CN101857633A - 一种水稻叶形控制基因srnl1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻叶形控制基因SRNL1编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了编码上述蛋白质的基因，其具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明的基因能用于培育叶片卷曲的水稻。

Description

一种水稻叶形控制基因SRNL1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻SRNL1(Semi-Rolled and Narrow Leaf 1)基因，通过构建互补载体借助转基因技术鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因调控叶片维管束数目的变化和泡状细胞的形态改变，从而调节水稻叶片宽度和卷曲度，用以获得农作物的理想株型，改善叶片光合效率，提高农作物的产量。

背景技术

水稻作为单子叶植物的模式植物，具有单子叶植物叶的典型特点。水稻叶由叶片和叶鞘组成，叶片可分为表皮层，叶肉层和维管层三个组成部分。叶片的发育作为植物形态建成的一个重要方面，是一个非常复杂的过程，包括了细胞分裂和延伸、极性决定、组织分化等诸多方面。在维管层中包括靠近远轴面的韧皮部、靠近近轴面的木质部、外周的维管束鞘薄壁细胞以及将维管束和表皮紧密相连的厚壁纤维细胞；其是植物进行光合作用和呼吸作用的主要器官，其光合效率的高低直接影响其生长发育及粮食产量的高低。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，叶片形态的研究一直备受关注。叶片对植物的生命活动起着重要的作用，关系到植物株型和农业产量的形成，所以叶片性状是超高产育种的一项重要形态指标。对其形态的遗传机理及叶形态建成的分子机理进行研究，不仅能使我们更多地了解水稻的叶发育机制，而且能帮助我们通过分子设计改良株型。

目前，国内外科学家们已经对水稻叶片的性状进行了大量研究，但在遗传控制及分子水平机制的研究相对较少，尤其对叶片形态建成的分子机理研究还很不充分。现已研究表明水稻中存在多对控制水稻叶片形状的基因，卷叶性状通常由1对或几对基因控制。虽然迄今为止已报道的水稻卷叶主基因多达12个，但其中3个基因被精细定位，而真正克隆到的卷叶调控相关的基因仅有2个。

近年来，植物的叶形态建成分子机理研究取得了重大进展，许多叶发育相关的关键基因、小分子RNA和生长素等调控因子被研究揭示出来，它们之间复杂的相互作用也得到了初步解析。调控叶原基及轴性发育因子间的信号转导通路没有一种是专有的，相互通路之间互相影响又紧密联系，共同调控叶的发育。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从水稻半卷窄叶突变体中克隆的新基因SRNL1，该基因编码一种BEL1同源的表达蛋白，主要通过控制水稻叶片中维管束的数目及泡状细胞的形态来控制叶片的宽度和卷曲度。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻叶形控制基因SRNL1编码的蛋白质，该蛋白质为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

作为本发明的水稻叶形态建成控制基因SRNL1编码的蛋白质的改进：氨基酸序列还包括在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

本发明还提供了编码上述蛋白质的基因，该基因为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

作为本发明的基因的改进：核苷酸序列还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

本发明还提供了含有上述基因的质粒。

本发明还提供了含有上述基因的植物表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述基因序列。

作为本发明的宿主细胞的改进：该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

本发明还提供了一种培育植物叶片卷曲的方法，包括用上述植物表达载体转化植物细胞，再将转化的植物细胞培育成植株。

作为本发明的培育方法的改进：转化采用农杆菌介导法或基因枪法。

具体的说：本发明所提供的从水稻卷叶突变体中克隆的新基因SRNL1，具有SEQ ID NO：1所示的DNA序列。也包括在取代一个核苷酸而产生的突变体等位基因，还含具有相同功能并能达到本发明目的的基因序列。

