CN116003549A - 水稻叶尖皱缩扭曲基因ltr1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明为水稻叶尖皱缩扭曲基因LTR1及其应用，公开了一种水稻叶形调控基因LTR1编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。本发明还同时提供了上述水稻叶形调控基因LTR1的用途：改良水稻叶形。该基因调控泡状细胞和维管束的发育，进而影响叶片形态，提高农作物的产量。

Description

水稻叶尖皱缩扭曲基因LTR1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆的水稻叶尖皱缩扭曲基因LTR1及其应用。

背景技术

水稻是人类重要的粮食作物之一，随着人口激增和耕地面积不断减少，粮食短缺问题日益严峻。株型作为水稻形态特征中的重要表型，其表现性状对提高水稻单产、提升抗性和改善稻米品质均有直接或间接的影响。水稻株型由叶型、茎型、穗型、根型等几部分构成，其中叶片是水稻进行光合作用和呼吸作用的主要场所，水稻的光合储能、正常生命功能行使都受叶片影响，因此叶片形态是水稻植株组织发生和形态建成的一个重要组成部分。叶片形态影响着水稻株型结构，并通过改变植株叶面积指数，在光合作用及抗逆性等方面起作用，主要通过叶长、叶宽、叶色、叶厚、卷曲度、叶倾角、披垂度等指标来评价，合适的叶片形态有利于水稻产量的提升。叶片大小影响光合叶面积，与卷曲度、直立性等也有一定关联。通常来说，叶片窄而短的表现为直立叶片，宽且长的多为披叶，叶片卷曲或较厚也对叶片直立度有一定影响。水稻叶片形态中叶倾角分布与冠层光分布关系最为密切，叶倾角大小也是决定叶面积指数(LAI)分布的主要因素。适宜的叶倾角可使叶片两面受光，提高光效率。水稻叶片卷曲可使水稻长叶品种叶片直挺，减少叶片披垂重叠，使群体生长中后期光照条件得到改善，提高光合效率。

在水稻育种领域，先后有多位育种专家提出了水稻高产理想株型模式，无一例外都提及叶片形态的选育。北方梗稻区的杨守仁先生提出“短枝立叶，大穗直穗”株型模式中对叶片的要求是“立叶”(杨守仁等，1984)；周开达院士提出“重穗型”超级稻的叶片形态是“叶片内卷直立”(周开达等，1995)；袁隆平院士也从叶片的形态上来提出了自己关于水稻超高产株型的模式，认为上部三叶具有“长、直、窄、凹、厚”等特征的合理分配可以有效改善群体的光合效率，促进水稻的增产(袁隆平，1997)。除此之外，国外也有不少学者在水稻株型研究中提出了自己的理想模式，日本的松岛省三认为水稻株型的理想状态应该是叶片形态以短、宽、厚和直立为宜，尤其以构成水稻生理后期冠层结构绿色叶面积为主要组分的上部片叶的形态更应如此(松岛省三等，1978)。从国内外研究者对水稻理想株型的要求来看，叶片形态的选择在水稻理想株型的选育过程中是必不可少的。

随着分子标记的发展和基因克隆技术的完善，在水稻上已鉴定并克隆多个叶形相关基因，，在水稻叶形形态发育及分子调控机理研究方面取得一些进展。目前已成功克隆到控制水稻叶宽性状相关基因28个，控制水稻叶长性状相关基因16个，水稻卷叶相关基因超30个，叶倾角调控基因超过60个。大多数叶形基因具有多效性，各性状间相互影响，比如大部分调控叶长、叶宽的基因也影响到叶面积的大小。叶形不仅受基因型控制，各类激素间的相互作用对叶形也有较大影响。NAL7、NAL1分别参与生长素的生物合成与极性运输影响叶片形态发育；OsCHR4影响生长素和赤霉素相关信号通路，通过对生长素和蜡质生物合成基因表达的表观遗传调控调节叶片形态的发生和角质层蜡的形成。

随着各种组学的发展以及高通量测序技术不断更新，叶片形态建成调控机理研究不断深入和转基因技术的不断完善，基因定点改造和有利基因的定向聚合将成为可能，这为叶片空间姿态的遗传网络研究提供了可利用的平台。

