KR101115014B1 - 핵산 검출용 크로마토그래피 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 측방이동 전개 방식 및 핵산의 서열 특이적 교잡반응의 원리를 기본으로 하는, 분석시료 중의 핵산 검출용 스트립, 상기 스트립을 포함하는 핵산 검출 시스템 및 상기 스트립을 이용한 특정 핵산 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 스트립, 시스템 및 방법은 사용의 용이성은 물론 검출 민감도 및 특이도가 매우 높아 소량의 핵산을 이용해서도 정확하며 신속한 분석을 가능하게 한다.
핵산, 스트립, 교잡반응, 바이러스

Description

핵산 검출용 크로마토그래피 시스템 {Chromatography System for Nucleic Acid Detection}
본 발명은 핵산 검출 분야에 관한 것으로, 구체적으로 핵산의 측방이동 전개 방식 및 핵산의 서열 특이적 교잡반응의 원리를 기본으로 하는, 분석시료 중의 특정 핵산 검출용 스트립, 상기 스트립을 포함하는 특정 핵산 검출 시스템 및 상기 스트립을 이용한 특정 핵산 검출 방법에 관한 것이다.
일반적으로 핵산(Nucleic acid)과 관련 있는 연구에서는 특정한 핵산 서열의 존재 여부에 대한 분석이 중요하다. 이러한 분석에서 현재 많이 사용되고 있는 방법 중의 하나는 중합효소연쇄반응을 이용해 특정 서열만을 선택적으로 증폭한 후 겔 전기영동, 서던블롯 및 노던블롯과 같은 교잡(hybridization) 방식을 이용하는 것이다. 그러나 이러한 방법은 작업에 오랜 시간이 소요되며 민감도가 떨어짐은 물론 교잡반응 시간, 교잡의 온도, 교잡에 사용되는 조성물의 조성 등과 같은 외부 조건에 따라 결과에 영향을 받으며 더욱이 정확한 시험 결과를 얻기 위해서는 최적의 조건을 찾기 위한 반복된 실험 및 특별이 잘 훈련된 전문가를 필요로 하는 등의 문제가 있다.
특히 핵산의 검출로 예를 들면 특정 질병의 유무와 같은 정확성을 요하는 판단에 있어서는 신속하면서도 재현성 있으며 민감성과 특이성이 높은 방법의 개발이 요구된다. 이러한 측면에서 근래에 단백질 검출의 경우는 항원 항체간의 반응을 이용한 면역학적 방법, 예를 들면 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), 면역크로마토그래피 방법이 개발되어 제품으로 사용되고 있으나, 시료의 처리 및 분석에 많은 시간이 소요된다. 특정 핵산의 검출이 질병의 진단 및 치료와 같은 의약분야, 예를 들면 특정 암의 진단 예컨대 자궁경부암과 같은 암의 진단에서 중요하게 대두되는 바, 기존의 방법을 대신할 수 있는 민감하고, 신속한 핵산 검출 시스템의 개발이 요구된다.
본원에서는 핵산을 분석, 검출함에 있어 측방이동 전개 방식 및 서열 특이적 교잡반응의 원리를 사용하여 기존의 핵산분석 방법에서 발생 되는 문제점들을 해결하고자 한 것이다. 본 발명은 사용의 용이함과 신속성은 물론 검출 민감도 및 특이도가 매우 높아 소량의 핵산을 이용해서도 정확한 분석을 가능하게 한다.
본 발명은 핵산 검출용 측방이동 스트립에 관한 것으로, 상기 스트립은 지지대, 전개용 매질, 샘플 패드 및 흡수 패드를 포함하며, 상기 지지대는 상기 전개용 매질, 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드를 지지하며, 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드는 서로 겹치지 않도록 상기 지지대의 양 단부에 각 각 위치되어 있으며, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 흡수 패드의 한 단부 및 상기 샘플 패드의 한 단부와 접해 있으며, 상기 전개용 매질에는 핵산을 포함하는, 한 종류 이상의 포획자가 부착되어 있으며, 상기 포획자는 상기 샘플 패드에 적하될 시료 중의 특정 핵산성분과 서열 특이적 교잡 반응을 할 수 있는 것인, 핵산 검출용 측방이동 스트립을 제공한다.
나아가 본 발명은 핵산 검출용 측방이동 스트립에 관한 것으로, 상기 스트립은 지지대, 전개용 매질, 샘플 패드 및 흡수 패드를 포함하며, 상기 지지대는 상기 전개용 매질, 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드를 지지하며, 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드는 서로 겹치지 않도록 상기 지지대의 양 단부에 각 각 위치되어 있으며, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 흡수패드의 한 단부 및 상기 샘플패드의 한 단부와 접해 있으며, 상기 전개용 매질에는 핵산을 포함하는, 한 종류 이상의 포획자가 소정의 위치에 부착되어 있으며, 상기 포획자 중 핵산은 상기 샘플패드에 적하될 시료 중의 특정 핵산성분과 서열 특이적 교잡 반응을 할 수 있으며, 상기 시료 중의 특정 핵산성분은 형광물질 또는 바이오틴으로 표지되어 있으며, 중합효소연쇄반응의 산물인, 핵산 검출용 측방이동 스트립을 제공한다.
본 발명은 또한 포획자의 핵산이 HPV (Human Papilloma Virus)에서 유래된 것인 HPV 핵산 검출용 측방이동 스트립을 제공한다.
본 발명은 또한 HPV 아형(type) 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82, 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81 및 CP108을 구분할 수 있는 HPV 핵산 검출용 측방이동 스트립을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 측방이동 스트립 및 상기 스트립의 포획자 위치에서 방출되는 검출신호를 검출하기 위한 표면형광 검출장치를 포함하는 핵산 검출 시스템을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 스트립을 이용한 시료 중의 핵산을 검출하는 방법에 관한 것으로 상기 방법은 샘플패드 상에, 형광물질 또는 바이오틴으로 표지된 분석하고자 하는 특정 핵산을 포함하는 시료를 적하하는 단계; 및 상기 시료가 전개용 매질을 통하여 이동되도록 하는 단계를 포함하며, 상기 이동 중, 상기 전개용 매질 상의 소정의 부위에 위치한 포획자 중의 핵산과 상기 시료 중의 특정 핵산이 서열 특이적 교잡 반응을 하며, 상기 포획자 위치에서 발생하는 형광신호를 형광 검출장치로 검출하는 단계로, 상기 포획자 위치에서의 형광신호의 검출은 상기 시료 중에, 상기 소정의 부위에 위치한 포획자와 서열 특이적으로 결합하는 핵산의 존재를 나타내는 것인, 핵산 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 단계를 포함하는 포획자의 핵산은 HPV (Human Papilloma Virus)에서 유래된 것인 HPV 핵산 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 HPV 아형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82, 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81 및 CP108을 구분하는 HPV 핵산 검출 방법을 제공한다.
한 양태에서 본 발명은 핵산 검출용 측방이동 스트립에 관한 것이다. 상기 스트립은 지지대, 전개용 매질, 샘플 패드 및 흡수 패드를 포함하며, 상기 지지대는 상기 전개용 매질, 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드를 지지하며, 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드는 서로 겹치지 않도록 상기 지지대의 양 단부에 각 각 위치되어 있으며, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 흡수 패드의 한 단부 및 상기 샘플 패드의 한 단부와 접해 있으며, 상기 전개용 매질에는 핵산을 포함하는, 한 종류 이상의 포획자가 부착되어 있으며, 상기 포획자는 상기 샘플 패드에 적하될 시료 중의 특정 핵산성분과 서열 특이적 교잡 반응을 할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 “접해있는”, “접한”은 서로 이어져 맞닿아 있거나 또는 겹쳐있는 것을 의미한다. 한 구현예에서 전개용 매질은 좌우 양 단부를 가지고 있으며, 그 한 단부는 흡수 패드의 한 단부와 이어져 맞닿아 있고, 다른 단부는 샘플 패드의 한 단부와 이어져 맞닿아 있다. 다른 구현예에서 전개용 매질은 그 한 단부가 흡수패드의 한 단부와 겹쳐져 있으며, 다른 단부는 샘플 패드의 한 단부와 겹쳐져 있다. 또 다른 구현예에서 전개용 매질의 한 단부는 흡수 패드의 한 단부와 이어져 맞닿아 있고, 다른 단부는 샘플패드의 한 단부와 겹쳐져 있거나 또는 그 반대인 경우도 있다. 단부끼리 이어져 맞닿아 있는 경우, 샘플패드, 흡수패드, 전개용 매질의 두께는 실질적으로 동일한 것이 바람직하다.
본원에서 사용된 용어 "시료"는 분석물을 포함하는 분석대상 화합물 또는 조성물을 가리키며, 본 발명에서 사용될 수 있는 시료는 전개용 매질을 이동할 수 있 어야 하므로 액체상 또는 액체와 유사한 유동성 있는 물질이다.