本发明中SEQ ID NO：2所示的蛋白质属於BEL1同源蛋白家族，其中进行一个或几个氨基酸的替换、插入或缺失氨基酸所获得的功能类似物。

本发明所提供的含有SEQ ID NO：1所示序列的基因或部分基因片段的载体，如图4所示，该载体可以表达由上述核酸序列编码的多肽或同源类似物。

本发明所提供的植物叶片卷曲的培育方法，是一种用SRNL1进行高效植物遗传转化的方法；具体地说，是利用植物表达载体转化植物细胞以影响农作物叶片形态方法。

实现本发明的具体技术步骤如下：

一、水稻卷叶突变体srnl-1的分离和遗传分析：

本发明所采用的水稻叶片半卷曲窄叶突变体是将粳稻品种“日本晴”(japonica)经1％浓度的化学诱变剂(ethyl methane sulphonate，EMS)处理后，再通过大量筛选而得到的表型稳定的突变体srnl-1。该突变体除了叶片变窄且表现出向上卷曲外，其它表型均与野生型相似，如图1所示。经杂交实验、遗传分析表明，我们所得到的是一个符合单基因控制遗传规律的隐性突变体。

二、图位克隆控制水稻叶形的SRNL1基因：

1、SRNL1基因的初步定位：

为了分离SRNL1基因，本发明首先建立了一个大的多态性高的定位群体，由srnl-1与籼稻品种台中本地1号(TN1)杂交而形成的F2群体，再通过图位克隆的方法，并利用STS、SSR等分子标记对SRNL1位点进行初步定位，将其初步定位在第3染色体上，并介于RM7000(为公知内容)和V128.3-1两标记之间，见图2。

2、SRNL1基因的精细定位：

通过对BAC克隆OSJNBa0079G12的序列分析，发展了3个新的SSR标记和9个STS标记(表1)，将SRNL1精确定位于STS标记V135.1-2(F：GACCTGTACGGGCGGTTC；R：CACTGTAGTCTCGCAAGGAGAA)和Vs135.1-2(F：ATTAGCAGCATGGATGGATAGG；R：GCCCTTTGAAGACAACACTAGG)之间，28kb的范围之内。通过测序分析此区段的开放阅读框(ORF)，将SRNL1基因确定于BAC克隆OSJNBa0079G12的54863-59968的位置(图3)。

3、SRNL1基因的鉴定和功能分析：

利用pCAMBIA1300质粒构建互补载体(图4)，通过转基因技术，进行功能互补的转基因研究，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常功能的转基因水稻(图5)，证明了本发明正确克隆了SRNL1基因，明确SRNL1基因的DNA序列(SEQ ID NO：1所示)和cDNA序列(SEQ ID NO：3所示)，氨基酸序列分析表明SRNL1基因编码一种BEL1同源的表达蛋白(SEQ ID NO：2所示)。

在水稻中，SRNL1基因功能的丧失造成叶片维管束数目的减少和泡状细胞形态的改变，导致叶片宽度减少，同时使叶片向近轴面的卷曲。进一步的实验表明，SRNL1基因编码一种BEL1同源的表达蛋白，主要通过调控维管束数目的下降，使叶片宽度变窄；同时通过改变泡状细胞的形态来控制叶形的卷曲程度。该基因在了解叶片泡状细胞、维管组织和厚壁纤维组织的分化发育，以及单子叶植物叶片极性建成等方面具有重要的理论价值。

综上所述，本发明利用水稻叶形突变体——半卷窄叶突变体(Semi-rolled and narrowleaf 1)srnl1，通过图位克隆技术克隆到了SRNL1基因，该基因编码一种BEL1同源的表达蛋白，并以此控制水稻叶片中维管束的数目及泡状细胞的形态，从而控制叶片的宽度及卷曲度。我国是水稻生产和消费大国，随着人口的增长和人均耕地面积的减少，对水稻需求将呈上升趋势。高产和超高产是作物育种永恒的主题，是确保我国粮食安全和农业可持续发展最有效的保障。现代高产或超高产育种理论都提出了卷叶性状的利用问题，而且，目前生产上育成推广的许多高产品种已经利用了该性状，说明卷叶性状确有育种利用价值。开展水稻卷叶基因的克隆研究无论在发育生物学还是在理想株型育种的分子设计上都具有重要的意义。SRNL1基因的克隆和应用，对超级水稻理想株形的分子设计育种奠定了分子理论基础和提供了可直接利用的有利基因资源。无论是对稻作科学的发展，实现我国水稻单产的第三次突破，还是对解决新世纪我国粮食安全问题，都具有重大意义。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是水稻日本晴野生型与卷叶突变体srnl1的表型图，

