚珠中诱导无融合生殖的蛋白质的核苷酸序列区域的内源性存在的并且受到抑制的调节元件的包含以下各项，优选地由以下各项组成的调节元件，特别是核苷酸序列，优选地DNA分子的引入允许逆转对所述调节元件的抑制作用并且诱导编码序列表达：本发明的调节核苷酸核心序列SEQ ID No.66至79中的任一个。

因此，本发明使用了分离的核酸分子，所述核酸分子包含用于诱导无融合生殖的多核苷酸，这意指本文具体公开的多核苷酸，其中所述特异性多核苷酸表示或包含调节元件或由调节元件组成，所述调节元件特别是本发明的调节核苷酸核心序列SEQ ID No.66至79中的任一个，并且可用于诱导植物的无融合生殖，这是因为它们允许与其可操作地连接的编码序列在植物胚珠中，特别是在胚珠发育期间在植物中进行可调型表达。因此，这些调节核苷酸核心序列使得植物胚珠中的编码序列不被抑制，并且提供了能够在植物的胚珠中直接表达编码序列的优势。

在另一个实施方案中，本发明使用了这些特异性多核苷酸，所述特异性多核苷酸能够用作调节核苷酸核心序列，特别是在作为启动子的一部分的情况下，如SEQ ID No.55、57、58、59或107至119中的任一个中所示，它们在胚珠中以调节方式非常特异性地起作用。在本发明的这种启动子(在下文中也被称作apo-启动子)的一个优选的实施方案中，所述调节核苷酸核心序列使得所述启动子在所述植物的胚珠中表达。

因此，本发明非常有利地允许与亲本相同的种子以无性繁殖方式产生。具体来说并且优选地，本发明的核苷酸分子可以被转化到所需的植物中，例如高产杂种中，以使它们的繁殖方式变成无融合生殖种子产生。因此，根据本发明，高产杂种可以被用于种子生产中以使所述高产杂种种子的相同拷贝繁殖，这将极大地降低种子生产的成本并且进而增加可以在商业上提供的基因型的数目。进一步，可以直接在商业杂种中对基因进行评价，这是因为后代将不分异，从而省去了繁琐的回交程序。无融合生殖可以用于使甚至具有复杂性状，如杂种优势的理想表型稳定。这些性状可以非常容易地被维持并且经由无融合生殖无限繁殖。此外，本发明提供了将它与雄性不育组合，有利地防止遗传工程化的稳定的性状与不合需要的亲缘植物杂交的可能性。

本发明提供了上文所示的技术问题的解决方案，这是通过提供分离的特异性核酸分子来实现的，所述核酸分子可以用于在植物中，特别是在植物胚珠中诱导无融合生殖，优选地用于在植物中，优选地在植物胚珠中诱导无减数无配子生殖和/或孤雌生殖。

用于本发明中的核酸分子在一个优选的实施方案中包含特异性多核苷酸，所述特异性多核苷酸的特征在于它们能够诱导植物的无融合生殖以及存在根据SEQ ID No.27、28、29、30或31，特别是SEQ IDNo.27、28、29、30，优选地SEQ ID No.27或29中的任一个的特定共有核苷酸序列模式，所述核苷酸序列模式代表本发明的所有具体公开的诱导无融合生殖的等位基因中所存在的核苷酸模式。

在另一个优选的实施方案中，所述特异性多核苷酸是各种诱导无融合生殖的等位基因，所述等位基因根据本发明被特定地使用并且在SEQ ID No.37至45中的任一个中被表征。

本发明的特征优选地在于使用呈特异性形式和共有形式的多核苷酸和多肽。共有形式是普遍序列基序(这意指模式)，所述基序在一个实施方案中存在于根据本发明所鉴定并且分离的所有多态性apollo基因中，特别是为包括无融合生殖形式和有性形式在内的所有不同的多态形式的编码序列所共有的。共有序列还以仅存在于无融合生殖多态性等位基因中的普遍序列基序的形式给出，或在另一个实施方案中，仅存在于所分离的有性多态性等位基因形式中。无融合生殖等位基因和有性等位基因可以根据它们的调节元件的不同共有序列来分类并且它们的编码区共有相同、类似或等同的共有序列。在共有序列中，“Xaa”代表任意天然存在的氨基酸并且“n”代表核苷酸a、t、g或c中的任一个。

本发明中所用的特异性多核苷酸和多肽是被特定分离和分析的并且展示呈所举例说明的形式的共有序列模式。

在特别优选的实施方案中，本发明因此使用下表I至III中所表征的共有和特异性多核苷酸和多肽。

表I

apollo氨基酸序列(多肽)

说明：A011a、A043a、A081a：无融合生殖霍氏筷子芥(Boecheraholboellii)等位基因；S011a、S355a、S390a：有性霍氏筷子芥等位基因

“共有”意指共有序列，这意指在apollo基因的多于一种特异性等位基因中存在的针对所观测到的序列偏差(即核苷酸/氨基酸多态性)具有特定鉴定的位置的一般序列基序。在氨基酸序列中，“Xaa”可以是任何天然存在的氨基酸。在核苷酸序列中，“n”可以是a、g、t或c中的任一个，在内含子中，“n”可以另外表示缺失的核苷酸。

“特异性”意指特定分离的具有所测序或推断的核苷酸和氨基酸序列的多态性等位基因。

“普遍”意指无融合生殖和有性apollo基因或蛋白质这两者的共有序列。

“Apo”意指无融合生殖apollo基因或蛋白质。

“有性”意指有性apollo基因或蛋白质。

“蛋白质”意指apollo蛋白质。

“核酸外切酶结构域”意指apollo蛋白质的片段，特异性生物活性DEDDh 3'-5'端核酸外切酶活性位于所述片段中。

“重复”意指任选地存在于apollo基因的无融合生殖等位基因和有性等位基因的编码区中并且在SEQ ID No.63(氨基酸)和SEQ ID No.64(核苷酸)中所指定的重复标记序列。

表II

编码apollo蛋白质的多核苷酸

SEQ ID No.	类型	亚型	表征
				22	共有	普遍	具有重复的基因组序列
23	共有	普遍	具有重复的编码序列
				24	共有	普遍	无重复的基因组序列
25	共有	普遍	无重复的编码序列
				26	共有	普遍	核酸外切酶结构域
27	共有	Apo	具有重复的基因组序列
				28	共有	Apo	具有重复的编码序列
29	共有	Apo	无重复的基因组序列
				30	共有	Apo	无重复的编码序列
31	共有	Apo	核酸外切酶结构域
				32	共有	有性	具有重复的基因组序列
33	共有	有性	具有重复的编码序列
				34	共有	有性	无重复的基因组序列
35	共有	有性	无重复的编码序列
				36	共有	有性	核酸外切酶结构域
37	特异性	Apo	A011a基因组序列
				38	特异性	Apo	A011a编码序列
39	特异性	Apo	A011a核酸外切酶结构域
				40	特异性	Apo	A043a基因组序列
41	特异性	Apo	A043a编码序列
				42	特异性	Apo	A043a核酸外切酶结构域
43	特异性	Apo	A081a基因组序列
				44	特异性	Apo	A081a编码序列
45	特异性	Apo	A081a核酸外切酶结构域
				46	特异性	有性	S011a基因组序列
47	特异性	有性	S011a编码序列

