CN101464456A - 用表面等离子共振技术检测病毒的方法以及其中使用的芯片 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用表面等离子共振技术(SPR)检测病毒的方法，包括：将待测样品与由SSPE溶液和硫酸葡聚糖溶液组成的缓冲液混合，形成的混合物中含有1－10×SSPE溶液和0.5％－10％硫酸葡聚糖溶液；使该混合物流过SPR生物传感器芯片，所述芯片连接有特异于所述病毒的探针；用SPR测定混合物流过芯片之前和之后相应流池的信号差值；将该信号差值与对照流池的信号差值进行比较，从而确定所述病毒是否存在。本发明方法特别可用于检测人乳头状瘤病毒(HPV)。另外，本发明也提供了可用于上述方法的SPR生物传感器芯片。

Description

用表面等离子共振技术检测病毒的方法以及其中使用的芯片

发明领域

本发明属于病毒检测领域。具体的，涉及一种用表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)检测病毒的方法，该方法特别可用于检测人乳头状瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)。本发明也涉及用于上述方法的改良的SPR生物传感器芯片，以及包含该芯片和核酸探针的试剂盒。

背景技术

表面等离子体共振技术(SPR)是利用在金属膜/液面界面，由光的全反射引起的物理光学现象来分析分子间相互作用的技术。SPR仪由自动采样机械手、高分辨率的CCD照相仪和上面布有一个或多个流池的镀金或镀银SPR生物传感器芯片构成。SPR技术在检测、分析生物分子间的相互作用等方面得到广泛的应用。

SPR技术利用了能够在某些金属(特别是金、银)界面上激发产生的表面等离子波。当入射光以大于临界角的角度入射到金属界面上时，发生全反射，在合适的角度下，入射光的平行矢量与表面等离子波的频率相匹配时，发生共振，能量从入射光转移到表面等离子波中，反射光的反射率表现出急剧衰减(反射光强度最低时所对应的入射角称为“共振角”)。发生共振时的入射角或波长高度依赖于金属表面近表面的折射率。表面上的生物分子的结合会改变此处的折射率，从而引起发生共振的入射角的变化。

通过监测共振角的变化，可以实现实时检测传感芯片表面的生物分子间的相互作用。传统的SPR传感器测量完整的SPR曲线作为入射光角度或者波长的函数，这种模式应用广泛，但通量较低。而高通量的SPR仪可以通过成像系统实现同时检测成千上万个生物分子的相互作用。一个典型的SPR成像装置包括一个p偏振光源和一个随后接收来自SPR生物传感芯片的反射光的探测器。CCD照相仪以成像的方式来收集反射光强度。SPR成像检测以固定入射角的方式来检测时，光强度变化与由生物分子结合到表面后引起的折射率变化成比例。结果，引起的光暗度与结合到探测区的物质的量有关。另外影响SPR成像系统灵敏度的一个因素是光源强度。来自金属表面的信号强度与入射光强度成线性比例，因此相对于发光二极管和卤素灯，优先选择激光光源。

SPR仪是一种光学传感器，可以通过检测折射率的变化来检测金属表面的生物分子的结合。对金属-水界面的探测深度在200nm以内，这使得SPR成为一种比较理想的研究固定的生物分子与溶液中分析物质相互作用的工具。相对于传统的技术如基于荧光或ELISA的技术，SPR技术有如下几个优点：1.因为检测的是折射率，所以分析物质无需任何标记(如放射性或荧光标记)而直接用于检测；2.检测能够实时进行，可以让用户收集动力学数据；3.SPR是一项通用技术，能够检测宽范围的具有不同分子量和亲和力的分析物质。因此，SPR技术是一种研究生物分子相互作用的有力工具。至今，在研究领域内，SPR技术已经用于研究蛋白-肽相互作用、蛋白-DNA相互作用，DNA杂交等。但目前还没有SPR方法用于病毒检测的报道，更没有SPR检测人乳头状瘤病毒(HPV)的报道。

HPV是性传播疾病最常见的原因之一。已经至少分离出200多个型，其中85个型被具体描述过。子宫颈癌是全球最常见的妇女癌症之一。生殖器HPV的感染和子宫颈癌的关系首先报道于上世纪80年代，有报道显示：99.7％的子宫颈鳞状上皮细胞癌与生殖器HPV感染有关。超过35个HPV型与子宫颈上皮瘤形成(CIN)和子宫颈癌的发生有关。依据这些型与子宫颈癌及癌前病变的关系，HPV被分为两组：高危型和低危型。高危型包括16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68等，低危型包括6，11，34，40，42，43，44，54，70等。

HPV分型方法主要有杂交法和以聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，PCR)为基础的检测方法两大类。

传统的杂交法主要有DNA印记法(southern blot)和原位杂交法(in situ hybridization，ISH)等。

Southern blot是HPV基因分析的标准，这项技术曾用于HPV的早期研究，但此方法敏感性低、耗时、需要大量高度纯化的DNA，而且需要新鲜样本，不能用于DNA已降解的组织，故不适合于临床HPV分型的检测应用。原位杂交法ISH能够在组织病理中估计目的核酸或基因的表达，但ISH测定HPV序列的敏感性很低[1]。新型杂交法主要指杂交捕获法。杂交捕获法II(hybrid capture，HCII)原理是DNA双链裂解为单链后与RNA探针结合成RNA-DNA杂交体，并被特异性抗体固定在试管壁或微孔壁上，结合有碱性磷酸酶的多个第2抗体与RNA-DNA杂交体结合，其标记物碱性磷酸酶使酶底物发光，光的强弱对应于碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂合体的含量[2]。该方法不能对HPV进行分型，加上专利的因素，使这种方法的研究、发展和应用受到一定限制。

以PCR为基础的检测方法与杂交法不同的是：以PCR为基础的检测方法是用PCR方法先进行目的基因的扩增，然后再用各种方法进行检测。目前认为以PCR为基础的检测方法是进行HPV DNA检测及分型的最好方法。

