CN106367537A - 一种检测鹅新城疫病毒的rt‑lamp可视化试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测鹅新城疫病毒的RT‑LAMP可视化试剂盒及其应用。该可视化试剂盒包含引物组和显色物质；引物为如SEQ ID N0:1～4所示的序列,显色物质为钙黄绿素和氯化锰。该试剂盒的使用方法如下：首先配制RT‑LAMP反应体系,包含AMV逆转录酶、10倍反应缓冲液、链置換DNA聚合酶、dNTP混合物、甜菜碱、钙黄绿素、氯化锰、MgS04、FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物以及待测样品RNA；接着将反应体系于61～65℃恒温反应50min,最后于80℃灭活4min；通过自然光照下或紫外光下判读结果或是二者结合判读：在自然光下反应产物为绿色,说明待测样品含有鹅新城疫病毒；在紫外光下反应产物呈现明显的绿色荧光,说明待测样品含有鹅新城疫病毒。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测鹅新城疫病毒的RT-LAMP可视化试剂盒及其应用。
背景技术
新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一种以呼吸道和消化道病变为主要特征的急性、烈性传染病，具有极高的发病率和死亡率，被OIE列为一类传染病。到目前为止，世界范围内已发生过四次ND大流行，给养禽业造成了巨大损失。作为NDV自然储存库的水禽，一度被认为对该病毒有很强的抵抗力，即使强毒株感染也不表现任何临床症状。1997年，在江苏和广东等地分离到对鹅具有高度致病性的毒株以来，不断在全国各地的鹅群中爆发流行，引起大量死亡。目前，鹅新城疫(GND)造成巨大的经济损失，严重危害养鹅业的健康发展。GND病原为禽Ⅰ型副粘病毒(APMV-Ⅰ)基因Ⅶ型毒株，与NDV同源性80％，差异较大，传统的NDV疫苗及诊断方法并不能很好的防治、诊断该疾病。
养鹅业的模式相对于其他禽类较为粗放、落后。近年来，蛋子瘟、鹅新城疫、小鹅瘟、禽流感等鹅病的发病率居高不下。如何有效的防控疾病的发生成为当前养鹅业的重要挑战，建立快速、高效的检测方法是临床的迫切需求。鹅场多在偏远的农村，条件简陋，交通不便捷。这要求建立的检测方法具有较高的稳定性和便携性，RT-LAMP可视化试剂盒，具有检测速度快、敏感性高、检测成本低、操作简便，便携且结果容易判读等优点，适合基层人员使用，具有较高的应用价值和转化前景。
目前，用于检测鹅新城疫病毒的方法包括病原的分离鉴定、血清学方法和RT-PCR。病原的分离鉴定是最传统的检测方法，其结果准确可靠，但其影响因素多，实际操作起来相当费时费力，因此在临床应用中有一定的局限性；血凝抑制实验、补体结合实验、中和实验和酶联免疫吸附试验等血清学试验的敏感性及特异性较低，操作也比较麻烦；而RT-PCR技术需要特殊的仪器设备(如PCR仪和凝胶成像系统等)和专业人员进行相关的操作，显然无法满足基层和现场检测的需要。
环介导等温核酸扩增技术(LAMP)是由日本学者Notomi于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，通过一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件下进行靶序列高效快速扩增。近年来，国内外已将该技术广泛应用于病原体检测。Hong TC等人(Development andevaluation of a novel loop-mediated isothermal amplification method for rapiddetection of severe acute respiratory syndrome coronavirus.Clin Microbiol,2004May；42(5):1956-61)于2004年根据LAMP原理设计了实时定量RT-LAMP方法，以快速检测SARS-Cov，结果RT-LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人(Rapid diagnosisof H5N1 avian influenza virus infection by newly developed influenza H5hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplificationmethod.Virol Methods.2007May；141(2):173-80.)于2007年建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的RT-LAMP检测体系。