SEQ ID No.	类型	亚型	表征
				48	特异性	有性	S011a核酸外切酶结构域
49	特异性	有性	S355a基因组序列
				50	特异性	有性	S355a编码序列
51	特异性	有性	S355a核酸外切酶结构域
				52	特异性	有性	S390a基因组序列
53	特异性	有性	S390a编码序列
				54	特异性	有性	S390a核酸外切酶结构域

说明：参见表I；“基因组序列”意指基因组DNA序列，优选地包括调节元件、外显子以及内含子。

“编码序列”仅意指编码全长apollo蛋白质的编码DNA序列。

表III

apollo调节多核苷酸、肽以及插入序列

SEQ ID No.	类型	亚型	表征
				55	共有	Apo	启动子
56	共有	有性	启动子
				57	特异性	Apo	A011a启动子
58	特异性	Apo	A043a启动子
				59	特异性	Apo	A081a启动子
60	特异性	有性	S011a启动子
				61	特异性	有性	S355a启动子
62	特异性	有性	S390a启动子
				63	特异性	Apo/有性	重复，氨基酸
64	特异性	Apo/有性	重复，DNA
				65	特异性	Apo	启动子插入序列
66	特异性	Apo	ATHB-5结合(+)
				67	更特异	Apo	ATHB-5结合(+)
68	特异性	Apo	LIM-1结合(+)
				69	更特异	Apo	LIM-1结合(+)

SEQ ID No.	类型	亚型	表征
				70	最特异	Apo	LIM-1结合(+)
71	特异性	Apo	LIM-1结合(-)
				72	更特异	Apo	LIM-1结合(-)
73	最特异	Apo	LIM-1结合(-)
				74	特异性	Apo	SORLIP1AT结合(+)
75	特异性	Apo	SORLIP1AT结合(-)
				76	特异性	Apo	SORLIP2AT结合(+)
77	特异性	Apo	SORLIP2AT结合(-)
				78	特异性	Apo	POLASIG1结合(+)
79	特异性	Apo	POLASIG1结合(-)
				80	特异性	有性	Dof2结合(+)
81	特异性	有性	Dof2结合(-)
				82	特异性	有性	Dof3结合(+)
83	特异性	有性	Dof3结合(-)
				84	特异性	有性	PBF结合(+)
85	特异性	有性	PBF结合(-)
				86	特异性	有性	329S2_S1启动子
87	特异性	有性	33A2_S6启动子
				88	特异性	有性	385S2_S3启动子
89	特异性	有性	385S2_S11启动子
				90	特异性	有性	390S2_S16启动子
91	特异性	有性	390S2_S1启动子
				92	特异性	有性	1A2_S6启动子
93	特异性	有性	34457_S2启动子
				94	特异性	有性	111A2_S13启动子
95	特异性	有性	43A3_S4启动子
				96	特异性	有性	215A3_S13启动子
97	特异性	有性	104A3_S7启动子
				98	特异性	有性	355S2_S3启动子

SEQ ID No.	类型	亚型	表征
				99	特异性	有性	376S2_S5启动子
100	特异性	有性	369S2_S3启动子
				101	特异性	有性	66A3_S8启动子
102	特异性	有性	168A2_S4启动子
				103	特异性	有性	380S2_S13启动子
104	特异性	有性	215A3_S5启动子
				105	特异性	有性	11A2_S8启动子
106	特异性	有性	1A2_S7启动子
				107	特异性	Apo	33A2_A5启动子
108	特异性	Apo	168A2_A6启动子
				109	特异性	Apo	1A2_A3启动子
110	特异性	Apo	11A2_A5启动子
				111	特异性	Apo	111A2_A8启动子
112	特异性	Apo	43A3_A7启动子
				113	特异性	Apo	215A3_A7启动子
114	特异性	Apo	104A3_A4启动子
				115	特异性	Apo	43A3_A3启动子
116	特异性	Apo	66A3_A3启动子
				117	特异性	Apo	1A2_A6启动子
118	特异性	Apo	11A2_A3启动子
				119	特异性	Apo	11A2_A1启动子

说明：参见表I；“启动子插入序列”：apo-启动子中存在的20bp的调节插入序列；(+)：正(正义)链；(-)：负(反义)链。

本发明在一个实施方案中使用了普遍共有基因组序列，特别是SEQ ID No.22和24的那些序列，所述序列表示无融合生殖等位基因和有性等位基因中所存在的核苷酸序列模式，这是因为所给出的核苷酸序列将在这两种类型的等位基因中被发现。

因此，在本发明的一个特别优选的实施方案中，使用编码apollo蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸的特征在于SEQ ID No.23、25至31、33、35至45、47、48、50、51、53或54中所给出的多核苷酸序列中的任一个，所述序列是无融合生殖等位基因和有性等位基因中存在的共有序列和特异性序列并且编码本发明中所使用的SEQ ID No.1至21，优选地SEQ ID No.4至9、13至15或19至21中的任一个的共有或特异性apollo蛋白质或其必要部分，即SEQ ID No.1至3、10至12或16至18的核酸外切酶结构域。最优选的是表I中所示的编码共有apollo蛋白质或其必要部分的多核苷酸，所述共有apollo蛋白质或其必要部分即SEQ ID No.1至21，优选地SEQ ID No.4、5、6、7、8、9、13、14、15、19、20或21，特别是SEQ ID No.4、5、6、7、8或9中的任一个。

本发明还使用功能上等同的多核苷酸以在植物中，特别是在植物胚珠中诱导无融合生殖，优选地在植物中，优选地在植物胚珠中诱导无减数无配子生殖和/或孤雌生殖，所述功能上等同的多核苷酸没有精确地显示出所述特异性核苷酸序列模式或诱导无融合生殖的等位基因的以及尤其在本文所给出的序列同一性方案中所给出的特异性核苷酸序列，但相对于其确实表现出轻微的偏差并且在本发明的上下文中被称作“多核苷酸变体”。这些多核苷酸变体是本发明序列同一性方案中所限定的多核苷酸的等位基因、多态性、突变型、截短型或延长型变体，并且所述变体因此与本发明序列同一性方案中所限定的多核苷酸相比显示出核苷酸的缺失、插入、倒位或添加。因此，本发明的多核苷酸或多肽变体(在下文中也被称作多核苷酸或多肽的“功能等同物”)具有结构和足够的长度以提供与所具体公开的本发明的多核苷酸或多肽相同的生物活性，这意指相同的诱导植物的无融合生殖的能力。

由本发明中所使用的多核苷酸变体编码的多肽在它的氨基酸序列与由本发明的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列相比发生改变的情况下被称作多肽变体。然而，由于遗传密码的简并，多核苷酸变体不一定在任何情况下均编码多肽变体，而是也可能编码本发明的多肽。

