CN102471807A - 用于核酸检测的层析系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于对样品中的核酸进行分离和序列特异性检测的试条,一种包含本发明中的试条和一种落射荧光装置以对核酸进行序列特异性检测的系统,和一种使用该试条对核酸进行定性和/或定量测定的方法。本发明中的试条、系统和方法容易使用,且由于其高灵敏度和特异性可在相对于常规检测更短的分析时间内提供精确和可靠的结果。
Description
技术领域
本发明主要涉及到核酸检测领域。本发明特别涉及到一种基于横向流层析分离和样品中核酸的序列特异性检测的试条、方法和系统。
背景技术
在不可避免地需要进行核酸检测的研究领域和工业领域中,不论该检测是涉及到确认目标核酸的存在与否还是对核酸进行定性或定量测定,主要使用涉及到核酸的序列特异性杂交的方法。该类方法中的其中一种是基于聚合酶链反应的测试,其中对特定的目标序列进行选择性扩增并对扩增产物进行凝胶电泳分析,之后使用序列特异性杂交方法如southern或northern blot或使用染料染色显像。
然而,上述方法是一个复杂的过程,其中无论是样品的制备和反应还是显像都需要长时间的工作。而且该反应结果不很灵敏,需要大量的进样,而且对不同反应条件如杂交时间或温度,以及反应缓冲溶液或所用的引物等十分敏感。因此,为了设定最佳反应条件以获得可靠结果,需要高度熟练的技术人员进行多次实验。
核酸检测被广泛应用于临床,如疾病的诊断或筛查或治疗的预后。因此,有对用于检测样品中核酸的简易、方便以及可靠的系统或产品或方法的需求。
发明内容
本发明涉及到一种用于核酸检测和/或量化以确定一种特定的核酸序列在样品中的存在与否及含量的试条、系统和方法。本发明基于横向流层析分离及样品中的核酸序列特异性检测,易于使用并由于其相对于传统系统的高灵敏度和特异性可在较短的分析时间内得到精确可靠的结果。
一方面,本发明涉及一种用于对分析物,即样品中的核酸分子,进行定性和/或定量的序列特异性测试的横向流检测试条。本发明的试条包含:提供样品涂布点的样品垫;吸收垫;以相互之间进行毛细流动传输的方式位于样品垫与吸收垫之间的层析介质,所述层析介质包含至少一种捕获分子,所述捕获分子能够与涂布在样品垫上的样品中的特定核酸序列进行序列特异性杂交;和固相载体,用于支撑以相同平面位于所述固相载体上以容许相互之间进行毛细流动传输的层析介质、样品垫和吸收垫。在一个实施方式中,所述固相载体具有样品垫和吸收垫分别位于一端的两个末端。在另一个实施方式中,所述至少一种捕获分子固定于所述层析介质上的已知的特定位置。
另一方面,本发明涉及到用于对分析物,即样品中的核酸分子,进行序列特异性检测的横向流定性和/或定量检测试条。本发明中的试条包含:提供样品涂布点的样品垫;吸收垫;以相互之间进行毛细流动传输的方式位于样品垫与吸收垫之间的层析介质,所述层析介质包含至少一种捕获分子,所述捕获分子能够与涂布于样品垫的样品中并用荧光材料或生物素标记且为聚合酶链反应产物的特定核酸序列进行序列特异性杂交;和固相载体,支撑以相同平面位于所述固相载体上以容许相互之间进行毛细流动传输的层析介质、样品垫和吸收垫。在一个实施方式中,固相载体具有样品垫和吸收垫分别位于一端的两个末端。
另一方面,本发明提供了上述试条,其中所述捕获分子具有来自于人类乳头状瘤病毒(HPV)的核酸序列。
另一方面,本发明提供了上述试条,能够检测并区分选自由16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73、82、6、11、40、42、43、44、54、61、72、81和CP108组成的组中的不同HPV亚型。
另一方面,本发明提供了一种用于检测样品中核酸的系统,该系统包含本发明中的试条和用于检测来自本发明任一试条中的捕获分子的信号的落射荧光检测装置。在一个实施方式中,所述落射荧光为激光诱导的。
1.另一方面,本发明提供了一种使用本发明中所述任一试条对样品中的核酸进行定性和/或定量检测的方法,该方法包括以下步骤:将含有以荧光或生物素标记的目标核酸序列的液体样品涂布到本发明中的试条的样品垫上;使该液体样品流到试条的吸收垫,其中在试条特定位置上的捕获物与目标核酸序列进行序列特异性反应以形成杂交体;和使用落射荧光检测装置检测杂交体上的标记物发出的信号,其中信号的存在表面存在目标核酸,或该信号用于量化目标核酸在样品中的量。
在一个实施方式中,所述捕获分子具有来自于人类乳头状瘤病毒(HPV)的核酸序列。
另一方面,本发明提供了上述方法,能够检测并区分选自由16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73、82、6、11、40、42、43、44、54、61、72、81和CP108组成的组中的不同HPV亚型。
上述摘要仅仅是示例性的而并不局限于此。除了上述示例性的方面、实施方式和特征,参照附图和以下详细说明,其它各方面、实施方式和特征也是显而易见的。
附图说明
参照以下详细描述以及附图,本发明的更完整的价值以及很多随之而来的优势会逐渐变得显而易见,同样也会被更好地理解,其中:
图1为本发明中试条的一个实施方式的示意图。附图标记表示:101:横向流试条;102:样品垫;103:吸收垫;104:层析介质;和105:信号检测区域(也被称为分析物检测区域)。
图2为激光诱导落射荧光检测装置的示意图。附图标记表示:108:检测窗口;109:样品涂布点;110:试条托架;200:激光诱导落射荧光检测装置;201:激光;202:激光光束控制透镜;203:聚光透镜;204:荧光滤镜;205:聚光透镜;206:空间滤波器;和207:光探测器。
图3为DNA固定实验的结果,以优化在硝酸纤维素膜上的固定条件。(a)无紫外照射;(b)对膜进行一小时的干燥,之后进行紫外照射;(c)在没有对膜进行干燥的条件下进行紫外照射。黄色区域表示被固定的DNA。
图4为PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上的电泳结果,其中分别使用Cy5标记的HPV 16和18的特异引物。红色表示DNA的存在,M表示尺寸标记物。
图5为通过确定核酸序列间的交叉反应以检测HPV的不同亚型的实验结果。使用本发明中一个实施方式中的系统对样品中的HPV 16进行检测,其中HPV 16和18的特异DNA被用作捕获分子。
图6为通过确定核酸序列间的交叉反应以检测HPV的不同亚型的实验结果。使用本发明中一个实施方式中的系统对样品中的HPV 18进行检测,其中HPV 16和18的特异DNA被用作捕获分子。
图7为PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上的电泳结果,其中分别使用生物素标记的HPV 16和18特异引物,并使用被鉴定为HPV阳性的模版。在PCR中使用不同的循环数。M:尺寸标记物,100bp ladder;1:20次PCR循环;2:10次PCR循环;3:5次PCR循环。
图8为使用本发明中一个实施方式中的系统对图7中的扩增产物进行分析的结果。蓝线:阴性对照;红线:20次PCR循环;黄绿线:10次PCR循环;紫线:5次PCR循环。
