CN110106226A - 可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片及其制备方法、应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片及其制备方法、应用方法，该芯片由ZnO‑Ag复合材料基底、核苷酸序列，5’端偶联巯基、3’端偶联荧光染料RhB的序列片段组成。所述芯片由复合材料与生物传感探针构成，共价连接在芯片上的DNAzyme可以对铀酰离子有特异性响应，生物活性被激活，使得底物链断裂成两段自由的DNA，修饰于一段DNA上的荧光分子，由于DNA序列的断裂，坠落到SERS基底表面，因而可检测到较强的SERS信号，达到较高的灵敏度、特异性、可重现性。同时，通过修补断裂后的序列，该生物传感探针可以循环使用，达到高效检测、降低成本的目的。
Description
技术领域
本发明涉及可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片，更具体地，本发明涉及一种基于可循环使用生物传感器检测痕量铀酰离子的生物传感芯片及方法，属于水环境中痕量离子的检测领域。
背景技术
众所周知，铀是一种重要的天然放射性元素，其在核能源领域发挥着重要作用。然而，铀具有危险的化学毒性和放射性，一旦扩散到环境中，可能造成难以挽回的生物危害。铀酰离子(UO2 2+)是铀在水环境中的主要存在形式，具有很高的生物相容性。目前用于水环境中痕量铀酰离子(UO2 2+)检测的主要方法有射线检测法、X射线荧光法、原子光谱法和ICP-MS法等。这些方法需要价格昂贵的精密仪器和复杂费时的前处理过程，无法满足现场快速检测的需要。
近年来，以DNAzyme为探针的生物传感器成为科学家们争相研究的新领域。在前期的研究中，以DNAzyme为主要链段的生物传感器被设计作为重金属汞、铅、铜等的高灵敏特异性生物传感器，铀酰离子作为一种特殊的重金属离子，报道却比较少见。导致目前已有的检测铀酰离子的方法种类单一，灵敏度较低，选择性差，或因抗基质干扰能力较低，无法用于实际环境水样中痕量铀酰离子(UO2 2+)的现场快速检测。因此，目前迫切需要一种高灵敏、选择性好的铀酰离子检测方法，以实现对其的实时、快速的现场检测。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片及其制备方法、应用方法，利用包含有能与铀酰离子有特异性响应的DNA酶和捕捉底物链序列的DNA单链，通过信报分子的信号可以间接探测铀酰离子。本发明能够超灵敏检测铀酰离子，可检测出浓度低至1.0×10-12M的铀酰离子，有效解决了现有检测技术灵敏度和选择性不高的问题。同时，通过对生物探针的重新设计及修饰，在检测完成后，可以将断裂的底物链进行修护，让其循环使用，继续检测是体系中的铀酰离子。本发明具有简单、方便、易于携带，可重复使用，能实时、在线检测铀酰离子的浓度，具有很好的应用前景。
本发明是这样实现的：
首先，本发明提供了一种可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片，由ZnO-Ag复合材料、DNAzynme底物链、DNAzynme酶链组成，酶链的5’端偶联巯基，3’端偶联荧光染料；
酶链核苷酸序列：
RhBCCCCGCTCAAGTCTGGATTACACGTCCATCTCTGCAGTCGGGTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGTAAGCCTTT-(CH2)6HS 5’-3’；
底物链核苷酸序列：
AAAGGCTTTTAATCACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTGTAATCCAGACTTGAGCGGG5’-3’；
其中，5’端偶联巯基、3’端偶联荧光染料的酶链核苷酸序列通过末端巯基与ZnO-Ag复合材料中的银纳米颗粒共价连接，底物链与酶链的核苷酸序列彼此形成互补双链连接。
本发明还提供了可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
步骤1、制备聚苯乙烯(PS)微球模板，在模板上制备ZnO-Ag复合材料，然后将其作为SERS基底；在PS微球模板上生长ZnO-Ag可以利用水热法；