본원에서 사용된 용어“분석물"은 시료 중의 분석 대상 화합물로, 표적자라고도하며 핵산을 포함하는 것이다. 또한 본원에서 용어“핵산”은 지놈 DNA, cDNA 및 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화학합성 DNA 및 RNA를 포함한다. 또한 상기 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥을 포함하며, 지놈 DNA, cDNA 및 올리고뉴클레오타이드 및 RNA는 당업계의 공지된 방법에 따라 제조 또는 합성할 수 있다. 한 구현예에서 상기 핵산은 DNA, 특히 PCR로 합성된 DNA이며, 단일가닥으로 사용되며, 검출용 표지물질로 직접 또는 간접적으로 표지되어 있다. 예를 들면 형광분자 또는 바이오틴과 같은 모이어티를 포함하도록 합성될 수 있으며, 후자의 경우, 다시 이에 결합하는 스트렙타비딘 또는 아비딘이 결합된 검출입자와 반응시켜 검출용 표지물질로 표지될 수 있다. 검출입자로는 다양한 비드 예를 들면, 폴리스티렌 미세구, 라텍스입자, 나노골드입자, 콜로이드성 골드입자, 금속입자, 자성입자, 형광입자, 및 반도체 나노크리스탈 등을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 상기 검출 표지물질로 표지된 핵산은 특이적 서열 교잡반응에 의해 포획자와 결합시 검출 표지물질을 감지하는 검출장치를 통해 검출될 수 있다. 표적자의 증폭을 위해 PCR 수행시 검체를 직접 PCR에 사용할 수 있거나 또는 검체로부터 당업계의 공지된 방법으로 지놈 DNA를 추출한 후 PCR에 사용할 수 있다. 나아가 상기 PCR 산물은 직접 또는 정제 후에 본 발명에 따르는 분석의 다음 단계에 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 “표적서열”은 표적자로서 증폭되는 서열을 일컫는 것이다. 표적서열은 프라이머 결합부위를 포함한다. 표적서열의 선택은 검출 목 적에 좌우된다. 예를 들면 검출의 목적이 바이러스의 특정 유형을 구분하는 것이라면 표적서열은 한 유형을 다른 유형으로부터 구분할 수 있는 그 유형에 특이적 서열을 포함해야한다. 특이성을 위해 한 종류의 구분 표적서열을 사용할 수도 있으나, 여러 개를 사용하는 것도 가능하다. 예를 들면 병원균 특이적 서열, 독소유전자 특이적 서열 등과 같은 목적하는 분석에 특이성을 부여하는 다양한 정보가 공지되어 있다. 한 구현예에서 본 발명의 표적자는 인간유두종바이러스(Human Papilloma Virus, HPV), HCV (Hepatitis C Virus), HIV(Human Immunodeficiency Virus)를 포함하며, 표적서열은 각 바이러스 아형구분에 특이적 부위를 포함하는 것이다. 다른 구현예에서 표적자는 HPV이며, 상기 아형은 고위험군 및 저위험군 아형을 포함하는 것이다. 상기 고위험군에 속하는 아형은 HPV 아형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 다른 구현예에서 상기 저위험군에 속하는 아형은 HPV 아형 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81, CP108을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또다른 구현예에서 상기 HPV 아형은 6, 11, 16, 18, 31, 45 및 51을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 다른 구현예에서 상기 HPV 아형은 16 및 18을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본 발명에서 분석물을 직접 표지하는 형광물질(분자)은 흡수파장과 방출파장이 20nm 이상의 차이가 나는 것을 사용할 수 있는데, 대표적인 형광물질로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 형광 입자, 퀀텀도트(quantum dot), 란타니드 킬레이트(lanthanide chelate)(예, 사마륨(Sm), 유로피엄(Eu) 및 테르븀(Tb)) 및 플루오 레슨스(fluorescence)(예, FITC, 로다민 그린, 티아디카르보시아닌, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Alexa 488, Alexa 546, Alexa 594 및 Alexa 647)가 포함된다. 한 구현예에서 표적자 핵산은 바이오틴으로 표지되어 있으며, 다른 구현예에서는 형광물질 Cy3와 Cy5로 표지되어 있다. 일반적으로 형광의 세기는 여기광(excitation light)의 세기가 지나치게 강하지 않으면 여기광의 세기에 직접 비례한다. 또한 본원에서 사용된 용어 "표면형광"은 전개용 매질을 이용한 측방이동 검출 스트립의 포획자 위치에 검출되는 형광물질 표지된 분석물-포획자 복합체로부터 발광되는 형광을 말한다.
본원에서 용어 "포획자"는 시료 중의 분석물과 서열 특이적 결합을 할 수 있는 물질로서 핵산을 포함하며, 포획자는 전개용 매질을 통해 이동하는 분석물(표적자)을 서열 특이성에 의해 선택적으로 포획할 수 있다. 상기 포획자는 전개용 매질 상에 공유 또는 비공유적 결합으로 부착될 수 있으며, 부착이란, 상기 전개 매질의 이동상이 이동하더라도 같이 이동하지 않고 고정된 자리 위치한 상태를 말한다. 한 구현예에서 상기 포획자는 전개용 매질에 비공유 결합으로 부착되어 있다. 핵산을 예를 들면 나이트로셀룰로스와 같은 다공성 막에 부착하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들면 고농도의 염을 사용하여 핵산을 막의 표면에 흡착시킨 후 고온(80°C)에서 열처리하여 고정시키는 방법이 있다. 또는 핵산을 막에 적하한 후 공기중에서 건조한 후 UV를 조사하는 방법이 있다. 또는 포획자 올리고뉴클레오타이드를 동량의 소디움클로라이드 및 소디움사이트레이트의 존재 하에서 진공에서 처리하거나, 또는 UV 처리하여 직접 고정할 수 있다. 또는 포획자 핵산은 하전된 나일론 막에 공유결합으로 고정될 수 있다. 한 구현예에서 상기 포획자는 올리고뉴클레오타이드이며, 단일가닥이다. 상기 올리고뉴클레오타이드의 서열은 표적자 서열의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 갖고 있다. 이상적으로는 표적자 서열을 검색하여 내부 수소결합으로 인한 이차구조 생성의 가능성이 낮은 부위를 포획자 서열 선정에 사용하는 것이 바람직하다. 포획자는 예를 들면 나이트로셀룰로스 막에 선폭 약 1mm 이하로 분주 될 수 있으나 이러한 범위를 벋어나는 것을 제외하는 것은 아니다. 구체적 수치는 사용하는 전개용 매질의 종류의 따라 달라질 수 있다. 분주에 필요한 포획자의 농도는 일반적으로 약 10 ~ 150pM이나, 이 범위를 벋어나는 것을 제외하는 것은 아니다. 한 구현예에서 포획자의 농도는 약 50pM이다. 다른 구현예에서 포획자의 농도는 약 100pM 이다. 적어도 하나의 포획자가 스트립으로 사용되는 전개용 매질 상의 소정의 위치에 위치하며, 분석을 위해 양성 또는 음성 대조군용 포획자를 포함할 수 있다. 소정의 위치란, 시료가 전개되는 방향으로 시료의 적하 지점으로부터 일정 간격 떨어진 위치(이하, '분석물 측정지역'이라 함)를 말하는 것으로 스트립에 분주되는 포획자의 갯 수에 따라 다 수가 존재할 수 있다. 예를 들면 샘플 패드 상의 시료 적하 지점으로부터 약 2 내지 5mm 떨어진 지점에 첫 번째 위치를 기준으로 약 1mm 이상의 간격을 두고 다수의 위치에 포획자가 존재할 수 있다. 다수의 포획자가 하나의 전개용 매질에 부착될 수 있으며, 당업자라면 전개용 매질의 특성, 크기, 분석물의 특성 등을 고려하여 하나의 전개용 매질에 포함될 수 있는 포획자의 수를 선택할 수 있을 것이다. 한 구현예에서 1종류, 2 종류, 3 종류, 4 종류, 5 종류, 6 종류, 7 종류, 8 종류, 9 종류, 10 종류, 11 종류, 12 종류, 또는 그 이상의 포획자가 전개용 매질의 소정의 위치에 존재할 수 있다. 이런 경우 포획자간의 간격은 스트립의 길이 및 포획자의 갯 수에 따라 달라진다. 한 구현예에서 포획자간의 간격은 약 1 mm 이상이나, 이보다 좁은 범위를 제외하는 것은 아니다.