图9为PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上的电泳结果,所用反应条件与图7相同,除了在模版上使用了不同样品。M:尺寸标记物,100bp ladder;1:30次PCR循环;2:20次PCR循环;3:10次PCR循环;4:5次PCR循环;5:3次PCR循环。
图10为使用本发明中一个实施方式中的系统对图9中的扩增产物进行分析的结果。浅蓝线:阴性对照;蓝线:30次PCR循环;红线:20次PCR循环;黄绿线:10次PCR循环;紫线:5次PCR循环。
图11为使用本发明中一个实施方式中的系统对PCR产物进行分析的结果,分别用蓝色和红色表示经过和未经过纯化的PCR产物。使用被生物素标记的HPV特异引物对该产物进行扩增,而HPV阳性样品被用作模版。
图12为使用本发明中一个实施方式中的系统在以下各种材料的存在下对PCR产物进行分析的结果。使用被生物素标记的HPV特异引物对该产物进行扩增,而HPV阳性样品被用作模版。所加入的组分为:蓝色:纯品;红色:Taq缓冲溶液;黄绿色:dNTPs;紫色:50mM KCl;和浅蓝色:2.5mMMgCl2。
图13为使用本发明中一个实施方式中的系统在以下EDTA的不同浓度下对PCR产物进行分析的结果。使用被生物素标记的HPV特异引物对该产物进行扩增,而HPV阳性样品被用作模版。蓝色:纯品;红色:2.5mM MgCl2;黄绿色:2.5mM MgCl2+检测剂(1mM EDTA);和紫色:2.5mM MgCl2+检测剂(50mM EDTA)。
图14为PCR扩充产物在2%琼脂糖凝胶上的电泳结果,其中使用生物素标记的HPV特异引物,几种HPV阳性样品被用作模版。
图15A和15B为使用本发明中一个实施方式中的系统对图14中的PCR产物进行分析的结果。图右侧的数字表示不同来源的样品ID。
图16为使用本发明中一个实施方式中的系统对PCR产物进行分析的结果,其中使用HPV特异引物进行扩增,并使用从图14中的非特异性条带提取的DNA作为模版。37;红色:阴性对照。
图17为使用HPV特异引物进行扩增的PCR产物在2%琼脂糖凝胶上的电泳结果,所用引物直接来自活检样品,之前没有进行DNA提取。
图18为使用本发明中一个实施方式中的系统对图17中的PCR产物进行分析的结果。
每幅附图中相同的附图标记表示相应的部分。
具体实施方式
以下部分将参照附图进行详细说明。除非另作说明,图中相同的标志通常表示相同组分。本发明并不局限于在详细说明书、附图和权利要求中所描述的示例性实施方式。在不违背此处主题的精神和范围的情况下,也可使用其它实施方式并作出其它改变。可以理解本发明中主要描述并在图中说明的各方面可以以多种不同形式进行排列、取代、结合和设计,它们都经过明确的思考并包括在本发明中。
一方面,本发明涉及一种用于以序列特异性方式对分析物,即样品中的核酸,进行定性和/或定量实验的横向流试条。
根据本发明的一个方面,提供了一种试条,包括:提供样品涂布点的样品垫;吸收垫;以允许相互(样品垫、层析介质和吸收垫)之间进行毛细流动传输的方式位于样品垫和吸收垫之间的层析介质,该层析介质包含至少一种捕获分子,该捕获分子能够与涂布于样品垫的样品中的特定核酸序列进行序列特异性反应;和固相载体,支撑以相同平面位于所述固相载体上以容许相互之间进行毛细流动传输的层析介质、样品垫和吸收垫。在一个实施方式中,固相载体具有样品垫和吸收垫分别位于一端的两个末端。在另一个实施方式中,至少一种捕获分子固定于层析介质上的一个特定位置。
此处所用术语“毛细流动传输”表示样品垫、层析介质和吸收垫之间存在接触,使得在样品垫中涂布的液体样品通过毛细作用流过层析介质到达吸收垫。在一个实施方式中,具有第一和第二末端的层析介质位于样品垫和吸收垫之间,一末端与样品垫接触,另一末端与吸收垫接触,其中所述末端可以与样品垫或吸收垫的一末端重叠或相互接触或相邻。优选样品垫、层析介质和吸收垫具有相同宽度,特别在末端重叠处。
此处所用术语“样品”是指含有需要被检测的分析物的化合物或组合物。在一个优选的实施方式中,所述样品为液态或水溶液,以使得被加入到样品垫中的样品可以通过毛细作用经由层析介质流动到吸收垫。
此处所用术语“分析物”或“目标分析物”或“目标材料”是指样品中被分析的化合物,也叫做“目标材料”,包括核酸。此处所用术语“核酸”是指任何来自生物材料或被化学合成或通过已知方法如聚合酶链反应扩增得到的DNA或RNA分子,其包括但不局限于如基因组DNA(脱氧核糖核酸)、cDNA、RNA(核糖核酸)。另外所述核酸可以是双链或单链,并可由生物材料如细胞或组织中提取,或根据本领域已知方法合成。在一个实施方式中,本发明中的核酸为DNA,特别是通过PCR合成的DNA,并作为单链使用,直接或间接被用于检测的标记基团如荧光染料或生物素标记,所述荧光染料或生物素可在合成时或合成后被结合到核酸中。当使用了标记染料如生物素时,所述染料可与链亲和素或亲和素结合使用并与颗粒相关联用于检测。可用于本发明的颗粒包括但不局限于例如聚苯乙烯微球、乳胶颗粒、纳米金颗粒、胶体金颗粒、金属颗粒、磁性微粒、荧光微粒和半导体纳米晶体颗粒。一旦被标记的核酸被固定在层析介质上的捕获分子通过序列特异性杂交捕获,核酸上的染料可被检测或被本领域中已知的适宜装置读取。如果需要,可以直接对作为模版的生物标本或由作为模版的标本中提取的DNA或RNA进行分析物的PCR扩增。另外,根据本发明,扩增后经过或未经过下一步检测纯化的PCR产物可用于分析。
此处所用术语“目标序列”是指被扩增并用作被检测的目标材料的序列。目标序列可以含有或不含有引物结合序列。目标序列可以根据将要进行的检测的目的选择。例如,如果该检测是为了区分目标病毒的不同类型,该目标序列需要涵盖各型目标病毒的特异性病毒基因组区域。为了增加特异性,可以使用多于一种目标序列并例如可以包括毒素基因或病原体的特异性序列,该序列可根据本领域中已知信息选择。在一个优选的实施方式中,一个目标序列或目标材料的示例选自人类乳头状瘤病毒(HPV)、丙型肝炎病毒(HCV)、HIV(人类免疫缺陷病毒)以区分其亚型。在另一个优选的实施方式中,目标序列来自HPV以区分其包括高危型和低危型的亚型。高危型HPV包括但不局限于HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73和82。低危型HPV包括但不局限于HPV亚型6、11、40、42、43、44、54、61、72、81和CP108。在一个优选的实施方式中,HPV亚型包括6、11、16、18、31、45和51,特别是亚型16和18。
根据本发明可以使用的荧光染料(分子)的激发波长和发射波长相差20nm。示例性例子包括但不局限于量子点、镧系元素螯合物(如Sm(钐)、Eu(铕)、Tb(铽))以及荧光物质(如FITC、罗丹明绿、硫杂二羰花菁(thiadicarbocyanine)、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Alexa 488、Alexa 594和Alexa 647)。在一个优选的实施方式中,根据本发明被检测的分析物被生物素标记。在另一个实施方式中分析物被Cy3或Cy5标记。一般来说,荧光的强度与激发光强度成正比。此处所用术语“落射荧光”是指从结合了捕获分子的标记目标材料或分析物中的共轭键,和/或结合了一个对照捕获分子的标记对照材料中的对照共轭键发出的荧光,其可以在固定有捕获分子的层析介质区域内被检测到。
