CN103103291A - 一种h4和h9亚型禽流感病毒多重鉴别检测的方法 - Google Patents

一种h4和h9亚型禽流感病毒多重鉴别检测的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种病毒的检测方法，更具体的讲是一种检测禽类及其产品中是否含有H4和H9亚型禽流感病毒的检测方法，包括以下步骤：设计两对引物、提取核酸、RT-PCR反应的反应体系、扩增条件、产物鉴定。本发明的有益效果是：在一个反应中同时鉴别诊断同一病毒的两种亚型，缩短操作时间；实验操作的反应液配制更为简单方便；避免了操作污染，因此本方法操作简便、成本更低，适合开发检测用RT-PCR试剂盒，用于H4和H9禽流感的临床鉴别诊断和流行病学调查。

Description

一种H4和H9亚型禽流感病毒多重鉴别检测的方法
技术领域
本发明涉及一种病毒的检测方法，更具体的讲是一种检测禽类及其产品中是否含有H4和H9亚型禽流感病毒的鉴别检测方法。
背景技术
流感病毒（Influenza virus）属于正粘病毒科流感病毒属，根据 NP 蛋白和 M 蛋白的差异可将其分为甲，乙和丙三个型。流感病毒基因组由 8 条负链 RNA 节段组成，编码 11 或 12 个蛋白，其中两个为糖蛋白：血凝素蛋白 HA 和神经氨酸酶蛋白 NA，二者位于病毒粒子表面。甲型流感病毒已在多种动物体内分离到，包括人，猪，马，鲸，海豹和鸟类等。甲型流感病毒，根据其血清学分析已经鉴定出 16 个 HA 亚型（H1-16）和 9 个 NA 亚型（N1-9）。随着在水禽中不断分离到各种亚型的流感病毒，水禽因此被认为是其它动物感染流感的病毒来源。在哺乳动物体内分离到的病毒亚型种类有限，在所有的流感病毒亚型中，仅仅 3 个 HA 和 2个 NA 亚型（H1N1，H2N2 和 H3N2）在人体内存在。在鸟类中，禽流感病毒可分为低致病性禽流感（LPAI）和高致病性禽流感（HPAI），已知的16 个 HA 和 9 个 NA 亚型均能在水禽体内分离到，其中仅 H5 和 H7 亚型的部分毒株属于 HPAI，其余均属于 LPAI。LPAI 和 HPAI 间致病性和致死性差别较大（从无任何症状到 100%致死）。呼吸道和肠道是流感病毒复制的主要场所，但组织分布差异较大，尤其在 HPAI 毒株间。病毒 HA 蛋白对受体的特异性和亲和力是决定宿主嗜性和传播能力的关键因素之一。H4 亚型和H9亚型 AIV 属于 LPAIV，国内之前分离到的毒株较少，NCBI 中登录的大陆的 H4 毒株不到 10 条，因此对之研究较少，缺乏认识。国际上 H4 亚型病毒分离的较早，目前韩国、俄罗斯等各国家均报道分离到该亚型。1999 年在加拿大猪体内分离到一株 H4N6 病毒，序列分析表明，其各病毒节段均为禽源，但 HA 基因的 226L 使病毒具有了感染猪的能力，表明 H4 亚型病毒在哺乳动物体内逐渐适应，但此后没有相关的跟踪报道。从 2009 年春至 2011 年春，在我国南方正常禽流感疫情监测过程中分离到多株 H4 亚型 AIV，而之前几年仅零星的分离到。关于H4亚型的禽流感的研究较少，几乎没有系统性的研究，检测方法的研究就更少了。而且H4和H9型流感仅仅靠临床诊断难以区别，最终的检测还是要靠病原学的诊断方法，包括显微观察、血清学检测以及分子生物学技术等。但是这些方法都存在这样或那样的缺点或不足，如：检测周期长、敏感性和特异性较差，以及成本较高、不适合临床样品等。因此建立一种快速的H4和H9亚型的鉴别诊断检测方法非常重要，本研究就H4和H9亚型禽流感建立了一步多重RT-PCR的鉴别检测方法。
发明内容
针对以上不足，本发明提供了一种利用多重RT-PCR技术快速鉴别H4和H9亚型禽流感病毒的方法，该方法检测准确、检测周期短、省时省力。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种H4和H9亚型禽流感病毒多重鉴别检测的方法，包括以下步骤：
（1）设计引物：参照GenBank中H4和H9禽流感病毒的HA基因序列，设计两对引物H9-HA-F、H9-HA-R和          H4-HA-F、H4-HA-R，用于扩增HA基因片段，序列为：
H9-HA-F：5'-GCCTGCTAGATCAAGTAGAGG-3'；
H9-HA-R：5'-TGGAACCCAATGCCCTCTTC-3'；
H4-HA-F：5'-AGCAAAAGCAGGGGAAACAATGC-3'；
H4-HA-R：5'- agtagaaacaagggtgttttttctc-3';
H4扩增片段长度1738bp、H9扩增片段长度404bp;
（2）提取核酸：将已知的H4和H9毒株样品等体积进行混合，并取200ul混合液加入1.5ml无RNA酶的离心管中，再加入1ml的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟；加入0.2 ml的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2-3min，然后进行12000 g离心15 min，将水相转移到另一无RNA酶的离心管中，加入与水相等体积的异丙醇，室温静置10 min，12000g离心15min，除去上层清液，向沉淀中加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，12000 g离心5min，除去上层清液，超净台内风干RNA沉淀，加入10ul DEPC水充分溶解RNA，同时设H4和H9单一病毒作为对照;
（3）RT-PCR反应的反应体系：
2x Buffer                            25μl
混合酶                          10U
