CN102851392A - 动物疫病三色荧光rt-pcr检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种动物疫病三色荧光RT-PCR检测试剂盒及检测方法，特点是该试剂盒包括多重荧光RT-PCR反应母液、阳性对照品、阴性对照品、AMV逆转录酶、Taq聚合酶，其中多重荧光RT-PCR反应母液含有多重10×荧光RT-PCR反应缓冲液、禽流感引物和探针、新城疫引物和探针、禽传染性支气管炎引物和探针、牛血清白蛋白，其中其中各上、下游引物、特异性探针序列如SEQIDNO.1、NO.2、NO.3、NO.4、NO.5、NO.6、NO.7、NO.8、NO.9、NO.10所示，优点是能够同时在同一反应管中实现样本中禽流感、新城疫及禽传染性支气管炎病毒检测，并且特异性强、灵敏度高、快速准确。

Description

动物疫病三色荧光RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的荧光PCR试剂盒，尤其是涉及用于禽流感、新城疫病毒野毒及禽传染性支气管炎病毒野毒的三色荧光RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

禽流感与新城疫同属国际兽医局指定的A类烈性禽类传染病，具有传播快、发病急、死亡率高的特征，在国家动物防疫法上同被列为一类动物疫病。禽传染性支气管炎是由一种冠状病毒引起的仅发生于禽的急性、高度接触性呼吸道疾病。禽流感（记为AIV）、新城疫（记为NDV）及禽传染性支气管炎（记为AIBV）的症状相似、病理进程难以区分，而社会危害相差悬殊：目前对这三种疫病采取的控制及扑杀的规定不同，禽流感特别是高致病性禽流感如H5N1、H7等可以突破种群传播的界限，能够导致易感人群发病，具有极高的致死率；而新城疫及禽传染性支气管炎属于严格的禽类传染病，一般对人不致病。所以一旦误诊误判，后果将不堪想象。禽流感病毒属于正粘病毒科甲型流感病毒属（基因组分为节段的RNA，容易发生重排）；新城疫病毒是副粘病毒科（基因组为单股不分节的RNA）；而禽传染性支气管炎病毒是冠状病毒科冠状病毒属（基因组为单股不分节段的RNA），因此，可以借助基因诊断等分子生物学手段进行快速准确的鉴别诊断。

目前世界动物卫生组织规定对禽流感、新城疫病毒的检验检疫方法包括：病毒的分离鉴定、琼脂凝胶免疫扩散试验、血凝和血凝抑制试验等。而禽传染性支气管炎病毒也是按照上述方法进行检测。

病毒的分离与鉴定：首先将样品接种至无特定病原的禽胚，病毒会随着禽胚的发育而增殖，经一星期后抽取禽胚的尿囊液，进行血凝和血凝抑制试验，从而可以判定检测样本中是否含有病毒。该方法的优点是灵敏度高，但是周期长，约需21天，而且工作量大，需要大量的人力物力。

琼脂凝胶免疫扩散实验：最早由oudin于1946年进行对抗原混合物进行分析。基本原理是在一定孔径的凝胶中，当抗原与抗体分子相遇时，形成抗原抗体复合物，若两者比例适当，则复合物分子量增大，颗粒增大，不再继续扩散而产生沉淀线。不同的抗原所形成的沉淀有各自的位置，从而可以将抗原分开。该方法的优点是简单易行，不需要特殊仪器，但是由于抗体分子与抗原决定簇的结合并不是一一对应的，而且，由于离子强度、PH等因素，致使该方法的特异性较低。

血凝和血凝抑制试验：其基本原理是某些病毒或者病毒的血凝素，能选择性的使几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝。当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，成为血凝抑制反应。该方法的优点是快速简单，但是由于他检测的是病毒抗体，而抗体必须在感染后相当一段时间内才能产生，因此，该方法的应用范围受到限制。