此处所用术语“捕获物或捕获分子或捕获寡核苷酸”是指一种可以与样品中的分析物进行序列特异性杂交的材料,包括但并不局限于核酸。本发明中的捕获分子被固定于层析介质上的特定区域,并通过序列特异性杂交捕获通过毛细作用在试条上传输的目标分析物。本发明中的捕获分子可以通过与层析介质的共价或非共价键固定。在一个优选的实施方式中,捕获分子通过非共价键连接或被固定。将核酸如DNA连接或固定到多孔膜如硝基纤维素膜上的方法在本领域中已知,并可被应用于本发明中。可用于本发明中的一种示例性的固定方法是,例如将核酸吸收在膜表面上,接下来在80℃下进行热处理。其它示例性方法包括,将核酸加入到膜上后风干,之后用紫外照射,或将捕获寡核苷酸与等量的氯化钠和柠檬酸钠混合并真空处理,或使用紫外线处理。捕获分子同样可以通过共价键固定于带电尼龙膜上。在一个优选的实施例中,本发明中的捕获分子为单链寡核苷酸,其序列部分或全部与目标材料或目标分析物的序列互补。一般来说,捕获序列可选自一段目标序列的区域,其中基于内部氢键的二级结构并不重要。捕获分子以一条例如宽度为1mm或更少的直线加入到层析介质如硝基纤维素膜上。本领域中的技术人员可以根据在测试中所用的层析介质类型选择所用的合适的线宽。加入到本发明中的层析介质上的捕获分子浓度在约10到150pM的范围内,但并不局限于此。在一个实施方式中,捕获分子的浓度为100pM。至少将可包括但不限于目标DNA、阴性和/或阳性对照的至少一种捕获分子(固定于本发明中试条上的层析介质的已知特定位置。术语“已知特定位置”是指与样品涂布点沿毛细流动方向具有已知/特定距离的位置(此后被称为“分析物测定区域”),并根据所用捕获分子的数量可以有多于一个位置。例如,捕获分子可存在于多个位置,而该位置在层析介质中形成一条线,起点与样品涂布点的距离为2至5mm,而不同捕获分子间的距离为1mm或更多。多个捕获分子可被固定于一个层析介质上,而本领域中技术人员可根据所用的层析介质类型、分子大小和/或分析物和/或用于检测的捕获分子的性质选择捕获分子的最佳数量。在一个实施方式中,本发明中的试条可在层析介质的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个及更多的位置上具有相同或不同的捕获分子。当存在多条捕获分子线时,各条线间的距离可变。在一个实施方式中,捕获线间的距离为至少1mm,但并不局限于此。
作为捕获分子的核酸长度可以为约10到200个碱基,但并不局限于此。在一个实施方式中,该长度可包括,但不局限于,约20个碱基、30个碱基、40个碱基、50个碱基、60个碱基、70个碱基、80个碱基、90个碱基、100个碱基、110个碱基、120个碱基、130个碱基。本领域中的技术人员应该能够根据所测试的的分析物选择合适的捕获分子的序列和/或长度。常用的长度为至少20个碱基,或任何熔点在50至70℃的长度。在一个实施方式中,捕获分子可包括包含9至20个T残基的空间序列。在另一个实施方式中,捕获分子可包含改性的核酸,如PNA(肽核酸)或LNA(锁核酸),以改变或提高杂交性质,这一点对于短寡核苷酸或在需要调控熔融温度时特别有用。用于与目标分析物杂交的捕获分子优选具有0、1或2个不同碱基。这是由于碱基堆积对稳定的杂交来讲很重要。捕获分子的序列选择取决于目标分析物。因此根据所测定的不同分析物的数量可使用多于一种具有不同序列的捕获分子。在一个实施方式中,捕获分子来源于包含高危亚型和低危亚型HPV序列。根据本发明的示例性高危亚型序列例子包括但不局限于亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73、82。根据本发明的示例性低危亚型序列的例子包括但不局限于亚型6、11、40、42、43、44、54、61、72、81、CP108。在一个实施方式中,HPV亚型包括6、11、16、18、31、45和51。在另一个实施方式中,HPV亚型包括16和18。
另外,基于卫生原因,如防止污染,本发明中的试条可被封于托架(盒子)中。本发明中的试条所用的托架可覆盖除用于进样和落射荧光测定区域外的全部试条。在一个实施方式中使用了图2(110)描述的一种示例性托架。
另一方面,本发明提供了一种核酸检测系统,该系统包括本发明中的任一种试条和用于检测由固定捕获分子且目标分析物与其杂交的位置所发出的信号的落射荧光检测装置。
所述系统可使用本领域中已知的落射荧光检测装置。通常,本系统所用的激光诱导落射荧光检测装置包含激光装置、激发滤光片、椭圆形反射镜或球面反射镜、荧光控制装置、准直仪、荧光滤镜和光检测器。可用于本系统的检测装置的一个实例如图2所述。参照图2可解释检测和收集落射荧光的原理。激光装置发出的入射光经过激发滤光片被聚焦到椭圆反射镜的第一焦点上,样品/分析物也位于此处,而聚焦在椭圆反射镜的第二焦点上的光被转化为平行光,之后经过荧光滤镜到达聚光透镜和光检测器。光检测器所检测到的落射荧光通过模拟数字转换器被传送到CPU,在与标准荧光比较后可确定样品中分析物的存在、不存在和/或量。在一个实施方式中,可用于本发明的检测装置包括但不限于Boditech Med,Inc.(韩国)的i-或Biosite(美国)的装置。
另一方面,本发明提供了使用本发明中所述的试条检测样品中的核酸的方法。该方法包括以下步骤:将含有以荧光物质或生物素标记的目标核酸序列的液体样品涂布到本发明中试条的样品垫上;使液体样品流过层析介质到达试条的吸收垫上,其中在试条的层析介质上特定位置的捕获物与样品中的目标核酸序列进行序列特异性反应以形成杂交体;和使用落射荧光检测装置检测杂交体上的标记物所发出的信号,此处信号的存在表明存在目标核酸,或该信号用于量化样品中目标核酸的量。在一个实施方式中,捕获分子含有来自于人类乳头状瘤病毒(HPV)的核酸序列。
本方法特别适用于样品中DNA或RNA的序列特异性检测。通常将整段DNA或RNA从细胞和组织中提取出来,之后用PCR扩增目标DNA。之后将所扩增的DNA涂布到在层析介质上具有捕获分子的本发明中的试条上,该捕获分子的序列部分或整体与上述扩充的序列互补。在反应完成后使用落射荧光检测装置检测信号。本发明中的方法十分灵敏,可用于检测扩增循环数为5或更少的PCR产物。也可将直接来自于PCR的生物样品作为模版使用而不需要对样品中的核酸进行前纯化。如果需要对样品中的核酸进行前纯化,本领域技术人员可以选择本领域中已知的各种方法来提取和纯化DNA和RNA,也可使用商业产品和试剂盒。通常扩增产物,即目标分析物,作为单链使用。目标序列含有引物结合位。根据检测的目的,测试的目标序列可以各自不同。例如,当该检测是为了区分同一种病毒的各种不同亚型时,上述目标序列需要选择涵盖包含对该病毒的每个亚型都具有特异性的序列的病毒基因组区域。可使用多于一个目标序列以提高特异性和/或灵敏度。本领域中存在各种已知信息用来例如选择病原体或毒素特异性序列。
