CN105441430B - 一种检测禽流感病毒及其h9、n2亚型的引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测禽流感病毒及其H9、N2亚型的引物及其应用。本发明公开一组引物，由如下(1)‑(6)所示的DNA分子组成：(1)SEQ ID No.1所示的DNA分子；(2)SEQ ID No.2所示的DNA分子；(3)SEQ ID No.3所示的DNA分子；(4)SEQ ID No.4所示的DNA分子；(5)SEQ ID No.5所示的DNA分子；(6)SEQ ID No.6所示的DNA分子。本发明公开的三重RT‑PCR是一种简便、快速、有效的检测AIV且能同时进行H9、N2亚型AIV分型检测的技术，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测禽流感病毒及其H9、N2亚型的引物及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
禽流感(avian influenza,AI)是由禽流感病毒(AIV)感染宿主后引起从无症状带毒到全身性败血等不同临诊症状的一类重要传染病，危害严重，能够对养禽业造成毁灭性的影响，是世界各国重点检疫和防范的对象。H9N2亚型AIV是低致病性禽流感病毒(Lowlypathogenic avian influenza virus，LPAIV)，可引起呼吸道症状、产蛋率下降等，在其继发其它病毒或细菌混合感染的情况下则可引起更严重的损失。自上个世纪90年代末，H9N2亚型AIV在亚洲南部、非洲南部、欧洲以及中东地区均有报道。目前仍在我国大范围流行并形成地方流行性疾病，其发病率占总禽流感发病率的90％以上。H9N2亚型AIV不仅能对我国养禽业造成损失，还能跨越种属屏障由禽类直接或间接传染给哺乳动物甚至人类，具有重大公共卫生意义。N2亚型是能导致禽类感染的常见NA亚型，在我国主要是H9N2亚型，但是其它N2亚型禽流感同样应引起引起人们的重视，如H5N2亚型禽流感在历史上曾多次爆发，仇保丰等调查发现华东地区家鸭内的绝大多数N2亚型的AIVs发生了NA基因的重排并且正处于不断的进化状态。
目前检测AIVs常见方法主要是利用传统的病原学分离鉴定与血清学试验，该方法耗时较长且敏感性较差，并不能同时检测多种亚型。多重RT-PCR以其操作简单快捷、特异性好、敏感性高的优点，在临床上具有较高的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测禽流感病毒及其H9、N2亚型的引物及其应用。
本发明提供一组引物，由如下(1)-(6)所示的DNA分子组成：
(1)SEQ ID No.1所示的DNA分子；
(2)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(3)SEQ ID No.3所示的DNA分子；
(4)SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(5)SEQ ID No.5所示的DNA分子；
(6)SEQ ID No.6所示的DNA分子。
一种鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒及待测样品中H9亚型和/或N2亚型禽流感病毒的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述引物。
一种鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒及待测样品中H9亚型和/或N2亚型禽流感病毒的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：以待测样品的cDNA为模板，以上述引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物含有大小为667bp的条带，则待测样品候选为含有禽流感病毒的样品；如果PCR扩增产物同时含有大小分别为667bp和313bp的条带，则待测样品候选为含有H9亚型禽流感病毒的样品；如果PCR扩增产物同时含有大小分别为667bp和451bp的条带，则待测样品候选为含有N2亚型禽流感病毒的样品；如果PCR扩增产物同时含有大小分别为667bp、451bp和313bp的条带，则待测样品候选为含有H9N2亚型禽流感病毒的样品；
所述大小为667bp的条带是以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的DNA分子为引物进行PCR扩增得到的；
所述大小为451bp的条带是以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的DNA分子为引物进行PCR扩增得到的；
所述大小为313bp的条带是以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA分子为引物进行PCR扩增得到的。
上述方法中，所述PCR的反应体系如下：2×PCR扩增缓冲液12.5uL，浓度均为25pmol/uL的SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子各0.5μL，浓度均为25pmol/uL的SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ ID No.4所示的DNA分子各0.7μL，浓度均为25pmol/uL的SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子各0.4μL，模板cDNA1uL，加ddH2O补足体系至25uL；