术语“变体”指的是本发明中所用的具体公开的多核苷酸或多肽的基本上类似的序列。一般来说，本发明的多核苷酸变体将与本发明的多核苷酸，特别是代表本发明的诱导无融合生殖的等位基因的那些多核苷酸，特别是它的编码序列具有至少60％、65％、或70％，优选地75％、80％或90％，更优选地至少95％，并且最优选地至少98％的序列同一性，其中序列同一性％是基于整个序列并且是通过BLAST分析，优选地在NCBI数据库中，特别是通过空位分析使用50的空位权重和3的长度权重来确定。

一般来说，本发明中所用的多肽序列变体将与能够诱导无融合生殖的本发明蛋白质具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％，优选地至少约85％或90％，并且更优选地至少约95％的序列同一性，其中序列同一性％是基于整个序列并且是通过BLAST分析，优选地在NCBI数据库中，特别是通过空位分析使用12的空位权重和4的长度权重来确定。

根据本发明，本发明的多肽的多个氨基酸可以被置换、插入或缺失而不改变蛋白质的功能。蛋白质之间的关系是通过所比对的个别蛋白质的氨基酸序列或其所比对的组成序列之间的序列同一性程度来反映。

动态编程算法提供不同种类的比对。如由Needleman和Wunsch以及由Sellers所提出的算法将两个序列的整个长度进行比对，从而提供序列的全局性比对。Smith-Waterman算法提供局部比对。局部比对将序列内的区域对进行比对，所述区域在考虑到评分矩阵的选择和空位罚分的情况下最类似。这允许进行数据库搜索以集中在序列的最高度保守区域。它还允许对序列内的类似结构域进行鉴定。为了加快使用Smith-Waterman算法的比对，BLAST(基本局部比对搜索工具)和FASTA这两者对比对设置额外的限制。

在本发明的背景下，方便地使用BLAST来进行比对，所述BLAST是被设计成探究所有可供使用的序列数据库的一组相似性搜索程序而不考虑查询序列是蛋白质还是DNA。这种搜索工具的2.2版BLAST(空位型BLAST)已可公开获得(目前http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST或http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi)。它使用启发式算法，所述启发式算法寻求局部比对而不是全局性比对并且因此能够检测仅共有分离区域的序列之间的关系。BLAST搜索中所指定的分数具有明确限定的统计学解释。在本发明的范围内特别有用的是允许在局部序列比对中引入空位的blastp程序和PSI-BLAST程序，这两种程序将氨基酸查询序列与蛋白质序列数据库进行比较，以及允许仅局部比对两个序列的blastp变体程序。

使用BLAST进行的序列比对还可以考虑到一个氨基酸被另一个氨基酸取代是有可能保留维持蛋白质的结构和功能所需的物理和化学特性还是很可能破坏必要的结构和功能特征。举例来说，非保守性置换可以低频率进行，并且保守性置换可以在下列各组内的氨基酸之间进行：(i)丝氨酸和苏氨酸；(ii)谷氨酸和天冬氨酸；(iii)精氨酸和赖氨酸；(iv)天冬酰胺和谷氨酰胺；(v)异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸以及甲硫氨酸；(vi)苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸；(vii)丙氨酸和甘氨酸。

这种序列相似性是用与相同氨基酸的百分比相比阳性氨基酸的百分比来定量的。

然而，本发明中所使用的多核苷酸或多肽变体尽管它们存在结构偏差但是还能够表现出与本发明的序列同一性方案中所限定的多核苷酸或多肽相同或基本上相同的生物活性。

在本发明的上下文中，术语“生物活性”指的是本发明的多核苷酸或多肽或它们的变体在植物中诱导无融合生殖的能力。术语“在植物中诱导无融合生殖”指的是多核苷酸或多肽或其变体在植物中，特别是在植物的胚珠中诱导有活力的种子以无性方式产生的能力，特别是在植物胚珠中诱导无减数无配子生殖或孤雌生殖或无减数无配子生殖和孤雌生殖这两者的能力，特别是通过在胚珠中编码或发挥核酸外切酶活性来实现。

在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸，特别是包含本文所用的顺式调节元件的多核苷酸能够在植物胚珠中通过激活或去阻遏，特别是通过在结构上改变编码能够在植物中，优选地通过在植物胚珠中表达来诱导无融合生殖的具有核酸外切酶活性的蛋白质的内源性存在的基因的调节元件来诱导无融合生殖。这种基因的特征尤其在于具有根据本发明的调节核苷酸核心序列并且从而在去阻遏(这意指诱导)后允许所述内源性编码的能够诱导植物的无融合生殖的具有核酸外切酶活性的蛋白质表达。

在本发明的上下文中，术语“诱导编码能够诱导无融合生殖的蛋白质的基因或多核苷酸表达”因此指的是控制所述编码序列表达的调节元件的激活，在下文中还被称作去阻遏，这意指激活表达，从而允许功能性apollo蛋白质在植物胚珠中产生。

在特别优选的实施方案中，由本发明中所用的多肽(意指能够诱导植物的无融合生殖的蛋白质)所发挥的生物活性是特异性核酸外切酶活性，所述特异性核酸外切酶活性的特征在于特异性，这是因为它的表达在无融合生殖植物的胚珠中被激活并且在有性植物中被阻遏或失活。

具体来说，不受理论束缚，能够在植物中，特别是植物胚珠中诱导无融合生殖并且具有特异性核酸外切酶活性的本发明所用的蛋白质，即apollo蛋白质是DEDD 3'→5'端核酸外切酶，还被称作DNA Q蛋白质，它的特征优选地在于分布在三个单独的序列链段，即exo I、exo II以及exo III中的四个酸性残基，即三个天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)(Moser等人,Nucl.Acids.Res 25(1997),5110-5118)。此外，这些蛋白质的特征在于位于它的活性侧面处的对于是DEDDy或是DEDDh蛋白质具有决定性的酪氨酸(y)或组氨酸(h)氨基酸。在优选的实施方案中，能够在植物胚珠中诱导无融合生殖的本发明的多肽是DEDDh核酸外切酶，优选地包含如SEQ ID No.1至3、10至12或16至18中的任一个中所给出的氨基酸序列，优选地在3'-5'端方向上催化DNA或RNA端点处的单磷酸核苷的切除。具体来说，本发明的核酸外切酶是植物DEDDh核酸外切酶。

在特别优选的实施方案中，由能够在植物胚珠中诱导无融合生殖的多肽(这意指apollo蛋白质)在所述植物胚珠中所发挥的特异性生物活性似乎是减数分裂调节，特别是减数分裂变更、改变或变化活性，特别是减数分裂抑制活性，从而防止生殖细胞中染色体数减少。

本发明中所用的分离的和/或所用的核酸分子可以分离的形式存在。然而，本发明中所用的分离的核酸分子还可以与例如调节元件或载体的其它核酸分子组合，从而形成不仅包含本发明的核酸分子的另一种分子。在这种情况下，本发明的“核酸分子”还被称作本发明的“核酸序列”。