目标分析物可直接或间接被标记染料标记。该标记染料可以在涂布到试条之前加入到液体样品中,也可以在扩增过程中被结合。例如,可以扩增或合成目标序列以在其中包含荧光分子或可检测基团如生物素。在后一种情况中,该被生物素标记的序列接着与带有链亲和素的颗粒反应以作为检测材料使用。可用于该目的的本领域已知的各类颗粒包括但不局限于,例如聚苯乙烯微球、乳胶颗粒、纳米金颗粒、胶体金颗粒、金属颗粒、磁性微粒、荧光微粒和半导体纳米晶体。一旦所标记的核酸被固定于层析介质上的捕获分子通过序列特异性杂交捕获,该被染料标记的核酸可以被适宜的本领域中已知设备检测或读取。需要时,可以在对目标序列的PCR扩增过程中加入被检测材料标记的引物,该方法在本领域已知。被扩增或未被扩增使用的核酸分子通过毛细作用从样品垫的样品涂布点中转移,并流经层析介质,此处该分析物与被沉淀并固定在层析介质上特定位置的捕获分子进行序列特异性杂交以形成分析物-捕获物复合体。之后来自该复合体(杂交体)的信号被落射荧光检测装置检测,该复合体的阳性信号表示样品中存在目标序列。
本发明中的试条、系统和方法可用于例如区分一种病毒的各种不同亚型,或确定一种特定病原体的存在。在一个实施方式中,本发明中的试条、系统和方法可用于区分并鉴定HPV病毒的各种亚型。HPV是一种含有7900bp双链DNA作为其基因组的病毒,在95%患有子宫颈癌的女性中被发现,并被认为是诱发子宫颈癌的主要原因。至今已发现120种不同亚型,其中多于40种被发现与子宫颈癌相关,并被进一步分类为高危型和低危型。高危型包括HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73和82,低危型包括HPV亚型6、11、40、42、43、44、54、61、72、81和CP108。它们都可被本试条、方法和/或系统检测到。在高危型中,亚型16和18占据70-80%,其余20-30%被亚型31、33、35、52和58占据。在少数情况下,HPV也可导致阴茎癌。(Gissmann L,Boshart M,DurstM,Ikenberg H,Wagner D,zur Hausen H.Presence of human papillomavirus ingenital tumers.J Invest Dermatol 1984;83(1suppl):26S-8S;de Villers EM.Heterogeneity of the human papillomavirus group.J Virol 1989;63:4898-903;Lorincz AT,Reid R,Jenson AB,Greenberg MD,Lancaster W,Kurman RJ.Human papillomavirus infection of the cervix:relative risk association of 15common anogental types.Obstet Gynecol 1992;79:328-37.)
常见的子宫颈癌类型是腺癌和占所有病例的90-95%的鳞状细胞癌(SSC)。通过各种方法如细胞学诊断、阴道镜检查或活检来检测SSC的癌前病变被认为是核异质(细胞核具有异常形状)或宫颈上皮内瘤样病变(CIN)。根据CIN的病变程度,其可被进一步分为一期、二期和三期(McIndoeWA et al.Obstetrics and Gynaecology,October,1984;64(4):451-458)。如本发明中实施例所述,本发明的试条、方法和系统可用于区分不同宫颈癌病变的不同HPV亚型。在一个优选的实施方式中,本发明中的试条、方法和系统可用于鉴定和区分不同HPV亚型16和18。
HPV感染需要尽快被检测到,这不仅是为了预防子宫颈癌,也是为了癌症治疗中/后的预后,因为女性的子宫颈癌发病率较高而HPV被认为是主要诱因。之前诊断子宫颈癌的方法包括细胞学检测、阴道镜检查或活检、检测HPV蛋白的免疫学试验和HPV DNA测试,其中由于其灵敏度、特异性和准确性常使用HPV DNA测试(Duggan MA,Benoit JL,Mcgregor SE,Nation JG,Inoue M,Stuart GC.The human papillomavirus status of 114endocervicaladenocarcinoma cases by dot-blot hybridization.Hum Pathol 1993;189:12-9;Jane C.Sterling and Stephen K.Tying.Human Papillomavirus:Clinical andscientific advances,ARNOLD,2001;Schneider A,Zahm DM,Kirchmayr R,Schneider VL.Screening for cervical intraepithelial neoplasia grade 2/3:validityof cytologic study,cervicography,and human papillomavirus detection.Am JObstet Gynecol 1996;174:1534-41;Cuzick J.Beverley E,Ho L,Terry G,Snapper H,Mielzynska I,et al.HPV testing in primary screening of older women.Br J Cancer 1999;81:554-8.)。特别是细胞学检测具有诊断的高假阴性率、低灵敏度和不准确性的问题。以下表1比较了常用的DNA HPV测试。
表1
表1中的HPV分型试剂盒为典型的基于PCR的试剂盒,包括GENOMED公司的HPV分型试剂盒,其中每种亚型的特异性序列被扩增和在琼脂糖凝胶上跑胶,之后使用ETBR染色剂对该凝胶显像。杂交捕获是一种基于RNA-DNA杂交体的形成的试验,该杂交体通过其特异性抗体被检测,该试验包括Diagene公司(美国)的产品。HPV DNA芯片包括Biomedlab(韩国)的产品。
本方法相对于从前的方法具有特异性、灵敏度和较短反应-检测时间的优点。具体来说,本方法的样品制备时间较短,因为,例如为了检测特定的HPV亚型,该测试可用于只经过5次PCR循环的样品上,另外,甚至可以在活检样品上进行PCR而不需要DNA纯化。在下一步的检测步骤中,扩增产物可被直接用在试条上以进行层析分离,而不需要纯化,该过程只需要10分钟就可以得到结果。所有这些都相对于之前的试验缩短了反应-检测时间。另外,可以通过使用多于一种捕获分子以进一步缩短分析时间。例如,如实施例中所述,总共需要30分钟到90分钟的分析时间:由活检样品中提取DNA,如果需要:约1小时;通过5次PCR循环进行扩增:约20分钟;层析分离和检测:12分钟。这样总分析时间可被缩短到1/20。
以下将参照附图详细说明包含激光诱导落射荧光检测装置和本发明中的试条的系统。
固相载体或支撑卡
固相载体(101)支撑试条的所有其它组分:样品垫、层析介质和吸收垫,或当不使用该载体时,层析介质(104)本身可作为载体使用。该载体通常由不溶于水、无孔的刚性材料制成,其尺寸等于或大于结合在载体上的其它组分的尺寸。该载体可由各种天然和合成的有机和无机材料制备,只要不阻止或干扰试条中的毛细流动及通过与分析物的非特异性结合干扰目标分析物与捕获分子的反应。可用于本载体的示例性材料包括但不局限于,例如,聚乙烯、聚酯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯乙烯60)、尼龙、聚乙烯基丁酸、玻璃、陶瓷、金属等。试条的其它组分可通过多种方法包括胶粘剂结合到载体上。选择适宜的胶粘剂可提高试条性能并延长试条的保质期。根据本发明可使用的胶粘剂包括但不局限于压敏胶(PSA)。通常,载体与试条其它组分的结合是通过使胶粘剂渗进其它组分的孔中从而将该其它组分与载体附着在一起。胶粘剂的这种可以在常态下流动的能力被称为“冷流”。由于在将PSA加到试条组分上时不需要加热,一定程度的冷流对试条各组分间的结合来说是不可或缺的。如果冷流的程度过低,起始的粘合力就会过低,导致不足以将试条各组分结合。反之,如果冷流程度过高,胶粘剂就会流到试条的其它组分中并可能会堵住孔隙、形成疏水性污点或弄湿试条。这些与胶粘剂的冷流相关的问题可通过使用直接铸造膜解决。例如,在直接铸造过程中,支撑塑料板可防止胶粘剂进入膜的孔隙中,因而避免了储存时胶粘剂的纵向流动。