随着分子生物学的飞速发展，对禽流感、新城疫及禽传染性支气管炎病毒的检测手段也有了快速的发展。例如采用逆转录聚合酶链式反应和实时荧光逆转录聚合酶链式反应。而普通的RT-PCR试验其结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作繁琐。而三色荧光PCR技术原理是基于单色荧光PCR技术，是指在同一个荧光PCR扩增试验中同时扩增四个目的基因，探针为多种荧光标记比如FAM、VIC、ROX、NED、HEX等，每种荧光标记的探针在PCR扩增过程中所产生的荧光信号不同。由于该方法引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高且容易漏检的问题。但是，目前国内外还没有关于对禽流感、新城疫及禽传染性支气管炎进行同步检测的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够同时在同一反应管中实现样本中禽流感、新城疫及禽传染性支气管炎病毒检测的特异性强、灵敏度高、快速准确的动物疫病三色荧光RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

本发明为实现上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种动物疫病三色荧光RT-PCR检测试剂盒，是在对禽流感病毒、新城疫病毒野毒及禽传染性支气管炎病毒野毒核酸序列分析的基础上，通过生物信息学方法分析选取保守基因序列设计出特异性引物，利用荧光PCR技术对禽流感、新城疫病毒野毒及禽传染性支气管炎病毒野毒进行检测。此技术不仅能够对禽流感病毒快速、准确及特异的定性检测，还能够有效区分新城疫病毒野毒与疫苗毒、禽传染性支气管炎病毒野毒与疫苗毒。

具体的说，本试剂盒包括多重荧光RT-PCR反应母液、阳性对照品、阴性对照品、AMV逆转录酶、Taq聚合酶，其中多重荧光RT-PCR反应母液含有多重10×荧光RT-PCR反应缓冲液、禽流感引物、禽流感探针、新城疫引物、新城疫探针、禽传染性支气管炎引物、禽传染性支气管炎探针、牛血清白蛋白；多重10×荧光RT-PCR反应缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷盐酸、氯化钾、甘油、四种单核苷酸单体、氯化镁，其中各引物及探针的序列如下，

依据禽流感病毒Matrix基因保守序列设计引物、探针：

禽流感病毒上游引物AIVPf:5′-GTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3′

禽流感病毒下游引物AIVPr:5′-CCCTGCAAAGACATCTTCAAGT-3′

禽流感病毒荧光探针AIVPb:5′-FAM-CCCCTCAAAGCCGAGATCGCGC-BHQ1-3′

依据新城疫病毒Fusion基因保守序列设计引物、探针：

新城疫病毒上游引物NDVPf:5′- GCCGATAATGGCACCTATAAA-3′

新城疫病毒下游引物NDVPr:5′- CCCTTGGTGATTCTATCCGC-3′

新城疫病毒荧光探针NDVPb1：5′-HEX- CGTTTTTGTCTCCTTCCTCCAGACG-BHQ1-3′

新城疫病毒荧光探针NDVPb2：5′-HEX- CGTCTCTGCCTCCTTCCTCCGGACG-BHQ1-3′

依据禽传染性支气管炎病毒Spike基因保守序列设计引物、探针：：

禽传染性支气管炎病毒上游引物AIBVPf:5′-GCCTGGAAACGAACGGTAG-3′

禽传染性支气管炎病毒下游引物AIBVPr:5′-TCCTAGTGCTGTACCCTCGG-3′

禽传染性支气管炎病毒荧光探针AIBVPb: 5′-ROX-CCCCGGCACTGGCATCTTTATACCT-BHQ1-3′。

所述的阳性对照品为连接有设计禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒的引物、探针的基因保守序列的pUCm-T克隆载体。

所述的阴性对照品为无RNA酶的DEPC水。

所述的多重10×PCR反应缓冲液组成为：三羟甲基氨基甲烷盐酸终浓度为100mM、氯化钾终浓度为500mM、甘油体积比为50%、四种单核苷酸单体（dATP、dGTP、dUTP、dGTP）终浓度为0.4mM，氯化镁终浓度为3mM及相应体积的超纯水。