已有报道表明，在水稻中，LTR1等位基因OsGL1-4通过影响花粉的黏附和水合反应来控制雄性育性。而叶片形态及叶组织细胞结构的研究尚未报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从叶尖皱缩扭曲突变体中克隆的新基因LTR1，该基因编码的功能蛋白，通过调控维管束分布和泡状细胞的发育来影响叶片的形态。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻叶形调控基因LTR1编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。

作为本发明的水稻叶形调控基因LTR1编码的蛋白质的改进：氨基酸序列还包括在SEQ ID No：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种中的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

本发明还提供了编码上述蛋白质的水稻叶形调控基因LTR1，该基因具有SEQ IDNo：1所示的核苷酸序列。

作为本发明的基因的改进：核苷酸序列还包括在SEQ ID No：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

本发明还提供了含有上述基因的质粒。

本发明还提供了含有上述基因的植物表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有基因序列，该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

本发明还同时水稻叶形调控基因LTR1的用途：改良水稻叶形。

作为本发明的水稻叶形控制基因LTR1的用途的改进：该基因调控泡状细胞和维管束的发育，进而影响叶片形态；从而提高农作物的产量。

本发明还提供了一种改良水稻叶形的方法，包括用为SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。转化可采用农杆菌介导法或基因枪法。

具体的说：本发明所提供的从水稻叶尖皱缩扭曲突变体中克隆的新基因LTR1，具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。也包括在取代一个核苷酸而产生的突变体等位基因，还含具有相同功能并能达到本发明目的的基因序列。

本发明中Seq ID No：2所示的蛋白质，还包括其中进行一个或几个氨基酸的替换、插入或缺失氨基酸所获得的功能类似物。

本发明所提供了含有SEQ ID No：1所示序列的基因或含部分该基因片段的载体，如图4所示，该载体可以表达由上述核苷酸序列编码的多肽或同源类似物。

本发明发现：LTR1基因通过调控维管束分布和泡状细胞的发育来影响叶片的形态。LTR1基因的克隆以及功能分析有利于深入解析水稻叶片形态建成的遗传调控机制，揭示蜡质合成调控基因在叶片形态发育以及叶片组织结构(如泡状细胞和维管束)发育调控中的重要调控作用。叶形作为作物重要的农艺性状，是理想株型的重要组成部分，在品种改良和分子设计辅助育种中占有重要的地位。该发明可以为水稻株型改良和分子设计育种提供新的基因资源和理论指导。

实现本发明的具体技术步骤如下：

一、水稻叶尖皱缩扭曲突变体ltr1的分离和遗传分析

本发明所采用的水稻叶尖皱缩扭曲突变体ltr1(leaf tip rumpled 1)是将粳稻品种日本晴(japonica)经1％浓度的化学诱变剂(ethyl methane sulphonate，EMS)处理后，再通过大量筛选而得到的表型稳定的突变体。ltr1突变体的表型除了叶片尖部有明显的扭曲外，多数叶脉弯曲导致叶片皱缩，其如图1所示。利用ltr1突变体与叶形正常的籼稻品种9311、南京号(NJ06)、台中本地号(TN1)以及粳稻品种日本晴(Nipponbare)分别构建遗传群体，并对F₁代及其自交后代F₂代的分离比例进行分析，经χ²检测之后均符合3：1遗传分离比例。因此，推测该水稻突变体叶片尖部皱缩扭曲性状是由一个隐性基因控制。

二、图位克隆控制水稻叶形的LTR1基因

1、LTR1基因的初步定位

为了分离ltr1基因，本发明以ltr1与籼稻品种台中本地号(TN1)杂交而形成的F₂代群体作为定位群体，再通过图位克隆的方法，并利用SSR等分子标记对ltr1位点进行初步定位，将其初步定位在第2染色体长臂上，并介于RM6318和RM1920两标记之间(图2)。

2、LTR1基因的精细定位

通过对籼稻品种9311和粳稻品种日本晴进行序列比对分析，发展了11个新的分子标记(表1)，将LTR1精确定位于N-12和N-20之间共13.5kb的范围之内。通过测序分析此区段的开放阅读框(ORF)，将LTR1基因确定于2号染色体的24718047-24724120的位置(图3)。

