CN102219839A - 水稻叶形控制基因srl-1及其应用 - Google Patents
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Abstract
发明公开了一种水稻叶形控制基因SRL-1编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQIDNo：2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了一种水稻叶形控制基因SRL-1，该基因具有SEQIDNo：1所示的核苷酸序列。本发明还同时公开了一种改良水稻叶形的方法，包括用为SEQIDNo：1所示的核苷酸序列的基因转化水稻植株，再将转化后的水稻进行叶片形态选育。利用本发明的基因能通过调控叶片近轴面泡状细胞的数目来影响叶片的卷曲程度。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆的水稻SRL-1基因，以及利用转基因互补实验确认该基因的功能；同时还涉及利用该基因调控叶片近轴面泡状细胞数目，影响叶片形态；同时利用该基因可调节叶片卷曲程度，能够获得农作物的理想株型，提高农作物的产量。
背景技术
水稻作为单子叶植物的模式植物，其叶的组成与双子叶植物不同，由叶片、叶鞘、叶枕以及叶舌和叶耳组成。其中叶片的结构又分为表皮、叶肉和叶脉三个部分。表皮有上下表皮之分，由表皮细胞、泡状细胞、气孔器和表皮毛等组成。泡状细胞是一种大型薄壁细胞，其细胞长轴与叶脉平行，分布于两个叶脉的上表皮中，每个细胞内含有大液泡。泡状细胞与叶片的卷曲和舒展有关，当叶片蒸腾失水过多时，泡状细胞失水收缩，使得叶片向上卷曲，以减少蒸腾；当天气湿润叶片蒸腾减少时，泡状细胞吸水膨胀，使得叶片又展开。
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，为全球一半以上的人口提供了主食，提高水稻的产量具有重要意义。而微卷的叶片是水稻理想株型的特征之一，微卷使得叶片能够直立，防止叶片披垂，并且能够减少阳光的遮挡，增加植株生长中后期下部叶片的透光率。
随着分子生物学和分子遗传学方法和技术的不断发展以及水稻对人类的重要性，多位研究者对叶片形态影响光合作用的基因进行了定位和克隆。张光恒等通过研究，把一个卷叶突变体(sll1)定位在水稻9号染色体上，sll1表现出极度卷曲的表型，编码一个SHAQKYE类MYB转录因子，SLL1突变会导致远轴面叶肉细胞程序性死亡不能进行而抑制叶片远轴特征化的形成，因而能引起叶绿素的增加和光合作用增强，能增加“源”的产出，具有高产的潜力。赵淑青等通过研究，把leaf inclination2基因的3个等位突变体lc2进行了鉴定和功能分析，把lc2基因定位在2号染色体上。突变体表现出叶角增大，把LC2基因转到突变体上进行互补实验，发现突变体的叶角变小，因此认为LC2能够减小水稻的叶角，能够改善植株的受光状态，提高光合效率，因而提高产量。李玲等通过研究在T-DNA插入突变体中定位到ACL1基因，该基因能使泡状细胞数目增加，表皮细胞扩胀，从而导致叶片近轴面和远轴面发育不协调，引起叶片向远轴面的卷曲。水稻中的AGO7基因可以使叶片向上卷曲，并且引起叶片直立，延长直立时间，并且保持较高的叶片直立指数。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种从水稻卷叶突变体中克隆的新基因SRL-1，其能通过调控叶片近轴面泡状细胞的数目来影响叶片的卷曲程度。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻叶形基因SRL-1编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID No：2(即序列表中的第2个序列)所示的氨基酸序列。
作为本发明的水稻叶形控制基因SRL-1编码的蛋白质的改进：氨基酸序列还包括在SEQ ID No：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种中的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
本发明还提供了编码上述蛋白质的水稻叶形控制基因SRL-1，该基因具有SEQ ID No：1(即序列表中的第1个序列)所示的核苷酸序列。
作为本发明的基因的改进：核苷酸序列还包括在SEQ IDNo：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。
本发明还提供了含有上述基因的质粒。
本发明还提供了含有上述基因的植物表达载体。
本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述基因序列，该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
本发明还提供了一种改良水稻叶形的方法，包括用为SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。转化可采用农杆菌介导法或基因枪法。
具体的说：本发明所提供的从水稻卷叶突变体中克隆的新基因SRL-1，具有SEQ IDNo：1所示的核苷酸序列。也包括在取代一个核苷酸而产生的突变体等位基因，还含具有相同功能并能达到本发明目的的基因序列。
本发明中SEQ ID No：2所示的蛋白质，还包括其中进行一个或几个氨基酸的替换、插入或缺失氨基酸所获得的功能类似物。
本发明所提供的含有SEQ ID No：1所示序列的基因或含部分该基因片段的载体，如图4所示，该载体可以表达由上述核苷酸序列编码的多肽或同源类似物。
实现本发明的具体技术步骤如下：
一、水稻卷叶突变体srl-1的分离和遗传分析：