所述的多重荧光RT-PCR反应母液配制如下：多重10×PCR反应缓冲液 5ul；浓度为20mg/ml的牛血清白蛋白1ul；浓度均为100μM的引物 AIVPf、AIVPr、NDVPf、NDVPr、AIBVPf和AIBVPr各0.4ul；浓度均为50μM的探针AIVPb、NDVPb和AIBVPb各0.3ul；无RNA酶DEPC水 31.5ul，配制混合后于冰箱-20℃保存。

2、一种动物疫病三色荧光RT-PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）样品处理

采集活禽咽喉拭子和泄殖腔拭子，放入盛有2ml的含抗菌素的磷酸盐缓冲液的试管，充分洗涤拭子，然后在管壁挤干液体，转入无菌离心管中备用或者采集活禽新鲜肌肉或脏器，取待检样品2g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10ml 磷酸盐缓冲液混匀，取上清转入无菌离心管中备用；

（2）病毒RNA的提取

将600ul 的TRIZOL裂解液加入混匀器中，再分别加入待测样本200ul和氯仿200ul，混匀器上振荡混匀5s；于12,000g离心15min后，加入于－20℃预冷的400ul异丙醇；吸取上清液转移至相应的管中，颠倒混匀；将上清液于12,000g离心15min后，吸去上清，取固体沉淀物加入600ul 的75%乙醇，颠倒洗涤，于12,000g离心10min；轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体，取固体沉淀物于4,000g离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，室温干燥5-10min，得到固体沉淀物为样品核酸；

（3）50ul多重荧光RT-PCR反应液配制

取10ul提取的样品核酸、10ul阳性对照品和10ul阴性对照品分别加入40ul多重荧光RT-PCR反应液至相应的PCR管中进行多重荧光RT-PCR扩增，其中多重荧光RT-PCR反应液的配制如下：多重荧光RT-PCR反应母液 39ul； AMV逆转录酶(5U/ul) 0.4ul；Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.6ul；

（4）多重荧光RT-PCR扩增检测：

在四色（或以上）荧光定量PCR仪上进行，探针检测模式设置为： FAM通道用于检测禽流感病毒、HEX通道用于检测新城疫病毒、ROX通道用于检测禽传染性支气管炎病毒；反应条件：50℃ 30分钟 1个循环；95℃ 3分钟 1个循环；95℃ 5秒，55℃ 40秒，循环40次，设置完成后，保存文件，运行程序；

（4）检测结果分析

根据阴性对照品的阳性对照品的显示结果，可得出检测样品如出现S形扩增曲线，Ct值小于37为阳性结果；有扩增曲线但不呈S形且阈值超过40或者没有出现S形扩增曲线为阴性结果；出现S形扩增曲线，但Ct值大于37，小于40为可疑结果，对可疑结果，应重复实验，如果重复实验出现S形扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种禽流感病毒、新城疫病毒野毒及禽传染性支气管炎病毒野毒三色荧光PCR检测试剂盒及检测方法，由于该试剂盒引入了针对禽流感病毒、新城疫病毒野毒及禽传染性支气管炎病毒野毒核酸序列所设计的特异性扩增引物和三色荧光探针，可以同时对禽流感病毒检测以及有效区分新城疫病毒野毒与疫苗毒及禽传染性支气管炎病毒野毒与疫苗毒，从而实现了一个标本中同时检测三种病毒的目的，既节约了生产成本和检测成本，又提高了检测效率及缩短了时间，一般来说，从处理样本到结果的判断仅需要2小时左右。

综上所述，本发明一种用于快速实时定性检测禽流感病毒、新城疫病毒野毒及禽传染性支气管炎病毒野毒的三色荧光PCR检测试剂盒及检测方法，病毒的检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率，可实现对禽流感病毒、新城疫病毒野毒及禽传染性支气管炎病毒野毒同时快速、准确及特异检测。