所述2×PCR扩增缓冲液的商品名称为2×EasyTaq PCR SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为AS111-02。
上述任一所述的方法中，所述PCR的反应程序如下：94℃5min；94℃40s，54℃40s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min，最后4℃结束反应。
上述引物在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒及待测样品中H9亚型和/或N2亚型禽流感病毒的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒及待测样品中H9亚型和/或N2亚型禽流感病毒的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的应用中，所述禽流感病毒为如下任一种亚型：H9N2、H1N2、H3N2、H4N2、H5N2、H6N2、H7N2。
本发明根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的NA基因以及AIV M基因序列，分别设计了3对针对H9亚型AIV的HA基因和N2亚型AIV的NA基因及所有AIV的M基因的保守序列的引物,建立了AIV H9、N2亚型和M基因的三重RT-PCR检测方法。应用本发明提供的方法对H9N2亚型AIV模板进行RT-PCR扩增，可得到3条目的条带，分别为313bp(H9-AIV)、451bp(N2-AIV)和667bp(M gene)；对非H9亚型的N2亚型AIV模板进行扩增，出现2条特异性扩增条带，即451bp(N2-AIV)和667bp(M gene)；对非N2亚型的H9亚型AIV模板进行扩增，出现2条特异性扩增条带，即313bp(H9-AIV)和667bp(M gene)；对非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带，即667bp(M gene)；对其它禽呼吸道病原体进行PCR扩增，结果均为阴性。敏感性试验结果表明本发明的方法最低检出限为10pg/μL。应用本发明所建立的三重RT-PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病毒分离鉴定结果相一致。
因此，本发明建立的三重RT-PCR是一种简便、快速、有效的检测AIV且能同时进行H9、N2亚型AIV分型检测的技术，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为特异性检测结果。
图2为三重RT-PCR对20株H9N2亚型AIV的扩增结果。
图3为敏感性检测结果。
图4为临床样品检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
病毒DNA/RNA抽提试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为ER201-01。
2×EasyTaq PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为AS111-02。
AMV反转录酶、5×AMV Buffer均购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为2621。
H9N2亚型AIV(A/turtledove/Guangxi/49B6/2013(H9N2))在文献“Xu Q，Xie Z X，Xie L J，et al.Characterization of an Avian Influenza Virus H9N2StrainIsolated from a Wild Bird in Southern China[J].Genome Announc.2014Jun 19；2(3).pii:e00600-14.doi:10.1128/genomeA.00600-14.”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
H1N1亚型AIV(A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1))在文献“彭宜,谢芝勋,郭捷,等.利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、N2亚型的分型”,病毒学报,2013,29(2):154-159.”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
H1N2亚型AIV(A/Sparrow/Guangxi/GXs-1/2012(H1N2))在文献“郭捷,谢芝勋,彭宜,等.一株鸟源H1N2型禽流感病毒全基因序列分析[J].中国兽医学报,2014,34(6):874-820.”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