步骤2、将所述SERS基底，与5’端偶联巯基、3’端偶联荧光染料的酶链核苷酸序列恒温混匀并振荡反应，使酶链核苷酸序列末端巯基与SERS基底上的银纳米粒子共价连接形成银-硫键，然后向溶液中加入盐溶液，过夜老化；
步骤3、将老化后的材料取出，与溶解于杂交缓冲液中的底物链核苷酸序列恒温混合孵育，通过DNA互补配对形成DNA双链结构，然后用PBS缓冲溶液冲洗，氮气吹干，得到可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片，也可叫做DNAzyme生物传感SERS芯片。
酶链核苷酸序列是5’端偶联有HS-(CH 2)6-、3’端偶联有RhB荧光染料的序列片段。
制备可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片的过程中，使用的酶链和底物链核苷酸序列的浓度均在0.001～1M范围内。
在没有特别说明的情况下，本发明中涉及到的浓度单位“M”是代表“mol/L”。
制备芯片的过程中，步骤2所述恒温混匀是在25℃的温度下混匀；步骤3所述恒温混合孵育为在37℃孵育1～24h。
步骤2所述加入盐溶液为将初始浓度为1M的盐溶液，每隔两小时分2-4次加入，溶液中盐的最终浓度为0.05～1M。这里的盐是指NaCl。
同时，本发明还提供了可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片的应用方法，由于该芯片可多次利用，因此在首次利用后需要进行处理才能再次利用，芯片具体的应用方法如下：首次检测：直接将该芯片浸泡到待测铀酰离子溶液中一段时间后取出，用共聚焦显微拉曼光谱仪进行检测；再次检测：在利用所述芯片检测铀酰离子溶液后，用PBS缓冲液冲洗芯片的基底表面，冲洗后将基底浸泡到有与酶链相匹配的溶解于杂交缓冲液中的底物链核苷酸序列中，恒温混合孵育，通过DNA互补配对形成DNA双链结构，然后用PBS缓冲液冲洗，氮气吹干，重新得到检测痕量铀酰离子的生物传感芯片，并用于检测铀酰离子。
应用芯片进行检测时，将芯片浸泡到待测铀酰离子溶液中的时间为10-20min。
应用后重新得到检测痕量铀酰离子的生物传感芯片的过程中，所述PBS缓冲液的pH值为6.88，所述溶解于杂交缓冲液中的底物链核苷酸序列的浓度为0.001M，恒温混合孵育条件为：37℃恒温孵育24h。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明利用标记有表面增强拉曼探针RhB的对铀酰离子具有特异性识别和切割作用的DNAzyme作为UO2 2+的生物传感单元、能与之发生底物链断裂反应，断裂后，长酶链发生弯曲，贴近于SERS基底表面，产生探针分子的拉曼信号，实现对水样中痕量UO2 2+的高灵敏快速检测；所建立的检测方法具有灵敏度高、选择性好、抗基体干扰能力强、简单快速等优点。
同时，通过简单冲洗，对断裂的底物链进行修护，重建DNAzyme生物传感器的双链状态，使其可以重复使用，循环使用次数大于3次。该方法克服了传统UO2 2+离子检测方法仪器昂贵、前处理操作复杂等缺点，可用于水样中痕量铀酰离子的现场快速和低成本检测；可以探测浓度低至1×10-12M的铀酰离子，能够超灵敏检测铀酰离子，可满足实际水样中痕量UO2 2+离子的现场快速检测需要，无需借助大型昂贵的仪器。
(2)本发明的方法操作简单，检测速度快，检测整个过程在30分钟之内完成。
(3)本发明所建立的检测方法具有良好的选择性，其它13种常见离子(Ag+、Mg2+、Fe3+、Ca2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Pb2+、Th4+、Ba2+、Mn2+)，不干扰UO2 2+离子的检测。
(4)本发明所建立的检测方法具有良好的抗基质干扰能力，检测水样无需复杂的前处理过程，只需要过滤去除水样中的沙土及悬浮物，便可立即检测。
附图说明
图1是本发明芯片检测铀酰离子过程及芯片重建示意图；
图2是本发明实施例一不同浓度的铀酰离子溶液的SERS检测图。
图3是本发明实施例一不同浓度的铀酰离子溶液的标准曲线图。
图4是本发明实施例二中干扰离子测试结果图。
