CN104498624A - 基于二温式rt-pcr检测h4亚型禽流感病毒的试剂盒 - Google Patents

基于二温式rt-pcr检测h4亚型禽流感病毒的试剂盒 Download PDF

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谢志勤
邓显文
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谢丽基
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黄莉
黄娇玲
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Abstract

本发明公开了一种基于二温式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的试剂盒，该试剂盒含有一对特异性引物。实验证明，应用本发明可检测H4亚型禽流感病毒，具有操作快速简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，特异性试验结果显示该法可特异性扩增出H4亚型禽流感病毒，不扩增其他常见禽病病原体；敏感性试验结果显示该法对H4亚型禽流感病毒检测下限为1.48pg/μL；对86份临床样品进行检测，临床样品检测结果与病毒分离结果一致。本发明用于H4亚型禽流感病毒导致的禽类感染早期诊断及有效防制，可以节约时间的成本。

Description

基于二温式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的试剂盒
技术领域
本发明属于PCR检测病毒技术领域，涉及一种基于二温式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的试剂盒。
背景技术
禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒属的禽流感病毒(AIV)引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征，主要引起禽类的全身或呼吸系统疾病。AIV亚型众多，根据表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的抗原性差异，已鉴别出16种HA亚型(H1-H16)和9种NA(N1-N9)亚型；根据AIV致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(Highly Pathogenic Avian Influenza Virus,HPAIV)和低致病性禽流感病毒(Lowly Pathogenic Avian Influenza Virus,LPAIV)。HPAIV引起家禽的AI以全身感染、高发病率和高死亡率为特征；LPAIV引起家禽AI的临床症状表现温和，死亡率不高，但影响家禽的生长发育和生产性能。
H4亚型AIV属于LPAIV，能隐性感染各种家禽及野生鸟类，宿主范围比较广，包括鸡、火鸡、鸭、野鸭、野鸟、鸵鸟、鹦鹉等，还可以跨种传播，感染哺乳动物。薛峰等报道，在江苏盐城国家级自然保护区对野鸭、丹顶鹤等野禽AIV检测中，H4亚型AIV分离率最高(38.5％)。虽然绝大多数LPAIV致病力低，但LPAIV可能为感染人类的AIV提供基因，潜在危害性不容忽视。因此，应加强对H4亚型AIV的监测。目前，国内已建立的快速检测方法多数都是针对其他亚型AIV，如H1、H3、H5、H6、H7、H9亚型，而针对H4亚型AIV的快速检测方法的未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供敏感性好、特异性强和重复性好的基于二温式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的试剂盒，以简便快速地检测H4亚型禽流感病毒。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：H4亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测引物对，包括引物1和2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。
引物1和引物2的摩尔比为1∶1。
上述H4亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测引物对在PCR扩增方面的应用，PCR扩增的退火温度为58.0℃-68.0℃。
PCR扩增的退火温度为65℃。
基于二温式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的试剂盒，包括引物对、PCR扩增缓冲液和水；
引物对包括引物1和2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列，其浓度均为25pmol/μL，在PCR反应体系中的终浓度分别为0.5pmol/μL；
PCR扩增缓冲液为2×Taq PCR Mix。
引物1和2在PCR反应体系中的终浓度分别为0.5μmol/L。
上述基于二温式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的试剂盒在PCR扩增方面的应用，PCR扩增的退火温度为58.0℃-68.0℃。
PCR扩增的退火温度为65℃。
针对目前缺乏对H4亚型禽流感病毒进行快速检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究设计了一对特异性引物，据此建立了H4亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，应用本发明可检测H4亚型禽流感病毒，具有操作快速简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，特异性试验结果显示该法可特异性扩增出H4亚型禽流感病毒，不扩增其他常见禽病病原体；敏感性试验结果显示该法对H4亚型禽流感病毒检测下限为1.48pg/μL；对86份临床样品进行检测，临床样品检测结果与病毒分离结果一致。本发明用于H4亚型禽流感病毒导致的禽类感染早期诊断及有效防制，可以节约时间的成本。
附图说明
图1是二温式RT-PCR退火温度优化结果电泳图，图中：M、DL1000 DNA Marker；1、58℃；2、59℃；3、60℃；4、61℃；5、62℃；6、63℃；7、64℃；8、65℃；9、66℃；10、67℃；11、68℃；12、阴性对照。