由于RT-LAMP的扩增产物是白色焦磷酸镁沉淀，用肉眼难以观察，日本已研制出专门对RT-LAMP产物进行实时监控的浊度仪。但是浊度仪的使用不但增加了费用，而且不方便携带；有学者利用往反应后的体系中加入SYBR Green I染料的方法来检测扩增产物，但是这样观察又必须开盖处理，RT-LAMP扩增的高效性及高敏感性使得产物中含有大量目的片段，开盖添加染料极其容易污染环境。
发明内容
本发明首要目的是提供一具有高灵敏度、高特异性、高效、可视化、操作方法简单的适用于检测鹅新城疫病毒的RT-LAMP可视化试剂盒。
本发明的另一目的在于，提供实现上述检测鹅新城疫病毒的RT-LAMP可视化试剂盒的使用方法。
本发明的目的是通过下述技术方案来实现的。
一种检测鹅新城疫病毒的RT-LAMP可视化试剂盒，包含引物组和显色物质；
所述引物组如下所示：
F3:5’-GATGACAACATGTAGATGTGTA-3’
B3:5’-CCCAAGCTCAGTTGAGAT-3’
FIP:5’-CCGCCTAAGGATAAAACATTGCATGGGTATCATATCGCAAAACTATGG-3’
BIP:5’-ATAACTTTAAGGCTCAGTGGGGAATTGCCTGTTATTATTACTTGAGAA-3’
所述显色物质为钙黄绿素(Calcein)和氯化锰(MnCl2)。
所述试剂盒还优选包含dNTP混合物、MgSO4、10倍反应缓冲液(10×IsothermalAmplification bufferⅡ)、链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)、甜菜碱(Betaine)和AMV逆转录酶；
所述试剂盒更优选为包含5U/μL的AMV逆转录酶、10倍反应缓冲液(10×Isothermal Amplification bufferⅡ)、6U/μL的链置换DNA聚合酶、10mmol/L的dNTP、10mol/L的甜菜碱(Betaine)、250μmol/L的Calcein、25mmol/L的MnCl2、100mmol/L的MgSO4、10μmol/L的引物FIP+BIP、10μmol/L的引物F3+B3；
所述的检测鹅新城疫病毒的RT-LAMP可视化试剂盒的应用，包含以下步骤：
1)配制RT-LAMP反应体系，按终浓度计算，AMV逆转录酶为105U/L、10倍反应缓冲液(10×Isothermal Amplification bufferⅡ)为1×/L、链置换DNA聚合酶0.08～0.48U/μL、dNTP混合物为0.4～1.6mmol/L、甜菜碱(Betaine)为0.2～1.4mol/L、Calcein为50μmol/L、MnCl2为0.8mmol/L、MgSO4为1.0～8.0mmol/L、FIP+BIP引物为1.2μmol/L、F3+B3引物为0.2μmol/L；待测样品RNA为3～5mg/L；
2)反应：将步骤(1)配置好的反应体系反应，条件为55～67℃恒温反应，最后灭活；
3)结果判读：通过自然光照下或紫外光下判读结果或是二者结合判读：
3-1)在自然光下反应产物为绿色，说明待测样品含有鹅新城疫病毒；在自然光下反应产物为橙色，说明待测样品不含有鹅新城疫病毒；
3-2)在紫外光下反应产物呈现明显的绿色荧光，说明待测样品含有鹅新城疫病毒，无荧光或绿色荧光不明显，说明待测样品不含有鹅新城疫病毒。
步骤1)中，所述MgSO4的终浓度优选为4mmol/L；
步骤1)中，所述dNTP的终浓度优选为1.4mmol/L。
步骤1)中，所述链置换DNA聚合酶的终浓度优选为0.24U/μL；