1.HPV DNA的PCR扩增：对HPV DNA的扩增主要可以分为型特异PCR和普通PCR。

(1)型特异PCR：型特异PCR是用型特异PCR引物，扩增单个HPV基因型即可确定特定型别的HPV，但这种方法费力，为了检测一个临床样本中HPV DNA的存在，需要分别完成多个型特异的PCR反应。

(2)通用引物PCR：通用引物PCR是使用通用引物来扩增广谱的HPV，引物针对不同HPV型别之间的保守区域。这个保守序列的确定需要来自每个HPV基因型的许多序列。由于在HPV基因组中I1区是最为保守的区，目前一些通常使用的通用引物就针对这个区，用普通PCR进行扩增后对阳性的扩增产物就可以用各种方法进行HPV的分型检测。

(3)实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RQ-PCR)：对于HPV的分型检测，一般的实时荧光定量PCR用型特异性引物，相当于特异PCR，仅多了定量的功能，但用于HPV的分型上，型特异实时PCR的工作量太大，而以分子探针为基础的实时PCR的蝎子引物及探针的有效性需要大量的验证及改良，而且目前实时荧光PCR实验成本比较高，也限制了其广泛应用。

2.PCR产物的分型检测：通用引物PCR的产物需要用各种检测方法进行分型检测，主要有直接测序法、限制性片段长度多态性分析、杂交法以及目前很具影响力的基因芯片法。

(1)PCR产物的直接测序法：直接测序法可以测定PCR产物中的一对引物之间的序列。与GeneBank数据库中的已知序列进行比较确定型别；对于混合感染中同步检测不同序列的敏感性不高，有时由于混合型别的存在使测序时序列无法读出从而无法判断型别，标本中含量少的型别容易被忽略而仅仅检测到占主导地位的基因型。

(2)PCR产物的限制性片段长度多态性分析(PCR—restrictionfragment length polymorphism，PCR-RFLP)：如果不同的HPV在限制性位点上有差异，将DNA特异性酶解，从而产生不同的限制性片段，产生不同的电泳条带模式。就可以根据特定的条带模式判断HPV的型别。这种方法对PCR产物的特异性要求比较高，非特异性条带的出现会导致酶切后分型上的不确定性，所以需要扩增目的片段的通用引物的特异性比较高。

(3)PCR产物的杂交分析：杂交分析是最常用的检测PCR产物序列的方法。型特异杂交法敏感性较高，一次可检测多个PCR产物，并对多重感染的检测能力较高，是目前非常实用的方法。

①微孔板杂交：其具体原理是在PCR引物的5’端标记生物素，将PCR产物与包被有亲和素的微孔板结合，并与含荧光素的特异性探针杂交，酶标记抗荧光素抗体与之结合进行显色反应，通过测定其吸光度来判断结果。这种方法的优点是微板模式的高通量和自动化及设备的应用减少了手工劳动时间[3]。但用特异探针检测每种HPV基因型的鉴定需要大量的PCR产物和各种特异性探针，操作繁琐，引物需要标记。

②反向杂交：反向杂交中较有名的是线性平行杂交(line probeassay，LiPA)，另外还有点杂交(dot blot assay)等。线性杂交是在一个膜条里平行固定了多个探针。用生物素标记的引物扩增后，双链的PCR产物在碱性环境下变性后加在上述平行固定的多个探针的膜上，在杂交和严格的冲洗后，依次加入链霉素生物素复合物和底物，根据探针上产生的紫红色沉淀判断相应的型别。这种方法单步即可检测多种HPV型别，而仅需要少量的PCR产物[4]。该方法敏感性高，可检测出混合感染中的各个型别，而且使用单一设计，每张膜上能同时对几十个PCR产物进行分型，但操作繁琐，难以实现自动化，结果重复性低。

(4)基因芯片(gene chip)，也称为DNA芯片、DNA微阵列(DNAmicroarray)、寡核苷酸阵列(Oligonucleotide array)，其原理是采用原位合成或显微点样技术将许多的DNA探针固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现快速、并行、高效的检测。但是成本昂贵，检测的可靠性、实用性也还有待于验证。

本发明人意外地发现，使用SPR方法对病毒特别是HPV进行分型检测，灵敏度高，自动化程度高，不必对待检测物进行任何标记，能够实现高通量和平行实时检测，能检测病毒的具体型别，是检测各病毒基因型的强有力工具。

本发明的方法还可用于在工业实验室中检测病毒，检测出的病毒可以进行各种工业化应用，例如用于制备减毒或灭活疫苗。

发明概述

在第一方面，本发明提供了一种SPR生物传感器芯片，该芯片基质为玻璃片，玻璃片表面镀有金属膜，金属膜表面经化学修饰形成巯基烃类单分子层，并且巯基烃类的末端官能团与葡聚糖相连。

其中所述金属膜由选自铜、银、铝和金的金属构成，优选为金。

其中所述巯基烃类选自分子式为HS(CH₂)_mR和HS(CH₂)_nR’的混合巯基烃类、分子式为R(CH₂)_mS-S(CH₂)_nR’的不对称双烃基二硫化物和分子式为R(CH₂)_mS(CH₂)_nR’的不对称双烃基硫化物，其中n和m代表亚甲基单位的数目，其为8-16的整数，R和R’代表烃链的末端，其为-CH₃、-OH、-COOH或NH₂等。优选地，巯基烃类为巯基十一醇和巯基十六醇的混合巯基烃类、(CH₂)₁₁OH-S-S-(CH₂)₁₆OH或(CH₂)₁₁OH-S-(CH₂)₁₆COOH。