图2是二温式RT-PCR的特异性试验结果电泳图，图中：M、DL1000 DNA Marker；1～3为3株不同的H4亚型禽流感病毒；4～9分别为H1、H3、H5、H6、H7、H9亚型AIV；10、NDV；11、IBV；12、ILTV；13、MG；14、ARV；15、阴性对照。
图3是二温式RT-PCR的敏感性试验结果电泳图，图中：M.DL1000 DNA Marker；1、14.8ng/μL；2、1.48ng/μL；3、148pg/μL；4、14.8pg/μL；5、1.48pg/μL；6、148fg/μL；7、14.8fg/μL；8、阴性对照。
具体实施方式
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：
1、H4N2亚型AIV(A/duck/Guangxi/125D17/2012(H4N2))序列信息收录于NCBI基因库，登录号为KJ881013-KJ881020
2、H4N5亚型AIV(A/Duck/HK/668/79(H4N5))记载于
Zhixun Xie,Yao-shan Pang,Jiabo Liu,et al.A multiplex RT-PCR for detectionof type A influenza virus and differentiation of avian H5,H7,and H9 hemagglutininsubtypes[J].Molecular and Cellular Probes,2006,20(3-4):245-249
3、H4亚型AIV(A/Duck/Guangxi/027D/09(H4))记载于
彭宜，谢芝勋，刘加波，等.禽流感病毒RT-LAMP检测技术的建立[J].动物医学进展，2012，33(12)：43－46.
4、H1N2亚型AIV(A/Sparrow/Guangxi/GXs-1/2012(H1N2))记载于
郭捷,谢芝勋,彭宜,等.一株鸟源H1N2型禽流感病毒全基因序列分析[J].中国兽医学报,2014,34(6):874-820
5、H3N2亚型AIV(A/Duck/Guangxi/N42/2009(H3N2))记载于
Peng Y1,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection of H3 subtype avian influenzaviruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay.Virology Journal,2011,8:337
6、H5N2亚型AIV(A/Turkey/GA/209092/02(H5N2))记载于
彭宜,谢芝勋,刘加波,等.H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立[J].南方农业学报，2013,02:323-327.
7、H6N2亚型AIV(A/duck/Guangxi/GXd-3/2009(H6N2))记载于
Peng Y,Xie Z,Liu J,et al.Epidemiological Surveillance of Low PathogenicAvian Influenza Virus(LPAIV)from Poultry in Guangxi Province,Southern China.[J].PLOS ONE,2013,8(10):1-6.
8、H7N2亚型AIV(A/Chicken/NY/273874/03(H7N2))记载于
谢芝勋,庞耀珊,邓显文,等.H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法的建立[J].
9、H9N2亚型AIV(A/turtledove/Guangxi/49B6/2013(H9N2))记载于
Xu Q，Xie Z X，Xie L J，et al.Characterization of an Avian Influenza VirusH9N2 Strain Isolated from a Wild Bird in Southern China[J].Genome Announc.2014Jun 19；2(3).pii:e00600-14.doi:10.1128/genomeA.00600-14.
10、新城疫病毒(lasota)、传染性支气管炎病毒(M41)、鸡毒支原体(MG S6)、记载于
彭宜,谢芝勋,郭捷,等.利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、N2亚型的分型”,病毒学报,2013,29(2):154-159
11、鸡传染性喉气管炎病毒(AV1231)记载于
Xie Z,Luo S,Xie L,et al.Simultaneous typing of nine avian respiratorypathogens using a novel GeXP analyzer-based multiplex PCR assay[J].J Virol Methods.2014 12；207C:188-195.
12、禽呼肠孤病毒鸡毒(S1133)记载于
Xie Z,Luo S,Xie L,et al.Simultaneous typing of nine avian respiratorypathogens using a novel GeXP analyzer-based multiplex PCR assay[J].J Virol Methods.2014 12；207C:188-195.
病毒DNA/RNA抽提试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为ER201-01。
AMV反转录酶、5×AMV Buffer均购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为2621。
dNTP,大连宝生物工程有限公司，产品目录号：4019。
2×Tap PCR Mix，大连宝生物工程有限公司，产品目录号：RR901A。
实施例1、引物的设计与合成
根据H4亚型禽流感病毒的HA基因核苷酸序列的保守区域，应用生物软件PrimerPremier 5.0设计并筛选了1对特异性引物，见表1。其中，引物扩增目的片段为336bp。引物由Invitrogen公司合成。
表1 引物序列
实施例2、二温式RT-PCR鉴定H4亚型禽流感病毒反应体系的建立
1、病毒RNA的抽提与反转录
参照DNA/RNA抽提试剂盒(北京全式金生物技术有限公司产品)使用说明书抽提H4亚型禽流感病毒H4N2亚型(A/duck/Guangxi/125D17/2012(H4N2))的RNA，采用AMV反转录酶、5×AMV Buffer、dNIP反转录体系进行反转录。加入随机引物2.0μL，70℃10min；冰浴5 min；加入反转录体系：10μL 5×AMV Buffer、4μL dNTP、0.5μL RNA酶抑制剂、1μL AMV反转录酶，瞬时离心,42℃放置90min，制备得到cDNA。所有抽提所得的DNA及反转录所得的cDNA置-30℃保存备用。