3、LTR1基因的鉴定和功能分析

利用pCAMBIA1300质粒构建LTR1互补载体。构建步骤：PCR扩增获得全长为8629bp的基因组DNA片段，包含LTR1基因启动区的2061bp，5450bp的编码区，1118bp的LTR1基因的下游序列，将该片段连接到pCAMBIA1300载体多克隆位点KpnⅠ上获得pCAMBIA1300-LTR1互补载体(图4)。

通过转基因技术，进行功能互补的转基因研究，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常叶片形态的转基因水稻(图5)，证明了本发明正确克隆了LTR1基因，明确LTR1基因的DNA序列(SEQ ID No：1)和cDNA序列(SEQ ID No：3)，氨基酸序列(SEQ ID No：2)分析表明由LTR1基因编码。

本发明从水稻叶尖皱缩扭曲突变体ltr1(leaf tip rumpled 1)中鉴定并克隆调控水稻叶片形态的基因，将其命名为LTR1，并通过互补实验进行基因功能验证。在水稻中，LTR1基因功能的缺失导致叶片近轴面泡状细胞和维管束发育异常(图6)，造成叶尖皱缩扭曲的表型。图位克隆的结果表明，该基因编码的功能蛋白，通过调控维管束分布及泡状细胞发育来影响叶片的形态。

综上，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆的水稻叶尖皱缩扭曲基因LTR1及其应用，以及利用转基因互补分析、敲除表型分析确认该基因的功能；同时还涉及利用该基因调控泡状细胞和维管束的发育，进而影响叶片形态，可以塑造水稻理想株型，提高农作物的产量。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是水稻叶尖皱缩扭曲突变体ltr1的表型图；

图1中：

a.野生型(NPB)和突变体(ltr1)的植株形态，标尺大小分别为10.0cm。b.野生型(NPB)和突变体(ltr1)上三叶叶片形态，标尺大小分别为2.0cm。(c)野生型(NPB)和突变体(ltr1)叶片横切面的冷冻切片观察，标尺大小为200μm，箭头所示为泡状细胞所在位置；

图2是叶尖皱缩扭曲基因LTR1在水稻第2染色体上的初定位图；

图3是叶尖皱缩扭曲基因LTR1基因的精细定位图；

图4是互补载体pCAMBIA1300-LTR1质粒图谱；

图5是功能互补实验T1代转基因互补植株表型图；

图6是LTR1基因敲除后的日本晴植株表型图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：(图位克隆)

1、水稻材料

水稻(Oryza sativa L.)突变体ltr1(leaf tip rumpled 1)，其原始野生型材料为粳稻品种日本晴(Nipponbare)。水稻(Oryza sativa L.)突变体ltr1(leaf tip rumpled1)是将粳稻品种(japonica)日本晴经1％浓度的化学诱变剂(ethyl methane sulphonate，EMS)处理后，再通过大量筛选而得到的表型稳定的突变体ltr1。该突变体除了叶尖皱缩扭曲外，其它表型均与野生型相似，如图1所示。

叶尖皱缩扭曲的作为纯合的ltr1突变体，用于下述步骤。

2、分析和定位群体

纯合的ltr1突变体与籼稻品种(indica)TN1进行杂交，F₁代自交，得到F₂群体，F₂代群体共488株，其中正常叶为362株，皱缩扭曲叶为126株。选择该126株ltr1突变体作为初定位群体。

然后又将ltr1分别与TN1和C84杂交，利用获得的两个不同的F₂分离群体扩大定位群体，从新的F₂分离群体中又分别挑选出了1143个和893个具有叶尖皱缩扭曲表型的隐性单株作为精细定位群体。在分蘖期每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA。

3、SSR和STS标记定位LTR1基因

采用改良的CTAB法提取水稻叶片用于基因定位的基因组DNA。取3-5cm水稻叶片，剪碎放入2.0ml eppendorf离心管中，加入2粒钢珠，700μl提取液，置于TissueLyser IIsystem组织研磨器，研磨2-3min，置于65℃恒温烘箱中40-60min，期间震荡1-2次。然后加入500μl氯仿萃取，上下剧烈振荡，静置后离心，吸取500μl上清液，加入等量冰冻的异丙醇，离心，用70％酒精洗涤1-2次，晾干后加入200μl超纯水作为DNA样品。每一个PCR反应用2-3μlDNA样品。