图5是本发明实施例三中循环测试图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一
1)制备本发明所述的DNAzyme生物传感SERS芯片；
首先制备PS微球模板，在模板上生长ZnO，利用磁控溅射仪制备ZnO-Ag复合材料，将制备好的ZnO-Ag复合材料基底作为SERS基底，将SERS基底放在离心管中，加入酶链溶液(浓度：0.001M)，使得溶液浸没SERS基底，所述酶链DNA：
RhBCCCCGCTCAAGTCTGGATTACACGTCCATCTCTGCAGTCGGGTAG TTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGTAAGCCTTT 5’-3’。
将离心管置于恒温混匀仪中，350转每分钟，25℃恒温，反应24小时，使DNA末端巯基与银纳米粒子共价形成银-硫键，在SERS基底表面自组装形成单分子层。然后向溶液中分5次每隔2小时加一次1M盐溶液，使得溶液中NaCl的最终浓度为0.1M，过夜老化。将SERS基底取出，与溶解于杂交缓冲液中的浓度为0.001M的底物链在恒温混匀仪中混合孵育，底物链的DNA：
AAAGGCTTTTAATCACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTGTAATCCAGACTTGAGCGGG 5’-3’,rA(ribonucleotide adenosine)代表核糖核苷酸中的碱基A；
恒温混匀仪中孵育条件是37℃恒温混合孵育24小时，通过DNA互补配对形成DNA双链结构，然后用PBS缓冲液冲洗几次，氮气吹干，得到DNAzyme生物传感SERS芯片。
将上述制备好的生物芯片用于铀酰离子的痕量检测，滴加待测铀酰离子溶液于芯片上，反应10min后，利用共聚焦显微拉曼光谱仪进行检测。对不同浓度铀酰离子溶液检测示意图见图2，对检测的不同浓度离子做线性曲线，见图3。从图2可以看出本发明可检测出浓度低至1.0×10-12M的铀酰离子。
实施例二本发明所述DNAzyme生物传感SERS芯片对同一浓度下不同金属离子检测实验：
利用实施例一所述的DNAzyme生物传感SERS芯片分别浸泡在同一浓度(10-9M)的不同重金属离子(如Ag+、Mg2+、Fe3+、Ca2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Pb2+、Th4+、Ba2+、Mn2+)溶液中10分钟，做拉曼检测。图4是本发明实施例二中干扰离子测试结果图。由图4可知铀酰离子和其他离子溶液相比，拉曼光谱具有明显的增强，从图4中可以看出相应的拉曼峰1366cm-1的强度可定量的比较不同离子之间的差别，结果显示该芯片具有较好的特异性可以准确识别实际体系中的铀酰离子。
实施例三：本发明所述芯片的重建以及循环使用试验
1、如图1所示，本发明所述的生物芯片的重建在一次检测后，用PBS清洗芯片以除去残余的DNA和铀酰离子，将芯片取出，与溶解于杂交缓冲液中的底物链在恒温混匀仪中37℃恒温混合孵育24小时，底物链浓度：0.001M，底物链DNA：
AAAGGCTTTTAATCACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTGTAATCCAGACTTGAGCGGG 5’-3’,rA(ribonucleotide adenosine)代表核糖核苷酸中的碱基A；
通过DNA互补配对形成DNA双链结构，然后用PBS缓冲液冲洗几次，氮气吹干，重建得到DNAzyme生物传感SERS芯片(图5)。上述过程中pH值可选择6.88。
2、本发明所述芯片的循环使用实验
将重建DNAzyme生物传感SERS芯片浸泡在1nM的铀酰离子溶液中，反应10分钟后，取出芯片，进行拉曼实验，然后循环使用，每一次重建之后拉曼强度都会明显的增强(每次重建后拉曼强度都会明显增强指的是刚重建后未使用的芯片的拉曼强度没有或者很微弱，当加入铀酰离子之后拉曼信号会明显的增强，参见图5)，由图5可知，拉曼1366cm-1的强度计算得知三次循环后强度仅减弱了12.8％，结果表明本发明芯片易于重建，可多次使用，可循环性高，大大降低制备成本。
尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。
序列表
酶链核苷酸序列：