H4-HA-F引物(10μM)           10～20pM
H4-HA-R引物(10μM)            10～20pM
H9-HA-F引物(10μM)          10～20pM
H9-HA-R引物(10μM)          10～20pM
RNA模板                       10ul 
RNase-free ddH2O               补至50μl；
（4）扩增条件：第一步50 min 50℃，1个循环；第二步94℃3 min，1个循环；第三步94℃1.5 min，52℃1.5 min，72℃2 min，35个循环，第四步72℃延伸7min，1个循环，4℃保存；
（5）产物鉴定：取5??L上述反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检验，以Marker作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，以5V/cm电泳1h，凝胶成像系统观察结果。
将结果与H4和H9单一病毒作对照，可以一次性鉴别出样品属于H4和H9禽流感的哪一种感染，可以对禽和产品中的传染病及时做出反应。
上述步骤（3）中所述混合酶为反转录酶和Taq DNA混合酶。
上述反转录酶和Taq DNA各5个单位。
本发明的有益效果是：将H4和H9临床样品分别进行RNA提取、多重RT-PCR，并与病毒分离检测结果进行比较。结果证实了该一步法的多重RT-PCR检测方法与病毒分离测定结果一致，证明了该检测方法的特异性和准确性，但是单一的病毒分离需要3-5天的时间，而多重PCR只需2小时。而采用的一步法的RT-PCR检测方法，将Buffer、dNTP、Enhance solution预混2X one-step buffer的形式，使实验操作的反应液配制更为简单方便，缩短操作时间，避免了操作污染，将结果与H4和H9单一病毒作对照，可以一次性鉴别出样品属于H4和H9禽流感的哪一种感染，可以对禽和产品中的传染病及时做出反应，因此本方法操作简便、成本更低，适合开发检测用RT-PCR试剂盒，用于H4和H9的临床鉴别诊断和流行病学调查。
附图说明
图1为本发明具体实施例PCR产物的鉴定图；
图中：1- H9单一扩增结果，2- H9和H4混合组1的多重扩增结果，3- Marker DL2000（2000,1000,750,500,250,100），4- H9和H4混合组2的多重扩增结果，5- H4单一扩增结果，5- H9和H4混合组3的多重扩增结果。
实施例1
（1）设计引物：参照GenBank中H4和H9禽流感病毒的HA基因序列，设计两对引物H9-HA-F、H9-HA-R和          H4-HA-F、H4-HA-R，用于扩增HA基因片段，序列为：
H9-HA-F：5'-GCCTGCTAGATCAAGTAGAGG-3'；
H9-HA-R：5'-TGGAACCCAATGCCCTCTTC-3'；
H4-HA-F：5'-AGCAAAAGCAGGGGAAACAATGC-3'；
H4-HA-R：5'- agtagaaacaagggtgttttttctc-3';
H4扩增片段长度1738bp、H9扩增片段长度404bp;
（2）提取核酸：将已知的H4和H9毒株样品等体积进行混合，取三个混合组，记为混合组1、混合组2、混合组3、分别取200ul入1.5ml无RNA酶的离心管中，再加入1ml的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟；加入0.2 ml的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2-3min，然后进行12000 g离心15 min，将水相转移到另一无RNA酶的离心管中，加入与水相等体积的异丙醇，室温静置10 min，12000g离心15min，除去上层清液，向沉淀中加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，12000 g离心5min，除去上层清液，超净台内风干RNA沉淀，加入10ul DEPC水充分溶解RNA，同时设H4和H9单一病毒作为对照;
（3）RT-PCR反应的反应体系：
2x Buffer                            25μl
混合酶  （反转录酶和Taq DNA） 各5U
H4-HA-F引物(10μM)           10～20pM
H4-HA-R引物(10μM)            10～20pM
H9-HA-F引物(10μM)          10～20pM
H9-HA-R引物(10μM)          10～20pM
RNA模板                       10ul 
RNase-free ddH2O               补至50μl；
（4）扩增条件：第一步50 min 50℃，1个循环；第二步94℃3 min，1个循环；第三步94℃1.5 min，52℃1.5 min，72℃2 min，35个循环，第四步72℃延伸7min，1个循环，4℃保存；
（5）产物鉴定：取5??L上述反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检验，分别以Marker DL（2000,1000,750,500,250,100）作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，以5V/cm电泳1h，凝胶成像系统观察结果。
将上述结果与病毒分离检测结果进行比较，结果证实了该方法的多重RT-PCR检测方法与病毒分离测定结果一致，证明了该检测方法的特异性和准确性。

