CN104004858A - H3亚型禽流感病毒巢式rt-pcr检测试剂盒及其引物组 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种H3亚型禽流感病毒巢式RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括两对特异性引物。实验证明，应用本发明可准确检测H3亚型禽流感病毒，具有操作快速简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点。本发明用于H3亚型禽流感病毒导致的禽类感染，可以保证检测结果的准确性，为H3亚型AIV的诊断提供了更加准确可靠的检测技术。

Description

H3亚型禽流感病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其引物组

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及H3亚型禽流感病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其引物组。

背景技术

禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)属于正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒，可感染各种家禽及野生禽类。根据其表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的抗原性差异，AIV可进一步分为不同的亚型，目前已鉴别出17种HA亚型(H1-H17)和10种NA亚型(N1-N10)。野生水禽被认为是AIV的天然存储库，几乎所有亚型的AIV都可从其体内分离到，尤其是野鸭，其带毒情况更为普遍。野鸭可以通过粪便排毒污染水系，将病毒扩散感染其它禽类和哺乳动物，为基因重排提供了条件。同时，野鸭和家鸭的亲缘关系最近，两者相互交往后带毒情况十分相似。目前在家鸭中以H3亚型AIV为主，由于H3亚型AIV为低致病性的，在宿主体内隐性携带，未引起人们的关注，但研究报道该亚型AIV可以为高致病性AIV提供基因片段造成对人类的感染。因此，加强对H3亚型AIV的监测对养禽业的发展和公共卫生都有重要意义。

巢式RT-PCR(nested RT-PCR)是在普通RT-PCR基础上建立的一种检测方法，其核心技术为通过2对引物对目的基因进行扩增得到更加准确的检测结果。巢式RT-PCR的第二对引物设计在第一对引物扩增片段的内部，使起始模板通过“外”、“内”两对引物的扩增，加大模板量进一步倍增至可观察量，解决了因起始模板量低导致假阴性检测结果的问题。巢式RT-PCR的另一个优点在于当第一对引物出现错误扩增，第二对引物不会能与第一次扩增产生的非特异性产物有效结合，从而提高了反应特异性。因此，巢式RT-PCR是一种比普通RT-PCR敏感性好、特异性强的检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供敏感性好、特异性强和重复性好的H3亚型禽流感病毒巢式RT-PCR检测试剂盒及其引物组，以快速准确地检测H3亚型禽流感病毒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：H3亚型禽流感病毒巢式RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。

引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为0.5-1∶0.5-1∶1∶1。

引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为1∶1∶1∶1。

上述H3亚型禽流感病毒巢式RT-PCR检测引物组在巢式RT-PCR扩增方面的应用，巢式RT-PCR第一次和第二次扩增的退火温度均为53.0℃-60.0℃。

巢式RT-PCR第一次和第二次扩增的退火温度分别为56.0℃和57.0℃。

H3亚型禽流感病毒巢式RT-PCR检测试剂盒，包括引物组、PCR缓冲液和水；

引物组包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列，其浓度均为25μmol/L，在PCR反应体系中的终浓度为0.1μmol/L-0.5μmol/L；

PCR缓冲液为2×Taq PCR Mix。

引物1和2、引物3和4在PCR反应体系中的终浓度为0.2μmol/L。

巢式RT-PCR第一次和第二次扩增的退火温度均为53.0℃-60.0℃。

巢式RT-PCR第一次和第二次扩增的退火温度分别为56.0℃和57.0℃。

针对目前缺乏对H3亚型禽流感病毒进行快速准确检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究设计了两对特异性引物，据此建立了H3亚型禽流感病毒巢式RT-PCR检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，应用本发明可准确检测H3亚型禽流感病毒，具有操作快速简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点。本发明用于H3亚型禽流感病毒导致的禽类感染，可以保证检测结果的准确性，为H3亚型AIV的诊断提供了更加准确可靠的检测技术。

附图说明

图1是巢式RT-PCR特异性试验结果的电泳图，图中：M.DNA标准分子质量；1-5.5株H3分离株；6.H1；7.H4；8.H5；9.H6；10.H7；11.H9；12.新城疫病毒；13.传染性支气管炎病毒；14传染性喉气管炎；15.鸡毒霉形体；16.禽呼肠孤病毒；17.阴性对照。

图2是巢式RT-PCR的敏感性试验结果的电泳图，图中：M.DNA标准分子质量；1-6.1×10⁷-1×10²拷贝/μL；7.阴性对照。

图3是普通RT-PCR的敏感性试验结果的电泳图，图中：M.DNA标准分子质量；1-6.1×10⁷-1×10²拷贝/μL；7.阴性对照。

具体实施方式

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：

H1亚型禽流感病毒记载在“利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、N2亚型的分型”，病毒学报，2013，29(2):154-159，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

H3亚型禽流感病毒记载在“Visual detection of H3subtype avian influenza virusesby reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay”VirologyJournal,2011,5；8:337，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

H4亚型禽流感病毒记载在“H4亚型家养水禽流感病毒分离株的表面膜蛋白基因的序列测定和遗传进化分析”，畜牧兽医学报，2006,37(12),1334-1339，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

H5亚型禽流感病毒记载在“H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立”，南方农业学报，2013,02:323-327，H5亚型AIV RNA为美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断研究室惠赠；

H6亚型禽流感病毒记载在“H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立”，畜牧与兽医，2012,44(11),12-16，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

