CN105463075B - 一种基于超亲水微井传感界面检测miRNA的方法 - Google Patents

一种基于超亲水微井传感界面检测miRNA的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于超亲水微井传感界面上检测miRNA的方法，属于材料制备和检测分析技术领域。本方法包括：(1)透明基片表面形成二氧化硅纳米结构，进行疏水修饰，紫外刻蚀得到具有超疏水‑超亲水微井的纳米二氧化硅基底；(2)功能化超亲水微井具有生物亲和性；(3)在功能化的微井中修饰捕获探针，与目标物特异性结合，实现miRNA的定量检测。该方法以二氧化硅作为基底，制备工艺简单、稳定性好，与传统检测方法相比，可将检测信号增强十几倍，可实现miRNA的高效定量超灵敏检测。

Description

一种基于超亲水微井传感界面检测miRNA的方法
技术领域
本发明属于材料制备和检测分析技术领域，涉及在一种新型的传感界面用于miRNA超灵敏检测方法。
背景技术
microRNAs(miRNAs)是一种由19-23个成熟核苷酸组成的小分子非编码RNA，于1993年由Ambros课题组在研究线虫时首次发现，已被证明在生物的生长中起着重要的作用，并在癌症中特异性表达。研究表明，早期检测能有效的提高癌症的治愈率。在早期的癌症检测中，miRNA已成为一种理想的生物标志物。然而由于部分重要的miRNA分子小、丰度低而难以检测，因此敏感的检测miRNA方法的发展是现在迫切需要的。
基于杂交及扩增原理的检测技术被广泛的应用于核酸的检测中，包括Northernblotting、实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)、微阵列芯片及生物传感器。Northernblotting法是经典的探针杂交检测法，灵敏度不高，且耗时耗量。实时荧光定量PCR将荧光基团加入到PCR反应体系中，利用荧光信号的累积实时监测PCR反应过程，从而对起始模板进行定量分析。但对操作人员专业要求较高、不便于携带且对操作过程中的污染较为敏感。微阵列芯片技术能同时测量多个样品，可以实现miRNA的高通量分析，但容易发生交叉反应，测定结果准确度低。而本发明的一种基于超亲水微井传感界面检测miRNA的方法，可将检测信号增强十几倍，基于超疏水-超亲水微井对样品的富集原理，从而实现miRNA的高效定量超灵敏检测。
发明内容
本发明是一种基于功能化的超亲水微井传感界面，在纳米结构表面构建超疏水-超亲水微井区域，为在其上面的溶液达到浓缩富集的作用，提供一种超灵敏检测的方法，可简单、快速、低成本检测miRNA含量。
一种基于超亲水微井传感界面上检测miRNA的方法，其特征在于如下步骤：
(1)在透明基片表面附着二氧化硅超亲水微井；
(2)功能化超亲水微井，使其具有生物亲和性；
(3)在功能化的微井中修饰捕获探针，与目标物特异性结合，完成miRNA定量检测。
具体步骤如下:
1.制备具有二氧化硅纳米结构的基底：将基片清洗干净并用氮气吹干，水平置于燃烧的蜡烛火焰上方，匀速往返移动，即可得到表面附有均匀的纳米烟灰颗粒的基片。然后放入装有氨水和正硅酸四乙酯的气相沉积反应容器中，室温下反应18-24h，在烟灰表面会包裹一层二氧化硅，经过2h的500-600℃的高温煅烧去除烟灰碳核，得到具有纳米二氧化硅结构的基底。
2.超亲水微井的形成：先将二氧化硅基底用十八烷基三氯硅烷进行超疏水修饰，然后覆盖具有微孔图案的掩板，用紫外灯照射30-60min，未被掩盖的微孔处的超疏水结构会被紫外破坏而重新恢复超亲水，就得到周围超疏水、微井处超亲水的二氧化硅基底。
3.功能化超亲水微井：用乙醇作溶剂，加入2％的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，将具有超亲水微井的二氧化硅基底置于溶液中，6-8h后取出，用乙醇反复清洗并烘干，3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷修饰在超亲水微井中。
4.检测miRNA：包括一个界面探针和两条与待检测miRNA适配的DNA链，链C(5’CAAACACCATTATGTTAAC3’)和荧光染料FAM标记的链H(5FAM-5’(T10)-GATCTATTGTGTCACACTCCA3’)。在探针DNA链上有一个环状结构，当没有miRNA时，链C和链H不会与探针结合。先将探针DNA链修饰到超亲水微井中，洗去多余的未修饰上的探针DNA，再将链C、链H和miRNA浓度比为1:1:2的混合液加入到探针DNA修饰的微井中，待反应完成后，洗去多余的未结合的核酸链，用荧光显微镜490nm波长的激发光进行检测。该方法检测miRNA灵敏度高，检测限低，可达到20aM。
本发明有以下优点：检测敏感度高，miRNA含量低达2ng/100μL时都可以检测出结果，比琼脂糖变性胶检测的精度高出十万倍。检测样品用量少。制备简单，材料易得，检测结果稳定。
附图说明：
图1是本发明提供的纳米二氧化硅基底表面正面扫描电子显微镜图片。
图2是本发明提供的纳米二氧化硅基底表面侧面扫描电子显微镜图片。
图3是本发明提供的与普通玻片对比的miRNA含量测定标准曲线图。
具体实施方式：
实施例对本发明作进一步的详细说明
实施例1