在第二方面，本发明提供了一种使用表面等离子共振技术检测病毒的方法，包括步骤：

(1)将待测样品与由SSPE溶液和硫酸葡聚糖溶液组成的缓冲液混合，形成的混合物中含有1-10×SSPE溶液和0.5％-10％硫酸葡聚糖溶液；

(2)使该混合物流过SPR生物传感器芯片的流池，所述流池连接有特异于所述病毒的探针；

(3)用SPR测定混合物流过芯片之前和之后相应流池的信号差值；和

(4)根据上述信号差值确定所述病毒是否存在。

在上述方法中，所述SPR生物传感器芯片还可包含对照流池，其连接了与待测病毒不相关的探针，或者不连接任何探针而作为空白对照，并且步骤(3)还包括用SPR测定混合物流过芯片之前和之后对照流池的信号差值。

在上述方法的步骤(4)中确定所述病毒是否存在的依据可以为：如果对照流池的信号差值>0，待测流池的信号差值与对照流池的信号差值之比>2，并且该待测流池的信号差值绝对值>200RU，则可认定为阳性结果；如果对照流池的信号差值<0，待测流池的信号差值绝对值>200RU，则也可认定为阳性结果。

所述方法优选可用于检测选自乙肝病毒、SARS病毒、禽流感病毒、人类免疫缺陷病毒和人乳头状瘤病毒的病毒，最优选为人乳头状瘤病毒。

优选地，其中步骤(1)中形成的混合物中含有2-8×SSPE溶液，优选2.5-5×SSPE溶液。

优选地，其中步骤(1)中形成的混合物中含有1％-8％硫酸葡聚糖溶液，优选2.5％-5％硫酸葡聚糖溶液。

最优选地，其中步骤(1)中形成的混合物中含有5×SSPE溶液和5％硫酸葡聚糖溶液。

优选地，上述方法中所用的SPR生物传感器芯片是通过下述方法从本发明第一方面的SPR生物传感器芯片获得：将本发明第一方面的SPR生物传感器芯片的硫酸葡聚糖进行表面活化，与链霉亲和素连接，再连接生物素标记的探针。或者，优选地所述SPR生物传感器芯片是通过下述方法获得：将裸金片与巯基修饰的探针直接反应，制备探针包被的SPR生物传感器芯片，其中所述裸金片的基质为玻璃片，表面镀上选自铜膜、银膜、铝膜和金膜的金属膜。

优选地，上述方法中所用的探针选自SEQ ID NO：1-54，特别优选选自SEQ ID NO：8、10、12、14、37和45。

上述方法中，所述SPR生物传感器芯片的不同流池中可以连接相同的探针，用于检测一种病毒。或者，所述SPR生物传感器芯片的不同流池中可以连接不同的探针，用于同时检测几种病毒。

另外，在所述方法的步骤(1)之前可以将待测样品扩增。

在所述方法中，所述待测样品优选为宫颈样品。

在第三方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明第一方面的SPR生物传感器芯片、核酸探针和说明书，其中所述核酸探针选自SEQ ID NO：1-54，优选选自SEQ ID NO：8、10、12、14、37和45。

发明详述

本发明实现了使用表面等离子共振技术(SPR)对多种病毒的检测，特别是对多种基因型的人乳头状瘤病毒(HPV)的检测。将病毒特异性的探针或其他配体(如抗体等)包被在一种SPR生物传感器芯片上，含有病毒分析物的液体流过传感器芯片表面，分子间发生特异性结合时可引起传感器表面折射率的改变，从而导致SPR信号的改变，通过检测SPR信号改变对病毒进行定性、定量或分型检测。

本发明方法可以用于检测HPV并对其进行分型。现有技术已知，根据与子宫颈癌及癌前病变的关系，HPV被分为高危型和低危型。高危型包括16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68等，低危型包括6，11，34，40，42，43，44，54，70等。特异于这些型的核酸探针都是现有技术已知的，将这些核酸探针与芯片流池连接，根据相应流池中SPR信号的变化就可确定对应于所述核酸探针的特定型HPV是否存在于待测样品中。通常，芯片的不同流池中连接不同的特异性核酸探针，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24种不同的特异性核酸探针，可以检测24个HPV基因型的一种、几种或全部。使包含待测HPV的液体流过芯片表面，测量各个流池中液体流过前后的SPR信号变化，据此确定与各流池所连接的探针相对应的特定型HPV是否存在。根据该方法，可以同时检测并分型多种HPV型，并且该方法还可以实时进行。另外，SPR生物传感器芯片的不同流池中可以连接相同的探针，从而只检测一种病毒，例如一种HPV型。

芯片上所使用的HPV核酸探针包括DNA探针、RNA探针或PNA探针。DNA探针长度一般为20-60nt。DNA探针5’端可连接与待检测区域不相关的核酸序列以提高杂交信号，不相关的核酸序列包括复杂的序列，如随机生成的序列，也可以是简单重复序列，如polyA，polyT，polyC和polyG，也可以不连接。为了将DNA探针包被到传感器芯片表面，探针的一端(5’端或3’端)需进行标记，标记物包括但不限于巯基，生物素，氨基等。每一个芯片上可以包被多个探针，能够用于检测24个HPV基因型的一种，几种，或全部。

另外，本发明人发现了新的特异于某些HPV型的核酸，它们可以作为探针用于本发明的方法中，获得较好的效果。表1给出了这些探针的序列，序列标识号及其与HPV型的对应关系。

表1

 