RhBCCCCGCTCAAGTCTGGATTACACGTCCATCTCTGCAGTCGGGTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGTAAGCCTTT-(CH2)6SH 5’-3’；
底物链核苷酸序列：
AAAGGCTTTTAATCACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTGTAATCCAGACTTGAGCGGG5’-3’。
Claims (9)
1.一种可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片，其特征在于由ZnO-Ag复合材料、DNAzynme底物链、DNAzynme酶链组成，酶链的5’端偶联巯基，3’端偶联荧光染料；
酶链核苷酸序列：
RhBCCCCGCTCAAGTCTGGATTACACGTCCATCTCTGCAGTCGGGTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGTAAGCCTTT-(CH2)6HS 5’-3’；
底物链核苷酸序列：
AAAGGCTTTTAATCACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTGTAATCCAGACTTGAGCGGG 5’-3’；
其中，5’端偶联巯基、3’端偶联荧光染料的酶链核苷酸序列通过末端巯基与ZnO-Ag复合材料中的银纳米颗粒共价连接，底物链与酶链的核苷酸序列彼此形成互补双链连接。
2.权利要求1所述的可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1、制备聚苯乙烯微球模板，在模板上制备ZnO-Ag复合材料，然后将其作为SERS基底；
步骤2、将所述SERS基底，与5’端偶联巯基、3’端偶联荧光染料的酶链核苷酸序列恒温混匀并振荡反应，使酶链核苷酸序列末端巯基与SERS基底上的银纳米粒子共价连接形成银-硫键，然后向溶液中加入盐溶液，过夜老化；
步骤3、将老化后的材料取出，与溶解于杂交缓冲液中的底物链核苷酸序列恒温混合孵育，通过DNA互补配对形成DNA双链结构，然后用PBS缓冲溶液冲洗，氮气吹干，得到可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述酶链和底物链核苷酸序列浓度均为0.001～1M。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤2所述恒温混匀是在25℃的温度下混匀。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤3所述恒温混合孵育为在37℃孵育1～24h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤2所述加入盐溶液为将初始浓度为1M的盐溶液，每隔两小时分2-4次加入，溶液中盐的最终浓度为0.05～1M。
7.可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片的应用方法，其特征在于首次检测：直接将该芯片浸泡到待测铀酰离子溶液中一段时间后取出，用共聚焦显微拉曼光谱仪进行检测；再次检测：在利用所述芯片检测铀酰离子溶液后，用PBS缓冲液冲洗芯片的基底表面，冲洗后将基底浸泡到有与酶链相匹配的溶解于杂交缓冲液中的底物链核苷酸序列中，恒温混合孵育，通过DNA互补配对形成DNA双链结构，然后用PBS缓冲液冲洗，氮气吹干，重新得到检测痕量铀酰离子的生物传感芯片，并用于检测铀酰离子。
8.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于检测时，将芯片浸泡到待测铀酰离子溶液中的时间为10-20min。
9.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于所述PBS缓冲液的pH值为6.88，所述溶解于杂交缓冲液中的底物链核苷酸序列的浓度为0.001M，恒温混合孵育条件为：37℃恒温孵育24h。
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