附图说明

图1为本发明动物疫病三色荧光RT-PCR扩增图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

禽流感病毒、新城疫病毒野毒及禽传染性支气管炎病毒野毒三色荧光RT-PCR检测试剂盒

1、RT-PCR检测试剂盒组成

本试剂盒包括多重荧光RT-PCR反应母液、阳性对照品、阴性对照品、AMV逆转录酶、Taq聚合酶。其中多重荧光RT-PCR反应母液含有多重10×荧光RT-PCR反应缓冲液、禽流感引物、禽流感探针、新城疫引物、新城疫探针、禽传染性支气管炎引物、禽传染性支气管炎探针、牛血清白蛋白；多重10×荧光RT-PCR反应缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷盐酸、氯化钾、甘油、四种单核苷酸单体、氯化镁。

其中多重10×PCR反应缓冲液组成为：三羟甲基氨基甲烷盐酸终浓度为100mM、氯化钾终浓度为500mM、甘油体积比为50%（甘油的体积为多重10×PCR反应缓冲液体积的50%）、四种单核苷酸单体（dATP、dGTP、dUTP、dGTP）终浓度为0.4mM，氯化镁终浓度为3mM及相应体积的超纯水。

其中多重荧光RT-PCR反应母液配制如下（括号内为相应的物质的浓度）：

多重10×PCR反应缓冲液                         5ul

牛血清白蛋白(20mg/ml)                             1ul

AIVPf和AIVPr（100μM）                      各0.4ul

NDVPf和NDVPr（100μM）                   各0.4ul

AIBVPf和AIBVPr（100μM）                  各0.4ul

AIVPb和NDVPb和AIBVPb（50μM）    各0.3ul

无RNA酶DEPC水                                  31.5ul

配制混合后于冰箱-20℃保存。

上述阳性对照品为连接有设计禽流感病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒的引物、探针的基因保守序列的pUCm-T克隆载体，阴性对照品为无RNA酶的DEPC水。

2、引物、探针设计与合成

从GenBank下载所有禽流感病毒、新城疫病毒及禽传染性支气管炎病毒的基因序列，经过生物信息学分析反复比对，选择如下区域作为扩增禽流感病毒、新城疫病毒及禽传染性支气管炎病毒的特异性目标区域：