名称	所对应的HPV型	序列	SEQ ID NO
				探针1	6	ATTATGTGCATCCKTAACTACATCTTCCAC	1
探针2	6	GCATCCkTAACTACATCTTCCAC	2
				探针3	11	ACTATGTGCATMTGTGTCTAAATCTGCTACa	3
探针4	11	ACTATGTGCATMTGYGTCTAMATCTGCTACa	4
				探针5	11	GCATmTGTGTCTAAATCTGCTAC	5
探针6	11	GCATMTGYGTCTAMATCTGCTAC	6
				探针7	16	CATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAMCTAC	7
探针8	16	GCTGCCATATCTACTTCAGAAmct	8
				探针9	18	TTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAA	9
探针10	18	TCTCCTGTACCTGGGCAATA	10
				探针11	31	tgtgctgcaattgcaaacagtgatactaca	11
探针12	31	gctgcaattgcaaacagtgatac	12
				探针13	33	Gactttatgcacacaagtaactagtgacagt	13
探针14	33	tttatgcacacaagtaactagtgac	14
				探针15	34	AGGTACACAATCCACAAGTACAACTGCACC	15
探针16	34	CAATCCACAAGTACAACTGCAC	16
				探针17	34	TACAACTGCACCATATGCAAAC	17
探针18	35	gtctgtgtgttctgctgtgtctwctagtga	18
				探针19	35	gtgttctgctgtgtctwctagtg	19
探针20	39	atCTACCTCTATAGAGTCTTCCATACCTTCTAca	20
				探针21	39	cTACCTCTATAGAGTCTTCCATACC	21
探针22	40	CACACAGTCCCCCACACCAAcc	22
				探针23	40	CCCACACCAACCCCATATAATAAC	23
探针24	42	TGTGTGCCACTGCAACATCTGGTGAT	24
				探针25	42	CCACTGCAACATCTGGTGAT	25
探针26	43	CTCTACTGACCCTACTGTGCCCAGTA	26
				探针27	43	tgACCCTACTGTGCCCAgta	27
探针28	44	GCCACTACACAGTCCCCTCCGTCTa	28
				探针29	44	CAGTCCCCTCCGTCTacatatac	29
探针30	44	CAGTCCCCTCCGTCTacata	30
				探针31	45	CCTCTACACAAAATCCTGTGCCARRTACA	31
探针32	45	cACAAAATCCTGTGCCArrTA	32
				探针33	51	TATTAGCACTGCCACTGCTGCGGTTT	33
探针34	51	ctaTTAGCACTGCCACTGCT	34
				探针35	51	ccCAACATTTACTCCAAGTAACTt	35

 

探针36	52	GACTTTATGTGCTGARGTKAAAAAGGAAAGC	36
				探针37	52	TGCTGArGTkAAAAAGGAAAGCa	37
探针38	53	GACTCTTTCYGCAACCACACAGTCTATGTC	38
				探针39	53	CAACCACACAGTCTATGTctaca	39
探针40	54	CTACAGCATCCACGCAGGATAGCTT	40
				探针41	54	TACAGCATCCACGCAGGATAG	41
探针42	56	catGACTATTAGTACTGCTACAGAACAGTTAAGt	42
				探针43	56	agTACTGCTACAGAACAGTTAAGta	43
探针44	58	gaCATTATGCACTGAAGTAAMTAAGGAAGGTAca	44
				探针45	58	CACTGAAGTAACTAAGGAAGGtac	45
探针46	59	tgtgTGCTTCTACTACTKCTTCTATTCCTAATGT	46
				探针47	59	TTCCTAATGTatacacacctaccag	47
探针48	66	tgacTATTAATGCAGCTAAAAGCACATTAACTAAa	48
				探针49	66	cTATTAATGCAGCTAAAAGCACATT	49
探针50	68	ACTACTACAGACTCTACTGTACCAGCTGTG	50
				探针51	68	TCTACTGTACCAGCTGTGtatga	51
探针52	70	TGCCTGCACCGAAACGGCCATACCTGCTGT	52
				探针53	70	attgTCTGCCTGCACCGAAA	53
探针54	70	cTGCTGTATATAGCCCTACAAAGt	54

含有待测样品(例如HPV)的液体流过传感器芯片表面，杂交在SPR仪上进行，含有待测样品的液体包括分析物和缓冲液。分析物包括DNA提取物、RNA提取物或PCR产物，将它们与缓冲液依照不同比例混合，加热变性或者不变性，进样与探针包被的传感器芯片反应，杂交温度应30℃以上。杂交可用静止杂交和流动杂交两种方式进行，静止杂交中将上样液加到芯片上以后，上样液静止不流动。流动杂交中上样液以不高于50ul/min的流速流过芯片表面完成杂交。杂交后可根据需要注射一定体积的洗涤液洗涤芯片表面清除非特异结合，也可以不洗涤。杂交反应信号以谐振角度毫度(m°)为单位或者以RU为单位。

本发明人进一步优化了缓冲液的成分，使得含有待测样品的液体含有1-10×SSPE溶液(NaH₂PO₄，0.15M；NaCl，2.25M；EDTA，0.015M)和0.5％-10％硫酸葡聚糖溶液，极大提高杂交信号，提高了杂交速度。含有待测样品的液体优选含有2-8×SSPE溶液，更优选2.5-5×SSPE溶液，最优选5×SSPE溶液。含有待测样品的液体优选含有1％-8％硫酸葡聚糖溶液，更优选2.5％-5％硫酸葡聚糖溶液，最优选5％硫酸葡聚糖溶液。

一般情况下，杂交之前记录一个SPR信号值，杂交之后再记录一个SPR信号值。根据两个信号值的不同来确定某个基因型HPV的存在。当样本和某型HPV检测探针杂交信号值超过阴性质控探针信号值，且具有显著性差异时，即可判定本样品中该型HPV为阳性。优选地，如果阴性对照信号>0，某流池产生的信号明显高于阴性对照信号，即信噪比>2，该流池产生的信号绝对值>200RU，则可认定为阳性结果；如果阴性对照信号<0，某流池产生的信号绝对值>200RU，则也可认定为阳性结果。