핵산 포획자의 길이는 대략 약 10 내지 200 base이나, 경우에 따라 이 범위를 벋어나는 것을 제외하는 것은 아니다. 한 구현예에서 포획자의 길이는 20 base, 30 base, 40 base, 50 base, 70 base, 80base, 90 base, 100 base, 110 base, 120 base, 130 base 등 일 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니며, 당업자라면 분석하고자하는 시료의 특성을 고려하여 적절한 포획자의 서열 및 길이를 선택할 수 있을 것이다. 전형적으로 20 base 이상이거나 또는 대략 50-70°C의 멜팅포인트를 나타내는 길이가 적절하다. 한 구현예에서는 9 내지 20 개의 T 잔기로 이루어진 스페이서 서열을 추가할 수 있다. 다른 구현예에서는 변형된 핵산 예컨대 PNA (peptide nucleic acid) 또는 LNA (locked nucleic acid)삽입하여 교잡특성을 향상시킬 수 있는데, 이는 원하는 멜팅포인트의 조절 또는 짧은 길이의 올리고뉴클레오타이드를 사용해야만 하는 경우에 특히 유리할 수 있다. 이러한 포획자는 표적자와 0, 1 또는 2 base이내의 차이로 결합할 수 있도록 디자인되어야 한다. 이는 베이스 적축(base stacking)이 안정된 교잡반응에 중요하기 때문이다. 포획자의 특정 서열은 검출하고자 하는 시료 중의 분석물의 핵산 서열에 따라 정해진다. 따라서 검출하고자 하는 분석물의 종류만큼 다양한 포획자가 사용될 수 있다. 한 구현예에서 상기 포획자는 HPV 서열에서 유래되며, 고위험군 및 저위험군 아형을 포함하는 것이다. 상기 고위험군에 속하는 아형은 HPV 아형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 다른 구현예에서 상기 저위험군에 속하는 아형은 HPV 아형 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81, CP108을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또다른 구현예에서 상기 HPV 아형은 6, 11, 16, 18, 31, 45 및 51을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 다른 구현예에서 상기 HPV 아형은 16 및 18을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
추가로 본 발명의 스트립은 오염 등의 방지를 위해 스트립을 감싸는 하우징(케이스)을 더 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 스트립은 스트립의 오염 등을 방지하기 위해 시료의 적하 위치와 표면형광 측정지역을 제외하고 스트립 전체를 감싸도록 구성된 스트립 하우징을 더 포함할 수 있다. 한 구현예에서 도 2의 기재된 것 (109)과 같은 것을 포함하나, 이로 한정하는 것은 아니다.
다른 양태에서 본원은 본 발명에 따른 측방이동 스트립 및 상기 스트립의 포획자 위치에서 방출되는 형광 신호를 검출하기 위한 표면형광 검출장치를 포함하는 핵산 검출 시스템을 제공한다.
구체적으로 상기 표면형광 검출장치는 레이저의 레이저빔 형상제어용 렌즈와 여기필터를 통과한 빛을 조사하여 이로부터 반사된 빛을 포집렌즈에 통과시켜 평행광을 형성하고, 이 평행광을 형광필터에 통과시켜 산란광을 걸러내고 순수한 형광성분광만 집광렌즈로 입사시키고, 이 집광렌즈에 의해 형광성분광이 공간필터의 중심으로 집속되며, 상기 공간필터에서 순수한 형광성분 광 이외의 빛이 제거된 광만 이 광검출기로 입사되며, 광검출기로 입사된 광은 아날로그 디지털 컨버터(ADC)를 통해 CPU로 전달되어 상기 복합체의 형광 양을 표준 형광양에 대하여 상대적으로 비교하여 핵산 분석물을 검출, 정량한다. 한 구현예에서 상기 표면형광 검출장치는 i- Chroma (바디텍메드 주, 한국) 및 Biosite사의 제품을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
또 다른 양태에서 본원은 본 발명에 따른 스트립을 이용한 시료 중의 핵산을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 샘플패드 상에 검출물질로 표지된, 분석하고자 하는 특정 핵산을 포함하는 시료를 적하하는 단계, 상기 시료가 전개 매질을 통하여 이동되는 단계를 포함하며, 상기 이동 중, 상기 전개 매질 상의 소정의 부위에 위치한 포획자 중의 핵산과 상기 시료 중의 특정 핵산이 서열 특이적 교잡 반응을 하며, 상기 포획자에서 발생하는 검출신호를 검출장치로 검출하는 단계로, 소정 부위에서의 검출신호의 검출은 상기 시료 중에, 상기 소정의 부위에 위치한 포획자와 서열 특이적으로 결합하는 핵산의 존재를 나타낸다.
본 발명의 방법은 시료 중에 포함된 표적자의 특이적 검출, 특히 DNA, RNA의 검출에 용이하다. 전형적으로 분석대상의 시료를 채취하고, 이로부터 DNA, RNA를 추출하고 이를 PCR의 방법을 통해 대상 분석물 중 표적서열을 증폭하여 표적자의 양을 늘린 후, 상기 표적서열에 상보적으로 결합할 수 있는 특이적 포획자 서열을 포함하는 본 발명의 스트립 및 이를 포함하는 시스템으로 특정 핵산의 존재 여부를 검사하는 것이다. 본 발명의 방법을 이용할 경우, 5 사이클 미만의 짧은 PCR로도 특정 핵산의 검출이 가능하다. 또한 표적서열을 증폭함에 있어 검체로부터 핵산을 추출하지 않고 검체를 직접 증폭에 사용하는 것도 가능하다. 검체로부터 핵산을 추출할 경우, DNA 또는 RNA를 추출하는 다양한 방법이 공지되어 있으며 이들을 추출하는 키트도 시중에서 구입할 수 있다. 이러한 것이 모두 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 전형적으로 표적자는 합성된 후 단일가닥으로 사용된다. 본원에서 사용된 용어 “표적서열”은 표적자 중의 증폭되는 서열을 일컫는 것이다. 표적서열은 프라이머 결합부위를 포함한다. 표적서열을 선택은 검출 목적에 좌우된다. 예를 들면 검출의 목적이 바이러스의 특정 유형을 구분하는 것이라면 표적서열은 한 유형을 다른 유형으로부터 구분지을 수 있는 그 유형에 특이적 서열을 포함해야한다. 특이성을 위해 한 종류의 구분 표적서열을 사용할 수도 있으나, 여러 개를 사용하는 것도 가능하다. 예를 들면 병원균 특이적 서열, 독소유전자 특이적 서열을 포함하는 목적하는 분석에 특이성을 부여하는 다양한 정보가 공지되어 있다.
상기 표적자는 검출 표지물질로 직접 또는 간접적으로 표지되어 있다. 검출물질은 시료의 적하 전에 액체시료에 혼합되는 방식으로 도입되거나, 시료 중 핵산의 준비, DNA 합성 시에 도입될 수 있다. 예를 들면 표적자는 형광분자 또는 바이오틴과 같은 모이어티를 포함하도록 합성될 수 있으며, 후자의 경우, 다시 이에 결합하는 스트렙타비딘이 결합된 검출입자와 반응하여 검출 표지물질로 표지될 수 있다. 검출입자로는 다양한 비드 예를 들면, 폴리스티렌 미세구, 라텍스입자, 나노골드입자, 콜로이드성 골드입자, 금속입자, 자성입자, 형광입자, 및 반도체 나노크리스탈 등을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 상기 검출물질로 표지된 핵산 은 특이적 서열 교잡반응에 의해 포획자와 결합시 상응하는 검출장치를 통해 검출될 수 있다. 예를 들면 PCR을 이용해 특정 DNA를 증폭할 경우, PCR에 사용되는 프로브 중 하나에 형광 물질을 도입할 수 있으며, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 시료 중의 핵산이 전개됨에 따라, 측정지역에 분주 고정되어 있는 포획자와 서열 특이적 교잡 반응으로 분석물-포획자 결합체를 형성한다. 이후, 분석물-포획자 결합체로부터 나오는 검출신호를 검출장치로 검출하고, 소정 부위에서의 형광신호의 검출은 상기 시료 중에, 상기 소정의 부위에 위치한 포획자와 서열 특이적으로 결합하는 핵산의 존재를 나타낸다.
본 발명의 스트립, 시스템 및 방법은 질환의 원인이 되는 다양한 바이러스 또는 같은 군에 속하는 바이러스의 특정 아형 구분에 효과적으로 사용될 수 있다. 예를 들면 본 발명의 스트립, 시스템 및 방법은 이로 제한하는 것은 아니지만 HCV, HIV, HPV 바이러스의 구분 및 각 바이러스의 아형 구분에 사용될 수 있다. 한 구현예에서 본 발명의 스트립, 시스템 및 방법은 HPV의 다양한 아형 검출에 사용될 수 있다. HPV는 7900bp의 이중 나선 DNA를 가지는 바이러스로 여성의 생식기 상피세포에 기생하며, 자궁경부암 환자의 95%정도에서 검출되어, 자궁경부암의 주요원인으로 밝혀졌다. 현재까지 약 120 종의 아형이 알려져 있으며, 이 중 40개 이상의 아형이 자궁경부암과 관련되며, 이는 고위험군 및 저위험군 아형으로 구분된다. 상기 고위험군에 속하는 아형은 HPV 아형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82를 포함하며 저위험군에 속하는 아형은 HPV 아형 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81, CP108을 포함하며, 이들 모두 본 발명의 스트립, 시스템 및 방법으로 검출가능한 아형의 범위 내에 포함된다. 이들 중 고위험군에 속하는 HPV 아형 16 및 18이 전체의 70-80%를 차지하고, 나머지 20-30%가 HPV 31, 33, 35, 52, 58형 등에 분포되어 있다. 자궁경부암 환자의 19.4%가 16,18 아형의 고위험 HPV에 감염되어 있으며, 특정 직업군을 가진 여성에서 40%가 HPV에 감염되어 있으며 HPV는 남성의 음경암을 일으키기도 한다. (Gissmann L, Boshart M, Durst M, Ikenberg H, Wagner D, zur Hausen H. Presence of human papillomavirus in genital tumors. J Invest Dermatol 1984;83 (1 suppl):26S-8S; de Villiers EM. Heterogeneity of the human papillomavirus group. J Virol 1989;63(Ⅱ):4898-903; Lorincz AT, Reid R, Jenson AB, Greenberg MD, Lancaster W, Kurman RJ. Human papillomavirus infection of the cervix: relative risk association of 15 common anogental types. Obstet Gynecol 1992;79:328-37.)
