CN103614490A - 用于检测h4亚型禽流感病毒的rt-lamp引物组应用及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及禽流感病毒的检测，尤其涉及用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组、该引物组的应用以及检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP试剂盒。一种用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组，其特征在于，所述的RT-LAMP引物组其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示。本方案的有益效果是，本发明所提供的用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组，具有简单、快速、敏感性和特异性强的特点。

Description

用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组应用及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及禽流感病毒的检测，尤其涉及用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组、该引物组的应用以及检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP试剂盒。

背景技术

流感病毒（Influenza virus）属于正粘病毒科流感病毒属，根据NP 蛋白和M 蛋白的不同可将其分为甲、乙和丙三型。流感病毒基因组是由8 条负链RNA 节段组成，编码11 或12 个蛋白，其中两个糖蛋白血凝素蛋白HA 和神经氨酸酶蛋白NA 较为重要，二者位于病毒粒子表面。病毒RNA 与核糖核蛋白及三个RNA 依赖的RNA 聚合酶亚基PB2、PB1 和PA 相连。已知甲型流感病毒已在多种动物体内分离到，包括人、猪、马、鲸、海豹和鸟类等。根据其血清学检测，现已经鉴定出17 个HA 亚型（H1-17）和9 个NA 亚型（N1-9）。

根据毒力大小的不同，流感病毒可分为低致病性禽流感（LPAI）和高致病性禽流感（HPAI），已知的17个HA 和9 个NA 亚型均能在水禽中分离到，其中仅H5 和H7 亚型的部分毒株属于HPAI，其余均属于LPAI。所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感。禽流感病毒中，H5、H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性。2005 年，中国西部青海湖地区发生了水禽感染HPAI 的H5N1，导致野鸟大面积死亡，所以要注意到迁徙鸟中的HPAI  H5N1 流感病毒的潜在危险。随后，在东南亚不同地区都出现了基因型和抗原性不同的新型HPAI  H5N1，并在家禽中广泛流行。同时亦不能忽视家禽转运和鸟类迁徙过程在HPAI H5N1 的远距离传播中的作用，这也解释了欧洲、中东和非洲地区等地区频繁暴发禽流感的可能原因。

流感病毒的HA 蛋白对受体的特异性和亲和力是决定宿主嗜性和传播能力的关键因素之一。1918 年H1N1 流感病毒会受HA 蛋白上190 和225 位氨基酸的影响；D225G 突变体下降了α2,6 唾液酸结合的亲和力，导致与人气管中杯状细胞的结合力下降，从而使病毒在雪貂中的传播能力下降。同时H5N1 病毒在识别不同的受体结合特性是由不同的氨基酸残基引起的。同样，在受体结合位点附近的残基差异使其它禽或流行的流感病毒的受体结合特性变得更加复杂，表明在不同的HA 亚型中受体的特异性是不同的。

我国一直被认为是禽流感的高发和易发地，经常是多种亚型AIV并存的情形。LPAIV 不像HPAIV 可引起野鸟和家禽的大面积死亡，但仍然存在较多的潜在危险，如重组变异形成新的病毒等。因此LPAIV 仍然需要相当的重视。

H4 亚型AIV 属于LPAIV，国内分离到的毒株较少，因此对之研究较少。国际上目前有韩国、俄罗斯等国家均报道分离到该亚型。哺乳动物分离到的该病毒是1999 年在加拿大猪体内分离到一株H4N6 病毒，序列分析表明，其各病毒节段均为禽源，但HA 基因的226L的特征使该病毒具有了感染猪的能力，由此暗示H4亚型病毒可能在哺乳动物体内逐渐适应。

目前，H4流感病毒检测主要依赖病毒分离和分子生物学检测，但是不能进行敏感特异快速的检测方法。所以目前为止还没有确定一种最具有临床使用价值的基层分子生物学诊断方法。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组，还提供了上述的用于检测H4亚型禽流感病毒RT-LAMP的试剂盒。

用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组，该RT-LAMP引物组其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2 、SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4所示。