在本发明的上下文中，术语“包含”被理解成具有“包括”或“含有”的意思，这意指一个第一实体含有第二实体，其中所述第一实体除第二实体之外还可以含有第三实体。因此，具体来说，术语“包含多核苷酸的核酸分子”意指本发明的核酸分子含有本发明的多核苷酸或多核苷酸变体，但可以另外含有其它核苷酸或多核苷酸。在一个具体的优选实施方案中，如本文所用的术语“包含”还被理解成意指“由……组成”，从而排除了除明确提到的要素以外的其它要素的存在。因此，本发明还涉及由本发明的多核苷酸或多核苷酸变体组成的核酸分子，这意指所述核酸分子仅由本发明的多核苷酸或多核苷酸变体构成并且不包含任何另外的核苷酸、多核苷酸或其它元件。根据这个实施方案，本发明的核酸分子是本发明的多核苷酸或多核苷酸变体。

本发明中所用的核酸分子以及其中所包含的多核苷酸这两者确实表现出能够诱导无融合生殖的所需生物活性。

术语“无融合生殖”指的是正常的有性繁殖由无性繁殖代替，这优选地意指在卵细胞没有受精的情况下，特别是意指仅中央细胞受精(假受精事件)，特别是在没有任何受精的情况下进行繁殖，具体来说，所述术语指的是经由种子进行无性繁殖，从而产生与亲本植物，特别是雌株在基因上相同的以无融合生殖方式产生的子代或后代。

术语“基因”指的是编码核苷酸序列和相关的调节核苷酸序列。编码序列被转录成RNA，所述RNA根据具体的基因将是mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA。调节序列(在下文中也被称作调节元件)的实例是启动子序列、5'端和3'端非翻译序列以及终止序列。可以存在的另外的元件是例如内含子或增强子。结构基因可以构成不间断的编码区或它可以包括一个或多个由适当的剪接点所界定的内含子。结构基因可以是源自于不同来源的链段的复合体，所述来源是天然存在的或合成的。

所要表达的基因可以经过修饰以使得已知的mRNA不稳定性基序或多聚腺苷酸化信号被去除或可以使用当中要插入有序列的植物所偏好的密码子。

本发明还使用本发明的核酸分子，特别是本发明的多核苷酸或多核苷酸变体，特别是DNA序列，其中所述核酸分子或序列编码能够诱导无融合生殖，特别是在植物，优选地植物胚珠中诱导无融合生殖并且具有，优选地包含SEQ ID No.1、2、3、10、11、12、16、17或18中所述的氨基酸序列的多肽或其多肽变体，所述多肽变体意指本发明中所用的多肽的功能等同物，优选地在生物活性方面与其类似的多肽。本发明因此还使用本发明的多肽变体，所述多肽变体尤其具有至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个氨基酸的长度，所述多肽变体在比对之后显示出与本发明的优选地全长的多肽，特别是如SEQ ID No.1至21，优选地SEQ ID No.4、5、6、7、8、9、13、14、15、19、20或21中所用的任一个中所表征的多肽具有至少40％并且优选地至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或更大的序列同一性。

术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用并且指的是具有包含至少20个、30个、40个、50个或60个氨基酸残基的特定氨基酸序列的分子。

术语“多肽”因此意指本发明中所用的蛋白质和其变体，特别是蛋白质片段、修饰的蛋白质、氨基酸序列以及合成氨基酸序列。根据本发明，多肽可以经过糖基化或没有经过糖基化。

本发明中所用的被截短的多肽变体也被称作本发明中所用的“片段”。因此，术语“片段”指的是多核苷酸序列的一部分或多肽的一部分，所述多肽意指本发明的氨基酸序列并且从而意指由其所编码的多肽。诸如SEQ ID No.26、31、36、39、42、45、48、51或54的多核苷酸序列的片段可以编码保持本发明的多肽的生物活性的多肽片段，所述多肽如SEQ ID No.1、2、3、10、11、12、16、17或18中的任一个中所给出。或者，多核苷酸序列的可用作杂交探针的片段一般不编码保持生物活性的多肽片段。多核苷酸序列的片段一般大于20个、30个、50个、100个、150个、200个或300个核苷酸并且最多编码本发明中所用的多肽的整个核苷酸序列。一般来说，片段具有少于1000个核苷酸并且优选地少于500个核苷酸的长度。本发明中所用的片段包括用于减少本发明的多核苷酸表达的反义序列。这些反义片段的长度可以在至少20个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸至整个编码序列的范围内变化，并且包括整个编码序列在内。

术语“调节元件”指的是位于编码序列上游(5'端)、编码序列内和/或下游(3'端)的序列，所述调节元件，潜在地联同细胞的蛋白质生物合成器一起对所述编码序列的转录和表达进行控制。“调节(regulation)”或“调节(regulate)”指的是调控由主要位于，但不仅仅位于所关注的基因的转录起点上游(5'端)的DNA序列元件所诱导的基因表达。调节可以引起对刺激的完全反应或无反应，或它可以引起基因表达水平发生变化。在本发明的背景下，调节元件优选地是顺式调节元件。

调节元件，特别是DNA序列，如启动子被称为与编码RNA或蛋白质的DNA序列“可操作地连接”或“缔合”，前提条件是这两个序列经过定位和取向以使得调节DNA序列引起编码DNA序列的表达。

“启动子”是引发所缔合的DNA序列转录的DNA序列，所述DNA序列特别是位于转录起点的上游(5'端)并且涉及RNA聚合酶的识别。根据具体的启动子区域，它还可以包括用作基因表达的调节因子，如激活因子、增强子和/或阻遏因子的元件。本发明的调节核苷酸核心序列和调节核苷酸靶序列通常是这样的启动子的一部分。

“3'端调节元件”(或“3'端”)指的是基因的包含如下DNA链段的部分，该DNA链段不包括所述基因的驱使转录开始的5'端序列和结构部分，决定正确的终止位点并且含有多聚腺苷酸化信号和能够引起信使RNA(mRNA)加工或基因表达的任何其它调节信号。多聚腺苷酸化信号的特征通常在于实现多聚腺苷酸束向mRNA前体的3'端的添加。多聚腺苷酸化信号常常通过与标准形式5'-AATAAA-3'存在同源性来识别。

术语“编码序列”指的是基因的编码蛋白质、多肽或其部分并且不包括驱使转录开始或终止的调节序列在内的部分。

基因、编码序列或调节元件可以是细胞中通常存在的基因、编码序列或调节元件，在这种情况下，它被称作“内源性的”或“自体的”，或它可以是细胞位置中通常不存在的基因、编码序列或调节元件，在这种情况下，它被称作“异源的”、“外源性的”或“转基因的”。

“异源”基因、编码序列或调节元件也可以是细胞自体的，然而，被排列成在它被转入的细胞中通常不存在或出现的顺序和/或取向或基因组位置或环境中。

术语“载体”指的是重组DNA构建体，所述重组DNA构建体可以是质粒、病毒、自主复制序列、人工染色体，如细菌人工染色体BAC、噬菌体或其它核苷酸序列，其中至少两个核苷酸序列已被接合或重组，其中至少一个核苷酸序列是本发明的核酸分子。载体可以是线性的或环形的。载体可以由单链或双链DNA或RNA构成。载体可以源自于任何来源。这种载体优选地能够将调节元件，例如启动子片段，以及本发明的用于在植物中诱导无融合生殖的呈正义取向或反义取向的核酸分子，优选地DNA序列连同适当的3'端非翻译序列一起引入到细胞中，特别是植物细胞中。在本发明的上下文中，术语“载体”与术语“植物载体”可互换使用。