依据禽流感病毒Matrix基因保守序列设计引物、探针：

禽流感病毒上游引物AIVPf:5′-GTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3′

禽流感病毒下游引物AIVPr:5′-CCCTGCAAAGACATCTTCAAGT-3′

禽流感病毒荧光探针AIVPb:5′-FAM-CCCCTCAAAGCCGAGATCGCGC-BHQ1-3′

依据新城疫病毒Fusion基因保守序列设计引物、探针：

新城疫病毒上游引物NDVPf:5′- GCCGATAATGGCACCTATAAA-3′

新城疫病毒下游引物NDVPr:5′- CCCTTGGTGATTCTATCCGC-3′

新城疫病毒荧光探针NDVPb1：5′-HEX- CGTTTTTGTCTCCTTCCTCCAGACG-BHQ1-3′

新城疫病毒荧光探针NDVPb2：5′-HEX- CGTCTCTGCCTCCTTCCTCCGGACG-BHQ1-3′

依据禽传染性支气管炎病毒Spike基因保守序列设计引物、探针：：

禽传染性支气管炎病毒上游引物AIBVPf:5′-GCCTGGAAACGAACGGTAG-3′

禽传染性支气管炎病毒下游引物AIBVPr:5′-TCCTAGTGCTGTACCCTCGG-3′

禽传染性支气管炎病毒荧光探针AIBVPb: 5′-ROX-CCCCGGCACTGGCATCTTTATACCT-BHQ1-3′。

 具体实施例二

禽流感病毒、新城疫病毒野毒及禽传染性支气管炎病毒野毒三色荧光RT-PCR检测方法，每次检测均应设立阳性对照组及阴性对照组

1、样品处理

若样品为活禽，建议取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮几次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子时将拭子伸入泻殖腔转一圈沾取粪便。然后将拭子一起放入盛有2ml 磷酸盐 （PBS）缓冲液（含抗菌素）的试管，充分洗涤拭子，然后在管壁挤干液体，转入无菌离心管中备用；若样品为新鲜肌肉或脏器，取待检样品2g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10ml PBS混匀，取上清转入无菌离心管中备用。为使样品的代表性更强，也可取50克肉样，加入50ml无菌的PBS液，用Bagmixer均质器处理后，取上清备用；

2、病毒RNA的提取

将600ul 的TRIZOL裂解液（产地Invitrogen，货号15596018)加入混匀器中，再分别加入待测样本200ul和氯仿200ul，混匀器上振荡混匀5s；于12,000g离心15min后，加入于－20℃预冷的400ul异丙醇；吸取上清液转移至相应的管中，颠倒混匀；将上清液于12,000g离心15min后，吸去上清，取固体沉淀物加入600ul 的75%乙醇，颠倒洗涤，于12,000g离心10min；轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体，取固体沉淀物于4,000g离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，室温干燥5-10min，得到固体沉淀物为样品核酸；

 3、50ul多重荧光RT-PCR反应液配制

取10ul提取的样品核酸、10ul阳性对照品和10ul阴性对照品分别加入40ul多重荧光RT-PCR反应液至相应的PCR管中进行多重荧光RT-PCR扩增（阳性对照品、阴性对照品相应的作为阳性对照组和阴性对照组），其中多重荧光RT-PCR反应液的配制如下：多重荧光RT-PCR反应母液 39ul； AMV逆转录酶(5U/ul) 0.4ul；Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.6ul；

4、多重荧光RT-PCR扩增检测

在四色（或以上）荧光定量PCR仪上进行，探针检测模式设置为：FAM通道用于检测禽流感病毒、HEX通道用于检测新城疫病毒、ROX通道用于检测禽传染性支气管炎病毒；反应条件：50℃ 30分钟 1个循环；95℃ 3分钟 1个循环；95℃ 5秒，55℃ 40秒，循环40次，设置完成后，保存文件，运行程序；

5、检测结果分析

根据阴性对照品的阳性对照品的显示结果，由此判断检测样品

阳性：出现S形扩增曲线，Ct值小于37；

可疑：出现S形扩增曲线，但Ct值大于37，小于40；

阴性：没有出现S形扩增曲线；或者曲线虽然超过阈值40，但不呈S形；

对可疑结果，应重复实验，如果重复实验出现S形扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。

具体何种病毒感染鉴定按照下表进行：表1 检测结果判断

。

 具体实施例三

三色荧光RT-PCR检测试剂盒灵敏度及特异性实验

1、实验材料：

选取病原微生物包括如下：实验组：禽流感病毒、新城疫病毒中强毒、禽传染性支气管炎病毒；对照组：人甲型流感病毒、人乙型流感病毒、新城疫疫苗株及禽传染性支气管炎疫苗株，上述病原毒株均来自美国农业部农业研究所东南家禽研究实验室，疫苗株均购自宁波动物疾病预防与控制中心

2、检测试剂盒灵敏度、特异性分析：

采用具体实施例一中禽流感病毒、新城疫病毒野毒及禽传染性支气管炎病毒野毒三色荧光RT-PCR检测试剂盒对上述毒株进行检测，目标毒株组的禽流感病毒、新城疫病毒中强毒及禽传染性支气管炎病毒野毒等检测均为阳性，而非目标毒株组的人甲型流感病毒、人乙型流感病毒、新城疫疫苗株及禽传染性支气管炎疫苗株等检测结果均为阴性，特异性为100%（图1）；用构建的阳性对照倍比稀释后检测敏感性达到10拷贝。

