CN105695428B - 水稻细胞质激酶基因OsBHL1及其编码蛋白与应用 - Google Patents

水稻细胞质激酶基因OsBHL1及其编码蛋白与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了水稻细胞质激酶基因OsBHL1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，cDNA序列如SEQ ID No.2所示，蛋白质序列如SEQ ID No.3所示，属于植物基因工程技术领域。通过农杆菌介导的遗传转化，将其转入到粳稻品种合江19（H1493）中，过表达的植株出现植株发育异常和抗性增加效应，主要表现在：植株叶片卷曲、直立性增加、分蘖减少、结实率降低、千粒重降低、穗数增多以及对褐飞虱的抗性增强。本发明的基因具有多效性作用，对于研究基因分子功能和育种工作都具有很好的借鉴意义。

Description

水稻细胞质激酶基因OsBHL1及其编码蛋白与应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻细胞质激酶基因OsBHL1及其编码蛋白与应用。
背景技术
水稻是一种重要的粮食作物，世界上有超过一半的人以其为主食，同时水稻也是目前农业生产和科学研究的热点植物，作为科学研究的模式植物，在完成水稻全基因组计划之后，其功能基因组的研究得到越来越多的广泛关注，特别是对一些调控水稻重要农业性状基因的研究日益受到研究人员的重视。
受体类蛋白激酶在植物生长、发育和防御反应中起重要作用。一般受体类蛋白激酶包括4个结构域：N-端信号肽、细胞外受体识别、单次跨膜和细胞质内的蛋白激酶结构域。细胞外的结构域结合配体后激活细胞内的激酶活性，可诱导下游蛋白的转磷酸化和自磷酸化过程，磷酸化的蛋白可进一步的诱导此配体引起的特异性反应。尽管受体类蛋白激酶在植物基因组中包含一个很大的家族，并且大量的基因已经克隆，但是这些蛋白的功能知道的还是很少。
叶片卷曲是水稻生产中一个重要的农艺学性状，适度的叶片卷曲可使叶片直立，增加光合作用效率，通过降低蒸腾作用水分的丧失和增加热的吸收提高应急反应。然而对于叶片卷曲的分子学机制还知道很少。
对于激酶基因多效应的研究报道也比较多，例如水稻类凝集素受体蛋白基因OslecRK参与发芽和抗性、Ca2+依赖的蛋白激酶CDPK7参与水稻的耐冷、耐盐和耐旱、受体激酶BAK1可通过BR信号调控生长发育，也可通过识别flg22或者ERF参与PTI调控的抗性反应等等。
发明内容
为了进一步研究控制水稻叶片卷曲的分子机理，本发明的目的在于提供一种水稻细胞质激酶基因OsBHL1及其编码蛋白与应用。
本发明提供水稻细胞质激酶基因OsBHL1，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因全长2433bp，具有5个内含子和6个外显子，其CDS区段分别为1-706、808-969、1230-1314、1397-1534、1621-1235和2098-2433，cDNA全长1567bp，如SEQ ID NO.3所示，其ORF为cDNA的238-1416bp。
本发明技术人员应当理解根据SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，对其替换、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，获得具有相同功能的核苷酸序列，例如，在不同水稻背景下的序列，替换一个或几个碱基。因此，本发明所述的基因还包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经替换、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列。
进一步地，本发明还提供了所述基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
应该理解为，在不影响BHL1蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。
因此，本发明的水稻BHL1基因编码的蛋白质还包括SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有同等活性的水稻BHL1基因编码的蛋白质。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
本发明还包括基于所述多核苷酸的正义序列或反义序列，包括含有所述多核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞和转基因植物。
本发明还提供了所述基因在水稻选育中的应用，所述水稻选育为提高水稻叶片卷曲度和直立性以及对褐飞虱的抗性。
本发明还提供一种培育具有一定褐飞虱抗性的植物的方法，包括：
1)用多核苷酸转化植物细胞；所述多核苷酸含有水稻细胞质激酶OsBHL1基因的ORF，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3的238-1416bp所示；
2)将被转化的植物细胞再生为植物；
3)培养再生的植物并使上述多核苷酸得到过量表达。
其中所述植物是单子叶植物。
所述单子叶植物是水稻。