步骤1)中，所述甜菜碱的终浓度优选为1.2mol/L。
步骤2)中，所述恒温反应的时间优选为10～80min；
步骤2)中，所述恒温反应的条件优选为在65℃下反应50min。
步骤2)中，所述灭活的条件优选为75～86℃下处理2～10min；更优选为80℃下处理4min。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
1)RT-LAMP成本低廉，利用Bst DNA polymerase在65℃实现等温扩增，不需要复杂且昂贵的PCR仪，因此，本发明提供的试剂盒使用成本低。
2)本发明所提供的试剂盒反应迅速，利用AMV反转录酶实现一步法RT-LAMP，无需增加42℃、1h的反转录过程，可以在90min内完成反应，最快可以在40min内完成。
3)本发明提供的试剂盒得到的反应结果易于观察，在反应前加入钙黄绿素和氯化锰，阳性反应管在自然光下就会呈现出绿色，置于紫外光下则呈现强烈的绿色荧光。
4)本发明提供的试剂盒特异性好，对H9禽流感、小鹅瘟、黄病毒(坦布苏病毒)等都呈阴性反应；灵敏度高，最低可以检测到10pg的RNA模版，即使是几个病毒粒子，也能被快速准确地检测出来。
5)本发明所述的可视化RT-LAMP试剂盒可快速、灵敏地检测鹅新城疫病毒，其操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及水禽养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。
附图说明
以下为RT-LAMP反应体系优化结果图：
图1A为不同MgSO4浓度的RT-LAMP反应结果图。
图1B为不同MgSO4浓度与电泳亮度关系图。
图2A为不同dNTP浓度的RT-LAMP反应结果图。
图2B为不同dNTP浓度与电泳亮度关系图。
图3A为不同Bst 3.0DNA polymerase浓度的RT-LAMP反应结果图。
图3B为不同Bst 3.0DNA polymerase浓度与电泳亮度关系图。
图4A为不同Betaine浓度的RT-LAMP反应结果图。
图4B为不同Betaine浓度与电泳亮度关系图。
图5A为不同内外引物浓度比例的RT-LAMP反应结果图。
图5B为不同内外引物浓度比例与电泳亮度关系图。
以下为RT-LAMP反应条件优化结果图：
图6A为不同反应温度的RT-LAMP反应结果图。
图6B为不同反应温度与电泳亮度关系图。
图7A为不同反应时间的RT-LAMP反应结果图。
图7B为不同反应时间与电泳亮度关系图。
图8为不同基因组为模版下RT-LAMP反应的电泳亮度关系图。
图9为以鹅新城疫病毒基因组为模版的RT-LAMP和RT-PCR灵敏度检测结果图，其中：
图A为利用RT-PCR方法得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳得到的图；
图B为利用RT-LAMP方法得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳得到的图。
图10为RT-LAMP可视化结果图，其中：
图A为在紫外灯下观察反应体系，图B为在自然光下观察反应体系；
图A与图B中，“+”表示反应呈现阳性结果，“－”表示反应呈现阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中所用的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。Bst DNA聚合酶购自New England公司；甜菜碱(Betaine)、钙黄绿素(Calcein)、MnCl2和MgS04购自Sigma公司。
实施例1
一、基因的选择和引物设计
F基因是鹅新城疫病毒的关键基因，与其侵染宿主能力有关。根据GenBank中已经公布的各基因型NDV，使用软件进行比较并选择差异保守区域作为RT-LAMP引物的设计模板，使设计的引物能同时检测各类型NDV病毒。根据RT-LAMP引物设计原则，针对NDV基因的保守区域序列，用primer5.0设计一套引物(如表1所示)，包括1对外部引物(F3和B3)和1对内部引物(FIP和BIP)。FIP由F1c(F1的互补序列)和F2序列组成；BIP由B1c(B1的互补序列)和B2序列组成；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,合成后的引物用灭菌三蒸水稀释成10μmol/L溶液，-20℃保存。