取普通载玻片，放入洗液(98％硫酸与30％过氧化氢溶液，3:1混合)浸泡，80℃加热1h。待玻片冷却后取出再依次放入丙酮、乙醇和去离子水中，室温下超声清洗10min，最后用氮气吹净，放入干净的培养皿中备用。将平时用的白色石蜡蜡烛点燃，洗净的载玻片置于蜡烛火焰上方水平匀速移动6s，黑色的烟灰颗粒即可均匀的附着在玻片表面。分别取2mL正硅酸乙酯和2mL氨水放置于密闭容器中，同时放入附着有烟灰的玻片进行气相沉积，室温下反应24h后取出，可得到二氧化硅包裹着的烟灰基底。将样品放入马弗炉550℃煅烧2h，去除烟灰颗粒，得到纳米二氧化硅基底。将二氧化硅基底浸泡在10nM十八烷基三氯硅烷的甲苯溶液中1h，取出后依次用乙醇清洗，烘干后可得到超疏水的二氧化硅基底，掩盖以有微孔的铝板置于100W的紫外灯照射1h，取出铝板后为具有超亲水微井的二氧化硅基底。
将具有超亲水微井的二氧化硅基底浸泡于加入2％3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，轻晃混合均匀，25℃避光反应6h后取出，依次用乙醇去离子水反复清洗，氮气吹干备用。
miRNA-122与许多癌症表达相关，在血清中含量范围可达200aM-20pM，需要检测范围很广的检测方法。与其适配的捕获链DNA(HN-(CH2)6-S-S-(CH2)6-5’(T10)CGCGTTAACATACAATAGAT CGCG3’),微井处滴加2μL氨基修饰的探针DNA序列(1μM)，氨基与环氧基反应，使探针DNA结合在微井中。探针DNA用pH 9.6的碳酸钠缓冲液稀释，偏碱性的反应环境有利于环氧基与氨基的反应，放入4℃的冰箱3天。取出后用磷酸缓冲液反复冲洗干净。
将1μM链C(5’CAAACACCATTATGTTAAC3’)和1μM链H-FAM(5FAM-5’(T10)-GATCTATTGTGTCACACTCCA3’)和按浓度比例1:1011、1:1012、1:10131:1014、1:1015、1:1016稀释浓度为2pM、200fM、20fM、2fM、200aM、20aM的miRNA-122以1:1:2的体积分别混匀，各取2μL加入修饰探针DNA的微井中。所用磷酸缓冲液均为25mM pH7.4的磷酸缓冲液。反应1h后冲洗干净，用荧光显微镜检测荧光信号并绘制荧光关系曲线。以上DNA链及miRNA全部购买自生工生物工程股份有限公司。
实施例2
取石英基片，放入洗液(98％硫酸与30％过氧化氢溶液，3:1混合)浸泡，80℃加热1h。待基片冷却后取出再依次放入丙酮、乙醇和去离子水中，室温下超声清洗10min，最后用氮气吹净，放入干净的培养皿中备用。将平时用的白色石蜡蜡烛点燃，洗净的基片置于蜡烛火焰上方水平匀速移动6s，黑色的烟灰颗粒即可均匀的附着在基片表面。分别取2mL正硅酸乙酯和2mL氨水放置于密闭容器中，同时放入附着有烟灰的基片进行气相沉积，室温下反应24h后取出，可得到二氧化硅包裹着的烟灰基底。将样品放入马弗炉600℃煅烧2h，去除烟灰颗粒，得到纳米二氧化硅基底。将二氧化硅基底浸泡在10nM十八烷基三氯硅烷的甲苯溶液中1h，取出后依次用乙醇清洗，烘干后可得到超疏水的二氧化硅基底，掩盖以有微孔的铝板置于100W的紫外灯照射45min，取出铝板后为具有超亲水微井的二氧化硅基底。
将具有超亲水微井的二氧化硅基底浸泡于加入2％3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，轻晃混合均匀，25℃避光反应6h后取出，依次用乙醇去离子水反复清洗，氮气吹干备用。
miRNA-122与许多癌症表达相关，在血清中含量范围可达200aM-20pM，需要检测范围很广的检测方法。与其适配的捕获链DNA(HN-(CH2)6-S-S-(CH2)6-5’(T10)CGCGTTAACATACAATAGATCGCG3’)，微井处滴加2μL氨基修饰的探针DNA序列(1μM)，氨基与环氧基反应，使探针DNA结合在微井中。探针DNA用pH 9.6的碳酸钠缓冲液稀释，偏碱性的反应环境有利于环氧基与氨基的反应，放入4℃的冰箱3天。取出后用磷酸缓冲液反复冲洗干净。
将1μM链C(5’CAAACACCATTATGTTAAC3’)和1μM链H-FAM(5FAM-5’(T10)-GATCTATTGTGTCACACTCCA3’)和按浓度比例1:1011、1:1012、1:1013、1:1014、1:1015、1:1016稀释浓度为2pM、200fM、20fM、2fM、200aM、20aM的miRNA-122以1:1:2的体积分别混匀，各取2μL加入修饰探针DNA的微井中。所用磷酸缓冲液均为25mM pH7.4的磷酸缓冲液。反应1h后冲洗干净，用荧光显微镜检测荧光信号并绘制荧光关系曲线。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京科技大学
<120> 一种基于超亲水微井传感界面检测miRNA的方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> C链
<400> 1
caaacaccat tatgttaac 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 荧光标记H链
<400> 2
gatctattgt gtcacactcc a 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 捕获探针
<400> 3
cgcgttaaca tacaatagat cgcg 24