자궁경부암에는 크게 편평상피암 (Squamous cell carcinoma, SSC)과 선암(adenocarcinoma)의 두 가지 형태가 있다. 편팡상피암의 일반적인 것으로 모든 자궁경부암의 90~95%를 차지한다. 편평상피암의 전구병변은 일반적으로 세포진검사, 질확대경검사, 생검조직검사를 통하여 세포의 핵이 농축된 이핵증(dyskaryosis)과 자궁경부상피내 종양(CIN)으로서 확인되며 CIN은 진행단계에 따라 1, 2, 3기로 나눌 수 있다. (McIndoe WA et al.Obstetrics and Gynaecology, October,1984;64(4):451-458) 본원 실시예에 기재된 바와 같이 본 발명의 시스템은 이러한 자궁경부암의 다양한 병변에 존재하는 HPV 유형을 정확하게 구분할 수 있 다. 한 구현예에서 본 발명의 스트립, 시스템 및 방법은 HPV 아형 16 및 18의 구분에 사용될 수 있다.
자궁경부암은 여성발암 3위를 차지하며 HPV 감염이 주요 원인으로 주목되기 때문에 HPV의 발병전 조기 검출은 물론 치료 후의 경과를 보기 위한 HPV의 검출 또한 매우 중요하다. 종전 자궁경부암 진단에 사용되는 방법으로는 크게 세포진검사, 자궁경부 확대, 조직검사, HPV 표적 단백질을 검사하는 면역검사, HPV DNA검사가 있으며, 정확성, 민감도 및 특이도의 우수함으로 인해 DNA 검사가 증가하는 추세이다. (Duggan MA, Benoit JL, Mcgregor SE, Nation JG, Inoue M, Stuart GC. The human papillomavirus status of 114 endocervical adenocarcinoma cases by dot-blot hybridization. Hum Pathol 1993;189:12-9; Jane C. Sterling and Stephen K. Tying. Human Papillomavirus: Clinical and scientific advances, ARNOLD, 2001; Schneider A, Zahm DM, Kirchmayr R, Schneider VL. Screening fro cervical intraepithelial neoplasia grade 2/3: validity of cytologic study, cervicography, and human papillomavirus detection. Am J Obstet Gynecol 1996;174:1534-41; Cuzick J, Beverley E, Ho L, Terry G, Sapper H, Mielzynska I, et al. HPV testing in primary screening of older women. Br J Cancer 1999;81:554-8.) 특히 현재 자궁경부암 선별검사에 흔히 사용되는 세포진 검사는 결과 해석이 주관적이고 위음성률이 높으며 민감도가 낮은 문제가 있다. 하기는 종전 시중에서 일반적으로 사용하고 있는 DNA HPV 검사법을 비교한 것이다.
구분 HPV typing kit PCR 검사법 Hybrid Capture HPV DNA Chip
sensitivity High High High High
specificity High High High High
검사시간 3 ~ 4 시간 6시간 3 ~ 4 시간 5 시간
검사type 수 2종 (16, 18) 2종 (16, 18) 17종 고위험
12종 저위험		 22종 고위험
15종 저위험
결과확인 형광검출법/color detection ETBR 형광법 Luminometer Chip Scanner
상기 표에서 HPV typing kit은 PCR를 이용하여 특정 유형의 HPV를 검출할 수 있는 패키지 형태로 제공되는 제품 예를 들면 GENOMED 사의 HPV Typing kit이며, PCR 법은 전형적인 PCR 검사법으로 각 유형에 특이적인 부위를 PCR로 사용하여 증폭한 후 아가로스겔 전기영동을 한 후 에씨디움브로마이드로 염색한 후 관찰하는 방법이다. Hybrid capture는 RNA-DNA Hybrid를 형성한 후 이에 대한 면역항체를 사용하여 검사하는 방법으로 예를 들면 Digene 사 (USA)의 제품을 사용한 검사이다. HPV DNA Chip은 예를 들면 Biomedlab(한국)의 제품이다.
본 발명의 시스템은 본원 실시예에 기재한 바와 같이 핵산 검출의 민감도, 특이성은 물론 시간의 면에서도 기존의 시스템과 비교하여 많은 장점이 있다. 구체적으로 5 사이클의 PCR (약 32 copy)만으로도 검체로부터 특정 HPV 아형을 검출할 수 있을 뿐 아니라, 검체로부터 DNA를 분리하지 않고 검체를 직접 PCR에 사용할 수 있어, 검체 준비에 걸리는 시간이 단축됨은 물론 PCR 증폭 후에도 별도의 정제없이 10 여분간의 짧은 크로마토그래피 후에 결과를 볼 수 있기 때문에 단계가 간편하고 시간이 추가로 단축된다. 또한 하나의 스트립에 하나 이상 여러 종류의 포획자를 넣을 경우 분석에 걸리는 시간은 더욱 단축될 수 있다. 예를 들면 검체에서 DNA를 추출할 경우, DNA 준비에 약 1시간, 5 사이클의 PCR 수행에 약 20분 및 본 발명의 시스템을 이용한 검출에 약 12분이 소요되어 총 약 1시간 30분 내에 결 과의 수득이 가능하다. 나아가, 본 발명의 실시예에 기재된 바와 같이 검체를 직접 PCR에 사용할 경우는 약 30분 내에 결과를 볼 수 있어, 기존의 방법과 비교하여 최대 1/20로 시간을 단축할 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 측방이동 핵산 검출 스트립, 이를 포함하는 레이져-유발 표면형광 검출 장치가 일체로 구성된 측방이동 핵산 정량 검출 시스템을 도면을 이용하여 자세하게 설명한다.
- 지지대( backing card )
지지대(101)는 스트립의 모든 구성요소를 지지하고 있으며, 지지대가 생략되는 경우에는 크로마토그래피 매질(104) 자체가 지지대가 될 수 있다. 지지대는 보통 수불용성, 비다공성 및 경직성이고, 보통은 지지대 위에서 시료를 전개하는 패드의 길이와 너비가 동일하나 이 보다 크거나 또는 작을 수 있다. 지지대는 다양한 천연 및 합성의 유기 및 무기 재료를 사용할 수 있으나, 다만 흡수 물질의 모세 작용을 방해하거나, 분석물과 비특이적으로 결합하거나, 분석물과 탐지자의 반응을 방해해서는 안된다. 지지대로 사용가능한 대표적인 중합체로는, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 나일론, 폴리(비닐 부티레이트), 유리, 세라믹, 금속 등을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일반적으로 지지대 위에는 접착제가 코팅되어 각종 패드 또는 매질이 부착될 수 있다. 적절한 접착제의 선택은 스트립의 성능을 개선하고 수명을 연장하는데 도움을 줄 수 있다. 본 발명에 따른 측방이동 검출 스트립에 사용되는 것으로는 압력감지성 접착제(pressure-sensitive adhesive, PSA)를 들 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 전형적인 측방이동 검출 스트립에서 각종 패드의 결합은 접착제가 패드의 기공 내로 침투하고 이에 따라 패드가 지지대와 함께 결합함으로써 달성된다. 이와 같이 접착제가 정상적인 조건하에서 이동하는 과정을 콜드 플로우(cold flow)라고 한다. PSA를 패드에 적층하는 과정에서는 가열을 하지 않기 때문에 어느 정도의 콜드 플로우는 패드와 지지대 사이의 결합이 형성되기 위해서는 필수적이다. 콜드 플로우의 정도가 너무 낮으면 스트립의 저장 기간 동안에 함께 결합되어 있는 패드내로 접착제가 이동하여 기공이 차단되거나 소수성 얼룩이 형성되거나 패드의 재습윤 문제가 발생할 수 있다. 이러한 접착제의 콜드 플로우와 연관된 문제는 직접-주조막을 사용함으로써 해결될 수 있다. 이러한 막은 지지플라스틱 시트에 의해 접착제가 막의 기공으로 들어가는 것을 차단해 주기 때문에 저장 기간 동안에 접착제의 상하이동을 예방할 수 있다.
- 샘플 패드( sample pad )
샘플 패드(102)는 스트립의 한 단부에 위치하며, 샘플 패드의 한 단부는 전개용 매질의 한 단부와 (104) 과 접해있다. 원칙적으로 샘플 패드는 분석물이 함유된 시료를 접수하는 역할을 하며 핵산과 최소한의 결합능을 가지며 시료의 성분들이 크로마토그래피 매질을 통해 용이하게 이동할 수 있도록 하는 물질이다. 이에 추가하여 샘플 패드는 시료중의 불용성 입자를 여과하는 기능을 가질 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명의 샘플 패드는 여과 기능을 부가하는 재질인 셀룰로스 소재의 여과지 또는 유리 섬유 여과지가 바람직하다. 한 구현예에서 샘플 패드는 Millipore cellulose fiber sample pad material (Cat# CFSP223000)과 같은 셀룰로스 파이버로 구성된 것이다. 샘플 패드는 그 재질에 시료 중의 분석물 특히 핵산이 비특이적으로 흡착되는 것을 막고, 동시에 시료의 성분들이 크로마토그래피 매질을 통해 용이하게 이동할 수 있도록 보조하기 위고, 반응의 감도를 유지하기 위해 전처리하는 것이 바람직하다. 샘플 패드는 보통 불활성 단백질 또는 계면활성제로 전처리한다. 불활성 단백질로는 0.1 내지 10% 소 혈청 알부민(BAS) 함유 0.1M Tris 완충액(pH 6 내지 9) 중의 0.1% 내지 10% 탈지유분의 용액 및/또는 0.1% 내지 10% 카제인 용액이 사용될 수 있고, 계면활성제로는 Triton X-100 또는 Tween 20이 사용될 수 있다. 그러나 이러한 전처리의 결정은 분석물 및 시료의 종류에 따라 결정될 것이며, 고온에서 진공건조 할 수 있다.