注：图1中的“WT”代表野生型品种，“srnl1”代表半卷窄叶突变体；

图2是SRNL1在水稻第3染色体上的初步定位图；

图3是SRNL1基因的精细定位图；

图4是互补载体构建质粒图谱；

图5是功能互补实验T1代转基因水稻的表型图，

注：图5中的“srnl1”代表半卷窄叶突变体，“srnl1/SRNL1”代表转SRNL1基因T0代突变体植株。

具体实施方式

参照上述附图，对本发明的具体实施方式进行详细说明。

实施例1：

1、水稻材料

本发明所采用的水稻(Oryza sativa L.)突变体(Semi-rolled and narrow leaf1)(srnl1)是由中国水稻研究所国家重点实验室种质创新组将常规粳稻品种“日本晴”种子(japonica)经1％浓度的化学诱变剂(ethyl methane sulphonate，EMS)处理后，再通过大量筛选而得到的表型稳定的半卷窄叶突变体srnl-1，原始野生型材料为“日本晴”粳稻品种。

2、分析和定位群体

纯合的srnl1突变体和叶片平展的常规籼稻品种台中本地1号(TN1)进行杂交，F1代自交，得到F2群体，并从中选出1451个srnl1突变个体(其叶片为半卷窄叶)作为定位群体。在分蘖初期每株取0.5克左右的嫩叶，用来提取总DNA。

3、SSR和STS标记定位SRNL1基因

采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约100 mg水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于100μl超纯水中。每一PCR反应用2μl DNA样品。

在SRNL1基因的初步定位阶段，对由F2中筛选出的242个半卷窄叶突变个体进行分子标记连锁分析，根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物和STS引物，根据常规的PCR扩增方法，具体步骤为：PCR仪是MJResearch的PTC-200型梯度热循环仪。PCR扩增反应总体积为20μl，其中包括2ul(10×)PCR缓冲液(TAKALA公司购买)，1.5ul 200μmol·L^-1dNTP，2ul(50-100ng)的基因组DNA，0.25ul(1个单位)的Taq聚合酶(TAKALA公司购买)和3ul(0.1μmol·L^-1)引物(上海生工合成)，14.25ul去离子水。PCR程序为94℃预变性5min，进入循环扩增：94℃变性1min，各引物退火温度见表1，退火时间1min，72℃延伸1min，循环40次；72℃延伸10min。经5％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(ER)染色，检测PCR产物的多态性。根据各标记与目标基因的交换值大小，将SRNL1初步定位在第3号染色体长臂RM7000和V128.9-1标记间。

4、SRNL1基因的精细定位

在精细定位SRNL1基因时，通过对BAC克隆OSJNBa0079G12的序列分析，在RM7000和V128.9-1两标记间发展了3个新的SSR标记和9个STS标记(如表1所示)利用常规的染色体步移法进行精细定位。所有外围交换单株在STS标记V135.1-1(F：AGCCGAGGGGAATATATCTAGG；R：ATAATTGCGCACAAAACACACT)处则出现共分离，于是我们将SRNL1精确定位于STS标记V135.1-2(F：GACCTGTACGGGCGGTTC；R：CACTGTAGTCTCGCAAGGAGAA)和Vs135.1-2(F：ATTAGCAGCATGGATGGATAGG；R：GCCCTTTGAAGACAACACTAGG)之间，28kb的范围之内。通过测序分析此区段的开放阅读框(ORF)，将SRNL1基因确定于BAC克隆OSJNBa0079G12的54863-59968的位置。

表1、新发展的具有多态的SSR标记和STS标记

注：V-为STS标记；VS-为SSR标记。

根据BAC克隆OSJNBa0079G12序列，设计测序引物，采用PCR方法分别从srnl1和野生型日本晴的基因组中分段扩增出这28kb，进行全测序分析。发现突变体SRNL1扩增的产物比野生型日本晴有一个碱基的替换(C到T)。在根据cDNA水平检测发现该突变事件发生基因的第一个开放阅读框(ORF)内，使编码谷氨酰胺氨基酸(Gln)密码子CAG突变成了终止子TAG，从而导致基因编码蛋白氨基酸序列提前终止。根据BAC克隆OSJNBa0079G12序列的基因注释信息(TIGR)，该基因编码一个编码一种BEL1同源的表达蛋白。通过测序分析此区段的开放阅读框(ORF)推测候选基因，将SRNL1基因定位于BAC克隆OSJNBa0079G12的54863-59968的位置。该基因共包含3个外显子(Exon)和2个内含子(Intron)。