Claims (1)

1.一种基于超亲水微井传感界面检测miRNA-122的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括超亲水微井传感界面、用于检测miRNA-122的界面探针、链C和荧光染料FAM标记的链H，
所述界面探针的具体序列为HN-(CH2)6-S-S-(CH2)6-5’(T10)CGCGTTAACATACAATAGATCGCG3’；
所述链C的具体序列为：5’CAAACACCATTATGTTAAC3’；
所述荧光染料FAM标记的链H的具体序列为： 5FAM-5’(T10)-GATCTATTGTGTCACACTCCA3’；
所述超亲水微井传感界面的制备方法包括步骤如下：
(1)在透明基片表面附着二氧化硅超亲水微井：
制备具有二氧化硅纳米结构的基底：将基片清洗干净并用氮气吹干，水平置于燃烧的蜡烛火焰上方，匀速往返移动，得到表面附有均匀的纳米烟灰颗粒的基片；然后放入装有氨水和正硅酸四乙酯的气相沉积反应容器中，室温下反应18-24h，在烟灰表面会包裹一层二氧化硅，经过2 h的500-600℃的高温煅烧去除烟灰碳核，得到具有纳米二氧化硅结构的基底；
超亲水微井的形成：先将二氧化硅基底用十八烷基三氯硅烷进行超疏水修饰，然后覆盖具有微孔图案的掩板，用紫外灯照射 30-60 min，未被掩盖的微孔处的超疏水结构会被紫外破坏而重新恢复超亲水，就得到周围超疏水、微井处超亲水的二氧化硅基底；
(2)功能化超亲水微井，使其具有生物亲和性：
用乙醇作溶剂，加入2%的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，将具有超亲水微井的二氧化硅基底置于溶液中，6-8 h后取出，用乙醇反复清洗并烘干，3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷修饰在超亲水微井中；
所述试剂盒的使用方法具体步骤如下:
在功能化的微井中修饰界面探针，与目标物特异性结合，完成miRNA定量检测：
先将界面探针DNA链修饰到超亲水微井中，洗去多余的未修饰上的界面探针DNA，再将链C、链H和miRNA浓度比为1:1:2的混合液加入到界面探针DNA修饰的微井中，待反应完成后，洗去多余的未结合的核酸链，用荧光显微镜490nm波长的激发光进行检测；在界面探针DNA链上有一个环状结构，当没有miRNA时，链C和链H不会与界面探针结合。
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