待测样品可以是含有待测病毒的任何样品。这些样品是本领域所熟知的。在检测HPV的情况下，待测样品可以是宫颈样品，优选直接从宫颈样品中提取的核酸或经过PCR扩增的核酸。PCR扩增后的核酸可以是双链DNA，也可以是单链DNA。单链DNA的PCR扩增使用改进了的GP5d+/GP6d+通用引物，该改进方法是将一定长度的无关序列连接到GP5d+或/GP6d+的5’端，提高一条引物的退火温度。单链DNA的扩增使用不对称PCR的方法，即先在较低的退火温度下扩增一定的循环数，扩增出一定数量的单链，再在较高的退火温度下扩增一定的循环数，扩增大量的单链。

在本发明方法中使用的SPR传感器芯片可以是现有技术已知的SPR传感器芯片，这些芯片在现有技术文献中描述或是可商购获得的。

另外，本发明也提供了一种改良的SPR传感器芯片，该芯片基质为玻璃片，玻璃片表面镀上金属膜(可以是铜膜，银膜，铝膜或者金膜)形成裸金片。用强氧化剂或者等离子刻蚀法清洗裸金片，然后用超纯水和除气的乙醇清洗表面，接着将洁净的裸金片浸入巯基烃类化合物的乙醇溶液中，在洁净的金表面上形成巯基烃类的单种成分或混合成分的自组装单分子层(SAM)。在合适的条件下使SAM表面暴露的的末端官能团(-OH，-COOH等)被葡聚糖修饰。本发明中，可以用环氧活化方法联接葡聚糖。具体讲，使用环氧氯丙烷与十一醇反应，生成环氧化合物，然后用葡聚糖与固定了环氧氯丙烷的传感器芯片表面反应，形成葡聚糖修饰的表面。为了能够更好的与配体反应，可通过使所述修饰的芯片与溴乙酸溶液反应将葡聚糖表面羧甲基化。将NHS和EDC的水溶液通过葡聚糖修饰的传感器芯片，使SAM表面的末端官能团重新暴露出来，从而使芯片表面被活化。注射pH值为弱酸性的链霉亲和素(SA)的醋酸缓冲液，以此反应来联接配体SA，最后以弱碱性的乙醇胺溶液封闭残存的活性位点。

一个SA分子可以结合多个生物素分子，这样将5’标记有生物素的核酸(包括DNA、RNA或PNA)探针分子的溶液通过芯片表面，探针就被包被到了芯片上。巯基(SH)修饰的探针可以直接在金膜上形成单分子层，完成探针的包被。

本发明的SPR生物传感器芯片的具体制备过程如下：

(一)生物素标记探针传感器芯片的制备

1，传感器芯片的葡聚糖修饰

a)裸金片的清洗

首先用强氧化剂(H₂SO₄:H₂O₂)或者等离子刻蚀法清洗裸金片，然后用超纯水和除气的乙醇清洗表面，之后以纯氮气流吹干。

b)自组装单分子层(SAM)的制备

在洁净的金表面上形成巯基烃类的单种成分或混合成分的自组装单分子层(SAM)。在金表面制备SAM的过程是：将洁净的裸金片浸入含1～10mM巯基烃类化合物的乙醇溶液中，室温下孵育12～18hr。

混合单分子层的合成有3个简便方法：

(1)混合烃基硫醇(HS(CH₂)_mR+HS(CH₂)_nR′)从溶液中的共吸附

(2)不对称双烃基二硫化物(R(CH₂)_mS-S(CH₂)_nR’)的吸附

(3)不对称双烃基硫化物(R(CH₂)_mS(CH₂)_nR’)的吸附，

其中n和m代表亚甲基单位的数目(范围是8-16)，R和R’代表烃链的末端(-CH₃，-OH，-COOH，NH₂等)。

c)自组装单分子层(SAM)的葡聚糖修饰

自组装单分子层形成后的修饰方法非常重要，因为这关系到表面是否能够有效引入具有生物学意义的复杂配基和大分子。在合适的反应条件下，SAM表面暴露的末端官能团(-OH，-COOH)，先联接反应中间体葡聚糖，然后再联接到配体分子上。

作为例子，本发明采用环氧活化方法联接葡聚糖。具体讲，使用～1mol·L^-1环氧氯丙烷与十一醇反应4h，生成环氧化合物，然后用100-500mg/ml的葡聚糖与固定了环氧氯丙烷的传感器芯片表面在20-37℃下反应15-24h，形成葡聚糖修饰的表面。为了能够更好的与配体反应，葡聚糖表面需要羧甲基化：将前面修饰的芯片浸入0.5-2mol·L^-1溴乙酸溶液中反应10-20h即可。

2，链霉亲和素(SA)包被

在葡聚糖修饰的传感芯片上进行SA的固定：把70ul含30-70mM NHS和100-300mM EDC的水溶液注射到葡聚糖修饰的传感器芯片上进行表面活化后，再注射含有1-200ug/ml SA的醋酸缓冲液(10mM，pH3.5-5.5)，以此反应来联接配体SA，最后以70ul 0.5-5M乙醇胺溶液(pH8.0-9.0)封闭残存的活性位点。

3，生物素标记的探针联接

准备生物素标记的不同HPV基因型特异的探针，溶解在缓冲液(0.01M HEPES，0.15M NaCl，10mM MgCl₂，pH7.4)中，探针浓度为0.1-1uM。反应在SPR仪上进行，进样100ul，进样的流速5ul/min。使探针与传感器芯片表面包被的链霉素进行反应，将不同探针分别包被在传感器芯片不同的流池中，这样生物素标记的探针就连接到了芯片上，可以在SPR仪器上进行下一步的杂交检测。

(二)巯基标记探针传感器芯片的制备

在30％H₂O₂、30％NH₃和milliQ水以1:1:5混合的溶液中，裸金片洗涤10min，然后彻底用milliQ水洗净。将洗涤过的裸金片浸泡在1ml含1uM巯基探针的固定液(KH₂PO₄1M，pH3.8)中，室温下孵育2hr。用milliQ水清洗后，再加1ml(1mM)的巯基封闭剂巯基己醇(MCH)在室温黑暗下孵育1hr。水洗，晾干或氮气吹干。安在塑料支架上，传入SPR仪中，准备用于杂交。