-전개용 매질
전개용 매질(104)의 양 단부는 각각 샘플 패드(102)와 흡수 패드(105)와 접해있다. 전개용 매질은 지지대(101)에 부착될 수 있다. 또는 전개용 매질은 그 자체가 지지대가 될 수 있다. 전개용 매질은 통상적으로 크로마토그래피 매질을 일컫는 것으로 바람직하게는 액체 시료, 분석물, 특히 핵산이 모세관력에 의해 신속하게 이동하여 그 위에 부착된 포획자에 도달될 수 있도록 하는 것이면 어느 것이든 사용될 수 있다. 일반적으로 전개용 크로마토그래피 매질은 모세관력에 반응하여 수성 매질에 의해 이동하는 다공성 물질이다. 전개용 매질의 예로는 측방이동에 사용될 수 있는 예컨대 셀룰로스, 나이트로셀룰로스, 폴리에테르설폰, 폴리비 닐리딘, 플루오라이드, 나일론, 하전나일론 및 폴리테트라플루오로에틸렌을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서 전개용 매질은 나이트로셀룰로스이다. 나이트로셀룰로스를 사용하는 경우에, 구멍의 직경은 전형적으로 0.1μm 이상, 특히 1.0μm 이상, 특히 0.2 내지 20μm, 더욱 특히 0.2 내지 12μm이다. 다른 구현예에서 입자형태의 표지물질을 사용할 경우, 구멍의 크기는 입자 직경의 약 10배 이상이 되어야 한다. 상기 예시된 물질은 단독으로 사용되거나 다른 물질과 조합하여 사용될 수 있다. 또 다른 예로는 세라믹 물질을 들 수 있다. 또한 크로마토그래피 매질은 다작용성이거나 다작용성으로 변형시켜 포획자와 공유결합을 가능하게 할 수 있다. 상기와 같은 성질을 갖는 크로마토그래피 매질은, 예를 들면, Schleicher & Schuell 사의 Prima 60, 85, AE98, AE99 및 AE100, Millipore 사의 HiFlow Plus HF09004, HF13504,HF090, HF120, HF135, HF180 및 HF240 및 Sartorius사의 CN90, CN140 등이 있다.
- 흡수 패드( absorption pad )
측방이동 검출 스트립의 샘플 패드가 부착된 말단과 반대 방향의 말단에는 전개용 매질의 한 단부와 접해있는 흡수 패드(105)가 위치하고 있다. 흡수 패드는 모세관 작용에 의해 크로마토그래피 매질을 따라 이동해 온 시료를 물리적으로 흡수하고 미반응 물질을 제거하기 위한 수단이다. 즉, 흡수 패드는 측방이동 스트립의 말단에 위치하면서 크로마토그래피 매질을 따라 이동해 오는 시료 및 시약의 속도를 조절하고 전개를 촉진하고 이를 담아두는 펌프 또는 저장소로서 작용한다. 시료 및 시약의 이동 속도는 흡수 패드의 질 및 크기에 따라 다를 수 있으며, 보통 사용되는 흡수 패드는 나이트로셀룰로스, 셀룰로스 에스테르, 유리(예를 들면 보로실리케이트 유리섬유), 폴리에테르설폰, 코튼, 탈수폴리아크릴아마이드, 실리카겔, 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 모세관 작용의 속도는 적절한 흡수패드의 선택으로 조절될 수 있다.
도 2는 본 발명의 예시적인 한 구현예에 따른 핵산 검출 시스템의 모식도이다. 본 발명에 따른 시스템은 상술한 측방이동 검출 스트립(100), 레이저 유발 표면형광 검출 장치(200) 및 구동장치를 포함한다.
-레이저-유발 표면형광 검출 장치
본 발명에 사용될 수 있는 한 레이저-유발 표면형광 검출 장치는 도 2에 예시적으로 기재되어 있다. 이러한 장치는 레이저(201), 레이저빔 형상제어용 렌즈(202), 여기필터, 포집렌즈(203), 형광필터(204), 집광렌즈(205), 공간필터(206), 광검출기(207), 아날로그디지털 컨버터(ADC) 및 중앙처리장치(CPU)를 포함한다. 이러한 레이져 유발 표면형광 검출 장치는 본원 출원인에 의한 등록특허 10-0639776에서 사용된 레이져 유발 표면형광 검출 장치 또는 GSI스캐너(the GSI group Inc., USA) 또는 Axon(Axon Instruments Inc., USA)사 장비와 동일한 것을 사용할 수 있다. 레이져 유발 표면형광 검출 장치는, 점광원 또는 선형으로 가공된 레이져 광원의 빛이 여기 필터를 통과한 뒤 시료에 입사되고, 이 위치에서 시료 중 표적물질에 부착된 염료에 의해 형광을 발광하면, 포집렌즈, 형광필터 및 집광렌즈에 의해 공간필터의 중심으로 집속되어 광검출기 도달하게 되며, 도달된 신호 는 아날로그 디지털 컨버터(ADC) 및 중앙처리장치(CPU)에 의해 환산되어 출력된다.
레이저 유발 표면형광 검출 장치는 포획자와 결합하는 특정 핵산의 검출에 사용된다. 시료 중의 분석물 (표적자)에 표지된 물질에서 생성되는 형광을 광학계에 의하여 포집하여 디텍터(detector)에서 검출 정량화한다. 즉, 액체 시료를 적하 한 후 일정 시간이 지나 결합반응이 끝나면 구동장치에 의해 스트립이 일정한 속도로 광원방향으로 이동하며, 이 스캐닝 과정에서 레이저에 의하여 생성되는 형광을 디텍터에 의하여 측정한다. 바람직하게는 스트립이 이동함에 따라 핵산 분석물 측정지역에서 발생하는 신호를 수회 포집하여 검출한다.
상기 설명한 바와 같은 본 발명에 따른 측방이동 검출 시스템을 이용하여 시료 중 핵산 분석물을 검출 정량하는 방법을 역시 도면을 참조하여 보다 자세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 예시적인 한 구현예에 따른 측방이동 핵산 검출에 사용되는 스트립의 모식도를 나타낸다. 본 발명에 따른 핵산 분석물의 검출은 액체 시료를 본 발명에 따른 스트립에 적하함으로써 시작된다. 액체 시료는 샘플 패드(102)에, 바람직하게는 샘플투입구(109)(도 2)를 통해 적하된다. 시료가 샘플 패드로 적하되면 모세관현상에 의해서 이동하게 되고, 그 이동 속도는 흡수 패드의 재질, 크기 등에 영향을 받을 수 있다. 분석물 중 핵산이 바이오틴으로 표지된 경우 이에 결합하는 스트렙타비딘-비드 복합체가 적하 전에 시료에 도입된다. 핵산 분석물 측정지역은 시료 적하지점인 샘플 패드로부터 일정한 거리에 위치하고 있으며, 일정량의 포획자가 상기 일정위치에 고정되어 있다. 상기 포획자는 상기 시료중의 분석물(표적자) 즉 핵산에 상보적 결합을 할 수 있는 서열을 포함하고 있으며 액체시료가 스트립을 따라 전개되어도 시료를 따라 같이 이동하지 않는다. 표지 검출물질로 표지된 표적자가 핵산 분석물 측정지역을 이동할 경우 서열 특이적 교잡반응에 의해 상보적 서열을 갖는 포획자와 결합한다. 형광 검출 장치는 상기 포획자가 고정된 지역에서 형광물질 표지된 표적자-포획자 결합체에 의해 발생한 신호를 수집한다.
핵산 분석물의 정량을 위해서는 목적하는 핵산 분석물의 표준곡선의 작성이 필요한데, 이는 농도가 확인된 분석물을 사용하며, 이때 농도는 당해 기술분야에 알려진 다양한 방법에 의해 측정할 수 있으며, 상기 기술한 방법대로 형광의 세기를 측정한 후, 특정 농도에 해당하는 형과의 세기를 측정하여 표준곡선을 작성한후, 분석 시료에서 얻은 형광의 세기를 대입하여 농도를 측정한다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술, 면역학의 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 다음의 책 및 문헌을 참조할 수 있다. 분자생물학 및 생화학에 관한 일반적인 방법에 관해서는 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley &Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (Hames and Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et al., eds.); 및 Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press)등을 참조할 수 있다. 또한 Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al., eds.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (Weir and Blackwell, eds., 1986); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley &Sons 1996); Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle &Griffiths, John Wiley &Sons 1998)을 참조할 수 있다. 본 명세서에 기술된 시약, 클로닝 벡터 및 키트는 BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich, 및 ClonTech 등과 같은 회사에서 구입할 수 있다.