样品垫
样品垫(102)位于试条的一端,并可与层析介质(104)进行毛细流动传输。基本上,样品垫的作用是接收含有目标分析物的液体样品以使分析物开始毛细流动,并需要与核酸具有最小的结合活性。同时它也可以过滤样品中的不溶颗粒。基于上述考虑,优选用于本发明的样品垫包括但不局限于可提供过滤功能的纤维素滤纸或玻璃纤维滤纸。例如,Millipore的纤维素纤维材料(Cat#CFSP223000)可作为样品垫使用。优选对样品垫进行前处理,以避免样品中的分析物在其中被非特异性吸收、使样品中的成分易于流过层析介质、以及保持反应灵敏度。通常通过使用失活蛋白或表面活性剂处理样品垫来完成对样品垫的前处理。例如,将衬垫材料浸入含有0.1至10%的牛血清白蛋白的0.1M Tris缓冲液(pH 6-9)、含有0.1%至10%脱脂奶粉的0.1MTris缓冲液(pH 6-9)和/或0.1至10%的酪蛋白溶液中以完成前处理。使用表面活性剂的前处理是通过将衬垫进入例如0.01%至1%的Triton X-100或2(非离子型表面活性剂)的溶液中,接着在高温下抽干。优选使用失活蛋白处理样品垫,然后使用表面活性剂处理。然而,前处理步骤所用的特定的步骤、条件和试剂可根据被检测的分析物和样品的性质而改变。
层析介质
层析介质(104)可在其两端与样品垫(102)和吸收垫(103)进行毛细流动传输。该层析介质(104)可被固相载体支撑,在这种情况下它可通过上述方法结合在载体上,或者其本身也可作为固相载体。可用作层析介质的材料包括任何可使流体样品中的液体和分析物,特别是其中的核酸,通过毛细作用流过该材料并和被固定在上面的捕获分子发生作用的材料,该材料可被修饰以便与捕获分子进行共价或非共价结合。捕获分子可通过例如化学键被固定在层析介质上。该化学键可通过已知方法(LABORATORYTECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY,Volume15,Edited by R.H.BURDON and P.H.Van KNIPPENBERG ELSEVIERAMSTERDAM:NEW YORK,OXFORD(1985)P.318-322)形成。通常,层析介质为多孔材料,以使水溶液进行毛细流动。可用于本发明的层析介质包括但不局限于,例如,纤维素、硝基纤维素、聚醚砜、聚偏氟乙烯、尼龙、带电尼龙、陶瓷和聚四氟乙烯。在一个实施方式中,使用硝基纤维素作为层析介质,其孔径至少为0.1μm,优选至少约1.0μm,更优选是约0.2μm至约20μm,最优选约0.2μm到约12μm。当使用颗粒材料作为标记手段时,则孔径需要至少为所用颗粒尺寸的10倍。该层析介质可为多功能,或被修饰为多功能,以便与捕获分子进行共价结合。用于本发明的优选层析介质包括Schleicher&Schuell生物科学公司的Prima 60、85、AE98、AE99和AE100;Millipore的HiFlow Plus HF09004、HF13504、HF090、HF120、HF135、HF180和HF240;和Sartorius AG的CN90、CN140。
吸收垫
吸收垫(103)位于固相载体上与样品垫相反的另一端,可与层析介质的一端进行毛细流动传输。吸收垫可以物理吸收任何通过毛细作用流过样品垫和层析介质的液体并除去未反应的物质,如果存在的话。位于试条末端的吸收垫控制或加快分析物和液体样品的毛细流动速度,也是储藏它们的容器。被传输物质的速度取决于所用吸收垫的不同尺寸和性质。可用于本发明中的吸收垫的例子包括硝基纤维素、纤维素酯、玻璃(例如硼硅玻璃纤维)、聚醚砜、棉花、脱水聚丙烯酰胺、硅胶和聚乙二醇等。毛细流动的速度可通过选择合适的吸收垫来进行可选择控制。
激光诱导落射荧光检测装置
使用激光诱导落射荧光检测装置来测量落射荧光以检测分析物的含量。图2是本发明的激光诱导落射荧光装置的一个示例,其中包含激光装置(201)、激光光束控制透镜(202)、激发滤光片、聚光透镜(203)、荧光滤镜(204)、聚光透镜(205)、空间滤波器(206)、光探测器(207)、模拟数字转换器(ADC)和中央处理单元(CPU)。可用于本发明的检测装置的示例包括本申请人在韩国专利No.063776中描述的装置、GSI扫描仪(GSI集团公司,美国)或Axon(Axon仪器公司,美国)。一般来说,由激光诱导落射荧光检测装置发出的平行激光束经过激发滤光片被聚焦到样品上,接着,捕获物-分析物复合体中的荧光染料发出的光反过来经过聚光透镜、荧光滤镜和聚光透镜指向空间滤波器的中心并到达光探测器,在这里该信号通过ADC和CPU被转化为可读的格式。
也就是说,激光诱导落射荧光检测装置被用于检测来自于通过序列特异性杂交形成的捕获物-分析物(核酸分子)复合体的信号,而由目标分析物中的染料发出的荧光信号被该装置收集和转换以量化样品中的分析物。在该过程中,在完成层析后该试条被放到光源下扫描以收集和检测该试条发出的荧光信号。优选对来自该试条的信号进行多次扫描以增强灵敏度。
现在将参照图1和2对本发明中的横向流检测试条及用于检测和/或定量测定分析物的方法进行更详细的说明。该说明使得本发明的特征和优点更为显而易见。
图1描述了用于检测样品中核酸的横向流检测试条的一个实例。在该横向流测试中,首先将样品涂布到样品垫(102)的样品涂布点(109)上。之后该水溶液样品通过毛细作用流过试条。该流动速度受到所用吸收垫的类型、性质和尺寸的影响。当使用生物素标记核酸时,将涂有链亲和素的颗粒在涂样前加入样品中。试条上固定有已知含量捕获分子的区域(105)与样品涂布点间具有一段已知距离。捕获分子含有能够通过序列特异性杂交与样品中的核酸结合的序列,而由于捕获分子固定在层析介质上,该捕获分子不会在试条上流动。因此可以在试条的层析介质的区域(105、108)使用检测装置检测捕获物-分析物复合体的信号,该区域上固定有捕获分子。
为了确定样品中目标分子的含量,可用已知浓度的分析物建立目标分析物的标准曲线。该曲线作为参考标准用于推断未知浓度的目标核酸的定量信息。
本发明被进一步参照一下实施例进行详细说明。然而所述实施例不应以任何形式被用于限制本发明的范围。