术语“表达”指的是内源性基因或转基因在植物中的转录和/或翻译。

“标记基因”通常编码选择或筛选性状。因此，“选择标记基因”的表达给予细胞以选择优势，这可能是由于与未转化的细胞的生长相比，它们能够在负选择试剂，如抗生素或除草剂的存在下生长。与未转化的细胞相比，转化的细胞所具有的选择优势还可能是由于它们提高的或新型的利用所添加的化合物作为营养物质、生长因子或能量来源的能力。选择标记基因还指的是基因或基因的组合，所述基因或基因的组合在植物细胞中的表达给予细胞以负选择优势和正选择优势这两者。另一方面，“筛选标记基因”不向转化细胞赋予选择优势，但它的表达使得转化细胞在表型上不同于未转化的细胞。

术语“在胚囊附近表达”指的是在心皮、珠被、胚珠、胚珠原基、子房壁、合点、珠心、珠柄或胎座中表达。术语“珠被”指的是由其衍生的组织，如内种皮。术语“胚芽发生”指的是细胞在允许条件下发育成胚芽的能力。

术语“植物”指的是任何植物，但特别是种子植物。

术语“转基因植物”或“转基因植物细胞”或“转基因植物材料”指的是特征在于存在本发明的多核苷酸或多核苷酸变体的植物、植物细胞或植物材料，所述多核苷酸或多核苷酸变体在它是所述植物自体的情况下与在所述植物、植物细胞或植物材料中所通常存在的相比可以位于另一位置处或沿另一取向，或对于所述植物、植物细胞或植物材料来说是异源的。优选地，所述转基因植物、植物细胞或植物材料表达所述多核苷酸或它的变体以诱导无融合生殖。

术语“植物细胞”描述了植物的结构和生理单元，并且包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以呈分离的单细胞的形式，如气孔保卫细胞或培养的细胞，或作为更高度组织的单元(例如像植物组织或植物器官)的一部分。

术语“植物材料”包括植物部分，特别是植物细胞、植物组织，特别是植物繁殖材料，优选地叶片、茎、根、萌发的胚根、花或花部分、花瓣、果实、花粉、花粉管、花丝、胚珠、胚囊、卵细胞、子房、合子、胚芽、合子胚本身、体细胞胚、胚轴切段、顶端分生组织、维管束、中柱鞘、种子、根、插条、细胞或组织培养物、或植物的任何其它部分或产物。

因此，本发明还提供了本发明的转基因植物的植物繁殖材料。所述“植物繁殖材料”被理解成是可以在体内或体外以有性方式或无性方式繁殖的任何植物材料。在本发明的范围内特别优选的是由转基因植物获得的原生质体、细胞、愈伤组织、组织、器官、种子、胚芽、花粉、卵细胞、合子以及任何其它繁殖材料。源自于先前借助于本发明的方法转化并且因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或它们的后代的植物部分，例如花、茎、果实、叶片、根也是本发明的目的。特别优选的植物材料，特别是植物繁殖材料是无融合生殖种子。

特别优选的植物是单子叶植物或双子叶植物。特别优选的是作物或农业植物，如向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苦苣、卷心菜、花椰菜、西兰花、芜菁、萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、芹菜、胡萝卜、西葫芦、南瓜、绿皮西葫芦、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、草莓、葡萄、覆盆子、菠萝、大豆、大麻属(Cannabis)、律草属(Humulus)(啤酒花)、番茄、高粱、甘蔗、以及不结果的树，如白杨、橡胶、泡桐属(Paulownia)、松树、榆树、黑麦草属(Lolium)、羊茅属(Festuca)、鸭茅属(Dactylis)、紫花苜蓿、红花、烟草、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶叶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果树、澳大利亚坚果(macadamia)、杏仁、青豆、利马豆、豌豆、冷杉、铁杉、云杉、红杉，特别是玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦、燕麦、草坪草以及饲用牧草、粟、水稻以及甘蔗。特别优选的是玉米、小麦、高粱、黑麦、燕麦、草坪草以及水稻。

特别优选的还有观赏植物，如观赏花卉和观赏作物，例如秋海棠(Begonia)、康乃馨(Carnation)、菊花(Chrysanthemum)、大丽花(Dahlia)、栀子(Gardenia)、芦笋(Asparagus)、天竺葵(Geranium)、雏菊(Daisy)、唐菖蒲(Gladiolus)、矮牵牛(Petunia)、丝石竹(Gypsophila)、百合(Lilium)、风信子(Hyacinth)、兰花(Orchid)、蔷薇(Rose)、郁金香(Tulip)、单药花(Aphelandra)、蜘蛛抱蛋(Aspidistra)、楤木(Aralia)、君子兰(Clivia)、彩叶(Coleus)、朱蕉(Cordyline)、仙客来(Cyclamen)、龙血树(Dracaena)、花叶万年青(Dieffnbachia)、榕树(Ficus)、喜林芋(Philodendron)、一品红(Poinsettia)、蕨类(Fern)、常春藤(Ivy)、八仙花(Hydrangea)、补血草(Limonium)、龟背竹(Monstera)、棕榈(Palm)、枣椰树(Date-palm)、Potho、合果芋(Singonio)、紫罗兰(Violet)、黄水仙(Daffodil)、熏衣草(Lavender)、百合(Lily)、水仙(Narcissus)、藏红花(Crocus)、鸢尾(Iris)、牡丹(Peonies)、葱兰(Zephyranthes)、花烛(Anthurium)、大岩桐(Gloxinia)、杜鹃花(Azalea)、藿香(Ageratum)、竹(Bamboo)、山茶(Camellia)、石竹(Dianthus)、凤仙(Impatien)、半边莲(Lobelia)、天竺葵(Pelargonium)、紫丁香(Lilac)、铃兰(Lily of the Valley)、千金子藤(Stephanotis)、八仙花、向日葵(Sunflower)、非洲菊(Gerber daisy)、酢浆草(Oxalis)、万寿菊(Marigold)以及木槿(Hibiscus)。

在双子叶植物当中，拟南芥属、筷子芥属、大豆、棉花、糖用甜菜、油菜、烟草、胡椒、甜瓜、莴苣、甘蓝类蔬菜(Brassica vegetable)，特别是甘蓝型油菜(Brassica napus)、糖用甜菜、油菜以及向日葵在本文中是更优选的。

“转化(transformation)”、“转化(transforming)”以及“转移”指的是将核酸分子，特别是DNA转移到细胞中的方法，包括但不限于生物射弹法，如粒子轰击、显微注射、使用各种物理处理(例如电穿孔)或化学处理(例如聚乙二醇或PEG处理)使细胞膜透化；原生质体的融合或根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的转化。对于在植物细胞中进行DNA的注射和电穿孔，对所用的质粒不存在特定的要求。可以使用诸如pUC衍生物之类的质粒。如果整体植物要从这些转化的细胞再生，那么使用选择标记是优选的。根据用于将所需基因引入到植物细胞中的方法，另外的DNA序列可能是必要的；如果例如使用Ti或Ri质粒来转化植物细胞，那么Ti和Ri质粒T-DNA的至少右边界，然而常常是右边界和左边界必须作为侧接区域与所要引入的基因连接。优选地，所转移的核酸分子被稳定地整合到受体植物的基因组或质体系中。