2、二温式RT-PCR条件的优化
PCR反应均为25μL反应体系，其他体系组分不变(2×PCR Master Mix 12.5μL、模板2μL)，分别针对引物浓度及退火温度进行优化。其中，2×Tap PCR Mix为TaKaRa公司产品，其产品目录号为RR901A。
PCR扩增，以步骤1获得的H4亚型禽流感病毒H4N2亚型AIV(A/duck/Guangxi/125D17/2012(H4N2))cDNA为模板，外引物上、下游引物各0.1μL-0.5μL(各引物溶液浓度均为25.0pmol/μL)范围，循环数35，退火温度58℃-68℃优化反应体系。
经过对二温式RT-PCR条件的优化，结果显示：
最佳的反应体系为：两轮的反应体系都是25μL，2×Tap PCR Mix 12.5μL，2μL模板，上下游引物各0.5μL(各引物溶液浓度均为25.0pmol/μL)，加纯水至25μL。反应体系中，各引物在PCR反应体系中的终浓度均为0.5pmol/μL。
最佳的反应程序为：95℃5min；95℃50s、65℃40s，35个循环；72℃延伸10min，12℃结束。
采用优化后的最佳反应体系及程序进行二温式RT-PCR，将所得每轮的PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。结果显示，特异性扩增产物大小在336 bp，与预期结果相符(图1)。
实施例3、二温式RT-PCR的特异性实验
1、病毒RNA的抽提与反转录
供试病毒：3株不同的H4亚型禽流感病毒H4N2亚型AIV(A/duck/Guangxi/125D17/2012(H4N2))、H4N5亚型AIV(A/Duck/HK/668/79(H4N5))和H4亚型AIV(A/Duck/Guangxi/027D/09(H4))、H1N2亚型AIV(A/Sparrow/Guangxi/GXs-1/2012(H1N2))、H3N2亚型AIV(A/Duck/Guangxi/N42/2009(H3N2))、H5N2亚型AIV(A/Turkey/GA/209092/02(H5N2))、H6N2亚型AIV(A/duck/Guangxi/GXd-3/2009(H6N2))、H7N2亚型AIV(A/Chicken/NY/273874/03(H7N2))、H9N2亚型AIV(A/turtledove/Guangxi/49B6/2013(H9N2))、新城疫病毒(NDV lasota)、传染性支气管炎病毒(IBV M41)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV AV1231)、禽呼肠孤病毒鸡毒(ARV S1133)、鸡毒支原体(MG S6)。参照DNA/RNA抽提试剂盒(北京全式金生物技术有限公司产品)使用说明书抽提各禽流感病毒、NDV、IBV和ARV的RNA，以及ILTV和MG的DNA，采用AMV反转录酶、5×AMV Buffer、dNIP反转录体系进行反转录。加入随机引物2.0μL，70℃10min；冰浴5min；加入反转录体系：10μL 5×AMV Buffer、4μL dNTP、0.5μL RNA酶抑制剂、1μL AMV反转录酶，瞬时离心,42℃放置90min，制备得到cDNA。所有抽提所得的DNA及反转录所得的cDNA置-30℃保存备用。
2、二温式RT-PCR的特异性检测
采用实施例2优化后的最佳反应体系及程序对步骤1获得的各cDNA(或DNA)样品进行二温式RT-PCR，以检测本发明二温式RT-PCR的特异性。同时设置以超纯水作为模板的阴性对照。PCR反应结束后，将最终的PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
结果显示：扩增产物只在3株H4亚型禽流感病毒的cDNA处出现了大小336 bp的目的条带，其他病原体的cDNA(或DNA)与阴性对照都无条带出现(图2)。这说明本发明建立的二温式RT-PCR检测方法具有良好的特异性。
实施例4、二温式RT-PCR的灵敏度实验
1、病毒RNA的抽提与反转录
参照DNA/RNA抽提试剂盒(北京全式金生物技术有限公司产品)使用说明书抽提H4N2亚型AIV(A/duck/Guangxi/125D17/2012(H4N2))的RNA，并按10倍倍比稀释H4亚型流感病毒RNA，其浓度分别为14.8ng/μL、1.48ng/μL、148pg/μL、14.8pg/μL、1.48pg/μL、148fg/μL、14.8fg/μL。对各浓度的病毒RNA进行反转录后，采用AMV反转录酶、5×AMV Buffer、dNIP反转录体系进行反转录。加入随机引物2.0μL，70℃10min；冰浴5min；加入反转录体系：10μL 5×AMV Buffer、4μL dNTP、0.5μL RNA酶抑制剂、1μL AMV反转录酶，瞬时离心,42℃放置90 min，制备得到cDNA。反转录所得的cDNA置-30℃保存备用。
2、二温式RT-PCR的灵敏度检测
采用实施例2优化后的最佳反应体系及程序对步骤1获得的H4亚型禽流感病毒各cDNA样品(分别对应不同浓度的H4亚型流感病毒RNA)进行二温式RT-PCR。同时设置以超纯水作为模板的阴性对照。PCR反应结束后，将最终的PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
结果显示：本发明建立的二温式RT-PCR方法对H4亚型禽流感病毒检测下限为1.48pg/μL(图3)
实施例5、检测试剂盒的组装
根据上述实施例的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。
该试剂盒包括引物对、PCR扩增缓冲液和水；引物对包括引物1和2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列，其浓度均为25pmol/μL，在PCR反应体系中的终浓度分别为0.5pmol/μL；PCR扩增缓冲液为2×Taq PCR Mix。引物1和2在PCR反应体系中的终浓度分别为0.5μmol/L。
应用本发明检测或辅助检测待测样品中是否含有H4亚型禽流感病毒时，所述待测样品均可为健康的动物或死亡的动物，具体为采自于活禽的咽喉拭子和泄殖腔拭子，操作步骤如下：
(1)从所述待测样品中提取总RNA，反转录得到待测cDNA；
(2)以所述待测cDNA作为模板，用所述外引物对进行一轮PCR反应，获得PCR产物1；
(3)根据所述PCR产物1的大小按照如下方法确定所述待测样品中是否含有H4亚型禽流感病毒：若所述PCR产物1中含有大小为336bp的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有H4亚型禽流感病毒，反之则所述待测样品中不含有或候选不含有H4亚型禽流感病毒。