LTR1基因的初步定位：在ltr1与TN1组合的F₂群体中选取126株突变体植株进行SSR分析，根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物，利用MJResearch的PTC-200型梯度热循环仪进行PCR扩增，其中PCR扩增反应总体积为20μl，其中包括50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，1.5mmol/L MgCl₂，200μmol/L dNTP，50-100ng的基因组DNA，1个单位的Taq聚合酶和0.1μmol/L引物(表1中带**标记的引物)，其余为蒸馏水。扩增程序为94℃预变性5min，进入循环扩增：94℃变性45s，各引物退火温度见表1，退火时间50s，72℃延伸50s，循环35-39次；72℃延伸10min。经4％-5％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测PCR产物的多态性。最终将LTR1初步定位在第2号染色体长臂RM6318和RM1920两分子标记之间。

LTR1基因的精细定位：为了缩小LTR1基因的定位区间，本发明将ltr1分别与TN1和C84杂交，扩大定位群体，从新F₂分离群体中又分别挑选出了1143个和893个具有叶尖皱缩扭曲表型的隐性单株，用于基因连锁分析。在初定位的基础上，通过对籼稻品种9311和粳稻品种日本晴进行序列比对分析，发展了11个新的分子标记(表1中带*标记的引物)。

利用MJResearch的PTC-200型梯度热循环仪进行PCR扩增，其中PCR扩增反应总体积为20μl，其中包括50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，1.5mmol/L MgCl₂，200μmol/L dNTP，50-100ng的基因组DNA，1个单位的Taq聚合酶和0.1μmol/L引物，其余为蒸馏水。扩增程序为94℃预变性5min，进入循环扩增：94℃变性45s，各引物退火温度见表1，退火时间50s，72℃延伸50s，循环35-39次；72℃延伸10min。经4％-5％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测PCR产物的多态性。

最终将LTR1精确定位在分子标记N-12和N-20之间共13.5kb的范围之内。初定位和精细定位的分子标记序列如表1所示。

表1、用于基因定位的分子标记序列

注：**为用于初定位标记；*为用于精细定位标记。

4、LTR1基因预测、cDNA全长基因的获得与功能的预测：

根据精细定位的结果，在13.5kb范围内根据Rice Genome Annotation Project(http://rice.uga.edu/index.shtml)的预测，发现在此区间内含有1个候选基因，本发明设计了这个候选基因的测序引物(见表2)，采用PCR方法，利用MJResearch的PTC-200型梯度热循环仪进行PCR扩增，其中PCR扩增反应总体积为20μl，其中包括50mmol/L KCl，10mmol/LTris-HCl(pH9.0)，1.5mmol/L MgCl₂，200μmol/L dNTP，50-100ng的基因组DNA，1个单位的Taq聚合酶和0.1μmol/L引物(表2)，其余为蒸馏水。扩增程序为94℃预变性5min，进入循环扩增：94℃变性30s，各引物退火温度见表2，退火时间30s，72℃延伸1min，循环35-39次；72℃延伸10min。分别从ltr1和野生型粳稻品种日本晴(Nipponbare)基因组中扩增出这个候选基因进行测序分析。发现这个基因的DNA片段中，缺失了2bp，移码突变导致转录提前终止。根据The Rice Annotation Project(https://rapdb.dna.affrc.go.jp)网站上的基因注释信息，预测该基因编码一个蜡质基因，通过调控叶片近轴面泡状细胞和维管束发育，来影响叶片的形态。

利用MJResearch的PTC-200型梯度热循环仪进行PCR扩增，其中PCR扩增反应总体积为50μl，其中包括1x PCR buffer，200μmol/L dNTP，50-100ng的基因组DNA，1个单位的Taq聚合酶和0.2μmol/L引物(5'-ATGGCGACCAGGCCGGGCCCTT-3’和5'-TCAAGCTTTAGTGAGAGGAAGG-3’)，其余为蒸馏水。扩增程序为94℃预变性4min，进入循环扩增：98℃变性10s，退火温度60℃，退火时间30s，68℃延伸2min，循环35-39次；68℃延伸10min，得到了LTR1基因的cDNA全长序列(SEQ ID No：3)。