H3N2亚型AIV(A/Duck/Guangxi/N42/2009(H3N2))在文献“Peng Y1,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reversetranscription loop-mediated isothermal amplification assay.Virology Journal,2011,8:337.”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
H3N6亚型AIV(A/Pigeon/Guangxi/020P/2009(H3N6))序列信息收录于NCBI基因库，登录号为KM186122-KM186129。
H3N8亚型AIV(A/Goose/Guangxi/020G/2009(H3N8))在文献“Liu T,Xie Z,SongD,et al.Genetic Characterization of a Natural Reassortant H3N8Avian InfluenzaVirus Isolated from Domestic Geese in Guangxi,Southern China.GenomeAnnounc.2014,2(4):e00747-14.”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
H4N2亚型AIV(A/duck/Guangxi/125D17/2012(H4N2))序列信息收录于NCBI基因库，登录号为KJ881013-KJ881020。
H4N5亚型AIV(A/Duck/HK/668/79(H4N5))在文献“Zhixun Xie,Yao-shan Pang,Jiabo Liu,et al.A multiplex RT-PCR for detection of type A influenza virusand differentiation of avian H5,H7,and H9hemagglutinin subtypes[J].Molecularand Cellular Probes,2006,20(3-4):245-249.”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
H5N2亚型AIV(A/Turkey/GA/209092/02(H5N2))在文献“彭宜,谢芝勋,刘加波,等.H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立[J].南方农业学报，2013,02:323-327.”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
H6N2亚型AIV(A/duck/Guangxi/GXd-3/2009(H6N2))在文献“Peng Y,Xie Z,LiuJ,et al.Epidemiological Surveillance of Low Pathogenic Avian Influenza Virus(LPAIV)from Poultry in Guangxi Province,Southern China.[J].PLOS ONE,2013,8(10):1-6.”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
H6N6亚型AIV(A/duck/Guangxi/GXd-7/2011(H6N6))在文献“Peng Y,Xie Z,LiuJ,et al.Epidemiological Surveillance of Low Pathogenic Avian Influenza Virus(LPAIV)from Poultry in Guangxi Province,Southern China.[J].PLOS ONE,2013,8(10):1-6.”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
H7N2亚型AIV(A/Chicken/NY/273874/03(H7N2))在文献“谢芝勋,庞耀珊,邓显文,等.H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法的建立[J].”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
新城疫病毒(lasota)、传染性支气管炎病毒(M41)、鸡毒支原体(MG S6)在文献“彭宜,谢芝勋,郭捷,等.利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、N2亚型的分型”,病毒学报,2013,29(2):154-159.”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
鸡传染性喉气管炎病毒(AV1231)、禽呼肠孤病毒鸡毒(S1133)在文献“Xie Z,LuoS,Xie L,et al.Simultaneous typing of nine avian respiratory pathogens using anovel GeXP analyzer-based multiplex PCR assay[J].J Virol Methods.201412；207C:188-195.”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