本发明所采用的水稻叶片半卷突变体(semi-rolled leaf)是将粳稻品种(japonica)“日本晴”经1％浓度的化学诱变剂(ethyl methane sulphonate，EMS)处理后，再通过大量筛选而得到的表型稳定的突变体srl-1。该突变体除了叶片表现出半卷曲外，其它表型均与野生型相似，如图1所示。杂交之后产生F1代自交产生的F2代群体，F2代群体共9548株，其中正常叶为7206株，卷叶为2342株，经卡平方测验，正常叶与卷叶个体的分离比符合3∶1(X2(0.127)＜X2 0.05(3.84))，表明我们所得到的是一个符合单基因控制遗传规律的隐性突变体。
二、图位克隆控制水稻叶形的SRL-1基因：
1、SRL-1基因的初步定位
为了分离SRL-1基因，本发明首先建立了一个大的多态性高的定位群体，由srl-1与籼稻品种台中本地1号(TN1)杂交而形成的F2群体，再通过图位克隆的方法，并利用STS、SSR等分子标记对SRL-1位点进行初步定位，将其初步定位在第7染色体短臂靠近端粒附近，并介于GH070392和GH070001两标记之间，见图2。
2、SRL-1基因的精细定位
通过对BAC克隆B102C12的序列分析，发展了11个新的分子标记(表1)，将SRL-1精确定位于STS标记S5869-3(F：CACAAATTAAACTGTTGCTAGGC；R：CCAGTTGTTGCTCACCTGAA)和S5895-4(F：GTTCGTCGTTCAGCTTCTCC；R：GCAAGCTGAGAAAGCAGTGA)之间，21.8kb的范围之内。通过测序分析此区段的开放阅读框(ORF)，将SRL-1基因确定于BAC克隆B102C12的132848-141711的位置(图3)。
3、SRL-1基因的鉴定和功能分析
利用pCAMBIA1302质粒构建互补载体(图4)，通过转基因技术，进行功能互补的转基因研究，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常叶片形态的转基因水稻(图5)，证明了本发明正确克隆了SRL-1基因，明确SRL-1基因的DNA序列(SEQ ID No：1)和cDNA序列(SEQ ID No：3)，氨基酸序列分析表明SRL-1基因编码一个未知蛋白(SEQ ID No：2)。
本发明从水稻卷叶突变体(semi-rolled laef)中克隆并鉴定了控制水稻叶片卷曲程度的基因，将其命名为srl-1，并通过互补实验进行基因功能验证。在水稻中，SRL-1基因功能的缺失导致叶片近轴面泡状细胞数目增多，造成叶片向近轴面的卷曲(内卷)。图位克隆的结果表明，该基因编码的功能蛋白，通过调控近轴面泡状细胞的数目控制叶片的卷曲程度。
根据序列的同源比对结果显示，本次申请的发明SRL-1基因与以上已有报道水稻叶形相关的基因同源性不高，从突变体的叶片细胞结构上看与ACL1基因的功能有所相似，但两者分别处于不同的染色体上，且两者之间不具有相同的结构域。因此我们认为该基因为又一水稻叶片发育的重要基因。
该基因在揭示叶片发生卷曲的分子机理，了解叶片近轴面泡状细胞的分化发育，以及单子叶植物叶片极性建成等方面具有重要的理论价值。叶形是作物的重要农艺性状，在品种改良和理想株形分子设计辅助育种中占有重要的地位。而微卷的叶片是水稻理想株型的特征之一，利用转基因技术改良植物叶片的卷曲程度，能够提高光合作用效率，加速干物质的积累，提高农业产量，具有广阔的应用前景。本发明可以为水稻株型改良和分子设计育种提供新的基因资源和理论指导。
附图说明
下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。
图1是水稻卷叶突变体srl-1的表型图；
图2是SRL-1在水稻第7染色体上的初步定位图；
图3是SRL-1基因的精细定位图；
图4是互补载体质粒图谱；
图5是功能互补实验T0代转基因水稻的表型图；
图6是BAC克隆OSJNBb0037L01在AP005869(B1026C12)中的位置图。
具体实施方式
实施例1：
1、水稻材料
水稻(Oryza sativa L.)突变体srl-1(Semi-rolled leaf 1)，其原始野生型材料为粳稻品种“日本晴”(Nipponbare)。水稻(Oryza sativa L.)突变体srl-1(Semi-rolled leaf 1)是将粳稻品种(japonica)“日本晴”经1％浓度的化学诱变剂(ethyl methane sulphonate，EMS)处理后，再通过大量筛选而得到的表型稳定的突变体srl-1。该突变体除了叶片表现出半卷曲外，其它表型均与野生型相似，如图1所示。
2、分析和定位群体
纯合的srl-1突变体与籼稻常规品种TN1进行杂交，F1代自交，得到F2群体，F2代群体共9548株，其中正常叶为7206株，卷叶为2342株。选择该2342株srl-1突变体作为定位群体。在分蘖期每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA。
3、SSR和STS标记定位SRL-1基因
采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约0.2g水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于150μl超纯水中，作为DNA样品。每一个PCR反应用2-3μl DNA样品。
SRL-1基因的初步定位：在srl1与TN1组合的F2群体中随机选取2342卷叶株中的186株，组成的小群体进行SSR分析，根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的RFLP、RAPD、SSR等引物，利用MJResearch的PTC-200型梯度热循环仪进行PCR扩增，其中PCR扩增反应总体积为20μl，其中包括50mmol/LKCl，10mmol/L Tris-Cl(pH9.0)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，50-100ng的基因组DNA，1个单位的Taq聚合酶和0.1μmol/L引物，其余为蒸馏水。扩增程序为94℃预变性5min，进入循环扩增：94℃变性1min，各引物退火温度见表1，退火时间1min，72℃延伸1min，循环40次；72℃延伸10min。经5％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测PCR产物的多态性。最终将SRL-1初步定位在第7号染色体接近短臂的端粒附近，GH070001和GH070392两分子标记之间。