下划线标示的为引物在基因中的位置，框中的是酶切位点。
表1APMV-Ⅰ可视化RT-LAMP的引物
二、RT-LAMP反应
1、病毒RNA的抽提：
RNA抽提严格按照Trizol(液体试剂)说明书进行。所用离心管等耗材均经0.1％DEPC处理，确保无RNA酶污染。
1)吸取250μL病毒液于1.5mL离心管中，加入750μL经30min冰预冷的Trizol，剧烈混匀后，室温静置5min。
2)加入200μL氯仿，剧烈混匀15s，室温静置5min。
3)在4℃条件下，12000r/min离心15min，将上层水相小心转移到一个新的离心管中(注意不要吸出中间层)，加入500μL的预冷的异丙醇并上下颠倒混匀，然后于4℃静置15min。
4)在4℃条件下，12000r/min离心15min后，小心除去上清液后倒置于一次性吸水纸上吸干液体。
5)用1mL75％乙醇洗涤RNA沉淀和管壁，4℃12000r/min离心8min，小心弃去乙醇后倒置于一次性吸水纸上吸干液体。
6)将RNA沉淀室温干燥5min后，用10μL RNase-free water溶解并于-80℃冰箱中保存备用。
2、RT-LAMP检测体系的建立：
参照Notomi等(Notomi,T.,Okayama,H.,Masubuchi,H.,et a1.Loop-mediatedisotherma1 amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28:E63)提供的方法构建25μL RT-LAMP反应体系,依次对MgS04浓度、dNTP浓度、Bst 3.0DNA polymerase浓度、Betaine浓度、内外引物浓度比例进行优化,得到的结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。
通过设置不同终浓度的MgS04：1.0mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM、5.0mM、6.0mM、7.0mM、8.0mM，其他成分的用量如表2所示。结果如图1A所示，图1A为不同MgSO4浓度的RT-LAMP反应结果图，离心管标记1.0为MgSO4浓度1.0mM的反应产物，离心管标记2.0为MgSO4浓度2.0mM的反应产物，离心管标记3.0为MgSO4浓度3.0mM的反应产物，离心管标记4.0为MgSO4浓度4.0mM的反应产物，离心管标记5.0为MgSO4浓度5.0mM的反应产物，离心管标记6.0为MgSO4浓度6.0mM的反应产物，离心管标记7.0为MgSO4浓度7.0mM的反应产物，离心管标记8.0为MgSO4浓度8.0mM的反应产物。
结果如图1B所示，图1B为不同MgSO4浓度与电泳亮度关系图，泳道M为DNA MarkerDL2000，泳道标记1.0为MgSO4浓度1.0mM的反应产物，泳道标记2.0为MgSO4浓度2.0mM的反应产物，泳道标记3.0为MgSO4浓度3.0mM的反应产物，泳道标记4.0为MgSO4浓度4.0mM的反应产物，泳道标记5.0为MgSO4浓度5.0mM的反应产物，泳道标记6.0为MgSO4浓度6.0mM的反应产物，泳道标记7.0为MgSO4浓度7.0mM的反应产物，泳道标记8.0为MgSO4浓度8.0mM的反应产物。
不同终浓度的dNTP：0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM，其他成分的用量如表2所示。结果如图2所示，图2A为不同dNTP浓度的RT-LAMP反应结果图，离心管标记0.4为dNTP浓度0.4mM的反应产物，离心管标记0.6为dNTP浓度0.6mM的反应产物，离心管标记0.8为dNTP浓度0.8mM的反应产物，离心管标记1.0为dNTP浓度1.0mM的反应产物，离心管标记1.2为dNTP浓度1.2mM的反应产物，离心管标记1.4为dNTP浓度1.4mM的反应产物，离心管标记1.6为dNTP浓度1.6mM的反应产物；