在本发明的上下文中，应了解的是，“转化”植物细胞指的是转化过程本身以及转基因(意指外源性)核苷酸序列在植物细胞的基因组中的后续稳定的整合。

措辞“后代”或“子代”指的是转基因植物的“以无性方式”和“以有性方式”产生的后代这两者。这个定义还意指包括可借助于诸如细胞融合或突变体选择之类的已知方法获得的并且仍表现出本发明的最初转化的植物的特征性特性的所有突变体和变体，以及转化的植物材料的所有杂交和融合产物。这还包括由回交产生的后代植物，只要所述后代植物仍含有根据本发明的多核苷酸和/或多肽即可。

本发明中所用的分离的核酸分子优选地是特定基因组或cDNA序列分子中的DNA，优选地来自植物，优选地来自十字花科植物，特别是筷子芥属，特别是霍氏筷子芥、迪瓦氏筷子芥(Boechera divaricarpa)或直立筷子芥(Boechera stricta)的DNA。然而，它还可以是RNA，特别是mRNA。

在优选的实施方案中，本发明还使用植物载体，所述植物载体包含根据本发明的核酸序列中的任一种。本发明中所用的特异性多核苷酸或多核苷酸变体这两者可以被包含在所述载体中与调节元件呈正义或反义取向。

在本发明的优选的实施方案中，所述植物载体包含能够用作与需要在植物，特别是植物胚珠中表达的蛋白质编码核酸序列可操作地连接的调节元件的多核苷酸，特别是本发明的顺式作用调节元件。

在优选的实施方案中，本发明还使用宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的载体。

本发明还提供了包含根据本发明的至少一种核酸分子或本发明的载体的转基因植物、植物细胞、植物材料，特别是植物种子。在优选的实施方案中，本发明还提供了包含根据本发明的细胞的细胞培养物，优选地植物细胞培养物。

在特别优选的实施方案中，本发明提供了转基因植物、植物细胞、植物材料，特别是植物种子，其中多核苷酸、多肽或其变体表现出它的生物功能。在本发明的具体的实施方案中，提供了植物或植物种子，所述植物或植物种子包含本发明的多核苷酸、多肽或其变体并且由于所述多核苷酸或多肽或其变体的存在而显示出无融合生殖。

虽然借助于通过本发明多核苷酸的异源表达产生无融合生殖种子具体描述了本发明，但将认识到本发明的多核苷酸的变体同样可以表达而获得类似的结果，所述变体的产物具有类似的结构和功能。此外，尽管实施例说明了筷子芥属和拟南芥属植物的无融合生殖种子产生，但是当然，本发明不限于无融合生殖种子诱导基因仅在这些植物中表达。

本发明的进一步优选的实施方案是从属权利要求的主题。

附图示出了：

图1：在所有apo等位基因中并且仅在apo等位基因中出现的正链中的无融合生殖特异性TBS。

图2：在所有apo等位基因中并且仅在apo等位基因中出现的负链中的无融合生殖特异性TBS。

图3：在所有apo等位基因中并且仅在apo等位基因中出现的负链中的无融合生殖特异性TBS。

图4：在所有的有性等位基因中并且仅在有性等位基因中出现的负链中的有性特异性TBS。

现在将借助于实施例来说明本发明。

实施例1：无融合生殖诱导基因(apollo基因)的筛选和分离

1.a)植物材料和种子筛选分析

使植物在人工气候室中在受控的环境条件下从幼苗开始生长。使用流式细胞术种子筛选对18种筷子芥属种质中的繁殖变异性进行分析(表IV)。

表IV：在微阵列和RT-PCR分析中所用的筷子芥属种质。

使用Geno-Grinder 2000(SPEX Certi-Prep)以150次/分钟的速率将单一的种子在容纳50μl的提取核分离缓冲液(参见下文)的96孔培养板(PP-Master-block 128.0/85MM，1.0ml 96孔培养板，Greinerbio-one公司，www.gbo.com)的每一个孔中用三个2.3mm不锈钢珠单独地研磨90秒。

使用两步程序，所述两步程序由分离缓冲液和染色缓冲液组成：(a)分离缓冲液I：溶解在H₂O中并且被调节到pH 2.5的0.1M柠檬酸一水合物和0.5％v/v吐温20(Tween 20)；以及(b)染色缓冲液II：溶解在H₂O(加上4μg/ml 4',6-二脒基苯基吲哚(DAPI))中并且被调节到pH 8.5的0.4M Na₂HPO₄.12H₂O。在研磨之前将50μl的分离缓冲液I添加到96孔培养板中的每孔每一个种子中，并且在研磨之后再添加160μl缓冲液I以经由过滤(使用Partec 30μm网孔宽度尼龙过滤器)回收足够的体积。然后将100μl染色缓冲液II添加到50μl的所得悬浮液(分离的核)中，并且在冰上孵育10分钟，之后进行流式细胞术分析。为了避免样品在对96种样品进行分析所需的2小时的时间段内降解，使用铝密封带将样品培养板密封。

在挂接到Partec PAII流式细胞仪(德国明斯特的Partec有限公司(Partec GmbH,Münster,Germany))的4℃冷却的Robby-Well自动进样器上分析所有样品培养板。来自SAD 12(一种已知的有性自花受精筷子芥属)的两个单一的种子始终作为外部参考被包括在孔位置1和96处以在分析时间段内对其它峰进行标准化并且校正峰移位。SAD 12种子仅由2C胚芽:3C胚乳比率构成，这反映了C(C表示单倍体DNA含量)母本(Cm)基因组+C父本(Cp)＝2C基因组的胚芽组成和2Cm+Cp＝3C的胚乳组成。

基于本发明的高通量流式细胞术种子筛选数据，所有无融合生殖种质均被证实特征在于100％无融合生殖种子产生。

1.b)胚珠显微解剖

选择处在2-II期至2-IV期之间的大孢子发生时的胚珠(其中大孢子母细胞分化，内珠被和外珠被开始发生)以研究与减数分裂和无减数无配子生殖相关的基因表达的变化。在数天内在标准化的时间(上午8点到9点)，在0.55M无菌甘露醇溶液中将有性筷子芥属和无融合生殖筷子芥属的雌蕊在大孢子发生阶段从未被授粉的花中解剖出。在无菌空气层流柜中使用立体显微镜(1000Stemi，德国耶拿的卡尔蔡司公司(Carl Zeiss,Jena,Germany))在2倍放大倍数下进行显微解剖。使用钳子固定雌蕊，同时使用无菌解剖刀纵向切割以使得长角果以及胚珠的两半立即暴露于甘露醇。随后在倒置显微镜(Axiovert 200M，卡尔蔡司公司)下在无菌条件中，使用无菌玻璃针(使用Narishige PC10牵拉工具自制，并且被弯到约100°的角度)以从胎座组织分离胚珠来采集单个活胚珠。使用接口于Eppendorf Cell Tram Vario手动显微注射仪的玻璃毛细管(具有150μm内径的开口)，将胚珠采集在容纳100μl的RNA稳定化缓冲液(RNA later，西格玛公司(Sigma))的无菌微量离心管中。以这种方式采集每个种质20至40个胚珠，直接在液氮中冷冻并且储存在-80℃。