附图说明

图1表示实施例6中的SPR检测结果，其中FC1-FC4分别对应芯片上的流池1-4，其上分别连接了寡核苷酸探针oligoT(生物素5’-TTTTTTTTTT)、探针8、10和45。图下面的表中给出了FC1-FC4的参数。图中波峰左侧星号标出的点表示进样前的SPR信号测量值，右侧星号标出的点表示进样后的SPR信号测量值，表中最后四行的“RelResp”给出了各流池中进样前后的信号差值。

图2表示实施例7中的SPR检测结果，其中FC1-FC4分别对应芯片上的流池1-4，其上分别连接了寡核苷酸探针oligoT(生物素5’-TTTTTTTTTT)(作为对照)、探针12、14和37。图下面的表中给出了FC1-FC4的参数。图中波峰左侧星号标出的点表示进样前的SPR信号测量值，右侧星号标出的点表示进样后的SPR信号测量值，表中最后四行的“RelResp”给出了各流池中进样前后的信号差值。

实施例

下面使用实施例对本发明进行更直观详细的描述，其仅是示例性的，但并不用于限制本发明的范围。

实施例1：传感芯片的制备

1.包被前金膜的表面清洁

(1)每张芯片加入2ml丙酮浸泡3min，然后超纯水冲洗干净；

(2)每张芯片加入2ml无水乙醇浸泡3min，超纯水冲洗干净，N₂吹干；

(3)每张芯片加入2ml pironha溶液浸泡2min，然后吸出pironha溶液，加入新鲜pironha溶液，pironha共加样3次，再用超纯水冲洗干净；

(4)每张芯片加入2ml超纯水浸泡震荡3次，每次3min；无水乙醇浸泡震荡3次(分析纯2次，色谱纯1次)，每次3min，N₂吹干。

注：步骤(1)-(3)在玻璃器皿中进行，步骤(4)在塑料孔板中进行。

2.巯基十一醇和巯基十六醇的单分子层修饰

(1)每张芯片滴加巯基十一醇和巯基十六醇的混合溶液2ml(其中巯基十一醇和巯基十六醇的浓度各为2.5mM)，自组装20h。(硫醇溶液应新鲜配制，反应在玻璃器皿中进行)。

(2)取出芯片用超纯水冲洗干净，然后用无水乙醇浸泡震荡5次(分析纯3次，色谱纯2次)，每次3min，N₂吹干。

3.环氧氯丙烷修饰

(1)每张芯片加入0.6M环氧氯丙烷溶液1ml反应4h，(环氧氯丙烷溶液应新鲜配制，反应在玻璃容器中进行)。

(2)取出芯片用超纯水冲洗干净，然后用超纯水浸泡震荡3次，每次3min；无水乙醇浸泡震荡3次(分析纯2次，色谱纯1次)，每次3min；再用超纯水浸泡震荡3次，每次3min，N2吹干。

4.葡聚糖修饰

(1)每张芯片加300mg/ml葡聚糖溶液100μl，反应20h，(反应在玻璃容器中进行，在芯片与玻璃之间垫上称量纸，避免芯片被葡聚糖粘在玻璃上)

(2)取出芯片用超纯水冲洗芯片，然后用超纯水浸泡震荡10次，每次3min，N2吹干。

5.葡聚糖羧甲基化

(1)每张芯片加1M溴乙酸溶液1ml，反应16h。然后吸出溴乙酸溶液，加入新鲜溴乙酸溶液，溴乙酸溶液共加样3次，每次反应16h。(反应在塑料容器中进行)

(2)取出芯片用超纯水冲洗芯片，然后用超纯水浸泡震荡10次，每次3min。N₂吹干。

注：芯片清洗振荡过程均在孔板中进行。

6.链霉亲和素SA的包被

将葡聚糖羧甲基化的SPR生物芯片装入Biacore 3000 SPR仪(Biacore公司)。

流速：5ul/min

1)注入70ul 1:1混合(用之前现用现配)的EDC/NHS混合液；

2)注入100ul pH4.5的20ug/ml的链霉亲和素；

3)注入70ul乙醇胺进行封闭，平衡1小时；

实施例2：传感芯片的制备

将实施例1的2(1)步骤中的巯基十一醇和巯基十六醇的混合溶液改为(CH₂)₁₁OH-S-S-(CH₂)₁₆OH溶液，其他步骤与实施例1相同。

实施例3：传感芯片的制备

将实施例1的2(1)步骤中的巯基十一醇和巯基十六醇的混合溶液改为(CH₂)₁₁OH-S-(CH₂)₁₆COOH溶液，其他步骤与实施例1相同。

实施例4：包被HPV16、18、58型特异探针到SPR生物传感器芯片

1.选取5’端标记生物素的寡核苷酸探针oligoT(生物素5’-TTTTTTTTTT)、探针8、10和45用1×缓冲液(HEPES，0.01M；NaCl，0.15M；MgCl₂，10mM；pH7.4)配制成0.4uM的溶液。其中探针8、10、45分别特异性地检测HPV16、18、58基因型。

2.各取上述探针溶液100ul分别注入实施例1制备的芯片的1、2、3、4流池，流速：5ul/min。

3.将注入速度改为20ul/min，用100ul洗涤缓冲液(Trisbase0.1M，NaCl 0.15M，pH7.5)冲洗各流池，重复3次。则该芯片上1、2、3、4流池包被的探针分别对应oligoT(作为对照)、HPV16型、HPV18型、HPV58型。

实施例5：包被HPV31、33、52型特异探针到SPR芯片

将实施例4选取的探针改为5’端标记生物素的寡核苷酸探针oligoT(生物素5’-TTTTTTTTTT)(作为对照)、探针12、14和37，其中探针12、14和37分别特异性地检测HPV31、33、52基因型。其他步骤同实施例4。