该图1主要是试剂盒特异性检测实验结果图示，检测包括禽流感病毒、新城疫病毒中强毒及禽传染性支气管炎病毒野毒等在内的目标毒株组均为阳性，检测包括人甲型流感病毒、人乙型流感病毒、新城疫疫苗株及禽传染性支气管炎疫苗株等在内的非目标毒株组均为阴性。

 具体实施例四

采用上述具体实施例二方法对采集自养殖场具有类似症状的鸡组织样本7份进行检测，结果说明该7份样本均为禽传染性支气管炎野毒感染，且Ct值在23.6-29.5之间。

 具体实施例五

采用上述具体实施例二方法对另外4份采集自养殖场具有类似症状的鸡咽喉拭子样本进行检测，检测结果均为为新城疫病毒中强毒感染，且Ct值在18-29.6之间。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种动物疫病三色荧光RT-PCR检测试剂盒，包括多重荧光RT-PCR反应母液、阳性对照品、阴性对照品、AMV逆转录酶、Taq聚合酶，其特征在于：多重荧光RT-PCR反应母液含有多重10×荧光RT-PCR反应缓冲液、禽流感引物、禽流感探针、新城疫引物、新城疫探针、禽传染性支气管炎引物、禽传染性支气管炎探针、牛血清白蛋白，其中各引物及探针的序列如下：

禽流感病毒上游引物AIVPf:5′-GTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3′

禽流感病毒下游引物AIVPr:5′-CCCTGCAAAGACATCTTCAAGT-3′

禽流感病毒荧光探针AIVPb:5′-FAM-CCCCTCAAAGCCGAGATCGCGC-BHQ1-3′

新城疫病毒上游引物NDVPf:5′- GCCGATAATGGCACCTATAAA-3′

新城疫病毒下游引物NDVPr:5′- CCCTTGGTGATTCTATCCGC-3′

新城疫病毒荧光探针NDVPb1：5′-HEX- CGTTTTTGTCTCCTTCCTCCAGACG-BHQ1-3′

新城疫病毒荧光探针NDVPb2：5′-HEX- CGTCTCTGCCTCCTTCCTCCGGACG-BHQ1-3′

禽传染性支气管炎病毒上游引物AIBVPf:5′-GCCTGGAAACGAACGGTAG-3′

禽传染性支气管炎病毒下游引物AIBVPr:5′-TCCTAGTGCTGTACCCTCGG-3′

禽传染性支气管炎病毒荧光探针AIBVPb: 5′-ROX-CCCCGGCACTGGCATCTTTATACCT-BHQ1-3′。

2.根据权利要求1所述的动物疫病三色荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的多重10×PCR反应缓冲液组成如下：三羟甲基氨基甲烷盐酸终浓度为100mM、氯化钾终浓度为500mM、甘油体积比为50%、四种单核苷酸单体终浓度为0.4mM，氯化镁终浓度为3mM及相应体积的超纯水。

3.根据权利要求2所述的动物疫病三色荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的多重荧光RT-PCR反应母液配制如下：多重10×PCR反应缓冲液 5ul；浓度为20mg/ml的牛血清白蛋白1ul；浓度均为100μM的引物 AIVPf、AIVPr、NDVPf、NDVPr、AIBVPf和AIBVPr各0.4ul；浓度均为50μM的探针AIVPb、NDVPb和AIBVPb各0.3ul；无RNA酶DEPC水 31.5ul，配制混合后于冰箱-20℃保存。

4.一种根据权利要求1所述的动物疫病三色荧光RT-PCR的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）样品处理

采集活禽咽喉拭子和泄殖腔拭子，放入盛有2ml的含抗菌素的磷酸盐缓冲液的试管，充分洗涤拭子，然后在管壁挤干液体，转入无菌离心管中备用或者采集活禽新鲜肌肉或脏器，取待检样品2g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10ml 磷酸盐缓冲液混匀，取上清转入无菌离心管中备用；