上述的RT- LAMP引物组在制备检测或诊断H4亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途、在制备检测或诊断鸭坦布苏病毒的生物试剂中的应用也是本发明所要保护的范围。

用于检测H4亚型禽流感病毒RT-LAMP的试剂盒，包括反应混合液、酶混液和蒸馏水，该试剂盒还包括荧光检测试剂及权利要求1所述的引物组。

H4亚型禽流感病毒RT-LAMP检测的试剂盒在制备检测或诊断H4亚型禽流感病毒的生物试剂中的应用、制备检测或诊断鸭坦布苏病毒的生物试剂中的应用也是本发明所要保护的范围。

反转录-环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)技术是一种等温核酸扩增新技术，其特点是针对靶基因的6个区域设计3对特异引物，利用一种链置换DNA 聚合酶在等温条件(63 ℃左右) 保温30～60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，由于不依赖任何专门的仪器设备可实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR，目前这一技术已经被用于多种病原微生物的检测。

LAMP技术具有一下特征：

1．引物设计

针对靶基因6个特异序列(3’端的F3c、F2c和Flc区以及5’端的Bl、B2和B3区)设计4条引物：上游内部引物(FIP)、上游外部引物(F3)、下游内部引物(BIP)、下游外部引物(B3)。后来添加了2条环状引物，上游环状引物(LF)和下游环状引物(LB)。国外已建立了LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。挑选最优组合即可。

2．扩增原理

60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，是一种动态活性温度，因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。

扩增分两个阶段。第1阶段为起始阶段，上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换DNA聚合酶作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链，FIP上的Flc与此单链上的Fl为互补结构，自我碱基配对形成环状结构，以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链，迅速以3’末端的Fl区段为起点．以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构，该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。第2阶段是扩增循环阶段．以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合，开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构，迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板．进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始，扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。

3．产物检测

(1)电泳检测：LAMP的产物可以用琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察，由于产物是混合物，故呈现出特异的梯状条带，经限制性内切酶酶切之后呈现单一靶序列条带Ⅲ。

(2)荧光检测：SYBR Green I荧光染料只与双链DNA小沟结合，当它与DNA双链结合时，肉眼观察荧光染料由橘黄色变为绿色，紫外线下可以发出荧光。在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量，荧光强度检测可以用实时定量PCR仪进行。

(3)浊度检测：是其特有也是最常用最便捷的检测方法。在核酸大量合成时．从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀，其具有极高的特异性。只要用肉眼观察或浊度仪在400 nm光下检测浊度就能够判断扩增与否，并对起始模板定量，达到实时定量的检测。

LAMP引物

引物均由上海生物工程有限公司合成，使用前用DEPC水溶解成20pmol/μL溶液，分装，-20℃保存备用。

RT-LAMP反应

病毒RNA提取：参照Trizol 法提取，按照试剂说明书进行。

取病毒样品200μL，加750μL的Trizol溶液充分振荡，室温作用10min，加200μL氯仿抽提1次，12,000rpm离心5min，上清液加等体积异丙醇于室温作用10min，12,000rpm离心5min，沉淀用75％的乙醇洗涤，12,000rpm离心5min，加适量的DEPC水溶解沉淀，-20℃保存备用。

RT反应体系（20μL）：25mmol/L Mg²⁺ 0.8～1.6μL、10 mmol/L dNTP 1～3μL、5×RT缓冲液4.0μL、引物BLP BIP和B3各10～30pM、RNA酶抑制剂（40U/μL）0.5μL、RNA模板100pg～1μg。置于PCR扩增仪上进行反应，AMV（5U/μL）1μL于42℃时加入；反应程序：70℃ 5min，42℃ 30min，95℃ 2min。

LAMP反应体系：25 uL反应体系中dNTP 混合液终浓度为1.2～1.6mmol·L-1，Triton X-100 0.1%，Bst DNA聚合酶6～10U，RT反应所得模板1～5μL，甜菜碱0.5～1M，FIP和BIP各30～50pmol，F3 和B3各2～7pmol，FLP 和BLP各10～30pmol。最佳反应条件为：63℃反应50 min，80℃加热2 min终止反应。