本发明还提供了水稻细胞质激酶基因OsBHL1转基因植株的分子检测方法，通过所述引物对扩增待检转基因水稻基因组DNA，并检测扩增产物：若利用引物OES-F和OES-R扩增出457bp的扩增片段，则说明是转基因阳性植株，若没有扩出这个片段则说明是转基因阴性植株。
OsBHL1基因的发现与研究实验进展：
1)发现过程：通过对类凝集素受体蛋白激酶LecRK在水稻9311文库筛选互作蛋白找到一个细胞质激酶蛋白OsBHL1。
2)遗传转化验证功能：本发明的基因来源于籼稻B5的基因组以及cDNA。将OsBHL1的ORF全长连入到含有ubi启动子的载体PCXUN中，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将过表达载体导入正常粳稻品种合江19(H1493)中，最后获得OsBHL1转基因植株25株。
筛选引物分别是
OES-F：GTCGCTGTGCATCCGCTCGT(5'-3')(SEQ ID NO.8)
OES-R：GTTTGCGCGCTATATTTTGT(5'-3')(SEQ ID NO.9)
其中阳性植株17株，然后对T1代的植株进行了Southern杂交、定量PCR分析，随机挑选3个具体代表性的单拷贝进行后续分析，分别是OE-22、OE-24、OE-25，表达程度上依次增高。
对T2代的纯合阳性植株进行田间性状考察，包括，叶片卷曲指数、叶片直立指数、叶片宽度、叶片长度、分蘖数、株高、结实率、千粒重、穗长、穗数、结实率进行性状考察。
对T2代的纯合阳性植株在苗期进行选择性实验，实验表明褐飞虱更喜欢在野生型H1493上取食，而在OsBHL1超量表达的转基因植株上分布较少，说明OsBHL1基因正向调控对褐飞虱的抗性。
本发明的优点和效果：
1.是对细胞质激酶基因参与水稻生长发育过程的一个很好的实例，这对理解激酶功能和对生长发育调控具有一定的参考价值。
2.本发明报道了细胞质激酶基因参与了对褐飞虱的抗性，这对研究水稻对抗褐飞虱是一个新的认识。
3.由于OsBHL1基因的具有很好的多效性，而且叶片卷曲和直立性对水稻的高产、稳产都具有重要意义，因此此基因可以用于育种工作中。
4.由于植物细胞中，激酶是一个很大的家族，因此OsBHL1基因的研究对于研究工作者以后研究其他的激酶基因具有很好的参考价值。
附图说明
图1为OsBHL1基因的组织表达模式
呈现组成型表达模式，在各个时期都有表达，但是在叶片中表达量比较高，特别是剑叶中达到最高。
图2为转基因材料的Southern杂交结果。
图3为转基因材料的定量PCR结果。
图4为转基因株系OE-25的植株表型
与对照H1493相比，分蘖数变少、叶片卷曲比较明显(标尺代表10厘米长度)。
图5为OsBHL1基因过表达植株的表型分析
卷曲指数(图5A)和叶片直立指数(图5B)。
图6为不同转基因株系株高(图6A)、分蘖数(图6B)、穗数(图6C)、结实率(图6D)、千粒重(图6E)以及叶片叶绿素含量(图6F)。
图7为褐飞虱对株系OE-25与对照H1493的选择结果。
图8为不同转基因株系抽穗期剑叶的横切图(图8A,B,C,D)以及对应的泡状细胞数目(图8E)及面积(图8F)。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
若未特别指明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术(参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
【实施例1】水稻OsBHL1基因的获得
通过对类凝集素受体蛋白激酶LecRK在水稻9311文库筛选互作蛋白找到一个细胞质激酶蛋白OsBHL1，通过设计引物在籼稻B5的cDNA中扩增得到基因的ORF序列，通过与数据库中的日本晴序列比对，发现只有3个核苷酸差异，在本发明中可理解为同一个基因的不同水稻品种的差异，然后通过日本晴序列设计引物扩增得到基因序列。
【实施例2】水稻OsBHL1基因表达模式
为了了解OsBHL1基因的表达情况，取H1493(本发明用到的转基因受体材料)不同时期的样品做组织表达模式，结果此基因在剑叶期的表达量最高(图1)，因此后续的取样和检测一般选用剑叶，一方面因为在剑叶中表达量最高，另一方面是因为剑叶的性状比较稳定。
其中所用定量PCR的引物为：
BHL1Q-F:CCGGCAAGAACGGTGGACGA(5'-3')(SEQ ID NO.4)
BHL1Q-R:TGAGCAAGAAGATGGGGATG(5'-3')(SEQ ID NO.5)
【实施例3】OsBHL1基因过表达载体构建和农杆菌介导的遗传转化
1.OsBHL1过表达载体构建
将OsBHL1的ORF两端各截取一段设计引物，加上Bgl II的酶切位点和保护碱基，序列如下：
OEV-F:AGTCAGATCTATGAGGCCTCTGTACCTGC(5'-3')(SEQ ID NO.6)OEV-R:AGTCAGATCTCTAATTGCTCAAAGATGATGAGC(5'-3')(SEQ ID NO.7)
所用载体为pCXUN(由美国Ohio State University的王国梁教授提供)，采用BglII酶切pCXUN载体，将外源片段加A后可以直接连入。根据SEQ ID No.3的序列情况，采用PCR的方法直接扩增ORF，经加A后连入载体。测序验证无误后，所得载体即为OsBHL1基因过表达载体，将其电转入农杆菌EHA105中。挑取单克隆扩大培养，进行PCR验证无误后，加等体积的50％甘油混匀，－70℃保存备用。