1.c)胚珠RNA分离

使用PicoPure RNA分离试剂盒(加利福尼亚州的ArcturusBioscience公司(Arcturus Bioscience,CA))进行总RNA提取。在Agilent2100生物分析仪上使用RNA Pico芯片(加利福尼亚州帕洛阿尔托的安捷伦科技公司(Agilent Technologies,Palo Alto,CA)验证RNA完整性和量。

1.d)微阵列

1.d.i)微阵列设计

使用454(FLX)技术对3种有性和3种无融合生殖筷子芥属种质的完全转录组进行测序，作为设计用于比较基因表达和拷贝数变异的高密度筷子芥属特异性微阵列的第一步。转录组测序的目标因此在于鉴定可以在花发育期间表达的所有基因，继而将所有所鉴定的基因点样到(Agilent)微阵列上。

这是通过以下来实现的：对于有性植物和无融合生殖植物分别汇集处在多个发育阶段的花，继而进行cDNA标准化程序以抵消转录物水平来提高对所有可观测到的mRNA种类进行测序的可能性。此外，使用3'-UTR(非翻译区)锚定454程序以使得mRNA序列偏向于它们的3'-UTR(所述区域表示相对高(但非随机)的变异水平)，以使得能够鉴定等位基因变异。

使用CLC基因组学工作平台，使用用于长读数高通量序列的标准组装参数，在使用内部序列质量得分对所有读数进行修整之后对454序列进行组装。在这样做时，获得36289个重叠群序列(contigsequence)和154468个未组装的单拷贝序列(singleton sequence)。向ImaGenes(有限公司，德国)提供这一数据以使用它们的预选策略(PSS)服务进行微阵列研发。

PSS服务如下运作：对每个重叠群14个不同的寡核苷酸(每一个的长度是60bp)和每个单拷贝8个寡核苷酸(包括每一个寡核苷酸的“反义”序列在内)进行生物信息学设计并且点样到两个1百万点测试阵列上。使用以下各项对这些测试阵列进行探测：(1)“复杂cRNA混合物”(通过汇集组织并且从它们采集所有RNA来获得)，以及(2)从有性个体和无融合生殖个体汇集的叶片组织所提取的基因组DNA。基于来自cRNA和基因组DNA样品的单独杂交结果，并且在所有质量测试之后，设计出最终的2×105000点阵列。这个阵列应当含有在筷子芥属花发育期间表达的每一种基因的多个寡核苷酸(即技术重复样品)。

1.d.ii)杂交

制备cRNA并且使用Quick-Amp单色标记试剂盒(加利福尼亚州的安捷伦科技公司)标记并且与Agilent定制的筷子芥属阵列杂交(对于有性基因型和无融合生殖基因型分别杂交8个和10个生物重复样品)。

1.d.iii)统计分析

使用GeneSpring GX软件(10版)进行分析并且基于下列参数选择在无融合生殖植物与有性植物之间显著差异性表达(p≤0.05)的候选探针：(a)75百分位数平移标准化(percentile shift 75normalization)，中值作为基线，繁殖方式(无融合生殖或有性)作为解释(第一水平)、不成对T检验作为统计分析以及Bonferroni FWER多重检验校正。使用最高的显著性水平阈值，使得对微阵列上4个不同的点进行鉴定(对于前三个来说，p<0.01，并且对于第四个来说，p<0.05)。重要的是，当将这4个点的寡核苷酸序列与454cDNA序列数据库进行BLAST比对时，所有这4个均与相同的筷子芥属转录物达成BLAST比对。因此，不仅已针对生物噪音对本实验进行校正，此外还检测了所有有性基因型和无融合生殖基因型的经过显微解剖的胚珠之间单一差异性表达的转录物，在微阵列上对于特定基因存在4个技术重复样品。当将二倍体和三倍体无融合生殖胚珠这两者与有性胚珠的那些进行比较时，这个基因以类似的方式表达，并且因此它的表达行为显然不受倍性的影响。最终，对这个筷子芥属转录物的同源物进行搜索证实它涉及其它物种的细胞周期，因此支持了有关使有性途径失调作为产生无融合生殖的手段的证据。

实施例2：无融合生殖诱导基因的表征

2.a)候选基因表征

2.a.i)基因组水平

2.a.i.1)克隆

使用校正聚合酶(Accuprime)将来自所有18个种质的全长转录物克隆并且测序(TOPO-TA克隆试剂盒，英杰公司(Invitrogen))。所述转录物具有高度多态性，并且特征在于在有性体与无融合生殖体之间单核苷酸多态性的水平相当。尽管如此，在所有10个无融合生殖种质中发现单“无融合生殖多态性”，但在任何有性种质中没有发现。SEQ ID No.46至54示出了三个有性等位基因，即S011a、S355a以及S390a的基因组序列和编码序列。SEQ ID No.37至45示出了三个无融合生殖等位基因，即A011a、A043a以及A081a的基因组序列和编码序列。在考虑到所有种质的地理采集点在加利福尼亚州到美国中西部的范围内(即1000千米)的情况下，在所有无融合生殖体中这种多态性的共有是高度显著的。最终，围绕“无融合生殖多态性”的SNP多态谱反映了在有性种质和无融合生殖种质这两者中在所有其它等位基因中所发现的。因此，“无融合生殖多态性”似乎在筷子芥属进化期间进行重组，但尽管如此，它仍由所有的无融合生殖体所共有，而与不同的遗传、倍性或地理背景无关。

2.a.i.2)BAC

使用所有组织种质的所汇集的DNA作为模板以产生杂交探针。通过PCR扩增，使用候选基因基因组序列的两对特异性引物来制备具有不同尺寸(1.6kb和2.3kb)的两个探针。将这两个探针标记并且用于在无融合生殖筷子芥属BAC文库上杂交。存在8个阳性杂交。对应的分离的BAC(PureLink质粒DNA纯化试剂盒)被命名为1、2a、2b、3、4、5、6以及7。使用候选基因的特异性引物重新测试所选择的BAC。除BAC-3之外，确认了所有的BAC。通过限制性内切酶消化来对其它七个BAC进行指纹图谱分析。BAC-1和BAC-2a似乎与其它BAC重复。对以下BAC进行测序：2b、4、5、6以及7。