以上反应体系组分浓度和反应程序是在大量实验基础上优化所得的，采用上述的方法进行H4流感病毒检测，在保证灵敏度和特异性的前提下，尽量节约了成本。

检测

RT-LAMP 扩增以后，阳性分离株的扩增试管底部有清晰白色絮状沉淀。采用紫外荧光法，加入SYBR green I在紫外灯观察下可见强烈的黄绿色荧光；而对照组并无荧光显示。

采用琼脂糖凝胶电泳结果，阳性反应呈现LAMP反应特有的梯度状条带。

本方案的有益效果在于，本发明通过分析流感数据库中的流感病毒基因序列，在此基础上设计了RT-LAMP特异性引物，这些基因序列涵盖了多种家禽及野鸟的流感病毒基因，具有普通性和代表性，利用该引物建立的RT-LAMP检测试剂盒对H4型禽流感病毒进行检测，结果表明，该检测试剂盒具有良好的特异性。

本试剂盒利用4条模板专一的特异引物和具有链置换能力的DNA 聚合酶，在等温条件下（63℃左右） 30－60分钟完成扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，同时还不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。高扩增效率，扩增效率可达到10E9-10E10，比PCR灵敏一个数量级，可检测到单拷贝的DNA分子。肉眼检测扩增结果，不需要昂贵的电泳、荧光PCR等仪器。

应用RT-LAMP方法检测H4流感病毒，具有简单、快速、敏感性和特异性强的特点。该方法在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，由于不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR，而与病毒分离鉴定、酶联免疫吸附反应、中和试验等检测手段相比，更具有显而易见的优点。同时，在本发明中RNA的RT反应和LAMP反应独立进行，避免了LAMP反应过程中不必要成分的添加和参与，也达到了减少非特异性扩增的目的。

由此可见，本发明与现有技术相比，具有突出的实质性特点和显著的进步，其有益效果也是显而易见的。

附图说明

图1为RT-LAMP扩增后的电泳结果，其中M为marker DL2000，1,2为阳性结果，3,4,5分别为H5,H9,H1亚型AIV的RT-LAMP扩增结果，6-9依次为H5,H9,H1 和 H4亚型的普通PCR扩增结果。

图2为RT-LAMP扩增后的紫外观察结果，其中3,4,5,6为阳性株，余下为阴性对照株。

图3为RT-LAMP的特异性检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。

实施例1

1试验材料和方法

毒株和试剂

本实施例所用的H4亚型禽流感病毒由山东农科院家禽研究所分离鉴定提供。

RT-LAMP引物组的设计和合成

分析了流感数据库中的H4亚型禽流感病毒基因序列的同源性，设计了4个引物，如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2 、SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4所示。

RT-LAMP引物序列

引物均由上海生物工程有限公司合成，使用前用适量DEPC水溶解成20pmol/μL溶液，小量分装，-20℃保存备用。

 2、RT-LAMP反应

病毒RNA提取：参照Trizol 法提取，按照试剂说明书进行。取病毒样品200μL，加750μL的Trizol溶液充分振荡，室温作用10min，加200μL氯仿抽提1次，12,000rpm离心5min，上清液加等体积异丙醇于室温作用10min，12,000rpm离心5min，沉淀用75％的乙醇洗涤，12,000rpm离心5min，加适量的DEPC水溶解沉淀，-20℃保存备用。

RT反应体系（20μL）：25mmol/L Mg²⁺ 0.8～1.6μL、10 mmol/L dNTP 1～3μL、5×RT缓冲液4.0μL、引物BLP BIP和B3各10～30pM、RNA酶抑制剂（40U/μL）0.5μL、RNA模板100pg～1μg。置于PCR扩增仪上进行反应，AMV（5U/μL）1μL于42℃时加入；反应程序：70℃ 5min，42℃ 30min，95℃ 2min。