图2B为不同dNTP浓度与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道标记0.4为dNTP浓度0.4mM的反应产物，泳道标记0.6为dNTP浓度0.6mM的反应产物，泳道标记0.8为dNTP浓度0.8mM的反应产物，泳道标记1.0为dNTP浓度1.0mM的反应产物，泳道标记1.2为dNTP浓度1.2mM的反应产物，泳道标记1.4为dNTP浓度1.4mM的反应产物，泳道标记1.6为dNTP浓度1.6mM的反应产物。
不同终浓度的Bst 3.0DNA polymerase：0U/μL、0.08U/μL、0.16U/μL、0.24U/μL、0.32U/μL、0.4U/μL、0.48U/μL,其他成分的用量如表2所示。结果如图3所示，图3A为不同Bst3.0DNA polymerase浓度的RT-LAMP反应结果图,离心管标记0为Bst 3.0DNA polymerase浓度0U/μL的反应产物，离心管标记0.08为Bst 3.0DNA polymerase浓度0.08U/μL的反应产物，离心管标记0.16为Bst 3.0DNA polymerase浓度0.16U/μL的反应产物，离心管标记0.24为Bst 3.0DNA polymerase浓度0.24U/μL的反应产物，离心管标记0.32为Bst 3.0DNApolymerase浓度0.32U/μL的反应产物，离心管标记0.4为Bst 3.0DNA polymerase浓度0.4U/μL的反应产物，离心管标记0.48为Bst 3.0DNA polymerase浓度0.48U/μL的反应产物；
图3B为不同Bst 3.0DNA polymerase浓度与电泳亮度关系图，泳道M为DNA MarkerDL2000，泳道标记0为Bst 3.0DNA polymerase浓度0U/μL的反应产物，泳道标记0.08为Bst3.0DNA polymerase浓度0.08U/μL的反应产物，泳道标记0.16为Bst 3.0DNA polymerase浓度0.16U/μL的反应产物，泳道标记0.24为Bst 3.0DNA polymerase浓度0.24U/μL的反应产物，泳道标记0.32为Bst 3.0DNA polymerase浓度0.32U/μL的反应产物，泳道标记0.4为Bst3.0DNA polymerase浓度0.4U/μL的反应产物，泳道标记0.48为Bst 3.0DNA polymerase浓度0.48U/μL的反应产物。
不同终浓度的Betaine:0M、0.2M、0.4M、0.6M、0.8M、1.0M、1.2M、1.4M，其他成分的用量如表2所示。结果如图4所示，图4A为不同Betaine浓度的RT-LAMP反应结果图,离心管标记0M+为Betaine浓度0M的反应产物，离心管标记0.2M+含Betaine浓度为0.2M的反应产物，离心管标记0.4M+为Betaine浓度0.4M的反应产物，离心管标记0.6M+为Betaine浓度0.6M的反应产物，离心管标记0.8M+为Betaine浓度0.8M的反应产物，离心管标记1.0M+为Betaine浓度1.0M的反应产物，离心管标记1.2M+为Betaine浓度1.2M的反应产物，离心管标记1.4M+为Betaine浓度1.4M的反应产物，离心管标记0M-、0.2M-、0.4M-、0.6M-、0.8M-、1.0M-、1.2M-、1.4M-分别为离心管标记0M+、0.2M+、0.4M+、0.6M+、0.8M+、1.0M+、1.2M+、1.4M+的阴性对照组；
图4B为不同Betaine浓度与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道标记0M+为Betaine浓度0M的反应产物，泳道标记0.2M+为Betaine浓度0.2M的反应产物，泳道标记0.4M+为Betaine浓度0.4M的反应产物，泳道标记0.6M+为Betaine浓度0.6M的反应产物，泳道标记0.8M+为Betaine浓度0.8M的反应产物，泳道标记1.0M+为Betaine浓度1.0M的反应产物，泳道标记1.2M+为Betaine浓度1.2M的反应产物，泳道标记1.4M+为Betaine浓度1.4M的反应产物，泳道标记0M-、0.2M-、0.4M-、0.6M-、0.8M-、1.0M-、1.2M-、1.4M-分别为泳道标记0M+、0.2M+、0.4M+、0.6M+、0.8M+、1.0M+、1.2M+、1.4M+的阴性对照组。