除非另作说明,本发明可通过本领域技术人员所掌握的知识、信息和技术被稳定重复。可参考以下书籍和出版物以获得分子生物学和生物化学的常用信息:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.(Sambrook et al.,Harbor Laboratory Press 2001);Short Protocols in Molecular Biology,4th Ed.(Ausubel et al.eds.,John Wiley&Sons 1999);DNA Cloning,Volumes I and II(Glover ed.,1985);Oligonucleotide Synthesis(Gait ed.,1984);Nucleic AcidHybridization(Hames and Higgins eds.1984);Transcription and Translation(Hames and Higgins eds.1984);Culture Of Animal Cells(Freshney and Alan,Liss,Inc.,1987);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Miller and Calos,eds.);Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in MolecularBiology,3rd Edition(Ausubel et al.,eds.);Recombinant DNA Methodology(Wu,ed.,Academic Press);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Miller andCalos,eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory);Methods in Enzymology,Vols.154 and 155(Wu et al.,eds.);Immobilized Cell and Enzymes(IRL Press,1986);Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);the treatise,Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.);ImmunochemicalMethods in Cell and Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,AcademicPress,London,1987);Handbook of Experimental Immunology,Volumes I-IV(Weir and Blackwell,eds.,1986);Protein Methods(Bollag et al.,John Wiley&Sons 1996);Immunology Methods Manual(Lefkovits ed.,Academic Press 1997);和Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths,John Wiley&Sons 1998)。所用试剂、克隆载体和各种试剂盒及染料可从BioRad、Strategene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和ClonTech等公司购买。
实施例1
目标分析物和捕获分子的制备
为了制备用于检测HPV DNA试条,目标分析物制备如下。首先,从鉴定为HPV亚型16、18或HPV阳性的活检样品(该活检样品来自韩国首尔的Yonsei大学并使用DNA芯片鉴定其类型)中提取基因组DNA。接着通过苯酚/氯仿萃取纯化所提取的基因组DNA,其中将1ml DNA溶液与1ml苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合之后缓慢旋转,并在室温下以14,000rpm的速度离心分离5分钟。离心分离后,将上清液转移到干净的试管中,在-20℃下向其中加入两倍体积的100%乙醇并混合均匀。然后混合物的上清液通过在4℃下以14,000的速度离心分离15分钟而除去,并用70%EtOH温和清洗沉淀物。在4℃下以14,000的速度离心分离15分钟以除去剩余的EtOH,将沉淀物在37℃下干燥,溶解在30μl的蒸馏水中并在使用前保存在-20℃下。之后使用以下表2中所列引物扩增能够确定亚型的HPV基因组区域,即目标序列(分析物)。使用生物素标记所有反义链引物。将2μl的如上制备的各活检样品的特异性DNA与1μl的各引物1号和2号(或1号和3号)混合。用于PCR反应的成分如下所述:10x Hot prime TaqTM缓冲液5μl、dNTP混合物4μl、25mM MgCl24μl、Hot prime TaqTM聚合酶0.7μl、D.D.W32.3μl。所用的PCR反应条件如下所述:94℃,2分钟X 1循环,(94℃,30秒,53℃,30秒,72℃,1分钟)X 30循环,72℃,5分钟X 1循环。引物和捕获DNA由Genotech(韩国)合成,而Taq聚合酶来自Takara(日本,Ex Taq和Ex缓冲液)。将PCR扩增产物使用MP生物制药,LLC的PCR纯化试剂盒根据厂家说明书进行纯化。
用于扩增的引物参照以下文献选自HPV的L1区(Jianduan Li et al.,Denaturing High-Performance Liquid Chromatography for Detecting and TypingGenital Human Papillomavirus.J of Clinical Microbiology2003;41(4):5563-5571;A J van den Brule et al.Journal of Clinical Microbiology.1990;28(12):2739-2743;and Ana-Maria de Roda Husman et al.,Journal ofGeneral Virology.1995:76;1057-1062.)。捕获序列参照以下文献选择:Ana-Maria de Roda Husman et al.The use of general primers GP5 and GP6elongated at their 3′ends with adjacent highly conserved sequences improveshuman papillomavirus detection by PCR.J.of General Virology.1995;76:1057-62;P.E.Gravitt et al.,Improved amplification of genital humanpapillomaviruses.J of Clinical Microbiology.2000;38(1):357-61;BernhardKleter et al.Novel short-fragment PCR assay for highly sensitive broad-spectrumdetection of anogenital human papillomaviruses.American J of Pathology.1998;153(6):1731-9;Peter J.F.Snijders et al.The use of general primers in thepolymerase chain reaction permits the detection of a broad spectrum of humanpapillomavirus genotypes.J of General Virology.1990;71:173-81)。