A/Duck/Guangxi/1/00(H9N2)、A/Duck/Guangxi/2/00(H9N2)、A/Duck/Guangxi/3/00(H9N2)在文献“Zhixun Xie,Yao-shan Pang,Jiabo Liu,et al.A multiplex RT-PCRfor detection of type A influenza virus and differentiation of avian H5,H7,and H9hemagglutinin subtypes[J].Molecular and Cellular Probes,2006,20(3-4):245-249.”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
A/chicken/China/Guangxi1/2000(H9N2)、A/chicken/China/Guangxi14/2000(H9N2)、A/chicken/China/Guangxi17/2000(H9N2)在文献“Xie Z X,Dong J B,Tang X F,et al.Sequence and phylogenetic Analysis of Three Isolates of Avian InfluenzaH9N2from Chickens in Southern China[J].Scholarly Research Exchange.Volume2008.1-7,Article ID 802317.doi:10.3814/2008/802317.”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
A/duck/Guangxi/RX/09(H9N2)在文献“彭宜,谢芝勋,郭捷,等.利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、N2亚型的分型”,病毒学报,2013,29(2):154-159.”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
A/chicken/Guangxi/067C4/2010(H9N2)在文献“Peng Y,Xie Z X,Liu J B,etal.Epidemiological Surveillance of Low Pathogenic Avian Influenza Virus(LPAIV)from Poultry in Guangxi Province,Southern China[J].PLoS ONE,2013,8(10):e77132doi:10.1371/journal.pone.0077132.”中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
A/chicken/Guangxi/LS/2013(H9N2)序列信息收录于NCBI基因库,登录号为KM070507-KM070514。
实施例1、三重RT-PCR条件的确定
一、引物的设计与合成
设计并合成针对H9亚型、N2亚型AIV及各种不同亚型AIV M基因的3对特异性引物，引物序列如表1所示，引物储存液浓度为25pmol/μL，-30℃保存备用。
表1 3对特异性引物的核苷酸序列
二、参照病毒DNA/RNA抽提试剂盒使用说明书对H9N2亚型AIV、H1N1亚型AIV、H1N2亚型AIV、H3N2亚型AIV、H3N6亚型AIV、H3N8亚型AIV、H4N2亚型AIV、H4N5亚型AIV、H6N2亚型AIV、H6N6亚型AIV、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒的RNA以及对鸡传染性喉气管炎病毒和鸡毒支原体的DNA进行抽提，抽提后的RNA、DNA分别用33μL、50μL DEPC水溶解。向RNA抽提产物中加入500ng国际通用流感病毒反转录引物Uni12primer(序列：5’-AGCAAAAGCAGG-3’(SEQ ID No.7))(参见文献“Hoffmann E,Stech J,Guan Y,Webster RG,Perez DR.2001.Universal primer set for the full-length amplification of allinfluenza A viruses.Arch Virol.146:2275-2289.”)，70℃10min；冰浴5min；加入反转录体系：10μL 5×AMV Buffer、4μL dNTP、0.5μL RNA酶抑制剂、1μL AMV反转录酶，瞬时离心,42℃放置90min，制备得到cDNA。所有抽提所得的DNA及反转录所得的cDNA置-30℃保存备用。
三、三重RT-PCR条件的优化
通过对三重RT-PCR的引物浓度配比及反应参数(包括时间和温度)进行优化，筛选出三重RT-PCR最佳反应体系及反应模式，最后确定三重RT-PCR条件如下：
PCR反应体系(总体系为25uL):2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5μL，步骤二得到的模板DNA或cDNA 1μL，浓度为25pmol/μL的引物H9-F、H9-R各0.5μL，浓度为25pmol/μL的引物N2-F、N2-R各0.7μL、浓度为25pmol/μL的引物M-F、M-R各0.4μL，用ddH2O补充体系至25μL。
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，54℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃结束反应。