不同内外引物浓度比例：1：1、2：1、3：1、4：1、6：1、8：1、10：1、12：1(内引物为BIP+FIP,外引物为B3+F3),此时具体的内外引物浓度比为:0.4μM:0.4μM,0.8μM:0.4μM,1.2μM:0.4μM,0.8μM:0.2μM,1.2μM:0.2μM,1.6μM:0.2μM,2.0μM:0.2μM,2.4μM:0.2μM,其他成分的用量如表2所示。结果如图5所示，图5A为不同内外引物浓度比例的RT-LAMP反应结果图，离心管1为内外引物浓度比为1：1的反应产物，离心管2为内外引物浓度比为2：1的反应产物，离心管3为内外引物浓度比为3：1的反应产物，离心管4为内外引物浓度比为4：1的反应产物，离心管5为内外浓度体积比为6：1的反应产物，离心管6为内外引物浓度比为8：1的反应产物，离心管7为内外引物浓度比为10：1的反应产物，离心管8为内外引物浓度比为12：1的反应产物；
图5B为不同内外引物浓度比例与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1为内外引物浓度比为1：1反应的产物，泳道2为内外引物浓度比为2：1反应的产物，泳道3为内外引物浓度比为3：1反应的产物，泳道4为内外引物浓度比为4：1反应的产物，泳道5为内外引物浓度比为6：1反应的产物，泳道6为内外引物浓度比为8：1反应的产物，泳道7为内外引物浓度比为10：1反应的产物，泳道8为内外引物浓度比为12：1反应的产物。
检测条件为65℃恒温50min,最后80℃灭活4min,终止反应。根据所得的实验结果,最终确定优化的检测体系(25μL)，如表2所示。
表2优化的检测体系
3、RT-LAMP检测条件的优化
为了得到最优化的反应温度,将RT-LAMP反应分别置于55℃、57℃、60℃、62℃、65℃及67℃,反应时间是50min,反应体系如表2所示,从多次重复试验中确定最佳反应温度。每次扩増反应同时设DEPC处理的水为阴性对照，结果如图6所示，图6的结果说明最佳反应温度为65℃。
图6A为不同反应温度的RT-LAMP反应结果图，离心管标记55+为反应温度55℃的反应产物，离心管标记57+为反应温度57℃的反应产物，离心管标记60+为反应温度60℃的反应产物，离心管标记62+为反应温度62℃的反应产物，离心管标记65+为反应温度65℃的反应产物，离心管标记67+为反应温度67℃的反应产物，离心管标记55-、57-、60-、62-、65-、67-分别为离心管55+、57+、60+、62+、65+、67+的阴性对照组；
图6B为不同反应温度与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道标记55+为反应温度55℃的产物，泳道标记57+为反应温度57℃的产物，泳道标记60+为反应温度60℃的产物，泳道标记62+为反应温度62℃的产物，泳道标记65+为反应温度65℃的产物，泳道标记67+为反应温度67℃的产物，泳道标记55-、57-、60-、62-、65-、67-分别为泳道标记55+、57+、60+、62+、65+、67+的阴性对照组。
以最佳反应温度(65℃),将反应时间按10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min及80min递増,反应体系如表2所示,从多次重复试验中确定最佳反应时间。每次扩増反应同时设DEPC处理的水为阴性对照，结果如图7所示。图7A为不同反应时间的RT-LAMP反应结果图，离心管标记10+为反应时间10min的反应产物，离心管标记20+为反应时间20min的反应产物，离心管标记30+为反应时间30min的反应产物，离心管标记40+为反应时间40min的反应产物，离心管标记50+为反应时间50min的反应产物，离心管标记60+为反应时间60min的反应产物，离心管标记70+为反应时间70min的反应产物，离心管标记80+为反应时间80min的反应产物，离心管标记10-、20-、30-、40-、50-、60-、70-、80-分别为离心管标记10+、20+、30+、40+、50+、60+、70+、80+的阴性对照组。