表2
实施例2
样品垫的前处理
通过对样品垫进行前处理来提高液体样品中组分/分析物的流速和保证灵敏度及减少目标分析物和/或捕获DNA在硝基纤维素膜上的非特异性结合。将样品垫(2.5x 30cm)浸入含有1%BSA、0.05%的磷酸盐缓冲液(PBS,137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM磷酸氢二钠,2mM磷酸二氢钾,pH 7.4)10分钟以达到平衡。之后将样品垫在50℃下抽干除去多余的溶液以防止变形。在使用前将经过前处理的样品垫在干燥条件下保存。
实施例3
捕获序列在硝基纤维素膜上的固定
将硝基纤维素膜(Millipore,HF 180)用作层析介质。将实施例1中制备的捕获DNA用蒸馏水稀释至100pM,在95℃下煮沸5分钟,接着用3X SSC(氯化钠/柠檬酸钠缓冲液)(Sigma-Aldrich,美国)稀释十倍。之后使用Bio-Dot(美国)的微量分注器(microdispenser)将所制得的DNA以1μl/cm的量进行沉淀以在硝基纤维素膜的区域形成一条1mm宽的线,所述区域与样品垫相隔2.8mm。在沉淀捕获DNA后,在42℃下将硝基纤维素膜干燥一小时,之后以1200J的强度用紫外照射5分钟以固定捕获DNA,该方法经测试证明为最有效的固定条件(图3)。将上述制备的试条与以下实施例4中所述的试条的其它成分一起结合在载体上,并放入适合用于韩国Boditech医药公司的激光诱导落射荧光检测器(激光-荧光扫描仪,i-)的一次性暗盒/支架(16x 90mm)中。之后将所得试条在干燥条件下单个包装,并在使用前保存在室温下。
实施例4
试条的制备
将分别按照以上实施例2和3制备的样品垫和硝基纤维素膜及吸收垫(纤维素膜,3M色谱级)和固相载体(韩国PJ公司,带有粘合剂的塑料载体)附于一次性暗盒(16x 90mm)中。将实施例3中制备的NC膜切割为25mm x 300mm并放在尺寸为89mm x 300mm的载体中央。之后将样品垫放在载体一端,吸收垫放置在载体另一端,并分别与中间的NC膜两端重合0.2mm。之后将所得试条切割为4.11mm x 64.8mm并插入一次性暗盒中。将所得试条在干燥条件下单个包装并在使用前保存在室温下。
实施例5
荧光珠和亲和素复合物的制备
将100mM MES缓冲液(2-(N-吗啉)甲磺酸,pH 6.0,25mM NaCl,2%珠溶液(Molecular Probes的Alexa 647荧光珠,直径0.2μm,表面被羧基化),0.2mg EDC(二氯乙烯)和0.5mg硫化NHS在室温下混合均匀并在室温下反应15分钟,接着超声1分钟。在超声后向混合物中加入15μl的2-巯基乙醇并反应5分钟以除去未反应的EDC,之后再进行一轮1分钟的超声。在第二次超声后,加入100μg亲和素(Kem&Tec公司),接着在室温下培养30分钟。之后以14,000rpm的速度离心分离5分钟以除去上清液,使用洗涤缓冲液(50mM NaPi pH 7.4,50mM NaCl)将沉淀物清洗三次。在最后一次清洗步骤后,加入阻断缓冲液(50mM NaPi pH 7.4,50mM NaCl,1%BSA,0.1%20)并在4℃下反应1小时,接着加入稳定缓冲液(50mM NaPipH 7.4,50mM NaCl,1%BSA,0.1%20,25%海藻糖,0.1%叠氮化钠)以稳定荧光珠。
实施例6
使用试条对HPV的PCR产物进行杂交测试
将根据实施例1中所述使用Cy5标记的引物制备得到的PCR产物与0.4N NaOH以1∶1的比例混合变性,并在室温下反应3分钟。在培养后以1∶100的比例加入中和缓冲液(1M Tris-Cl,0.3%20,pH 6.3),将100μl所得溶液涂布到试条的样品垫上,而相应的捕获分子则根据实施例3和4被固定在该试条上,等待12分钟以进行横向流动。12分钟后使用荧光检测设备i-(Boditech医药公司,韩国)对试纸进行扫描。
关于生物素标记的引物,将根据实施例1中使用生物素标记的引物制备得到的PCR产物与0.4N NaOH以1∶1的比例混合并在室温下反应3分钟。在培养后,以1∶10的比例加入50μl的中和缓冲液(1M Tris-Cl,0.3%20,pH6.3)和0.1%实施例5中制备的荧光珠,并混合均匀。将100μl的所得混合物涂布到试条的样品垫上,而相应的捕获分子则根据实施例3和4被固定在该试条上,等待12分钟以进行横向流动。12分钟后使用荧光检测设备i-(Boditech医药公司,韩国)对试纸进行扫描。用于层析分离的缓冲液是含有1%明胶、0.3%20、0.1%硫柳汞的PBS。试条的位置是由设备自动确定的相对位置。
实施例7
HPV检测的特异性和交叉反应测试
使用在实施例1中被确认为HPV 16或18的从活检样品中提取的基因组DNA作为模版并使用Cy5标记的引物进行PCR以得到150bp长度的产物。将扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳(图4)。将所得产物根据实施例6中所述进行处理并加到实施例4中制备的试条上,使用i-(Boditech医药公司)扫描12分钟。该试条上固定有实施例1中所述的HPV16或18的特异性捕获分子。结果如图5和6中所示。从图中可以看出,只能在带有HPV 16的特异性捕获分子的位置检测到HPV 16目标序列(分析物)的信号,而也只能在带有HPV 18的特异性捕获分子的位置检测到HPV 18目标序列(分析物)的信号。因此该结果表明在HPV 16和18之间不存在交叉反应。
实施例8
HPV检测的灵敏度
在该实验中分别独立使用两个被鉴定为HPV阳性的活检样品。使用生物素标记的引物(表2中的1号和3号)对由样品中提取的基因组DNA进行PCR,其反应条件与实施例1相同,除了分别进行3次、5次、10次、20次和30次PCR循环。将扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳(图4)。按照实施例6中所述对该产物进行处理,并涂布到实施例4中制备的试条上,使用i-(Boditech医药公司)扫描12分钟以进行荧光检测。其结果如图7到10中所示。由图7和8可知,当使用本发明中的试条时,只进行5次或更少的PCR循环就足以检测到捕获物-分析物杂交体的阳性荧光信号,该结果与通过电泳方法(2%琼脂糖凝胶)得到的阴性结果相反。当使用来自其它独立来源的样品时会得到相同结果(图9和10)。
实施例9
在测试时使用未纯化的分析物扩增产物
通常在进行下一步分析时需要将PCR产物在扩增后进行纯化。然而去除该纯化步骤具有加快分析速度和降低成本的优点。由图11可知,使用引物1号和3号对实施例1中相同的HPV阳性样品进行两次相同的PCR。在反应后,使用纯化试剂盒(MP生物医药,LLC)对扩增产物之一进行纯化,而另一个则未经纯化。分别使用实施例6中的本发明中的试条对它们进行测试。由图11可知,未经纯化产物的信号比纯化产物的信号弱。