실시예 1: 표적자 및 포획자 DNA 제작
HPV DNA 검사용 스트립을 제작하기 위하여, 시료로 사용되는 표적자를 하기와 같이 제작하였다. 우선 검체 HPV 아형 16, 18로 확인된 샘플과 HPV 양성(연세대학교 의과대학으로부터 수득하였으며 DNA Chip 방식으로 양성으로 판정)으로 판정된 조직 검체로부터 지놈 유전체를 추출하였다. 검체 1ml과 동량의 phenol/chloroform/Isoamyl acohol (25:24:1)을 부드럽게 잘 섞어준 후 실온에서 14,000rpm으로 5분간 원심분리 한 다음 상층액을 새 시험관으로 옮겼다, 여기에 -20℃에 보관중인 100% EtOH을 상층액 부피의 두 배 되는 부피로 첨가하여주고, 5M sodium acetate를 상층액 부피의 1/20의 부피로 넣어준 다음 잘 섞어 주었다. 이 용액을 4℃, 14,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 가라앉은 침전물을 조심스럽게 70% EtOH로 씻어주었다. 70% EtOH를 제거하기 위하여 4℃에서 5분간 다시 원심분리 하여 70% EtOH를 제거하고 37℃에서 펠렛을 완전히 건조시킨 다음 멸균된 증류수 30㎕로 녹여 사용하기 전까지 -20℃에서 보관하였다. 이후 하기 표에 기재된 것을 프라이머로 하여 HPV의 아형을 결정짓는 부위 (표적서열)의 핵산을 증폭하였다. 상기 검체로부터 수득한 각 DNA 2㎕에 프라이머 No. 1, 2 (또는 1, 3)를 각각 1㎕씩 첨가하고 10x Hot prime TaqTM buffer 5㎕, dNTP mixture 4㎕, 25mM MgCl2 4㎕, Hot prime TaqTMpolymerase 0.7㎕, D.D.W 32.3㎕를 넣어 잘 섞은 후에 94℃, 2 min X1, (94℃, 30 sec, 53℃, 30sec, 72℃, 1min) X 30, 72℃, 5min X1 cycle의 조건으로 PCR을 수행하였다. 상기 PCR에 사용될 anti-sense primer를 각각 Cy5와 바이오틴으로 표지하여 표적자로 사용하였다. PCR의 결과 150 bp의 산물이 수득되었다. 형광 표지 물질로는 Molecular Probe사의 Cy5(Ex : 650, Em : 680)와 Invitrogen Dark red bead(Ex : 660, Em : 680)를 사용하였다. 프라이머 및 포획자 핵산은 제노텍(한국)에서 합성하였다.
HPV 아형 16 및 18에 대한 포획자 서열 및 표적자 증폭에 사용한 HPV 16 및 18 증폭용 프라이머는 하기와 같으며 서열은 하기의 문헌을 참조로 HPV의 L1 부위에서 선택하였다 (Jianduan Li et al., Denaturing High-Performance Liquid Chromatography for Detecting and Typing Genital Human Papillomavirus. J of Clinical Microbiology 2003;41(4):5563-5571; A J van den Brule et al., Journal of Clinical Microbiology. 1990; 28(12):2739-2743; 및 Ana-Maria de Roda Husman et al., Journal of General Virology. 1995:76;1057-1062.) 포획자 서열은 하기의 문헌을 참조하여 선택하였다 (Ana-Maria de Roda Husman et al. The use of general primers GP5 and GP6 elongated at their 3' ends with adjacent highly conserved sequences improves human papillomavirus detection by PCR. J of General Virology. 1995;76:1057-62; P.E. Gravitt et al., Improved amplification of genital human papillomaviruses. J of Clinical Microbiology. 2000;38(1):357-61; Bernhard Kleter et al. Novel short-fragment PCR assay for highly sensitive broad-spectrum detection of anogenital human papillomaviruses. American J of Pathology. 1998;153(6):1731-9; Peter J. F. Snijders et al. The use of general primers in the polymerase chain reaction permits the detection of a broad spectrum of human papillomavirus genotypes. J of General Virology. 1990;71:173-81)
Primer No. Type Sequence bp
1 HPV sense primer 5'-TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT A-3' 22
2 HPV
anti-sense primer-I		 Cy5-5'-TGA AAA ATA AAC TGT AAA TCA TAT-3' 24
3 HPV
anti-sense primer-II		 biotin-5'-TGA AAA ATA AAC TGT AAA TCA TAT-3' 24
HPV type 16 capture(포획자) 5'-ACG CAG TAC AAA TAT GTC ATT ATG TGC TGC CAT ATC TAC TTC AGA AAC TAC ATA TAA AAA TAC TAA CTT TAA GGA GTA CCT ACG ACA TGG GGA GGA -3‘ 96
HPV type 18 capture(포획자) 5'-CAC TCG TAG TAC CAA TTT AAC AAT ATG TGC TTC TAC ACA GTC TCC TGT ACC TGG GCA ATA TGA TGC TAC CAA ATT TAA GCA GTA TAG CAG ACA TGT TGA A -3‘ 100
상기 PCR 산물은 MP Biomedicals, LLC Kit을 이용하여 정제 한 후에 사용되었다.
실시예 2: 샘플패드 전처리
나이트로셀룰로스 막을 통한 용액 성분들의 이동을 용이하게 하며, 또한 반응의 민감도를 유지하고 표적자 DNA와 포획자 DNA, 나이트로셀룰로스 막과의 비특이적 반응을 최소화하기 위하여 샘플패드를 전처리하였다. 샘플패드(2.5 X 30cm)를 전처리 용액(1% BSA, 0.05% Tween 20을 포함하는 Phosphate Buffered Saline (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Sodium Phosphate dibasic, 2 mM Potassium Phosphate monobasic pH of 7.4))에 충분히 적셔 10분간 평형화 시켰다. 이어 샘플패드의 과도한 용액을 제거하고 열에 의한 샘플패드의 변형을 막기 위해 50℃의 온도에서 진공 건조하였다. 준비된 패드는 사용 전까지 제습장치에서 보관하였다.
실시예 3: 나이트로셀룰로스 막에 포획자의 고정
전개용 매질로서 나이트로셀룰로스 막 (Millipore, HF180)을 사용하였다. 상기 실시예 1의 HPV type 16 포획용 올리고뉴클레오타이드를 100pM이 되도록 증류수로 희석한 후 95℃에서 5분간 삶은 후 3X SSC(Sodium Chloride/Sodium Citrate buffer)(Sigma-Aldrich, USA)에 1/10되게 희석한 다음 나이트로셀룰로스막(NC) 상에 미세분주기(Bio-Dot)를 사용하여 1㎕/cm의 양으로 샘플패드로부터 2.8mm 떨어진 곳으로부터 선폭이 1mm이 되도록 분주하였다. 분주된 나이트로셀룰로스 막을 42℃에서 1시간 동안 건조 시킨 후 UV를 1200J에서 5분 동안 조사하였다. 상기 고정조건은 시험된 다른 조건과 비교하여 가장 고정성이 우수한 것으로 나타났다 (도 3 참조). 상기와 같이 전처리된 스트립은 형광 측정장치(laser-fluorescence scanner, i- CHROMA, 바디텍메드, 한국)의 투입구(holder)에 맞게 제작된 1회용 카세트(16 x 90mm)에 조립하여 제습실에서 제습상태로 포장한 후 사용하기 전까지 실온에서 보관하였다.
실시예 4: 스트립의 제조
상기 실시예 2 및 3에서 제조한 나이트로셀룰로스 막(NC 막)과 샘플 패드S&S 903 패드), 흡수 패드 (셀룰로스 막, 3MM chromatography grade) 및 지지대(PJ 상사, 플라스틱 지지대, 지지대에 접착제 포함)를 1회용 카세트에 조립하였다. 크기 89mm x 300mm 의 지지대 상에 실시예 3의 크기 25mm x 300mm의 NC막을 중앙에 올려놓았다. 그 후 양 말단에 각각 크기 18mm x 300mm의 샘플 패드와 흡수 패드가 NC와 0.2mm 겹치도록 포개어 붙인 후 절단기를 사용하여 최종 스트립의 크기가 4.11× 64.8 mm이 되도록 하였다.
실시예 5: 형광비드 및 아비딘 접합체의 제조
100mM MES buffer(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, pH 6.0, 25mM NaCl, 2% bead solution (Molecular Probes사의 Alexa 647 형광비드, 크기는 0.2 μm 이며 비드표면이 carboxilate 되어 있음), 0.2mg EDC(ethylene dichloride) 및 0.5mg sulfo-NHS를 잘 섞고 상온에서 약 15분간 반응시켰다. 후에 1분간 소니케이션하고 15㎕의 2-mercaptoehanol넣어 5분간 반응시켜 반응하지 못한 EDC를 제거한다. 그리고 다시 1분간 소니케이션을 하고 여기에 아비딘(Kem & Tec사) 100μg을 넣어준 후 2시간 동안 상온에서 반응시키고 1M glycin(pH7.2) 75㎕ 넣고 다시 30분간 상온에서 반응시켰다. 그 후 14000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 가라앉은 펠렛을 세척완충액 (50mM NaPi pH7.4, 50mM NaCl)로 3회 세척하였다. 마지막 세척이 끝난 후 블록킹 완충액(50mM NaPi pH7.4, 50mM NaCl, 1% BSA, 0.1% Tween 20)를 넣어 주고 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후에 안정화 완충액 (50mM NaPi pH7.4, 50mM NaCl, 1% BSA, 0.1% Tween 20, 25% Trehalose, 0.1% sodium azide)를 추가하여 비드를 안정화시켰다.