实施例6：SPR技术检测HPV16、18、58基因型

1.反应样品制备

1.1样品DNA提取

待测样品为从子宫颈采样的阴道拭子，经过预处理后，用合适的方法从拭子采样中提取DNA用于下一步的扩增反应。

1.2待测样品的PCR扩增

按以下方案配制反应体系，10×PCR缓冲液(不含MgCl₂)5ul，25mM MgCl₂ 5ul，2.5mM dNTP 4ul，5U/ul DNA聚合酶0.5ul，20uM引物5ul，引物序列分别为5’-TTCTCGGATGgtcactagcttttkttachgtkgtdgatacyac-3’(SEQ ID NO：55)和5’-GAAAHATAAAYTGYAADTCATAYTC-3’(SEQ ID NO：56)，DNA模板1ul，加水将体系补足到50ul。

使用ABI9700扩增仪扩增。反应程序如下：

94℃，3min；

94℃ 1min，48℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环；

94℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min，共20个循环；

72℃ 7min，4℃保持。

2.在SPR仪上进行杂交检测

将实施例4包被的芯片装入SPR仪。将以上50ul PCR产物用纯净水稀释到100ul，将该稀释液与15×SSPE(NaH₂PO₄ 0.15M；NaCl，2.25M；EDTA，0.015M)，15％硫酸葡聚糖三者以1:1:1(体积比)混匀，95℃加热变性3min，即制成300ul上样液，此上样液中含5×SSPE，5％硫酸葡聚糖。将上样液平均分成4份，并行对四个流池进行上样，流速5ul/min，温度40℃。杂交反应信号以RU为单位，根据上样液通入后的信号与通入前信号的差值即是该样品所产生的信号，以包被有oligodT探针流池的信号为阴性对照。

3.结果的判读

如图1所示，对照流池1(FC1)信号差值为99.7，流池4(FC4)信号差值为1117.4，信噪比大于2，流池4的信号差值绝对值>200RU，而流池2(FC2)和流池3(FC3)的信号差值绝对值<200RU，故该样品HPV58为阳性，则该样品中含有HPV58，但不含有HPV16和18。

对该样品DNA的PCR测序结果与上述结果一致。

实施例7：SPR技术检测HPV31，33，52基因型

使用实施例5包被的芯片，样品为来自另一患者的从子宫颈采样的阴道拭子。其他步骤同实施例6。结果如图2所示，阴性对照流池1(FC1)的信号差值为70.1，流池3(FC3)的信号差值为1333.7，信噪比大于2，信号绝对值>200RU，而流池2(FC2)和流池4(FC4)的信号差值绝对值<200RU，故该样品HPV11为阳性，则该样品中含有HPV33，但不含有HPV31和52。

对该样品DNA的PCR测序进一步证实了上述结果。

实施例8：SPR技术检测HPV16、18、58基因型

将50ul PCR产物(与实施例6的样品相同)用纯净水稀释到100ul，将该稀释液与15×SSPE(NaH₂PO₄ 0.15M；NaCl，2.25M；EDTA，0.015M)，15％硫酸葡聚糖三者按合适的比例混合，使形成的上样液中含有2.5×SSPE和2.5％硫酸葡聚糖。其他步骤同实施例6。实验结果与实施例6相似，流池4的信号差值绝对值大于200RU，并且与流池1的信号差值之比大于2，而流池2和3的信号差值绝对值<200RU，从而表明该待测样品中含有HPV58基因型，但不含有HPV16和18基因型。

参考文献

[1]Hesselink AT，van-den-Brule AJ，Brink AA，etal.Comparison of hybrid capture 2 with in situ hybridizationfor the detection of high-risk human papillomavirus in liquidbased cervical samples.Cancer，2004，102(1)：11-18.

[2]Petry KU.Menton S.Menton M，et al.Inclusion of HPVtesting in routine cervical cancer screening for women above29 years in Germany：results for 8466 patients.Br J Cancer，2003.88(10)：1570-1577.

[3]Kobashi G，Hata A，Ohta K，et al.A1166C variant ofsngiotensin II type 1 recepto rgene is associated with severehypertension in pregnancy independently of T235 variant ofangiotensinogen gene.J Hunl Genet，2004，49(4)：182-186.

[4]Jin W，Liu Y，Sheng HH，et al.Single nucleotidepolymorphisms in promoter of angiotensin II type 1 receptor geneassociated wit hessential hypertension and coronary heartdisease in Chinese population.Aeta Pharmacol Sin，2003，24(11)：1083-1088.

序列表

<110>北京赛德创生物技术有限公司

<120>用表面等离子共振技术检测病毒的方法以及其中使用的芯片

<130>IDC070109

<160>56

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(14)

<223>k＝g或t

<400>1

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(7)

<223>k＝g或t

<400>2

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>m＝a或c

<400>3

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>m＝a或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

<223>y＝c或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>m＝a或c

<400>4

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>m＝a或c

<400>5

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>m＝a或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>y＝c或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(14)

<223>m＝a或c

<400>6

<210>7

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(30)..(30)

<223>m＝a或c

<400>7

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(22)

<223>m＝a或c

<400>8

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<400>9

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<400>10

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<400>11

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<400>12

<210>13

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<400>13

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<400>14

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<400>15

<210>16

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<400>16

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<400>17

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>w＝a或t

<400>18

<210>19

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(17)

<223>w＝a或t

<400>19

<210>20

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<400>20

<210>21

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<400>21

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<400>22

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<400>23

<210>24

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<400>24

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<400>25

<210>26

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<400>26

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<400>27

<210>28

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<400>28

<210>29

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<400>29

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<400>30

<210>31

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(25)

<223>r＝a或g

<400>31

<210>32

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(19)

<223>r＝a或g

<400>32

<210>33

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<400>33

<210>34

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<400>34

<210>35

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<400>35

<210>36

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)..(19)