图7B为不同反应时间与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道标记10+为反应时间10min的产物，泳道标记20+为反应时间20min的产物，泳道标记30+为反应时间30min的产物，泳道标记40+为反应时间40min的产物，泳道标记50+为反应时间50min的产物，泳道标记60+为反应时间60min的产物，泳道标记70+为反应时间70min的产物，泳道标记80+为反应时间80min的产物，泳道标记10-、20-、30-、40-、50-、60-、70-、80-分别为泳道标记10+、20+、30+、40+、50+、60+、70+、80+的阴性对照组。
图7的结果说明最佳反应时间是50min。优化后的检测条件为65℃恒温50min,最后80℃灭活4min,终止反应。
4、检测体系特异性、灵敏性分析
使用本实验室分离保存的鸡新城疫病毒、鹅新城疫病毒、H9禽流感病毒、小鹅瘟病毒、黄病毒(坦布苏病毒)为模版检测RT-LAMP体系的特异性。反应体系如表2所示，反应条件为步骤3确定的优化条件，结果如图8所示，泳道1是以鸡新城疫病毒基因组为模版的RT-LAMP反应产物；泳道2是以鹅新城疫病毒基因组为模版的RT-LAMP反应产物；泳道3是以H9禽流感病毒基因组为模版的RT-LAMP反应产物；泳道4是以小鹅瘟病毒基因组为模版的RT-LAMP反应产物；泳道5是以黄病毒(坦布苏病毒)基因组为模版的RT-LAMP反应产物。
图8结果显示检测RT-LAMP体系的特异性良好，可特异地检测到鹅新城疫病毒和鸡新城疫病毒。
从250μL鹅新城疫病毒液中提取病毒总RNA,在紫外分光光度计上测定其RNA含量(100ng/μL),将RNA样品进行10倍梯度稀释,将稀释后的样品分别进行RT-LAMP(反应体系如表2所示,除了模板有变化；反应条件为步骤3确定的优化条件)和RT-PCR(RT-PCR所使用的引物是P1:5’-ATGGGCTCCAGACCTTC-3’；P2:5’-TCACATTTTTGTAGTGGCTC-3’)。取抽提的RNA溶液10μL,置于经DEPC处理过的离心管中，再依次加入反转录的其它成分进行反转录。
具体反转录体系如表3所示：
表3RT-LAMP(反转录体系)
混匀后使用LX-100手掌型离心机瞬时离心，使液体集中于管底，置于42℃水浴中，反应1小时。
反转录结束后，以该cDNA为模版，P1和P2为引物进行PCR，具体体系及程序如表4所示：
表4具体体系及程序
PCR程序如下：94℃预变性2min；94℃45s，51℃40s，72℃45s为一个循环，运行35个循环，之后72℃延伸10min，最后4℃保存。
比较两种检测方法的灵敏度，如图9所示(图A为RT-PCR反应结果图，图中为：
1的模版为APMV-1RNA进行10倍稀释；
2的模版为APMV-1RNA进行102倍稀释；
3的模版为APMV-1RNA进行103倍稀释；
4的模版为APMV-1RNA进行104倍稀释；
5的模版为APMV-1RNA进行105倍稀释；
6为模版为APMV-1RNA进行106倍稀释。
图B为RT-LAMP反应结果图，图中为：
1的模版为APMV-ⅠRNA进行10倍稀释；
2的模版为APMV-ⅠRNA进行102倍稀释；
3的模版为APMV-ⅠRNA进行103倍稀释；
4的模版为APMV-ⅠRNA进行104倍稀释；
5的模版为APMV-ⅠRNA进行105倍稀释；
6为模版为APMV-ⅠRNA进行106倍稀释。)，结果显示可视化RT-LAMP能检测到的GNDV基因组RNA的最低限度比RT-PCR高10倍，最低可以检测到10pg的GNDVRNA。可见,本发明提供的可视化RT-LAMP更灵敏,而且用时更短,操作更加简単,结果比较直观,易于检测,无需电泳。
5、检测体系的结果鉴定
