CN101070557A

CN101070557A - 禽流感病毒pcr扩增和杂交检测与分型方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN101070557A
Application number: CN 200710027422
Authority: CN
Inventors: 陈守义; 刘金株
Original assignee: Zhuhai Hui Hui Biological Technology Co Ltd; GUANGZHOU DISEASE PREVENTION-CONTROL CENTER
Current assignee: Zhuhai Hui Hui Biological Technology Co Ltd; GUANGZHOU DISEASE PREVENTION-CONTROL CENTER
Priority date: 2007-04-05
Filing date: 2007-04-05
Publication date: 2007-11-14

Abstract

本发明涉及禽流感病毒的PCR扩增和核酸杂交检测与分型的方法，以及禽流感病毒的检测试剂盒。本发明所述的禽流感病毒检测及分型方法，是对AIV的基因组核酸进行PCR反应后利用PCR产物进行核酸杂交，通过酶标记的AIV通用型和亚型特异性探针进行禽流感病毒的检测和分型。涉及的禽流感病毒包括通用型和H1、H3、H5、H7、H9、N1、N2等目前主要流行的亚型。本发明还提供了一种禽流感病毒的检测试剂盒。本发明提供的检测方法使用的主要试剂均来源于本发明所包括的试剂盒，实验流程少，操作简便易行，消耗费用低。和其他禽流感病毒检测的方法相比较，本发明的优势还在于进行检测的同时可以对禽流感病毒进行分型。

Description

禽流感病毒PCR扩增和杂交检测与分型方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及禽流感病毒的检测与分型方法，尤其是涉及禽流感病毒的PCR扩增和核酸杂交(PCR-杂交)检测与分型的方法，以及禽流感病毒的检测试剂盒。涉及的禽流感病毒包括通用型和H1、H3、H5、H7、H9、N1、N2等目前主要流行的亚型。

背景技术

禽流感是禽流行性感冒(Avian Influenza，AI)的简称，它由禽流感病毒(AIV)引起。禽流感病毒(AIV)属于正粘病毒科流感病毒属。正粘病毒科中只有一个属，即流感病毒属。根据流感病毒核蛋白(NP)和基质蛋白(MS)抗原性的不同，将其分为甲、乙、丙三个血清型，一般意义上的禽流感病毒在血清型上属于甲型流感病毒。根据流感病毒血凝素HA和神经氨酸酶NA抗原性的差异，又可将其分为不同的亚型。目前，禽流感病毒有15种特异的HA(H1～H15)和9种特异的NA(N1～N9)。禽流感病毒除可感染人之外，还可以感染许多其他种属的动物，如禽类、猪、马、海豹等。

禽流感病毒属于呼吸道病原体，主要通过呼吸道侵入人体，并随呼吸道分泌物向外传播，侵入另一易感机体引起呼吸道传染性疾病。在野外条件下，流感病毒常从感染禽的鼻腔分泌物和粪便中排出，病毒受到这些有机物的保护极大地增加抗灭活的抵抗力。此外，流感病毒可以在自然环境中，特别是凉爽和潮湿的条件下存活很长时间，在常温下禽流感病毒可以在动物粪便中存活7天。以上这些因素给禽流感的预防控制工作带来极大的困难，目前禽流感预防的重点主要在于早期发现和在流行前的预防。

AIV感染可引起低致病性禽流感和高致病性禽流感，感染后引起感染宿主的临床表现不特异，在禽类感染的前期症状和其他呼吸道传染病如鸡瘟等类似。高致病性禽流感主要表现为：暴发时家禽大批急性死亡，产蛋停止，呼吸道症状，头部、颜面部和颈部浮肿，无毛部皮肤(冠肉髯、脚部)发绀、肿、出血、坏死，白绿色下痢。低致病性禽流感主要表现为：无症状急性感染，死亡率为5％～15％，产蛋率下降5％～50％，呼吸道病变、气管水肿、干酪样渗出物、气囊炎，肾脏肿大、尿酸盐沉着。在人类禽流感所引起的症状和其他呼吸道病毒感染所引起的症状几乎无法鉴别。仅根据禽流感的临诊症状和剖检病变很难确诊，必须进行实验室诊断。

历史上的禽流感在人类社会曾发生过多次全球性大流行，第一次世界大战末期(1918～1919)的流行，导致5亿人患病，死者2000万；1946～1947年、1957～1958年与1968～1969年又曾三度流行于全世界，之后由于传染病的预防和控制体制和机构的不断健全，从而极大程度的控制了禽流感的在人类中的流行。然而对于一些易感宿主，禽流感的发病率仍然居高不下。2005年至今H5N1亚型禽流感疫情在人和禽类宿主的不断爆发对人类社会的经济和文明亦造成了极大的危害。