为了增强未经纯化产物的信号,以下确定了在PCR反应中减弱信号的因素。在如图12和13所示不同浓度的不同化学物质的存在下按照以上描述进行同样的PCR反应。由图12可知,发现2.5mM的MgCl2对信号的不利影响最大。根据该结果,在试条测试之前,用50mM EDTA对未纯化的PCR扩增产物进行处理以除去反应缓冲液中的MgCl2,进而得到了与纯化产物相同的信号强度(图13)。在图13中使用生物素和琏亲和素进行检测。
实施例10
不同类型HPV阳性样品的横向流测试
从HPV阳性的子宫颈癌患者的39个活检样品中提取基因组DNA(表3)(来自Yonsei大学,每个病人均知情同意),对每个DNA样品使用实施例1中的引物1号和3号进行30次PCR循环。通过2%琼脂糖凝胶电泳(图4)和实施例4和6中的试条测试对该扩增产物进行鉴定。结果如图15(A和B)所示。由图15可知,电泳测试没有发现一些已鉴定为HPV阳性样品的HPV条带,但在本试条测试中所有被鉴定为HPV阳性的样品均产生了荧光信号。
表3
CIN(宫颈上皮内瘤样病变),CIS(原位癌),HGSIL(高度鳞状上皮内病变),LGSIL(低度鳞状上皮内病变),SCC(鳞状细胞癌),CSIL(宫颈鳞状上皮内病变)
另外,当在上述同样条件下对由#37列中的非特异性条带(图14)中提取的DNA进行PCR时,没有检测到阳性荧光信号(图16)。这说明非特异性扩增产物不会干扰本系统中的HPV检测,这证明了本系统的优异特异性。在图15和16中,非特异性表示阴性对照。
实施例11
未经DNA前提取的活检样品的PCR扩增产物的横向流测试
通常,在使用生物素标记的引物进行PCR时,需要在作为模版使用前将DNA从活检样品中提取和纯化。然而,为了减少样品制备时间进而减少所需总分析时间,活检样品本身就可作为模版使用而不需进行DNA前提取。在与实施例1相同的条件下对实施例10中的5号HPV阳性样品进行PCR。之后使用电泳和实施例4和6中所述横向流测试分析扩增产物。由图17可知,电泳测试没有得到阳性结果,该结果与使用本系统的横向流测试检测到的阳性结果(图18)相反。该结果表明本系统可以在不破坏特异性的前提下通过去掉所需DNA的提取步骤进一步减少总分析时间。
常规的HPV测试通常需要从活检样品中制备DNA的步骤和DNA的PCR扩增以检测子宫颈癌。该传统方法具有一定程度的特异性和灵敏度;然而它们具有反应时间长和步骤复杂等缺点。相反,基于DNA色谱的本系统不仅具有较好的检测特异性和灵敏度,还通过去除PCR前的DNA提取和PCR后的纯化步骤以及具有较快的色谱反应,从而具有更短的测试时间,致使至少减少了50%的总分析时间。另外,需要注意的是本系统不仅局限于HPV检测,也可使用各种捕获分子来检测来自各种来源的DNA。还需要注意的是该测试中使用了多于一种捕获分子对多种DNA进行同时检测/鉴定。
对于此处所用的实质上的复数和/或单数术语,本领域中技术人员可根据是否适合上下文和/或该申请将复数转为单数和/或将单数转为复数。为了表达清楚,可以在此处表达各种单数/复数排列。
除了此处公开的各方面和实施例,其它方面和实施例对本领域中技术人员也是显而易见的。此处公开的各方面和实施例是为了示例性说明,而不是用作限制,而真实的保护范围和主题将由以下权利要求表示。
Claims (19)
1.一种用于定性和/或定量检测样品中核酸的横向流试条,包括:提供样品涂布点的样品垫;吸收垫;以允许相互之间进行毛细流动传输的方式位于所述样品垫和所述吸收垫之间的层析介质,所述层析介质包含至少一种捕获分子,所述捕获分子能够与涂布到所述样品垫上的所述样品中的所述核酸进行序列特异性杂交;和固相载体,支撑以相同平面位于所述固相载体上以容许相互之间进行毛细流动传输的所述层析介质、所述样品垫和所述吸收垫。
2.如权利要求1所述的试条,其中所述至少一种捕获分子具有来自人类乳头状瘤病毒的序列。
3.如权利要求1所述的试条,其中所述至少一种捕获分子具有来自HPV亚型的序列,所述HPV亚型选自由HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73、82、6、11、40、42、43、44、54、61、72、81和CP108组成的组中。
4.如权利要求3所述试条,其中所述HPV亚型选自由6、11、16、18、31、45和51组成的组中。
5.如权利要求1至4中任一项所述的试条,其中涂布到所述样品垫上的所述核酸为聚合酶链反应产物。
6.如权利要求5所述的试条,其中所述PCR进行1到10次循环。
7.如权利要求6所述的试条,其中所述PCR进行1到5次循环。
8.如权利要求1至7中任一项所述的试条,其中涂布到所述样品垫上的所述核酸用荧光材料或生物素标记。
9.一种用于定性和/或定量鉴定样品中的核酸的横向流试条,包括:提供样品涂布点的样品垫;吸收垫;以允许相互之间进行毛细流动传输的方式位于所述样品垫和所述吸收垫之间的层析介质,所述层析介质具有至少一种捕获分子,所述捕获分子能够与涂布到所述样品垫上的所述样品中的所述核酸进行序列特异性杂交;和固相载体,支撑以相同平面位于所述固相载体上以容许相互之间进行毛细流动传输的所述层析介质、所述样品垫和所述吸收垫,所述样品中的所述核酸用荧光材料或生物素标记,且为PCR产物。
10.如权利要求9所述的试条,其中所述PCR进行1到10次循环。
11.如权利要求5所述的试条,其中所述PCR进行1到5次PCR循环。
12.如权利要求9至11中任一项所述的试条,其中所述至少一种捕获分子具有来自人类乳头状瘤病毒的序列。
13.如权利要求9至11中任一项所述的试条,其中所述至少一种捕获分子具有来自HPV亚型的序列,所述HPV亚型选自由HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73、82、6、11、40、42、43、44、54、61、72、81和CP108组成的组中。
14.如权利要求13所述的试条,其中所述HPV亚型选自由6、11、16、18、31、45和51组成的组中。
15.一种系统,所述系统包括权利要求1至14中任一项所述的试条和用于检测由所述捕获分子存在的点发出的信号的落射荧光检测装置。
16.一种使用权利要求1至14中任一项所述的试条对样品中的核酸进行定性和/或定量检测的方法,所述方法包括以下步骤:将含有以荧光素或生物素标记的目标核酸序列的液体样品涂布到所述试条的样品垫上;使所述液体样品流到所述试条的吸收垫上,其中固定于所述试条的特定位置上的至少一个捕获分子与所述目标核酸序列进行序列特异性反应以形成杂交体;和使用落射荧光装置检测由所述杂交体上的标记物发出的信号,其中所述信号的存在表明存在所述目标核酸,或所述信号用于量化所述样品中的所述目标核酸的量。
17.如权利要求16所述的方法,其中所述至少一种捕获分子具有来自人类乳头状瘤病毒的序列。
18.如权利要求16所述的方法,其中所述至少一种捕获分子具有来自HPV亚型的序列,所述HPV亚型选自由HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73、82、6、11、40、42、43、44、54、61、72、81和CP108组成的组中。
19.如权利要求18所述的方法,其中所述HPV亚型选自由6、11、16、18、31、45和51组成的组中。
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