在自然光或者紫外灯下,肉眼可以直接观察RT-LAMP反应的产物。如图10A所示,在紫外灯下可视化RT-LAMP阳性反应可以发出非常强烈的绿色荧光,而阴性反应几乎没有荧光；如图10B所示,在自然光下,可视化RT-LAMP阳性反应产物为绿色，而阴性对照为橙色。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
序 列 表
<110> 刘文俊
<120> 一种检测鹅新城疫病毒的RT-LAMP可视化试剂盒及其应用
<160> 4
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<400> 1
gatgacactgtagatgtgtgta 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<400> 2
cccaagctcagttgagat 18
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<400> 3
ccgcctaaggataaaacattgcatgggtatcatatcgcaaaactatgg 48
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<400> 4
ataactttaaggctcagtggggaattgcctgttattattacttgagaa 48
Claims (4)
1.一种检测鹅新城疫病毒的RT-LAMP可视化试剂盒，其特征在于，包含引物组和显色物质；
所述引物组如下所示：
F3：5’-GATGACAACATGTAGATGTGTA-3’；
B3：5’-CCCAAGCTCAGTTGAGAT-3’；
FIP：5’-CCGCCTAAGGATAAAACATTGCATGGGTATCATATCGCAAAACTATGG-3’；
BIP：5’-ATAACTTTAAGGCTCAGTGGGGAATTGCCTGTTATTATTACTTGAGAA-3’；
所述显色物质为钙黄绿素和氯化锰。
2.根据权利要求1所述的检测鹅新城疫病毒的RT-LAMP可视化试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含dNTP混合物、MgS04、10倍反应缓冲液、链置換DNA聚合酶、甜菜碱和AMV逆转录酶。
3.根据权利要求2所述的检测鹅新城疫病毒的RT-LAMP可视化试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含5U/μL的AMV逆转录酶、10倍反应缓冲液(10×Isothermal AmplificationbufferⅡ)、6U/μL的链置換DNA聚合酶、10mmo1/L的dNTP、10mo1/L的甜菜碱、250μmo1/L的钙黄绿素、25mmo1/L的氯化锰、100mmo1/L的MgS04、10μmol/L的引物FIP+BIP、10μmol/L的引物F3+B3。
4.权利要求1～3任一项所述的检测鹅新城疫病毒的RT-LAMP可视化试剂盒的应用，其特征在于包含以下步骤：
1)配制RT-LAMP反应体系，按终浓度计算，AMV逆转录酶为105U/L、10倍反应缓冲液(10×Isothermal Amplification bufferⅡ)为1×/L、链置换DNA聚合酶0.08～0.48U/μL、dNTP混合物为0.4～1.6mmol/L、甜菜碱为0.2～1.4mol/L、Calcein为50μmol/L、MnCl2为0.8mmol/L、MgSO4为1.0～8.0mmol/L、FIP+BIP引物为1.2μmol/L、F3+B3引物为0.2μmol/L；待测样品RNA为3～5mg/L；
2)反应：将步骤1)配制好的反应体系反应，条件为61～65℃恒温反应，最后灭活；
3)结果判读：通过自然光照下或紫外光下判读结果或是二者结合判读：
3-1)在自然光下反应产物为绿色,说明待测样品含有鹅新城疫病毒；在自然光下反应产物为橙色,说明待测样品不含有鹅新城疫病毒；
3-2)在紫外光下反应产物呈现明显的绿色荧光，说明待测样品含有鹅新城疫病毒；无荧光或绿色荧光不明显,说明待测样品不含有鹅新城疫病毒。
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