目前临床上对AIV检测的金标准仍然是鸡胚或MDCK细胞培养分离和血凝实验，其他的检测还有荧光PCR检测、ELISA抗原抗体检测、胶体金抗原检测等方法和试剂盒。金标准的检测方法需要的时间比较长而难于及时的对疫病进行监控；荧光PCR的检测主要由于检测仪器的昂贵和仪器的不普及而不能广泛应用；ELISA和胶体金抗原检测由于方法固有的低灵敏度而不能完全满足疫病防控的需要。

目前尚未有关于禽流感病毒的PCR-杂交检测及分型方法和试剂盒。目前也没有这方面的国家标准。

发明内容

本发明的目的在于提供一种常见禽流感病毒的早期、有效而简便的检测及分型方法，是对AIV的基因组核酸进行PCR反应后利用PCR产物进行核酸杂交，通过酶标记的AIV通用型和亚型特异性探针进行禽流感病毒的检测和分型。涉及的禽流感病毒包括通用型和H1、H3、H5、H7、H9、N1、N2等目前主要流行的亚型。

本发明所述的一种禽流感病毒PCR扩增和杂交检测与分型方法，包括以下步骤：

a)分析在国际基因数据库GenBank中登录的所有禽流感病毒即AIV基因组全序列，确定针对AIV通用型和AIV主要亚型即H1、H3、H5、H7、H9、N1、N2亚型的高度保守的特异性核酸序列作为靶序列；

b)针对所述靶序列设计并合成AIV通用型和各主要亚型的特异性引物；

c)针对所述靶序列位于所述引物之间的序列设计并合成AIV通用型和各主要亚型的扑获探针和生物素标记的杂交探针；

d)提取待检样本RNA，在包含所述引物的RT-PCR反应液中进行RT-PCR扩增得到样本cDNA；

e)将所述的生物素标记杂交探针和变性液加入PCR产物中，进行变性反应；

f)将变性产物与杂交液加入包含所述扑获探针的检测条中，进行杂交反应；以及

g)显色和终止反应，通过检测条的显色条带，判断待检样本是否含有禽流感病毒以及确定病毒的分型。

本发明在大量分析现有的GenBank登录的AIV基因组全序列的基础上，获取针对AIV不同亚型的亚型特异性和AIV通用型特异性核酸序列，设计了AIV各亚型和通用型的特异性引物和探针，提高了临床检测的特异性和灵敏度，同时在检测的同时可以鉴别AIV的亚型。这种检测方法结合了PCR方法高灵敏度的优点，同时发挥了核酸杂交方法操作简单的性能；采用了特异性的引物和包被、杂交探针，极大程度上提高了检测的特异性。本发明的禽流感PCR-杂交检测及分型方法的技术特征在于，对GenBank中的相关序列进行分析，找出高度保守的特异性核酸序列，并使用相关软件分析并设计相应引物和探针，利用引物、探针序列的特异性，采用PCR-杂交的方法，对可疑含有AIV的样本进行AIV的检测和分型。

本发明的另一目的在于提供一种禽流感病毒的检测试剂盒。

本发明所述的一种禽流感病毒的检测试剂盒，包括：病原体基因组核酸提取液；PCR反应试剂，其包含如权利要求1所述的检测与分型方法中的引物；检测条，其包含如权利要求1所述的检测与分型方法中的扑获探针；杂交探针混合管，其包含如权利要求1所述的检测与分型方法中的生物素标记的杂交探针；变性液；杂交液；洗液；辣根过氧化酶的链霉亲和素交联液，即streptavidin-HRP交联液；底物液；以及终止液。

优选地，所述的病原体基因组核酸提取液包括：提取液I，其组分为2％糖原、20％异丙醇、5M异硫氰酸胍、31.25mM柠檬酸钠、0.6125％十二烷基磺酸钠、0.125M β-巯基乙醇；提取液II，其组分为异丙醇；提取液III，其组分为75％乙醇水溶液；以及样本稀释液，其组分为0.1％的DEPC水。

对于该检测方法所配套的试剂盒，采用的引物和探针顾及到了几乎所有的GenBank登录的AIV的型别和毒株，探针和引物所选择的是核酸片段具有明显的AIV特异性或亚型特异性。试剂盒采用的通用型和亚型特异性包被探针均在同一的检测条上，杂交探针均标记有生物素，杂交温度均控制在55℃左右；试剂盒附带有阳性对照品，检测条上设置有阳性控制线；试剂盒为定性检测，检测结果为阴性或阳性及具体亚型。