实施例2、特异性试验
一、按照实施例1中步骤二的方法提取H9N2亚型AIV(A/turtledove/Guangxi/49B6/2013(H9N2))、H1N1亚型AIV(A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1))、H1N2亚型AIV(A/Sparrow/Guangxi/GXs-1/2012(H1N2))、H3N2亚型AIV(A/Duck/Guangxi/N42/2009(H3N2))、H3N6亚型AIV(A/Pigeon/Guangxi/020P/2009(H3N6))、H3N8亚型AIV(A/Goose/Guangxi/020G/2009(H3N8))、H4N2亚型AIV(A/duck/Guangxi/125D17/2012(H4N2))、H4N5亚型AIV(A/Duck/HK/668/79(H4N5))、H6N2亚型AIV(A/duck/Guangxi/GXd-3/2009(H6N2))、H6N6亚型AIV(A/duck/Guangxi/GXd-7/2011(H6N6))、新城疫病毒(lasota)、传染性支气管炎病毒(M41)、禽呼肠孤病毒鸡毒(S1133)的RNA，并反转录为cDNA；H5N2亚型AIV(A/Turkey/GA/209092/02(H5N2))和H7N2亚型AIV(A/Chicken/NY/273874/03(H7N2))的RNA由为美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断研究室惠赠，直接反转录为cDNA。提取鸡传染性喉气管炎病毒(AV1231)、鸡毒支原体(MG S6)的DNA。
二、利用实施例1中步骤三优化后的三重RT-PCR反应体系及程序，对步骤一得到的各个DNA进行RT-PCR扩增，同时以ddH20代替模板作为阴性对照，进行上述反应，得到各个PCR扩增产物。
将各个PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。
图1中，M为DNA标准DL1000；1：H9N2亚型AIV(A/turtledove/Guangxi/49B6/2013(H9N2))；2：H1N1亚型AIV(A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1))；3：H1N2亚型AIV(A/Sparrow/Guangxi/GXs-1/2012(H1N2))；4：H3N2亚型AIV(A/Duck/Guangxi/N42/2009(H3N2))；5：H3N6亚型AIV(A/Pigeon/Guangxi/020P/2009(H3N6))；6：H3N8亚型AIV(A/Goose/Guangxi/020G/2009(H3N8))；7：H4N2亚型AIV(A/duck/Guangxi/125D17/2012(H4N2))；8：H4N5亚型AIV(A/Duck/HK/668/79(H4N5))；9：H5N2亚型AIV(A/Turkey/GA/209092/02(H5N2))；10：H6N2亚型AIV(A/duck/Guangxi/GXd-3/2009(H6N2))；11：H6N6亚型AIV(A/duck/Guangxi/GXd-7/2011(H6N6))；12：H7N2亚型AIV(A/Chicken/NY/273874/03(H7N2))；13：新城疫病毒(lasota)；14：传染性支气管炎病毒(M41)；15：传染性喉气管炎病毒(AV1231)；16：鸡毒支原体(MG S6)；17：禽呼肠孤病毒鸡毒(S1133)；18：阴性对照。
图1表明，H9N2亚型AIV扩增出现三条目的条带(667bp、451bp和313bp)；对H1N2、H3N2、H4N2、H5N2、H6N2、H7N2亚型AIV的扩增出两条目的条带(667bp和451bp)，对H1N1、H3N6、H3N8、H4N6、H6N6亚型AIV的扩增出现了一条目的条带(667bp)，而对新城疫病毒(lasota)、传染性支气管炎病毒(M41)、传染性喉气管炎病毒(AV1231)、鸡毒支原体(MG S6)及禽呼肠孤病毒鸡毒(S1133)及阴性对照扩增未出现任何目的条带。以上结果均与预计结果相一致，说明所建立的三重RT-PCR方法具有良好的特异性。
三、用步骤一和步骤二同样的方法对不同年份、不同宿主的H9N2亚型AIV(A/Duck/Guangxi/1/00(H9N2)、A/Duck/Guangxi/2/00(H9N2)、A/Duck/Guangxi/3/00(H9N2)、A/chicken/China/Guangxi1/2000(H9N2)、A/chicken/China/Guangxi14/2000(H9N2)、A/chicken/China/Guangxi17/2000(H9N2)、A/duck/Guangxi/RX/09(H9N2)、A/chicken/Guangxi/067C4/2010(H9N2)、A/turtledove/Guangxi/49B6/2013(H9N2)、A/chicken/Guangxi/LS/2013(H9N2)等进行扩增后，得到PCR扩增产物，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。
图2中，M为DNA标准DL1000；1-20为20株H9N2AIVs。
图2表明，20株H9N2AIVs均出现三条与预期大小相符的目的条带(667bp、451bp和313bp)，说明该三重RT-PCR方法的实用性好。