5、SRNL1 cDNA全长基因的获得与功能的预测

在分蘖盛期取野生型日本晴品种的叶片，采用Trizol方法提取mRNA；通过RT-PCR技术反转录获得全基因组cDNA，RT-PCR反应体系(20μl)包括：(RNase free)专用水9μl；5×RTbuffer4μl；dNTPs(10mM)2μl；RNase inhibitor(10U/μl)1μl；OligdT 1μl；E(AMV)1μl和RNA 2μl。RT-PCR运行程序：30℃ 10min；42℃ 20-40min；95℃ 5min；0-5℃ 5min。程序结束后进行瞬时离心，反转录好的cDNA在-20℃贮藏备用。

通过设计测定SRNL1基因全长cDNA引物(F：GCCGGCATGGGAATAGCG；R：CGCCAACAGTGCGGTATCTATAG)。用该引物PCR扩增反转录好的cDNA，获得的目标片段经测序后明确SRNL1基因的cDNA全长序列(SEQ ID NO：3所示)。在上述研究的基础上发现了基因发生突变的位置，并预测该基因编码一个编码一种BEL1同源的表达蛋白(SEQ ID NO：2所示)，主要通过调控维管束数目的下降，使叶片宽度变窄；同时通过改变泡状细胞的形态来控制叶形的卷曲程度。

实施例2：

植物转化载体pCAMBIA1300的改造和质粒转化：

设计1对将Swa I酶切位点引入pCAMBIA1300载体的引物Vsrnl-1300(F：GC

TTAATTAAGCCGTCGCTG；R：GCATTTAAATCCGACGAGGG)，其中前引物中含有BamH I酶切位点序列(GGATCC)，后引物中含有Hind III(AAGCTT)和Swa I(ATTTAAA)酶切位点序列；用该合成的Vsrnl-1300引物PCR扩增日本晴基因组DNA，获得不含pCAMBIA1300多克隆位点上所有酶切位点序列421bp片段(SEQ ID NO：4)，将该扩增片段电泳分离、回收纯化后用BamH I和Hind III两种内切酶进行双酶切，并回收411bp的目标片段(SEQ ID NO：5)。将该片段与同样用BamH I和Hind III两种内切酶双酶切后的pCAMBIA1300载体连接，这样在pCAMBIA1300载体的多克隆位点BamH I与Hind III之间就引入了Swa I酶切位点。然后将BAC克隆OSJNBa0079G12用BamH I和Swa I进行完全酶切，将电泳分离后割取8.371KB的DNA片段(SEQ ID NO：6)连接到pCAMBIA1300多克隆位点中的BamHI和Swa I切点上，该DNA片段覆盖了整个ORF的基因组区域(SEQ ID NO：1)，还包括ATG上游2.310Kb启动子序列和终止子TAG后的0.955Kb的3’端非翻译区序列。

这个质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中转化水稻。我们利用突变体幼胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有40mg/LHygromycin的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有50mg/L预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行鉴定和连续的观察，于同一生长阶段的突变体比较，发现植株叶片宽度恢复了正常，叶片平展不再卷曲(图5)。说明SRNL1基因具有使突变体叶片表型恢复正常的功能。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种水稻叶形控制基因SRNL1编码的蛋白质，其特征在于：该蛋白质为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的水稻叶形控制基因SRNL1编码的蛋白质，其特征在于：所述氨基酸序列还包括在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

3.一种编码权利要求1或2所述蛋白质的基因，其特征在于：该基因为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述核苷酸序列还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

5.一种含有权利要求3或4所述基因的质粒。

6.一种含有权利要求3或4所述基因的植物表达载体。

7.一种宿主细胞，其特征在于：该宿主细胞含有权利要求3或4所述的基因序列。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于：该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

9.一种培育植物叶片卷曲的方法，其特征在于：包括用权利要求6所述的植物表达载体转化植物细胞，再将转化后的植物细胞培育成植株。

10.根据权利要求9所述的培育植物叶片卷曲的方法，其特征在于：所述转化为农杆菌介导法或基因枪法；所述植物为水稻。

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