Claims (3)

1.一种H4和H9亚型禽流感病毒多重鉴别检测的方法，包括以下步骤：
（1）设计引物：参照GenBank中H4和H9禽流感病毒的HA基因序列，设计两对引物H9-HA-F、H9-HA-R和          H4-HA-F、H4-HA-R，用于扩增HA基因片段，序列为：
H9-HA-F：5'-GCCTGCTAGATCAAGTAGAGG-3'；
H9-HA-R：5'-TGGAACCCAATGCCCTCTTC-3'；
H4-HA-F：5'-AGCAAAAGCAGGGGAAACAATGC-3'；
H4-HA-R：5'- agtagaaacaagggtgttttttctc-3';
H4扩增片段长度1738bp、H9扩增片段长度404bp;
（2）提取核酸：将已知的H4和H9毒株样品等体积进行混合，并取200ul混合液加入1.5ml无RNA酶的离心管中，再加入1ml的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟；加入0.2 ml的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2-3min，然后进行12000 g离心15 min，将水相转移到另一无RNA酶的离心管中，加入与水相等体积的异丙醇，室温静置10 min，12000g离心15min，除去上层清液，向沉淀中加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，12000 g离心5min，除去上层清液，超净台内风干RNA沉淀，加入10ul DEPC水充分溶解RNA，同时设H4和H9单一病毒作为对照;
（3）RT-PCR反应的反应体系：
2x Buffer                        25μl
混合酶                       10U
H4-HA-F引物(10μM)           10～20pM
H4-HA-R引物(10μM)           10～20pM
H9-HA-F引物(10μM)          10～20pM
H9-HA-R引物(10μM)          10～20pM
RNA模板                      10ul 
RNase-free ddH2O               补至50μl；
（4）扩增条件：第一步50 min 50℃，1个循环；第二步94℃3 min，1个循环；第三步94℃1.5 min，52℃1.5 min，72℃2 min，35个循环，第四步72℃延伸7min，1个循环，4℃保存；
（5）产物鉴定：取5??L上述反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检验，以Marker作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，以5V/cm电泳1h，凝胶成像系统观察结果。
2.根据权利要求1所述的一种H4和H9亚型禽流感病毒多重鉴别检测的方法，其特征在于：上述步骤（3）中所述混合酶为反转录酶和Taq DNA混合酶。
3.根据权利要求2所述的一种H4和H9亚型禽流感病毒多重鉴别检测的方法，其特征在于：所述反转录酶和Taq DNA各5个单位。
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