该水稻叶尖皱缩扭曲基因LTR1编码的蛋白质具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。SEQ ID No：2的末尾为终止密码子(TGA)。

表2、用于候选基因测序的引物及其PCR退火温度

实施例2：功能互补验证

植物转化

PCR扩增全长为8629bp的基因组DNA片段(SEQ ID No：1)，包含LTR1基因的ATG上游启动区的2061bp，编码区的5450bp，终止子后的1118bp下游序列，利用引物5'-ACGAATTCGAGCTCGGTACCTTTAACAGAGATGAACACCGCC-3’和5'-GCCTGCAGGTCGACTCTAGACAATGTCAATCAAACTTCTAAT-3’扩增第一段序列(SEQ ID NO:1，1-4312bp)，引物5'-GACCACCTCCACAACCTTCTGATCTAGATATAGCTGTTGCTATTACTGA-3’和5'-GCCTGCAGGTCGACTCTAGAATACATGCAGTTGATAGTCGGA-3’扩增第二段序列(SEQ ID NO:1,4184-8629bp)，将第一段扩增片段连接到pCAMBIA1300载体的KpnⅠ酶切位点上，再将经测序验证过已连上第一段的载体经XbaⅠ酶切后同第二段扩增片段连接，最终获得包含LTR1基因组全长序列的遗传转化载体pCAMBIA1300-LTR1。

这个质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中转化水稻。本发明利用突变体成熟胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养2周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有50mg/L Hygromycin的筛选培养基上光照培养14天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行鉴定和连续的观察，发现植株叶片恢复了正常的形态，与同一生长阶段的突变体比较，叶片不再皱缩扭曲。如图5所示。

实施例3：基因敲除

利用华南农业大学刘耀光团队的A pYLCRISPR/Cas9-MH/B vector system进行基因敲除载体的构建。

具体步骤为：

首先利用引物LTR1-U3-F：GGCATGGGTTGGTGTTCTACGCG和LTR1-U3-R：AAACCGCGTAGAACACCAACCCA制备靶点接头，下一步利用酶切过的pYL gRNA-U3载体与所对应接头连接反应制备gRNA表达盒，然后通过2轮巢式PCR扩增gDNA表达盒，以上步所制备的gRNA表达盒为第一轮扩增模板，扩增引物为U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’和gRNA-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’，以第一轮扩增产物稀释百倍后的为第二轮扩增模板，扩增引物为Uctcg-B1’：5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’和gRcggt-BL：5’-AGCGTGGGTCTCGACCGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’。将两组扩增的PCR产物纯化后等量混合，然后同pYLCRISPR/Cas9-MH载体边酶切边连接，然后转化至DH5α中，通过菌落PCR、测序等鉴定阳性质粒，从而获得该基因的基因敲除载体pYLCRISPR/Cas9-MH-LTR1。将质粒pYLCRISPR/Cas9-MH-LTR1通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中转化水稻。然后利用粳稻品种“日本晴”成熟胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养2周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有质粒pYLCRISPR/Cas9-MH-LTR1的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有50mg/L Hygromycin的筛选培养基上光照培养14天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行鉴定和连续的观察，发现转基因水稻产生了与突变体类似的叶尖皱缩扭曲表型，野生型和敲除转基因株系叶片的冷冻切片观察发现与野生型相比，LTR1-KO株系泡状细胞分布不均匀、维管束发育排列紊乱，这些组织结构的异常导致了叶片的皱缩扭曲(图6)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.水稻叶形调控基因LTR1编码的蛋白质，其特征在于：该蛋白质具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述氨基酸序列还包括在SEQ ID No：2所示的氨基酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

3.编码如权利要求1或2所述蛋白质的水稻叶形调控基因LTR1，其特征在于：该基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：还包括在SEQ ID No：1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

5.含有权利要求3或4所述基因的质粒、植物表达载体、宿主细胞。

6.如权利要求3或4所述水稻叶形调控基因LTR1的用途，其特征在于：改良水稻叶形。

7.根据权利要求6所述的水稻叶形控制基因LTR1的用途，其特征在于：该基因调控泡状细胞和维管束的发育，进而影响叶片形态，提高农作物的产量。

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