2.遗传转化
采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，1994，Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.Plant Journal 6:271-282)将上述OsBHL1基因过表达载体导入粳稻品种H1493。
获得转基因植株25株，用引物OES-F和OES-R检测，其中阳性植株17株，后取T1代混合植株样品提DNA，用Southern检测，单拷贝有11株(图2)。将T1代阳性植株，取剑叶提RNA，反转成cDNA，用定量PCR检测其表达量(图3)。
【实施例4】OsBHL1基因过表达植株的表型分析
1.叶片卷叶指数和直立指数
根据(shi等，2007，Over-expression of rice OsAGO7gene induces upwardcurling of the leaf blade that enhanced erect-leaf habit.Planta 226:99–108)提供的方法，待水稻抽穗期时对其剑叶进行叶片宽度和长度测量，然后利用公式计算其叶片卷曲指数和叶片直立指数。(图4，图5)
叶片卷曲指数LRI(％)＝(LW-LN)/LW*100,其中LW:伸展开的叶边缘之间距离,LN：卷曲状态下的叶边缘之间距离。
叶片直立指数LEI(％)＝Lnl/Lsl*100，其中Lnl：叶尖和叶根部之间的自然距离，Lsl：叶尖和叶根部之间拉直的距离。
结果分析：H1493植株的LRI为0，没有出现卷曲情况，而三个超表达植株出现20％以上不等的LRI，与对照相比具有极显著差异；H1493植株的LET为95.1％，而三个超表达株系都是99％以上，与对照相比具有极显著差异。
2.田间株高测量以及分蘖数的统计
待水稻抽穗期时，拿2米的直尺测量株高，使其底部对着水稻植株地面上最低位，上部对着水稻最高的穗子，然后读取数值，即为植株高度，过表达植株统计了3个株系，每份统计20株，以H1493为对照(图6A)。
结果分析：过表达植株三个株系的株高与对照相比有所下降，并且具有显著或者极显著差异。
待水稻抽穗期时，田间数水稻从底部发出分蘖数，过表达植株统计了3个株系，每份统计20株，以H1493为对照(图6B)。
结果分析：过表达植株三个株系的分蘖数与对照相比有所减少，并且具有极显著差异。
3.对成熟期水稻进行考种
待水稻成熟后，贴着地面将植株用镰刀割掉，晾干后考种，包括穗数、千粒重、结实率。过表达植株统计了3个株系，每份统计10株，以H1493为对照。结果发现与对照相比，过表达植株的穗数增多、结实率下降、千粒重降低(图6C,D,E)。
4.宿主选择性实验
用奶茶杯种过表达植株OE-25和H1493各2株，对角播种，每棵苗子距离2cm，待长至4叶一心时，用纱网套住杯子，放40头褐飞虱，然后每天数每棵苗子上褐飞虱的数目，连续数6天，共20个生物学重复，统计每棵苗子上褐飞虱的数目，求平均值(图7)。
【实施例5】OsBHL1基因过表达植株叶片卷曲的分子机理
1.石蜡切片观察叶片横切面细胞学结构
将过表达株系OE-22，OE-24，OE-25和对照H1493，取抽穗期的剑叶，通过材料固定-脱水与透明-浸蜡与包埋-切片与展片-脱蜡与复水-染色-显微镜下观察，每个株系取3个叶片。与对照相比，过表达植株叶片泡状细胞的数目变少，体积变小了，呈现显著性差异(图8)。
结果分析：由于泡状细胞是一种大的、薄的高度泡状化的细胞，植物在缺水的情况下，泡状细胞由于失水变小，叶片发生卷曲，当水分供给充足时，泡状细胞会从新吸收水分，卷曲的叶片会恢复成平展状，因此泡状细胞是影响叶片卷叶的一个重要因素。而本发明的基因OsBHL1就是通过影响泡状细胞发育来调控叶片卷叶的，因为OsBHL1基因过表达的株系的泡状细胞数目变少，体积变小，并且与对照相比不管数目还是面积都具有极显著差异。因此，OsBHL1基因对泡状细胞是一种负调控机制。
2.叶片卷曲可增加光合作用效率，从而增加叶绿素含量
等水稻长到抽穗期时，用光合测定仪对植株剑叶进行光合作用效率测定，每个株系测30个叶片，求平均值(图6F)，结果发现，过表达植株的叶绿素含量与对照H1493相比明显升高，具有显著性差异，这与叶片卷曲后增加光照面积，增强了光合作用，从而增加了叶绿素含量是相一致的。

Claims (2)

1.水稻细胞质激酶基因OsBHL1在水稻选育中的应用，其特征在于，所述水稻选育为提高水稻叶片卷曲度和直立性以及对褐飞虱的抗性，所述的水稻细胞质激酶基因OsBHL1的cDNA序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种培育抗褐飞虱水稻的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）用多核苷酸转化水稻细胞，所述多核苷酸含有水稻细胞质激酶OsBHL1基因的开放读码框，水稻细胞质激酶OsBHL1基因的cDNA序列如SEQ ID NO.3所示，其开放读码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3的第238碱基到第1416碱基所示；
2）将被转化的水稻细胞再生为水稻；
3）培养再生的水稻并使上述多核苷酸得到过量表达。
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