Claims (8)

1.H4亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测引物对，其特征在于包括引物1和2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的H4亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测引物对，其特征在于：所述引物1和引物2的摩尔比为1∶1。
3.权利要求2所述H4亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测引物对在PCR扩增方面的应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为58.0℃-68.0℃。
4.权利要求4所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为65℃。
5.一种基于二温式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的试剂盒，其特征在于包括引物对、PCR扩增缓冲液和水；
所述引物对包括引物1和2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列，其浓度均为25pmol/μL，在PCR反应体系中的终浓度分别为0.5pmol/μL；
所述PCR扩增缓冲液为2×Taq PCR Mix。
6.根据权利要求6所述的基于二温式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述引物1和2在PCR反应体系中的终浓度分别为0.5μmol/L。
7.权利要求7所述基于二温式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的试剂盒在PCR扩增方面的应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为58.0℃-68.0℃。
8.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为65℃。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MING-SHIUH LEE ET AL: "Identification and subtyping of avian influenza viruses by reverse transcription-PCR", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *
MING-SHIUH LEE ET AL: "Identification and subtyping of avian influenza viruses by reverse transcription-PCR", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》, vol. 97, 31 December 2001 (2001-12-31), pages 13 - 22 *
张苗等: "通用引物鉴定野鸟源禽流感病毒HA亚型", 《野生动物》 *

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