实施例3、敏感性试验
一、按照实施例1中步骤二的方法提取H9N2亚型AIV(A/turtledove/Guangxi/49B6/2013(H9N2))的RNA并反转录为cDNA，测定cDNA模板的浓度，并用超纯水将其倍比稀释成100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL。
二、利用实施例1中步骤三优化后的三重RT-PCR反应体系及程序，对步骤一得到的各个浓度的cDNA进行RT-PCR扩增，同时ddH20代替模板作为阴性对照，进行上述反应，得到各个PCR扩增产物，以此检测敏感性。
将各个PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。
图3中，M：DNA标准DL1000；1：100ng/μL H9N2；2：10ng/μL H9N2；3：1ng/μL H9N2；4：100pg/μL H9N2；5：10pg/μL H9N2；6：1pg/μL H9N2；7：100fg/μL H9N2；8：阴性对照。
表3表明，该三重RT-PCR最低能检出浓度为10pg/μL的H9N2亚型AIV cDNA模板。
实施例4、临床样品检测
一、对120份从广西南宁市活禽市场采集的咽喉和泄殖腔拭子进行无菌PBS缓冲液冲洗溶解处理，得到各个拭子样品溶液。按照实施例1中步骤二的方法提取各个样品溶液的RNA并反转录为cDNA。
二、利用实施例1中步骤三优化后的三重RT-PCR反应体系及程序，对步骤一得到的各个cDNA进行RT-PCR扩增，同时以H9N2亚型AIV(A/turtledove/Guangxi/49B6/2013(H9N2))的cDNA为模板作为阳性对照，以ddH20代替模板作为阴性对照，进行上述反应，得到各个PCR扩增产物。实验重复三次，保证实验的准确性。
三、同时对这120份样品用传统鸡胚接种的方法进行病原分离，并用传统血清学方法鉴定各个样品中所分离的病毒的亚型(具体可参考文献“殷震,刘景华.动物病毒学[M].第2版.北京:科学出版社,1997:733-734.)，以验证本发明的方法的准确性。
将各个拭子样品的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，部分结果如图4所示。
图4中，M：DNA标准DL1000；1：H9N2亚型AIV阳性对照；2-20为标号为2-20的各个拭子样品；21：阴性对照。
图4表明，阳性对照H9N2亚型AIV(A/turtledove/Guangxi/49B6/2013(H9N2))扩增出现三条目的条带(667bp、451bp和313bp)；标号为4,20的拭子样品扩增出667bp的目的条带，并且标号为4,20的拭子样品含有的AIV经血清学鉴定均为非H9亚型、非N2亚型的AIV；标号为7,13,18的拭子样品扩增出667bp和451bp的目的条带，并且上述标号为7,13,18的拭子样品含有的AIV经血清学鉴定为非H9亚型的N2亚型AIV；标号为8,15的拭子样品扩增出现三条目的条带(667bp、451bp和313bp)，并且标号为8,15的拭子样品含有的AIV经血清学鉴定为H9N2亚型的AIV；标号为2,3,5,6,9,10,11,12,14,16,17,19的拭子样品没有目的条带产生，经鉴定不含有AIV,阴性对照也无目的条带产生。
120份从广西南宁市活禽市场采集的口腔和粪便拭子样品，经三重RT-PCR检测，有9份呈H9N2亚型AIV阳性，阳性率为7.50％；14份呈N2亚型(非H9亚型)AIV阳性，阳性率为11.67％；22份呈其它亚型(非H9亚型、非N2亚型)AIV阳性，阳性率为18.33％；75份呈AIV阴性，该结果与用传统血清学方法鉴定的各个样品含有的病毒的亚型鉴定结果一致，说明本方法可以应用于临床样品检测。
Claims (7)
1.一组引物，由如下（1）-（6）所示的DNA分子组成：
（1）SEQ ID No.1所示的DNA分子；
（2）SEQ ID No.2所示的DNA分子；
（3）SEQ ID No.3所示的DNA分子；
（4）SEQ ID No.4所示的DNA分子；
（5）SEQ ID No.5所示的DNA分子；
（6）SEQ ID No.6所示的DNA分子。
2.一种鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物。
3.一种鉴定或辅助鉴定待测样品中H9亚型和/或N2亚型禽流感病毒的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物。
4.权利要求1所述的引物在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒的产品中的应用。
5.权利要求1所述的引物在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中H9亚型和/或N2亚型禽流感病毒的产品中的应用。
6.权利要求2所述的试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒的产品中的应用。
7.权利要求2所述的试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中H9亚型和/或N2亚型禽流感病毒的产品中的应用。
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