本发明所述的禽流感病毒聚合酶链式反应和杂交检测与分型方法及其试剂盒所涉及的AIV的靶核酸序列片段分别为：

AIV通用型序列(AIV-G)：

ATGCTCATGCCCAAGCAGAAAGTGGCAGGTTCCCTTTGCATCAGAATGGACCAGGCAATAATGGATAAAAACATCATATTGAAAGCAAACTTCAGTGTGATTTTTGACCGACTGGAAACCCTAATACTACTTAGAGCTTTCACAGAAGAAGGAGCAATTGTGGGAGAAATTTCACCGTTACCTTCTCTTCCAGGACATACTGATGAGGATGTCA

AIVH1亚型序列(AIV-H1)：

TACAGGACTAAGAAACATCCCATCCATTCAATACAGAGGTCTATTTGGAGCCATTGCTGGTTTTATTGAGGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGGATGGTATGGTTATCATCATCAGAATGAACAGGGATCAGGCTATGCAGCGGGTCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGGGATTACAAACAAGGTGA

AIV H3亚型序列(AIV-H3)：

ACGAAGCATTAAACAACCGGTTTCAGATCAAAGGTGTTGAACTGAAGTCTGGATACAAAGACTGGATCCTGTGGATTTCCTTTGCCATATCATGCTTTTTGCTTTGTGTTGTTTTGCTGGGGTTCATCATGTGGACCTGCCAGAGAGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGAGTG

AIV H5亚型序列(AIV-H5)：

TAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGAATGGATTTCTTCTGGACAATTTTAAAACCGAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAGCAATTATAAAAAGTGAAGTGGAATATGGTAACTGCA

AIV H7亚型序列(AIV-H7)：

AGTTTCAATGGGGCCTTCATAGCTCCAGACCGTGCAAGCTTCCTGAGAGGGAAATCTATGGGAATTCAGAGTGGAGTACAGGTTGACGCCAATTGTGAAGGGGATTGCTATCATAGTGGAGGGACAATAATAAGTAATTTGCCCTTTCAGAACATAAATAGCAGGGCAGTAGGGAAATG

AIV H9亚型序列(AIV-H9)：

CCAAAGAATTGCTCCACACAGAGCACAATGGAATGCTATGTGCAACAAACCTGGGGCATCCTCTCATACTAGACACCTGCACTATCGAAGGGCTGGTATACGGCAATCCCTCTTGTGATTTGCTGCTGGGAGGAAAAGAATGGTCTTACATTGTCGAAAGATCATCAGCGATC

AIVN1亚型序列(AIV-N1)：

ACTACGAGGAGTGTTCCTGTTATCCTGATGCTGGCGAAATAACATGTGTGTGCAGGGATAATTGGCATGGCTCGAATCGACCGTGGGTTTCTTTCAATCAGAATCTGGAGTATCAAATAGGATACATATGCAGTGGGGTTTTCGGAGACAATCCACGCCCCAATGATGGAACAGGCAGTTGTGG

AIV N2亚型序列(AIV-N2)：

AAGCTGCATCAATAGGTGTTTTTATGTGGAGTTGATAAGAGGAAGGCCGCAAGAGACTTAGAGTATGGTGGACCTCAAACAGTATTGTCGTATTTTGTGGCACTTCAGGTACTTATGGAACAGGCTCATGGCCTGATGGGGCGAATATCAATTTCATGCCTATATAAGCTTCCGCAATTTTAG