실시예 6: HPV PCR 산물의 측방이동 교잡 시험
상기 실시예 1에서 수득한 Cy5가 접합 되어있는 프라이머를 사용하여 얻어진 PCR산물과 0.4 N NaOH를 1:1 비율로 섞어준 다음 3분간 실온에서 반응시킨 후, 여기에 중화완충액(1M Tris-Cl, 0.3% Tween 20, pH6.3)을 1:100의 비율로 섞어주었다. 이렇게 준비된 용액 100㎕를 포획 올리고뉴클레오타이드가 고정되어있는 상기 실시예 4에서 제조된 스트립의 샘플 투입구에 첨가한 후 12분 후에 형광측정장치(i- CHROMA, 바디텍메드, 한국)로 스캐닝하였다.
아울러 실시예 1에서 수득한 바이오틴이 접합 되어있는 프라이머를 사용하여 얻어진 PCR산물과 0.4 N NaOH를 1:1 비율로 섞어준 다음 3분간 실온에서 반응시킨 후 여기에 중화완충액(1M Tris-Cl, 0.3% Tween 20, pH6.3)을 50㎕ 그리고 상기 실시예 5에서 제작된 아비딘이 부착되어있는 0.1% 형광 비드와 1:10의 비율로 잘 섞어주었다. 이렇게 준비된 용액 100㎕를 포획자 올리고뉴클레오타이드가 고정되어있는 스트립의 샘플 투입구에 첨가한 후 12분 후에 형광측정장치(i- CHROMA, 바디텍메드, 한국)로 스캐닝하였다.
모든 경우 크로마토그래피에 사용된 전개용 버퍼로는 1% gelatin, 0.3% Tween 20, 0.1% Thimerosal을 포함하는 PBS를 사용하였다.
실시예 7: HPV 검출의 특이도 시험/교차반응성 시험
상기 실시예 1에서 같이 HPV 아형 16, 18로 판단된 검체의 지놈 DNA를 사용하여 Cy5로 표지 되어있는 프라이머를 사용하여 PCR를 수행하여 길이 150bp의 산물을 수득하였다. PCR후에 산물은 2%의 아가로스겔에서 전기영동으로 확인하였다 (도 4 참조). 이어 상기 산물을 실시예 6에서와 같이 처리하여 실시예 4에서와 같이 제작된 스트립에 적하한 후 12분 후에 형광측정장치(i- CHROMA, 바디텍메드, 한국)로 스캐닝하였다. 상기 스트립에는 실시예 1에서 기술한 HPV 16 및 18 포획자 올리고뉴클레오타이드 각기 다른 스트립에 고정되었다. 결과는 도 5 및 6에 기재되어 있다. 상기 도면에서 보는 바와 같이 HPV 16 표적자 핵산은 HPV 16 포획자 핵산 분석물 측정위치(도 5), HPV 18 표적자 핵산은 HPV 18 포획자 핵산분석물 측정위치(도 6)에서만 형광이 관찰되었고 서로 간에 교차반응은 일어나지 않는 것으로 확인 되었다.
실시예 8: HPV 검출의 민감도 시험
HPV 양성 반응을 보이는 두 개의 독립적 검체를 선택하여 바이오틴으로 표지 되어 있는 프라이머 (표 1에서 No.1 및 3)를 사용하여 사이클만 수만 달리하여 실시예 1에서와 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 사이클 수는 3, 5, 10, 20, 30으로 수행하였다. 이렇게 해서 나온 PCR 산물을 상기 실시예 4에서와 같이 제작된 스트립에 실시예 6에서와 같은 방법으로 적하/반응시킨 후 스캔하여 형광의 양을 비교하였다. 결과는 도 7 내지 10에 기재되어 있다. 도 7에서 보는 바와 같이 5 사이클의 경우, 전기영동법(2%의 아가로스겔)으로는 HPV 밴드를 확인할 수 없었지만, 본 발명의 한 구현예에 따른 스트립을 사용한 결과 5 사이클 이하로 돌린 PCR 산물에서도 강한 형광신호를 검출할 수 있었다 (도 8). 또 다른 양성 검체를 사용한 독립적 시험에서도 같은 결과를 확인하였다 (도 9 및 10).
실시예 9: 표적자 핵산으로 사용되는 PCR 산물의 정제 없는 사용
본 발명과 같은 DNA 분석에 있어서 PCR를 수행한 후에 정제의 과정을 거치는 것이 보통이다. 하지만, 이러한 정제과정을 거치지 않고도 정제한 것과 동일한 결과를 얻을 수 있다면 더욱 신속한 분석을 가능하게 하는 큰 장점이다. 도 11에서 나타난 바와 같이 동일한 두 개의 양성 검체에 대하여 실시예 1에서와 같이 프라이머 1 및 3을 사용하여 PCR를 수행한 후 하나는 정제 후(MP Biomedicals, LLC Kit), 다른 하나는 정제하지 않고, 실시예 6에서와 같이 교잡반응을 시험하였다. 도 11에 기재된 바와 같이 정제를 하지 않은 경우 신호가 정제한 것에 비하여 매우 낮음을 알 수 있었다.
이어서 PCR 조성중의 어떤 성분이 형광세기를 낮추는가를 확인하기 위해 위와 동일한 실험을 각기 다른 조성들을 첨가한 후 수행하였다. 도 12에 기재된 바와 같이 형광의 세기에 가장 많은 영향을 주는 것은 2.5mM MgCl2이라는 것을 알 수 있다. 따라서 위와 동일한 실험 후 PCR 후에 정제를 하지 않고 단순히 2.5mM MgCl2를 50mM EDTA를 제거하여 정제한 것과 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 결과는 도 13에 기재되어 있다.
실시예 10: 다양한 종류의 HPV 양성검체를 사용한 PCR 산물의 측방이동 시험
HPV 양성반응으로 검사가 된 약 39개의 자궁경부암 환자 검체(표 2)(연세대 의과대학에서 수득)로부터 실시예 1에서와 같이, DNA를 분리하고 프라이머 (No. 1 및 3)를 사용하여 PCR(30cycle)을 수행하였다. 이어 수득한 산물을 전기영동법으로 확인하였고(도 14), 또한 실시예 4에서와 같이 제작된 스트립에 첨가하여 실시예 6에 기재된 바와 같이 분석하였다. 결과는 도 15에 있다. 도 15에 기재된 바와 같이 일부 양성 검체가 전기영동법을 이용해서는 DNA 밴드를 확인할 수 없었지만 본 발명에 따른 스트립을 이용해 확인했을 때에는 모든 PCR산물에서 형광의 세기를 관찰 할 수 있었다.
자궁경부암 병변 #
adenocarcinoma 2
CINⅠ 4
CINⅡ 3
CINⅢ 5
CIS 9
CNⅠ 5
CSIL 1
HGSIL 3
invasive 2
LGSIL 1
Micro invasive 2
SCC 2
합계 39
CIN (Cervical intraepithelial neoplasia ), CIS (Carcinoma in situ), HGSIL (High grade squamous intraepithelial lesion), LGSIL (Low grade squamous intraepithelial lesion), SCC (Squamous Cell Carcinoma).
나아가 도 14의 샘플 중 비특이적 밴드가 검출되는 레인 #37의 밴드에서 DNA를 추출(Qiagen Gel Extraction kit)하여 실시예 6과 같은 실험을 한 결과, 이러한 비특이적 밴드로는 양성 신호가 검출되지 않았다 (도 16 참조). 이는 상기 비특이적 밴드가 HPV 검출에 영향을 미치지 않으며, 본 분석의 우수한 특이도를 나타내는 것이다.
실시예 11: HPV 양성검체를 직접적으로 PCR 증폭에 사용한 경우의 측방이동 시험
통상적으로 바이오틴으로 표지된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하기 위해서는 검체로부터 DNA를 추출한 후 PCR을 수행하여야 한다. 하지만 시간과 시험 과정을 단축하기 위하여 DNA를 추출하지 않고 실시예 10의 HPV 양성검체 5㎕를 직접 주형으로 사용하여 실시예 1과 같은 PCR을 수행하였다. 그 결과 DNA 전기영동법에서는 양성 밴드를 확인할 수 없었으나(도 17)상기 PCR 산물을 본 발명의 실시예 4에 따라 제조된 스트립을 사용하여 실시예 6의 방법대로 분석한 결과 형광신호를 검출할 수 있었다. 결과는 도 18에 기재되어 있다. 이는 분석의 신속성과 정확도를 입증하는 효과이다.