可将BAC序列组装在一起形成2b_4和5_7对，而BAC-6保持单独。

通过与其它植物序列进行比较来对BAC序列进行表征。

2.a.ii)转录组水平

进行RACE实验(SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒)。

结果揭示对应于无融合生殖种质的mRNA在“无融合生殖多态性”上游具有截短的5'末端，而有性种质具有约200pb的额外长度。

在已知5'和3'mRNA末端后，对所有组织cDNA进行进一步的PCR以进行完全的剪接谱表征。

2.b)验证

2.b.i)QRT-PCR

完成对来自6个有性和10个二倍体无融合生殖筷子芥属种质(每个种质3个技术重复样品)的经过显微解剖的活胚珠(大孢子母细胞阶段)上的候选基因进行的等位基因特异性qRT-PCR分析。使用跨越由基因序列所鉴定的无融合生殖特异性多态性的两种不同的正向PCR引物，有可能分别对于有性等位基因和无融合生殖等位基因这两者测量转录物丰度。

使用RevertAid H Minus逆转录酶制备cDNA。

对于实时PCR反应，使用绿色PCR主混合物(加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司(Applied Biosystems,Foster City,CA))。在7900HT快速RT-PCR系统机器(应用生物系统公司)中使用下列用于SYBR绿色测定的温度曲线来进行QRT-PCR扩增：在90℃下最初变性10分钟，继而40个循环：95℃持续15秒和60℃持续1分钟。为了检查扩增子质量，在扩增结束时由产物获得解链曲线梯度。使用Ct作为靶基因的起始拷贝数的量度，所述Ct被定义为首先检测到报告基因荧光出现统计显著性增加所处的PCR循环。计算每一种cDNA的每一组三个技术重复样品的平均表达水平和标准偏差。通过比较ΔΔCt法，使用校准样品参照管家基因UBQ10的表达水平来进行所扩增的靶标的相对定量和标准化。

结果是结论性的：无融合生殖等位基因仅在所有无融合生殖种质的经过显微解剖的胚珠中表达，而有性等位基因从未在任何(这意指有性或无融合生殖)胚珠中表达。这两种等位基因均在其它组织，即体细胞组织中表达。因此，似乎非常合理地假定有性等位基因在正常的有性胚珠发育期间是无活性的/被沉默，而无融合生殖等位基因的表达与无减数胚珠发育具有相关性。

实施例3：使用无融合生殖诱导基因转化拟南芥

3.a)植物转化

使用本发明的基因对拟南芥(有性)(杂种F1)和筷子芥属(有性)的转化能够显示出它们的繁殖方式变成无融合生殖种子产生。为此，已经将完整基因组等位基因(包括完整的启动子)克隆进pNOS-ABM。

此外，使用不同的构建体来对本发明的调节元件，特别是本发明的启动子在它的表达中的作用进行表征。为此，已经使apo启动子和有性启动子这两者在pGUS-ABM中在gus前面精确地与ATG连接。

还使用完整BAC-4进行转化。

实施例4

为了对本发明的调节元件进行启动子分析，已经使用植物PAN软件(1.0.2007版本)(http://plantpan.mbc.nctu.edu.tw/gene_group/index.php；Chang等人,(2008)“植物PAN：用于在植物基因群组中在存在距离限制的情况下鉴定组合顺式调节元件的植物启动子分析导航工具(PlantPAN:Plant Promoter Analysis Navigator,for identifyingcombinatorial cis-regulatory elements with distance constraint in plantgene group)”,BMC Genomics,9:561)。

Claims

1.用于产生转基因无融合生殖植物的方法，其包括下列步骤：

a)提供植物细胞，

b)将所述植物细胞用含有至少一种外源性核苷酸序列元件的至少一种植物载体转化以获得转基因植物细胞，所述转基因植物细胞包含所述至少一种外源性核苷酸序列元件，并且所述转基因植物细胞包含编码反式作用无融合生殖效应子的核苷酸序列、顺式作用调节元件、以及在所述顺式作用调节元件控制下的编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列，其中所述反式作用无融合生殖效应子能够与所述顺式作用调节元件相互作用，并且其中所述顺式作用调节元件包含选自以下的至少一种调节核苷酸核心序列：

c)使转化的植物细胞再生成表现出无融合生殖的转基因植物。

2.根据前述权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述顺式作用调节元件是转基因顺式作用调节元件。

3.根据前述权利要求1至3中任一项所述的方法，其中将步骤a)中所提供的所述植物细胞在步骤b)中用植物载体转化，所述植物载体含有包含所述顺式作用调节元件的外源性核苷酸序列元件。

4.根据前述权利要求1至4中任一项所述的方法，其中包含所述顺式作用调节元件的所述外源性核苷酸序列元件另外包含编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列。

5.用于产生转基因无融合生殖植物的方法，所述方法特别是根据权利要求1所述，其包括下列步骤：

y)通过使所述顺式作用调节元件中所含的并且选自SEQID No.80至85中的任一个的至少一种调节核苷酸靶序列突变来对控制所述编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列的所述顺式作用调节元件进行修饰，以及

6.根据权利要求6所述的方法，其中所述顺式作用调节元件中所含的所述核苷酸靶序列是Dof2、Dof3或PBF的转录结合位点。

7.用于产生转基因无融合生殖植物的方法，所述方法特别是根据前述权利要求中任一项所述，其包括下列步骤：

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将步骤a)、x)或m)中所提供的所述植物细胞用植物载体转化，所述植物载体含有包含编码反式作用无融合生殖效应子的核苷酸序列的外源性核苷酸序列元件。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反式作用无融合生殖效应子是过表达的反式作用无融合生殖效应子。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反式作用无融合生殖效应子是转录因子，特别是ATHB-5、LIM-1、SORLIP1AT、SORLIP2AT或POLASIG。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列包含选自以下的核苷酸序列：a1)SEQ ID No.22至54中的任一个中所限定的多核苷酸或其完全互补链；b1)编码具有SEQ ID No.1至21中的任一个中所限定的氨基酸序列的多肽的多核苷酸或其完全互补链；以及c1)与a1)或b1)中所限定的所述核酸序列具有大于70％的序列同一性程度的多核苷酸变体或其完全互补链。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述编码具有DEDDh核酸外切酶活性的蛋白质的核苷酸序列包含选自以下的核苷酸序列：a2)SEQ ID No.22、23、27、28、32、33中的任一个中所限定的多核苷酸或其完全互补链；b2)编码具有SEQ ID No.4、5、6中的任一个中所限定的氨基酸序列的多肽的多核苷酸或其完全互补链；以及c2)与a2)或b2)中所限定的所述核酸序列具有大于70％的序列同一性程度的多核苷酸变体或其完全互补链。

13.用于鉴定植物中的无融合生殖效应子的方法，其中在DNA-蛋白质结合测定中使用选自以下的核苷酸序列以鉴定与所述核苷酸序列结合的蛋白质：SEQ ID No.66或67中的任一个的ATHB-5结合位点、SEQ ID No.68至73中的任一个的LIM-1结合位点、SEQ ID No.74或75中的任一个的SORLIP1AT结合位点、SEQ ID No.76或77中的任一个的SORLIP2AT结合位点以及SEQ ID No.78或79中的任一个的POLASIG1结合位点。

14.转基因无融合生殖植物，所述转基因无融合生殖植物是通过权利要求1至13中任一项所述的方法中的任一种所产生的。

15.转基因植物材料，所述转基因植物材料来自权利要求14所述的植物。