所涉及的引物和探针的序列分别为：

AIV通用型序列(AIV-G)：

引物1：ATGCTCATGCCCAAGCAGAA

引物2：TGACATCCTCATCAGTATGTCC

探针1：TGGCAGGTTCCCTTTGCATCAG

探针2：CAGGACATACTGATGAGGATGTCA-生物素

AIV H1亚型序列(AIV-H1)：

引物1：TACAGGACTAAGAAACATCCCATC

引物2：TCACCTTGTTTGTAATCCCGTTAATCCG

探针1：ATTGAGGGGGGATGGACTGGAATG

探针2：CCTTGTTTGTAATCCCGTTAATCCGTA-生物素

AIV H3亚型序列(AIV-H3)：

引物1：ACGAAGCATTAAACAACCGG

引物2：CACTCAAATGCAAATGTTGCACC

探针1：CTGTGGATTTCCTTTGCCATATC

探针2：GGTGCAACATTTGCATTTGAGTGTA-生物素

AIV H5亚型序列(AIV-H5)：

引物1：TAGCTACTAGATCCAAAGTAAACG

引物2：TGCAGTTACCATATTCCACA

探针1：GGGCAAAGTGGAAGAATGGA

探针2：AGTGAAGTGGAATATGGTAACTGCATA-生物素

AIV H7亚型序列(AIV-H7)：

引物1：AGTTTCAATGGGGCCTTCATAG

引物2：CATTTCCCTACTGCCCTGCTA

探针1：CTCCAGACCGTGCAAGCTTCCTGAGAGGG

探针2：TAGCAGGGCAGTAGGGAAATGTA-生物素

AIV H9亚型序列(AIV-H9)：

引物1：CCAAAGAATTGCTCCACACAGA

引物2：GTCTAGAATAAGAGGATGTCCCAGATTT

探针1：GATCGCTGATGATCTTTCGAC

探针2：GTCGAAAGATCATCAGCGATCTA-生物素

AIVN1亚型序列(AIV-N1)：

引物1：ACTACGAGGAGTGTTCCTGT

引物2：CCACAACTGCCTGTTCCATCA

探针1：TCCTGATGCTGGCGAAATAAC

探针2：TGATGGAACAGGCAGTTGTGGTA-生物素

AIVN2亚型序列(AIV-N2)：

引物1：AAGCTGCATCAATAGGTG

引物2：CTAAAATTGCGGAAGCTTATATAGGC

探针1：TGGTGGACCTCAAACAGTATTGTC

探针2：CTATATAAGCTTCCGCAATTTTAGA-生物素

本发明采用RT-PCR一步法的反应体系和反应程序。RT-PCR反应体系中含有的RT-PCR反应液，各组分和浓度分别为：Tris-HCl(pH8.9)50mM，KCl 50mM，MgCl24.0mM，甘油5％，明胶0.01％；dNTP 0.3mM；9对引物每条各0.45μM；Taq DNA聚合酶1U；M-MLV反转录酶100U。RT-PCR反应条件为：第一步37℃30min，95℃2min；第二步95℃5s，55℃35s，72℃30s，40次循环。RT-PCR反应液中的9对引物序列包括1对对照(Control)序列和8对上述的引物序列。

本发明所用检测条(AIV KIT)的主要部分为结合有9条寡5核苷酸序列的硝酸纤维膜，其中1条为用于对照(Control)的序列，8条为上面述及的AIV-G和各亚型的特异性探针1序列，该九条序列依次排列为Control、AIV-G、AIV-H1、AIV-H3、AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9、AIV-N1、AIV-N2。

本发明的杂交探针混合管(PROBE MIX)内容物为干粉，含有9条生物素标记探针，1条为对照(Control)探针，8条为上述的8条探针2序列。使用时加入750μL的无菌水溶解后使用。

试剂盒中的变性液以EDTA为主要成分，杂交液和洗液是含有0.1％CAA的SSC缓冲液，streptavidin-HRP交联液是含有碱性磷酸酶和0.01％的MIT的TRIS缓冲体系，底物液为TMB/E溶液，终止液为2M的硫酸。

本发明所述的禽流感病毒PCR-杂交检测及分型方法和试剂盒，是采用AIV通用型和亚型特异性核酸序列来对禽流感病毒进行病原学诊断和亚型分析。该方法结合了PCR检测方法高灵敏度的优点，PCR后通过扑获探针使PCR产物结合到检测条上，最后通过生物素标记探针的杂交结合和TMB底物显色。对于阳性样本在检测条上可出现特异性检测条带。本方法不需要特殊和昂贵的检测仪器，操作简便快捷，结果直观可靠，利于推广使用。

本发明所述的禽流感病毒PCR-杂交检测及分型方法，采用特异性的核酸序列进行AIV的病原学诊断和亚型分析，有利于在疫病流行的早期就确定引起病原体。有利于对禽流感的流行病学进行研究，指导在禽流感疫病流行的初期进行预防，从而能极大程度的降低AIV的流行范围和程度，降低AIV流行对社会的危害。

和现有的禽流感病毒检测方法相比较，本发明具有明显的优势：

本发明对临床样本的检测从样本的收集、核酸的抽提、反应体系的配制、程序的运行到得出结果，可以在6个小时内完成，有利于禽流感病毒的快速检测；所选用的引物和探针均顾及到流行的主要型别，并且是各个病原体的特异性核酸片段，因此具有高的灵敏度和特异性，有利于禽流感病毒的早期诊断和型别鉴定。本发明提供的检测方法使用的主要试剂均来源于本发明所包括的试剂盒，实验流程少，操作简便易行，消耗费用低。和其他禽流感病毒检测的方法相比较，本发明的优势还在于进行检测的同时可以对禽流感病毒进行分型。

具体实施方式

1、试剂盒组成

(1)病原体基因组核酸提取液，包括提取液I：2％糖原；20％异丙醇；5M异硫氰酸胍；31.25mM柠檬酸钠；0.6125％十二烷基磺酸钠；0.125M β-巯基乙醇；提取液II：异丙醇；提取液III：75％乙醇水溶液；样本稀释液：0.1％的DEPC水(去离子水)。

(2)PCR反应试剂包括RT-PCR Buffer(缓冲液)I、II和酶I、II。检测时加入提取的模板6μl，反应液终体积为50μl，最终反应液的各组分如下：Tris-HCl(pH 8.9)50mM，KCl 50mM，MgCl2 2.5mM，DTT 5％，BSA 0.01％；dNTP 0.3mM；9对引物每条各0.45μM；Taq DNA聚合酶2U；M-MLV反转录酶200U。