（2）病毒RNA的提取

将600ul 的TRIZOL裂解液（Invitrogen,15596018)加入混匀器中，再分别加入待测样本200ul和氯仿200ul，混匀器上振荡混匀5s；于12,000g离心15min后，加入于－20℃预冷的400ul异丙醇；吸取上清液转移至相应的管中，颠倒混匀；将上清液于12,000g离心15min后，吸去上清，取固体沉淀物加入600ul 的75%乙醇，颠倒洗涤，于12,000g离心10min；轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体，取固体沉淀物于4,000g离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，室温干燥5-10min，得到固体沉淀物为样品核酸；

（3）多重荧光RT-PCR反应液配制

取10ul提取的样品核酸、10ul阳性对照品和10ul阴性对照品分别加入40ul多重荧光RT-PCR反应液至相应的PCR管中进行多重荧光RT-PCR扩增，其中多重荧光RT-PCR反应液的配制如下：多重荧光RT-PCR反应母液 39ul；浓度为5U/ul 的AMV逆转录酶0.4ul；浓度为5U/ul 的Taq DNA聚合酶0.6ul；

（4）多重荧光RT-PCR扩增检测

在四色荧光定量PCR仪上进行，探针检测模式设置为： FAM通道用于检测禽流感病毒、HEX通道用于检测新城疫病毒、ROX通道用于检测禽传染性支气管炎病毒；反应条件：50℃ 30分钟 1个循环；95℃ 3分钟 1个循环；95℃ 5秒，55℃ 40秒，循环40次，设置完成后，保存文件，运行程序；

（4）检测结果分析

根据阴性对照品的阳性对照品的显示结果，可得出检测样品如出现S形扩增曲线，Ct值小于37为阳性结果；有扩增曲线但不呈S形且阈值超过40或者没有出现S形扩增曲线为阴性结果；出现S形扩增曲线，但Ct值大于37，小于40为可疑结果，对可疑结果，应重复实验，如果重复实验出现S形扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。

5.根据权利要求4所述的动物疫病三色荧光RT-PCR的检测方法，其特征在于：所述的多重10×PCR反应缓冲液组成如下：三羟甲基氨基甲烷盐酸终浓度为100mM、氯化钾终浓度为500mM、甘油体积比为50%、四种单核苷酸单体终浓度为0.4mM，氯化镁终浓度为3mM及相应体积的超纯水。

6.根据权利要求4所述的动物疫病三色荧光RT-PCR的检测方法，其特征在于：所述的多重荧光RT-PCR反应母液配制如下：多重10×PCR反应缓冲液 5ul；浓度为20mg/ml的牛血清白蛋白1ul；浓度均为100μM的引物 AIVPf、AIVPr、NDVPf、NDVPr、AIBVPf和AIBVPr各0.4ul；浓度均为50μM的探针AIVPb、NDVPb和AIBVPb各0.3ul；无RNA酶DEPC水 31.5ul，配制混合后于冰箱-20℃保存。

7.根据权利要求4所述的动物疫病三色荧光RT-PCR的检测方法的检测方法，其特征在于：禽流感病毒上游引物AIVPf如SEQ ID NO.1，其下游引物AIVPr如SEQ ID NO.2所示，禽流感病毒荧光探针AIVPb如SEQ ID NO.3所示；新城疫病毒上游引物NDVPf如SEQ ID NO.4，其下游引物NDVPr如SEQ ID NO.5所示，新城疫病毒荧光探针NDVPb1如SEQ ID NO.6所示，新城疫病毒荧光探针NDVPb2如SEQ ID NO.7所示；禽传染性支气管炎病毒上游引物AIBVPf如SEQ ID NO.8所示，其下游引物AIBVPr如SEQ ID NO.9所示，禽传染性支气管炎病毒荧光探针AIBVPb如SEQ ID NO.10所示。

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