<223>k＝g或t

<400>36

<210>37

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(7)

<223>r＝a或g

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>k＝g或t

<400>37

<210>38

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>y＝c或t

<400>38

<210>39

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<400>39

<210>40

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<400>40

<210>41

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<400>41

<210>42

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<400>42

<210>43

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<400>43

<210>44

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>m＝a或c

<400>44

<210>45

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<400>45

<210>46

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>k＝g或t

<400>46

<210>47

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<400>47

<210>48

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<400>48

<210>49

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<400>49

<210>50

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<400>50

<210>51

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<400>51

<210>52

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<400>52

<210>53

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<400>53

<210>54

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<400>54

<210>55

<211>43

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>k＝g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(29)..(29)

<223>h＝a、c或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(32)..(32)

<223>k＝g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(35)..(35)

<223>d＝g、a或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(41)..(41)

<223>y＝c或t

<400>55

<210>56

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>h＝a、t或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(11)

<223>y＝t或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(14)

<223>y＝t或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(17)

<223>d＝g、t或a

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>y＝t或c

<400>56

Claims (20)

1.一种SPR生物传感器芯片，该芯片基质为玻璃片，玻璃片表面镀有金属膜，金属膜表面经化学修饰形成巯基烃类单分子层，并且巯基烃类的末端官能团与葡聚糖相连。

2.权利要求1的SPR生物传感器芯片，其中所述金属膜由选自铜、银、铝和金的金属构成，优选为金。

3.权利要求1或2的SPR生物传感器芯片，其中巯基烃类选自分子式为HS(CH₂)_mR和HS(CH₂)_nR’的混合巯基烃类、分子式为R(CH₂)_mS-S(CH₂)_nR’的不对称双烃基二硫化物和分子式为R(CH₂)_mS(CH₂)_nR’的不对称双烃基硫化物，其中n和m代表亚甲基单位的数目，其为8-16的整数，R和R’代表烃链的末端，其为-CH₃、-OH、-COOH或NH₂。

4.权利要求3的SPR生物传感器芯片，其中巯基烃类为巯基十一醇和巯基十六醇的混合巯基烃类、(CH₂)₁₁OH-S-S-(CH₂)₁₆OH或(CH₂)₁₁OH-S-(CH₂)₁₆COOH。

5.一种使用表面等离子共振技术检测病毒的方法，包括步骤：(1)将待测样品与由SSPE溶液和硫酸葡聚糖溶液组成的缓冲液混合，形成的混合物中含有1-10×SSPE溶液和0.5％-10％硫酸葡聚糖溶液；

(2)使该混合物流过SPR生物传感器芯片的流池，所述流池连接有特异于所述病毒的探针；

(3)用SPR测定混合物流过芯片之前和之后相应流池的信号差值；和

(4)根据上述信号差值确定所述病毒是否存在。

6.权利要求5的方法，其中所述SPR生物传感器芯片还包含对照流池，其连接了与待测病毒不相关的探针，或者不连接任何探针而作为空白对照，并且步骤(3)还包括用SPR测定混合物流过芯片之前和之后对照流池的信号差值。

7.权利要求6的方法，其中步骤(4)的确定依据为：如果对照流池的信号差值>0，待测流池的信号差值与对照流池的信号差值之比>2，并且该待测流池的信号差值绝对值>200RU，则可认定为阳性结果；如果对照流池的信号差值<0，待测流池的信号差值绝对值>200RU，则也可认定为阳性结果。

8.权利要求5-7中任一项的方法，其中所述病毒选自乙肝病毒、SARS病毒、禽流感病毒、人类免疫缺陷病毒和人乳头状瘤病毒，优选为人乳头状瘤病毒。

9.权利要求5-8中任一项的方法，其中步骤(1)中形成的混合物中含有2-8×SSPE溶液，优选2.5-5×SSPE溶液。

10.权利要求5-8中任一项的方法，其中步骤(1)中形成的混合物中含有1％-8％硫酸葡聚糖溶液，优选2.5％-5％硫酸葡聚糖溶液。

11.权利要求5-8中任一项的方法，其中步骤(1)中形成的混合物中含有5×SSPE溶液和5％硫酸葡聚糖溶液。

12.权利要求5-8中任一项的方法，其中所述SPR生物传感器芯片是通过下述方法从权利要求1-4中任一项的SPR生物传感器芯片获得：将权利要求1-4中任一项的SPR生物传感器芯片的硫酸葡聚糖进行表面活化，与链霉亲和素连接，再连接生物素标记的探针。

13.权利要求8的方法，其中所述特异于所述病毒的探针选自SEQID NO：1-54。

14.权利要求13的方法，其中所述特异于所述病毒的探针选自SEQID NO：8、10、12、14、37和45。

15.权利要求5-8中任一项的方法，其中所述SPR生物传感器芯片是通过下述方法获得：将裸金片与巯基修饰的探针直接反应，制备探针包被的SPR生物传感器芯片，其中所述裸金片的基质为玻璃片，表面镀上选自铜膜、银膜、铝膜和金膜的金属膜。

16.权利要求5-8中任一项的方法，其中所述SPR生物传感器芯片的不同流池中连接了特异于所述病毒的相同的探针，用于检测一种病毒。

17.权利要求5-8中任一项的方法，其中所述SPR生物传感器芯片的不同流池中连接了特异于所述病毒的不同的探针，用于检测几种病毒。

18.权利要求5-8中任一项的方法，其中在步骤(1)之前将待测样品扩增。

19.权利要求5-8中任一项的方法，其中所述待测样品为宫颈样品。

20.一种试剂盒，其包含权利要求1-4中任一项的SPR生物传感器芯片、核酸探针和说明书，其中所述核酸探针选自SEQ ID NO：1-54，优选选自SEQ ID NO：8、10、12、14、37和45。

Images