(3)杂交试剂包括有检测条、杂交探针混合管、变性液、杂交液、洗液、streptavidin-HRP交联液、底物液和终止液。其中变性液以EDTA为主要成分，杂交液和洗液是含有0.1％CAA的SSC缓冲液，streptavidin-HRP交联液是含有碱性磷酸酶和0.01％的MIT的TRIS缓冲体系，底物液为TMB/E溶液，终止液为2M的硫酸。

2、可疑含禽流感病毒基因组样本的PCR-杂交检测及分型

(1)基本原理禽流感病毒分为许多亚型，其中最主要的是H1亚型、H3亚型、H5亚型、H7亚型、H9亚型、N1亚型和N2亚型。根据禽流感病毒各亚型或通用型保守序列，筛选出各自的特异性引物和探针序列，通过PCR倍数扩增和酶标记放大的技术，不同亚型的禽流感病毒在检测条的不同位置显示出各自的特异性条带，从而实现在一个检测条上实现禽流感病毒的检测和分型的目的。

(2)样本采集、保存及运输

禽类咽喉拭子和泄殖腔拭子样本：将拭子伸入喉头口及上颚裂、咽后壁部位或泄殖腔刮取咽喉分泌液或沾取少量粪便；将采集后的拭子放入1.0mL的生理盐水或PBS中，反复挤压拭子，挤出拭子中的液体，丢弃拭子到专用的废液缸内，液体部分4℃、3000rpm离心5min，取上清液转入无菌的1.5mL Eppendorf管中，标记后保存待检。

肌肉或组织脏器样本：采集肌肉或组织脏器，取待检样本100mg于洁净、无菌的研钵中充分研磨，加1mL的生理盐水或PBS混匀，4℃、3000rpm离心5min，取上清液转入无菌的1.5mL Eppendorf管中，标记后保存待检。

血清样本：取血清到无菌的1.5mL Eppendorf管中，标记后保存待检。

分离培养液：收集鸡胚培养液或细胞培养液的细胞悬液，到无菌的1.5mL Eppendorf管中，标记后保存待检。

运输：样本运送采用冰壶或加冰泡沫箱。

(3)样本处理取200μl提取液A于1.5mL Eppendorf管中，每管分别加入待检样本、阴/阳性对照60μl，作好标记，颠倒数次充分混匀，室温静置3min；加入200μl提取液B，颠倒数次充分混匀，于4℃13000rpm离心15min，去上清；加入200μl提取液C，轻柔颠倒数次以冲洗管壁，于4℃13000rpm离心5min，吸弃上清，室温放置2～6分钟晾干；加入20μl样本稀释液，短暂离心使液体落于管底部以溶解RNA，取上清做PCR。提取的RNA在2小时内进行PCR，如长期保存须置于-70℃。

(4)PCR扩增取出RT-PCR反应液和酶，室温融化后短暂离心；取相应份数的反应液(反应液44μl/份)和相应份数的酶(1.0μl/份)混匀，向每个PCR反应管内加入45μl，加入5μl提取的样本模板。RT-PCR反应条件为：第一步37℃30min，95℃2min；第二步95℃5s，55℃35s，72℃30s，40次循环。

(5)杂交向各PCR管内加入15μl混合探针液和15μl的变性液，37℃下孵育10min，取出PCR管内容物和450μl的杂交液，加入到放置有检测条的专用的容器内，37℃下加盖振摇孵育45min；取出检测条到同一洗液盘中并加入洗液，以液面盖过检测条为准轻振摇冲洗10分钟，连续冲洗三次；加入streptavidin-HRP交联液，37℃下加盖振摇孵育30min后用冲洗液冲洗三次；加入1/10体积的底物液TMB/E并37℃下加盖振摇孵育10min；加入1/10体积的终止液终止反应；取出检测条目测观察检测结果。

(6)结果判定

未出现阳性对照条带的结果无效；仅出现阳性对照条带的为阴性；出现阳性对照条带、通用型条带和某亚型特异性条带的为该亚型禽流感病毒感染；出现阳性条带和通用型条带、无亚型检测结果的需要进行重复检测，若重复结果仍如此的提示该待检样本所含有的禽流感病毒超出本试剂的亚型检测范围。

(7)注意事项：

特殊样本的处理应选用相应级别的生物安全实验室操作。

操作步骤需严格分区进行，谨防污染操作环境。

实验进行前和完成后清注意操作环境的空气和操作台的消毒。

实验操作以及PCR实验室规范应参考中华人民共和国国家标准的GB/T 19438-2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》。