HPV검사를 위한 기존의 측정 방식들은 전형적으로 질 조직을 채취한 후에 DNA를 확보하기 위한 준비과정과 확보한 DNA를 증폭하기 위한 PCR과정을 거쳐 얻은 산물을 가지고 자궁경부암 유무를 판별한다. 기존 분석방법도 정확도와 민감도를 갖추고 있으나, 자궁경부암 유무를 판별하기에 많은 시간이 소요되며 실험 절차가 복잡하다는 단점이 있다. 그러나 본 연구에서 개발된 DNA 크로마토그래피법을 이용한 HPV 분석 시스템은 기존 분석방법이 갖춘 정확도를 갖으면서도 기존 분석방법보다 민감도가 뛰어나고, PCR 수행 후 별도의 처리없이 산물을 직접 분석에 사용하며, 짧은 전개 시간으로 측정시간이 50%이상 줄어들었으며 실험 절차가 간편해졌음은 물론 다양한 자궁경부암 병변에 존재하는 HPV 유형을 검출할 수 있다. 또한 본 실시예에서 기술한 DNA 크로마토그래피 법을 이용한 분석 시스템은 HPV를 분석하는 방법에 한정된 것이 아니라 전개용 매질에 고정하는 포획자의 DNA만 달라진다면 어떠한 종류의 DNA 분석도 가능하고 여러 DNA의 종류의 다수의 포획자를 하나의 전개용 매질에 고정하는 것이 가능하여 한 번의 실험으로 여러 가지 유형의 DNA도 분석이 가능하다.
도 1은 본 발명의 한 구현예에 따른 핵산 검출용 측방이동 스트립의 모식도이다.
도 2는 본 발명에 사용될 수 있는 한 종류의 레이져 유발 표면 형광장치 광학계의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 한 구현예에 따른 나이트로셀룰로스 막상에 포획자 DNA의 고정조건을 시험한 결과이다. (A) UV 조사하지 않음; (B) UV 42℃에서 1시간 건조 후 UV 조사; (C) 건조없이 UV 조사.
도 4는 본 발명의 한 구현예에 따른 Cy5로 표지된 프라이머로 증폭된 HPV 아형 16 및 18의 표적자 DNA의 2% 아가로스겔 전기영동 결과이다.
도 5는 교차반응성을 확인하기 위한 시험으로 본 발명의 한 구현예에 따른 표적자 HPV 16 핵산과 포획자 HPV 16 및 18 간의 교잡반응을 본 발명의 한 구현예에 따른 시스템으로 분석한 결과이다.
도 6은 교차반응성을 확인하기 위한 시험으로 본 발명의 한 구현예에 따른 표적자 HPV 18 핵산과 포획자 HPV 16 및 18 간의 교잡반응을 본 발명의 한 구현예에 따른 시스템으로 분석한 결과이다.
도 7은 양성 검체로부터 바이오틴으로 표지된 프라이머로 PCR 사이클 수를 달리하여 증폭된 HPV 표적자 DNA의 2% 아가로스겔 전기영동 결과이다. M: 100bp DNA ladder, 1: 20 cycle, 2: 10 cycle, 3: 5 cycle,
도 8은 도 7의 표적자를 본 발명의 한 구현예에 따른 시스템으로 분석한 결 과이다.
도 9는 검체만을 달리하여 도 7과 동일한 실험을 한 결과이다. M : 100bp DNA ladder, 1: 30 cycle, 2: 20 cycle, 3: 10 cycle, 4: 5 cycle, 5: 3 cycle.
도 10은 도 9의 표적자를 본 발명의 한 구현예에 따른 시스템으로 분석한 결과이다.
도 11은 양성 검체를 사용하여 본 발명의 한 구현예에 따른 바이오틴으로 표지된 프라이머로 증폭된 HPV 표적자 핵산을 정제 및 정제없이 본 발명의 한 구현예에 따른 시스템으로 분석한 결과이다.
도 12는 양성 검체를 사용하여 본 발명의 한 구현예에 따른 바이오틴으로 표지된 프라이머로 증폭된 HPV 표적자 핵산에 표시된 성분을 첨가한 후 본 발명의 한 구현예에 따른 시스템으로 분석한 결과이다.
도 13은 HPV 양성 검체를 사용하여 본 발명의 한 구현예에 따른 바이오틴으로 표지된 프라이머로 증폭된 HPV 표적자 핵산에 EDTA를 첨가한 후 본 발명의 한 구현예에 따른 시스템으로 분석한 결과이다.
도 14는 HPV 양성 검체로 확인된 환자 시료를 본 발명의 한 구현예에 따른 바이오틴으로 표지된 프라이머로 증폭한 후 2% 아가로스겔 전기영동한 결과이다.
도 15는 도 14에 따른 표적자 HPV 핵산을 본본 발명의 한 구현예에 따른 시스템으로 분석한 결과이다.
도 16은 도 14의 비특이적 밴드로부터 DNA를 추출한 후 이를 표적자 핵산으로 사용하여 본 발명의 한 구현예에 따른 시스템으로 분석한 결과이다.
도 17은 HPV 양성검체로부터 DNA를 추출하지 않고 직접 시료로 사용하여 본 발명의 한 구현예에 따른 바이오틴으로 표지된 프라이머로 증폭한 후 2% 아가로스겔 전기영동한 결과이다.
도 18은 도 17에 따른 표적자 HPV 핵산을 본 발명의 한 구현예에 따른 시스템으로 분석한 결과이다.
도면 1 및 2의 부호에 대한 설명이다.
100: 측방이동 스트립
101 : 지지대
102 : 샘플 패드
103 : 흡수패드
104 : 전개용 매질
105 : 핵산 분석물 측정지역
108 : 검사창(window)
109 : 샘플 투입구
110: 스트립 하우징
200 : 레이저-유발 표면 형광 검출장치
201 : 레이저
202 : 레이저빔 형상 제어용 렌즈
203 : 포집렌즈
204 : 형광필터
205 : 집광렌즈
206 : 공간필터
207 : 광검출기

Claims (19)

  1. 핵산 검출용 측방이동 스트립에 있어서,
    상기 스트립은 지지대, 전개용 매질, 샘플 패드 및 흡수 패드를 포함하며,
    상기 지지대는 상기 전개용 매질, 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드를 지지하며,
    상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드는 서로 겹치지 않도록 상기 지지대의 양 단부에 각 각 위치되어 있으며,
    상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 흡수 패드의 한 단부 및 상기 샘플 패드의 한 단부와 접해 있으며,
    상기 전개용 매질에는 핵산을 포함하는, 한 종류 이상의 포획자가 부착되어 있으며, 상기 포획자는 상기 샘플 패드에 적하될 시료 중의 특정 핵산성분과 서열 특이적 교잡 반응을 할 수 있는 것으로,
    상기 샘플 패드에 적하될 시료 중의 특정 핵산 성분은 중합효소연쇄반응의 산물이고,
    상기 포획자 또는 상기 시료 중의 특정 핵산 성분은 형광물질 또는 바이오틴으로 표지되어 있으며,
    상기 형광물질 또는 바이오틴에서 방출되는 형광신호는 표면형광 검출장치를 통해 검출되는, 시료 중의 핵산 검출용 측방이동 스트립.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 포획자의 핵산은 HPV (Human Papilloma Virus)에서 유래된 핵산인, 핵산 검출용 측방이동 스트립.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 HPV는 HPV 아형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82, 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81 및 CP108 중 하나 이상으로부터 유래된 것인, 핵산 검출용 측방이동 스트립.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 HPV는 HPV 아형 6, 11, 16, 18, 31, 45 및 51 중 하나 이상으로부터 유래된 것인, 핵산 검출용 측방이동 스트립.
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은 1 내지 10 사이클 범위로 수행되는 것인, 핵산 검출용 측방이동 스트립.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은 1 내지 5 사이클 범위로 수행되는 것인, 핵산 검출용 측방이동 스트립.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 1 항 내지 제 4 항, 제 6 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 측방이동 스트립 및 상기 스트립의 포획자 위치에서 방출되는 검출신호를 검출하기 위한 표면형광 검출장치를 포함하는 핵산 검출 시스템.
  16. 제 1 항 내지 제 4 항, 제 6 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 스트립을 이용한 시료 중의 핵산을 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    샘플패드 상에, 형광물질 또는 바이오틴으로 표지된 분석하고자 하는 특정 핵산을 포함하는 시료를 적하하는 단계,
    상기 시료가 전개용 매질을 통하여 이동되도록 하는 단계로, 상기 이동 중, 상기 전개용 매질 상의 소정의 부위에 위치한 포획자 중의 핵산과 상기 시료 중의 특정 핵산이 서열 특이적 교잡 반응을 하며,
    상기 포획자 위치에서 발생하는 형광신호를 형광 검출장치로 검출하는 단계로, 상기 포획자 위치에서의 형광신호의 검출은 상기 시료 중에, 상기 소정의 부위에 위치한 포획자와 서열 특이적으로 결합하는 핵산의 존재를 나타내는 것인, 핵산 검출 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 포획자의 핵산은 HPV (Human Papilloma Virus)에서 유래된 핵산인, 핵산 검출 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 HPV는 HPV 아형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82, 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81 및 CP108 중 하나 이상으로부터 유래된 것인, 핵산 검출 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 HPV는 HPV 아형 6, 11, 16, 18, 31, 45 및 51 중 하나 이상으로부터 유래된 것인, 핵산 검출 방법.
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