LAMP反应体系：25 uL反应体系中dNTP 混合液终浓度为1.2～1.6mmol·L-1，Triton X-100 0.1%，Bst DNA聚合酶6～10U，RT反应所得模板1～5μL，甜菜碱0.5～1M，FIP和BIP各30～50pmol，F3 和B3各2～7pmol，FLP 和BLP各10～30pmol。最佳反应条件为：63℃反应50 min，80℃加热2 min终止反应。

以上反应体系组分浓度和反应程序是在大量实验基础上优化所得的，使用本方法进行H4流感病毒检测，在保证灵敏度和特异性的前提下，尽量节约了成本。

3、检测

RT-LAMP 扩增以后，阳性分离株的扩增试管底部有清晰白色絮状沉淀。采用紫外荧光法，加入SYBR green I在紫外灯观察下可见强烈的黄绿色荧光；而对照组并无荧光显示。

采用琼脂糖凝胶电泳结果，阳性反应呈现LAMP反应特有的梯度状条带。

将H4亚型病毒液测定EID50ml^-1（鸡胚半数感染量），而后按照10倍进行倍比稀释，进行LAMP检测，确定LAMP的敏感性。具体实验步骤与实施例1相同。

特异性实验

运用JN毒株(H4 亚型)、WF毒株（H5 亚型）、CL毒株（H9亚型）以及XM（H1 亚型）进行特异性实验，来确定引物是不是只可以扩增H4亚型禽流感，而对H5、H9、H1等无扩增效果。以上毒株均由山东省农科院家禽研究所分离鉴定保存。具体实验步骤与实施例1相同。

实验结果

敏感性实验：将H4亚型病毒液按照10倍进行倍比稀释，进行LAMP敏感性检测。结果显示RT-LAMP 的最小检出量为 10EID50 ml^-1病毒液的RNA，而RT-PCR的最小检出量为100EID50 ml^-1。说明LAMP检测方法与PCR方法相比，具有优越性和敏感性。（图3）

特异性实验：在荧光下观察JN毒株(H4 亚型)、WF毒株（H5 亚型）、CL毒株（H9亚型）以及XM（H1 亚型）的LAMP扩增结果，发现只有H4亚型具有明亮的亮绿光，其他H5 亚型、H9亚型以及H1 亚型均无亮光（图2）。在琼脂糖凝胶电泳检测也出现相同的结果，只有H4亚型出现LAMP特有的梯形条带（图1）。

 

                          SEQUENCE LISTING

<110>  山东省农业科学院家禽研究所SPF鸡场

<120>  RT-LAMP引物组其核苷酸序列

<130>  无

<160>  1     

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  

<212>  DNA

<213>  RT-LAMP引物组其核苷酸序列

SEQ ID NO.1

<400>  1

tgtaactgac tcggagatga                                                 20

SEQ ID NO.2 

ggaatcgatt gttgattgct                                                 20

SEQ ID NO.3

acccatttcc tttgtcttca gcttttcaag ctctttgaaa gagtaagg                   48

SEQ ID NO.4

gcttcgaaat attccacaaa tgtgattttt atagacatca tgatcatagg tcc             53

Claims (6)

1.一种用于检测H4亚型禽流感病毒的RT-LAMP引物组，其特征在于，所述的RT-LAMP引物组其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2 、SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的RT- LAMP引物组在制备检测或诊断H4亚型禽流感病毒的生物试剂中的用途。

3.如权利要求1所述的RT- LAMP引物组在制备检测或诊断鸭坦布苏病毒的生物试剂中的应用。

4.一种用于检测H4亚型禽流感病毒RT-LAMP的试剂盒，包括反应混合液、酶混液和蒸馏水，其特征在于，所述的试剂盒还包括荧光检测试剂及权利要求1所述的引物组。

5.权利要求4所述的H4亚型禽流感病毒RT-LAMP检测的试剂盒在制备检测或诊断H4亚型禽流感病毒的生物试剂中的应用。

6.权利要求4所述的H4亚型禽流感病毒RT-LAMP检测的试剂盒在制备检测或诊断鸭坦布苏病毒的生物试剂中的应用。

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