序列表SEQUENCE LISTING

<110>广州市疾病预防控制中心

珠海汇康生物科技有限公司

<120>禽流感病毒PCR扩增和杂交检测与分型方法及其试剂盒

<130>

<160>40

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>214

<212>DNA

<213>AIV-G

<400>1

atgctcatgc ccaagcagaa agtggcaggt tccctttgca tcagaatgga ccaggcaata 60

atggataaaa acatcatatt gaaagcaaac ttcagtgtga tttttgaccg actggaaacc 120

ctaatactac ttagagcttt cacagaagaa ggagcaattg tgggagaaat ttcaccgtta 180

ccttctcttc caggacatac tgatgaggat gtca 214

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(primer)

<400>2

atgctcatgc ccaagcagaa 20

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(primer)

<400>3

tgacatcctc atcagtatgt cc 22

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(probe)

<400>4

tggcaggttc cctttgcatc ag 22

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列(probe)

<400>5

caggacatac tgatgaggat gtca 24

<210>6

<211>194

<212>DNA

<213>AIV-H1

<400>6

tacaggacta agaaacatcc catccattca atacagaggt ctatttggag ccattgctgg 60

ttttattgag gggggatgga ctggaatgat agatggatgg tatggttatc atcatcagaa 120

tgaacaggga tcaggctatg cagcgggtca aaaaagcaca caaaatgcca ttaacgggat 180

tacaaacaag gtga 194

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列(primer)

<400>7

tacaggacta agaaacatcc catc 24

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(primer)

<400>8

tcaccttgtt tgtaatcccg ttaatccg 28

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列(probe)

<400>9

attgaggggg gatggactgg aatg 24

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列(probe)

<400>10

ccttgtttgt aatcccgtta atccgta 27

<210>11

<211>179

<212>DNA

<213>AIV-H3

<400>11

acgaagcatt aaacaaccgg tttcagatca aaggtgttga actgaagtct ggatacaaag 60

actggatcct gtggatttcc tttgccatat catgcttttt gctttgtgtt gttttgctgg 120

ggttcatcat gtggacctgc cagagaggca acattaggtg caacatttgc atttgagtg 179

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(primer)

<400>12

acgaagcatt aaacaaccgg 20

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列(primer)

<400>13

cactcaaatg caaatgttgc acc 23

<210>14

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列(probe)

<400>14

ctgtggattt cctttgccat atc 23

<210>15

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(probe)

<400>15

ggtgcaacat ttgcatttga gtgta 25

<210>16

<211>186

<212>DNA

<213>AIV-H5

<400>16

tagctactag atccaaagta aacgggcaaa gtggaagaat ggatttcttc tggacaattt 60

taaaaccgaa tgatgcaatc aacttcgaga gtaatggaaa tttcattgct ccagaatatg 120

catacaaaat tgtcaagaaa ggggactcag caattataaa aagtgaagtg gaatatggta 180

actgca 186

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列(primer)

<400>17

tagctactag atccaaagta aacg 24

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(primer)

<400>18

tgcagttacc atattccaca 20

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(probe)

<400>19

gggcaaagtg gaagaatgga 20

<210>20

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列(probe)

<400>20

agtgaagtgg aatatggtaa ctgcata 27

<210>21

<211>179

<212>DNA

<213>AIV-H7

<400>21

agtttcaatg gggccttcat agctccagac cgtgcaagct tcctgagagg gaaatctatg 60

ggaattcaga gtggagtaca ggttgacgcc aattgtgaag gggattgcta tcatagtgga 120

gggacaataa taagtaattt gccctttcag aacataaata gcagggcagt agggaaatg 179

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(primer)

<400>22

agtttcaatg gggccttcat ag 22

<210>23

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(primer)

<400>23

catttcccta ctgccctgct a 21

<210>24

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列(probe)

<400>24

ctccagaccg tgcaagcttc ctgagaggg 29

<210>25

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列(probe)

<400>25

tagcagggca gtagggaaat gta 23

<210>26

<211>173

<212>DNA

<213>AIV-H9

<400>26

ccaaagaatt gctccacaca gagcacaatg gaatgctatg tgcaacaaac ctggggcatc 60

ctctcatact agacacctgc actatcgaag ggctggtata cggcaatccc tcttgtgatt 120

tgctgctggg aggaaaagaa tggtcttaca ttgtcgaaag atcatcagcg atc 173

<210>27

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(primer)

<400>27

ccaaagaatt gctccacaca ga 22

<210>28

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(primer)

<400>28

gtctagaata agaggatgtc ccagattt 28

<210>29

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(probe)

<400>29

gatcgctgat gatctttcga c 21

<210>30

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列(probe)