SRL-1基因的精细定位：在srl-1与TN1组合的F2群体中共选取2342株(包括初定位的186株)隐性个体，在初定位的基础上继续设计SSR和STS标记，通过对BAC克隆B102C12的序列分析，发展了11个新的分子标记(表1)。
利用MJResearch的PTC-200型梯度热循环仪进行PCR扩增，其中PCR扩增反应总体积为20μl，其中包括50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl(pH9.0)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，50-100ng的基因组DNA，1个单位的Taq聚合酶和0.1μmol/L引物，其余为蒸馏水。扩增程序为94℃预变性5min，进入循环扩增：94℃变性1min，各引物退火温度见表1，退火时间1min，72℃延伸1min，循环40次；72℃延伸10min。经5％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测PCR产物的多态性。
最终将SRL-1精确定位于AP005869的BAC上(即克隆B1026C12)，位于分子标记S5869-3和S5869-4之间共21.8kb的范围之内。初定位和精细定位的分子标记序列如表1所示。
表1、用于基因定位的分子标记序列
注：**为用于初定位标记；*为用于精细定位标记；“T”为STS标记；“S”为SSR标记。
4、SRL-1基因预测、cDNA全长基因的获得与功能的预测：
根据精细定位的结果，在21.80kb范围内根据Rice Automated Annotation System(http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp)的预测，发现在此区间内含有2个候选基因，我们设计了这两个候选基因的测序引物(见表2)，采用PCR方法分别从srl-1和野生型粳稻品种日本晴(Nipponbare)基因组中扩增出这两个候选基因进行测序分析。发现其中一个基因的DNA片段中，发生单碱基的替换。根据BAC克隆AP005869(B1026C12)序列的基因注释信息(NCBI)，预测该基因编码一个功能蛋白，通过调控近轴面泡状细胞的数目来影响植株叶片的形状。经过几轮扩增得到了SRL-1基因的cDNA全长序列(SEQ ID No：3)。
该SRL-1基因(水稻叶形控制基因SRL-1编)码的蛋白质具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。SEQ IDNo：2中的“*”表示终止密码子(TAG)。
表2、用于候选基因测序的引物及其PCR退火温度
实施例2：
植物转化
由于我们没有得到BAC AP005869(B1026C12)全长DNA克隆，我们找到另外一个BAC克隆OSJNBb0037L01，该克隆全部包含于AP005869(B1026C12)之中，且包含SRL-1基因全长DNA序列(132848-141711)，如图6所示。我们将OSJNBb0037L01克隆用SpeI进行完全酶切，电泳分离后割取11.131KB的DNA片段连接到pCAMBIA1302中，获得了转化载体pCAMBIA1302-SRL-1，该克隆覆盖了整个ORF的基因组区域8.864Kb，还包括ATG上游1.596Kb启动子序列和终止子后0.671Kb下游序列。
这个质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中转化水稻。我们利用突变体幼胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有40mg/L Hygromycin的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有50mg/L预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行鉴定和连续的观察，发现植株叶片恢复了正常的形态，与同一生长阶段的突变体比较，叶片不再卷曲。如图5所示。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (8)
1.水稻叶形控制基因SRL-1编码的蛋白质，其特征是：该蛋白质具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征是：所述氨基酸序列还包括在SEQ ID No：2所示的氨基酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
3.一种水稻叶形控制基因SRL-1，其特征是：该基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的水稻叶形控制基因SRL-1，其特征是：所述核苷酸序列还包括在SEQ ID No：1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。
5.一种质粒，其特征是：含有如权利要求3或4所述的水稻叶形控制基因SRL-1。
6.一种植物表达载体，其特征是：含有如权利要求3或4所述的水稻叶形控制基因SRL-1。
7.一种宿主细胞，其特征是：含有如权利要求3或4所述的水稻叶形控制基因SRL-1，所述细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
8.一种改良水稻叶形的方法，其特征在于：包括用为SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的基因转化水稻植株，再将转化后的水稻进行叶片形态选育。
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