<400>30

gtcgaaagat catcagcgat cta 23

<210>31

<211>184

<212>DNA

<213>AIV-N1

<400>31

actacgagga gtgttcctgt tatcctgatg ctggcgaaat aacatgtgtg tgcagggata 60

attggcatgg ctcgaatcga ccgtgggttt ctttcaatca gaatctggag tatcaaatag 120

gatacatatg cagtggggtt ttcggagaca atccacgccc caatgatgga acaggcagtt 180

gtgg 184

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(primer)

<400>32

actacgagga gtgttcctgt 20

<210>33

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(primer)

<400>33

ccacaactgc ctgttccatc a 21

<210>34

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(probe)

<400>34

tcctgatgct ggcgaaataa c 21

<210>35

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列(probe)

<400>35

tgatggaaca ggcagttgtg gta 23

<210>36

<211>182

<212>DNA

<213>AIV-N2

<400>36

aagctgcatc aataggtgtt tttatgtgga gttgataaga ggaaggccgc aagagactag 60

agtatggtgg acctcaaaca gtattgtcgt attttgtggc acttcaggta cttatggaac 120

aggctcatgg cctgatgggg cgaatatcaa tttcatgcct atataagctt ccgcaatttt 180

ag 182

<210>37

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(primer)

<400>37

aagctgcatc aataggtg 18

<210>38

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列(primer)

<400>38

ctaaaattgc ggaagcttat ataggc 26

<210>39

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列(probe)

<400>39

tggtggacct caaacagtat tgtc 24

<210>40

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(probe)

<400>40

ctatataagc ttccgcaatt ttaga 25

Claims

1、一种禽流感病毒PCR扩增和杂交检测与分型方法，其特征在于，包括以下步骤：

2、根据权利要求1所述的检测与分型方法，其特征在于：所述针对AIV通用型的靶序列为如SEQ ID No.1所列的核苷酸序列；针对AIV通用型的靶序列的一对引物为如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所列的核苷酸序列；针对AIV通用型的靶序列的扑获探针为如SEQ ID No.4所列的核苷酸序列；针对AIV通用型的靶序列的杂交探针为如SEQ ID No.5所列的核苷酸序列。

3、根据权利要求1所述的检测与分型方法，其特征在于：所述针对AIV的H1亚型的靶序列为如SEQ ID No.6所列的核苷酸序列；针对AIV的H1亚型的靶序列的一对引物为如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所列的核苷酸序列；针对AIV的H1亚型的靶序列的扑获探针为如SEQ ID No.9所列的核苷酸序列；针对AIV的H1亚型的靶序列的杂交探针为如SEQ ID No.10所列的核苷酸序列。

4、根据权利要求1所述的检测与分型方法，其特征在于：所述针对AIV的H3亚型的靶序列为如SEQ ID No.11所列的核苷酸序列；针对AIV的H3亚型的靶序列的一对引物为如SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所列的核苷酸序列；针对AIV的H3亚型的靶序列的扑获探针为如SEQ ID No.14所列的核苷酸序列；针对AIV的H3亚型的靶序列的杂交探针为如SEQ ID No.15所列的核苷酸序列。

5、根据权利要求1所述的检测与分型方法，其特征在于：所述针对AIV的H5亚型的靶序列为如SEQ ID No.16所列的核苷酸序列；针对AIV的H5亚型的靶序列的一对引物为如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所列的核苷酸序列；针对AIV的H5亚型的靶序列的扑获探针为如SEQ ID No.19所列的核苷酸序列；针对AIV的H5亚型的靶序列的杂交探针为如SEQ ID No.20所列的核苷酸序列。

6、根据权利要求1所述的检测与分型方法，其特征在于：所述针对AIV的H7亚型的靶序列为如SEQ ID No.21所列的核苷酸序列；针对AIV的H7亚型的靶序列的一对引物为如SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所列的核苷酸序列；针对AIV的H7亚型的靶序列的扑获探针为如SEQ ID No.24所列的核苷酸序列；针对AIV的H7亚型的靶序列的杂交探针为如SEQ ID No.25所列的核苷酸序列。

7、根据权利要求1所述的检测与分型方法，其特征在于：所述针对AIV的H9亚型的靶序列为如SEQ ID No.26所列的核苷酸序列；针对AIV的H9亚型的靶序列的一对引物为如SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所列的核苷酸序列；针对AIV的H9亚型的靶序列的扑获探针为如SEQ ID No.29所列的核苷酸序列；针对AIV的H9亚型的靶序列的杂交探针为如SEQ ID No.30所列的核苷酸序列。

8、根据权利要求1所述的检测与分型方法，其特征在于：所述针对AIV的N1亚型的靶序列为如SEQ ID No.31所列的核苷酸序列；针对AIV的N1亚型的靶序列的一对引物为如SEQ ID No.32和SEQ ID No.33所列的核苷酸序列；针对AIV的N1亚型的靶序列的扑获探针为如SEQ ID No.34所列的核苷酸序列；针对AIV的N1亚型的靶序列的杂交探针为如SEQ ID No.35所列的核苷酸序列。

9、根据权利要求1所述的检测与分型方法，其特征在于：所述针对AIV的N2亚型的靶序列为如SEQ ID No.36所列的核苷酸序列；针对AIV通用型的靶序列的一对引物为如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所列的核苷酸序列；针对AIV通用型的靶序列的扑获探针为如SEQ ID No.39所列的核苷酸序列；针对AIV通用型的靶序列的杂交探针为如SEQ ID No.40所列的核苷酸序列。

10、一种禽流感病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括：

病原体基因组核酸提取液；

PCR反应试剂，其包含如权利要求1所述的检测与分型方法中的引物；

检测条，其包含如权利要求1所述的检测与分型方法中的扑获探针；

杂交探针混合管，其包含如权利要求1所述的检测与分型方法中的生物素标记的杂交探针；

变性液；

杂交液；

洗液；

辣根过氧化酶的链霉亲和素交联液，即streptavidin-HRP交联液；

底物液；以及

终止液。

11、根据权利要求10所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的病原体基因组核酸提取液包括：

提取液I，其组分为2％糖原、20％异丙醇、5M异硫氰酸胍、31.25mM柠檬酸钠、0.6125％十二烷基磺酸钠、0.125M β-巯基乙醇；

提取液II，其组分为异丙醇；

提取液III，其组分为75％乙醇水溶液；以及

样本稀释液，其组分为0.1％的DEPC水。

12、根据权利要求10所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的引物是针对AIV通用型的靶序列的一对引物，包含如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所列的核苷酸序列；所述的扑获探针为针对AIV通用型的靶序列的扑获探针，包含如SEQ ID No.4所列的核苷酸序列；所述的杂交探针为针对AIV通用型的靶序列的杂交探针，包含如SEQ IDNo.5所列的核苷酸序列。

13、根据权利要求10所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的引物是针对AIV的H1亚型的靶序列的一对引物，包含如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所列的核苷酸序列；所述的扑获探针为针对AIV的H1亚型的靶序列的扑获探针，包含如SEQ ID No.9所列的核苷酸序列；所述的杂交探针为针对AIV的H1亚型的靶序列的杂交探针，包含如SEQ ID No.10所列的核苷酸序列。

14、根据权利要求10所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的引物是针对AIV的H3亚型的靶序列的一对引物，包含如SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所列的核苷酸序列；所述的扑获探针为针对AIV的H3亚型的靶序列的扑获探针，包含如SEQ ID No.14所列的核苷酸序列；所述的杂交探针为针对AIV的H3亚型的靶序列的杂交探针，包含如SEQ ID No.15所列的核苷酸序列。

15、根据权利要求10所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的引物是针对AIV的H5亚型的靶序列的一对引物，包含如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所列的核苷酸序列；所述的扑获探针为针对AIV的H5亚型的靶序列的扑获探针，包含如SEQ ID No.19所列的核苷酸序列；所述的杂交探针为针对AIV的H5亚型的靶序列的杂交探针，包含如SEQ ID No.20所列的核苷酸序列。

16、根据权利要求10所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的引物是针对AIV的H7亚型的靶序列的一对引物，包含如SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所列的核苷酸序列；所述的扑获探针为针对AIV的H7亚型的靶序列的扑获探针，包含如SEQ ID No.24所列的核苷酸序列；所述的杂交探针为针对AIV的H7亚型的靶序列的杂交探针，包含如SEQ ID No.25所列的核苷酸序列。

17、根据权利要求10所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的引物是针对AIV的H9亚型的靶序列的一对引物，包含如SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所列的核苷酸序列；所述的扑获探针为针对AIV的H9亚型的靶序列的扑获探针，包含如SEQ ID No.29所列的核苷酸序列；所述的杂交探针为针对AIV的H9亚型的靶序列的杂交探针，包含如SEQ ID No.30所列的核苷酸序列。

18、根据权利要求10所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的引物是针对AIV的N1亚型的靶序列的一对引物，包含如SEQ ID No.32和SEQ ID No.33所列的核苷酸序列；所述的扑获探针为针对AIV的N1亚型的靶序列的扑获探针，包含如SEQ ID No.34所列的核苷酸序列；所述的杂交探针为针对AIV的N1亚型的靶序列的杂交探针，包含如SEQ ID No.35所列的核苷酸序列。

19、根据权利要求10所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的引物是针对AIV的N2亚型的靶序列的一对引物，包含如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所列的核苷酸序列；所述的扑获探针为针对AIV的N2亚型的靶序列的扑获探针，包含如SEQ ID No.39所列的核苷酸序列；所述的杂交探针为针对AIV的N2亚型的靶序列的杂交探针，包含如SEQ ID No.40所列的核苷酸序列。