H7亚型禽流感病毒记载在“H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法的建立”，中国兽医科技，2005,35(6),437-440，H7亚型AIV RNA为美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断研究室惠赠；

H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报，2006，(09):858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

新城疫病毒记载在“禽流感和新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立”，生物技术通讯，2008,19(3)410-413，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

传染性支气管炎病毒记载在“应用多重反转录_聚合酶链反应检测鸡新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的研究”，中国预防兽医学报，2000,22(2),126-130，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

传染性喉气管炎病毒记载在“传染性喉气管炎病毒疫苗的研究进展”，中国畜牧兽医，2006,33(2),41-44，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得

鸡毒霉形体记载在“用SDS-PAGE分析鸡毒霉形体广西分离株的结构蛋白”，中国兽医科技，2003,33(2),41-43，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

禽呼肠孤病毒记载在“禽呼肠孤病毒广西分离株σ3基因的克隆和表达”，中国预防兽医学报，2005,27(3)，167-170，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

RNA抽提试剂盒、AMV反转录酶、5×AMV Buffer、dNTP、RNA酶抑制剂均购自TaKaRa公司，质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司，2×Taq PCRMaster MIX购自Invitrogen公司。

实施例1、引物的设计与合成

根据GenBank中H3亚型AIV HA基因的保守序列，利用DNAStar软件进行多序列比对，在保守区用primer5.0设计引物。引物由Invitrogen公司合成。(表1)。

表1 引物信息

实施例2、巢式RT-PCR检测

一、核酸的提取及RNA的反转录

参照DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取传染性喉气管炎、鸡毒霉形体DNA，同时对H1、H3、H4、H6、H7、H9、禽呼吸道传染病、传染性支气管炎和新城疫病毒进行抽提，并按反转录说明书将RNA反转录成cDNA，具体如下：采用50μL体系，于EP管中依次加入10μL5×反转录缓冲液、10mmol/L dNTP4μL、5U/μLAMV1μL、20U/μL RNA酶抑制剂1μL、流感通用引物(序列为5′-AGCAAAAGCAGG-3′，SEQ.ID.No.5)2μL、待检总RNA模板32μL，瞬离后水浴锅42℃90min，将制备的cDNA置-30℃保存备用。

二、巢式RT-PCR扩增体系的建立

1、反应体系的优化

两次扩增体系相同，都采用25.00μL反应体系：12.5μL2×PCR Matermix、2μLcDNA、上下游引物(25μmol/L)各加入0.1～0.5μL5个梯度进行引物浓度优化，最后加水至25μL，瞬时离心。第二次扩增以第一次扩增产物作为模板，通过对第一轮PCR反应产物进行10倍倍比稀释，为第二轮PCR反应优化选择最佳的模板浓度。最终确定两轮PCR反应体系均为25μL，包括:2×PCR Master Mix12.5μL，上下游引物各0.2μL(25μmol/L)，模板cDNA2μL，加水至25μL，其中第二次扩增以第一次扩增产物直接稀释1000倍后取2μL为模板。

2、反应条件的优化

按照上述反应体系，将退火温度按53.0℃-60.0℃依次递增，多次重复试验后确定最佳退火温度。最终确定最佳反应条件为：第一轮PCR反应模式为：94℃4min；进入94℃40s，56℃50s，72℃1min,35个循环；然后再72℃延伸10min，4℃结束。第二轮PCR反应模式为：94℃4min；进入94℃40s，57℃50s，72℃1min,30个循环；然后再72℃延伸10min，4℃结束。

三、巢式RT-PCR特异性试验

利用上述优化后的巢式PCR反应体系及条件，扩增5株分离的H3亚型AIV核苷酸作为阳性对照，同时扩增H1、H4、H5、H6、H7、H9亚型AIV、NDV、IBV、ILTV、MG、和ARV的核苷酸，检测其特异性。结果如图1所示，5株分离的H3亚型AIV扩增片段均为271bp,与预期结果大小一致，而其他亚型AIV和禽呼吸道疾病病毒均未扩增出对应条带。说明本发明的引物和方法有高特异性。

因此，上述引物和方法可应用于鉴定未知样本是否感染H3亚型禽流感病毒：若得到271bp片段，则样本中含有H3亚型禽流感病毒，反之则没有。

四、巢式RT-PCR的敏感性试验

对H3亚型AIV HA基因测序正确的质粒标准品进行10倍倍比稀释，使其浓度为1×10⁷-1×10²拷贝/μL，用巢式RT-PCR方法分别对1×10⁷-1×10²拷贝/μL质粒标准品进行扩增，结果如图2所示，可见本发明建立的H3亚型AIV巢式PCR检测方法最低能检测到1×10³拷贝/μL H3亚型AIV。普通RT-PCR敏感性结果如图3所示，其对H3亚型AIV检测下限为1×10⁵拷贝/μL，结果表明，巢式RT-PCR方法比普通RT-PCR方法灵敏100倍。实施例3、检测试剂盒的组装

根据实施例1和2的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。

试剂盒包括引物组、PCR缓冲液和水；引物组包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，其浓度均为25μmol/L(在PCR反应体系中的终浓度均为0.2μmol/L)；PCR缓冲液为2×Taq PCR Mix。

PCR检测中的其他试液可现场配置或直接使用商品化试剂。

实施例4、巢式RT-PCR检测临床样本

对96份从广西南宁市活禽市场采集的咽喉和泄殖腔拭子反复挤压、清洗，从中抽提病毒RNA并反转录为cDNA，使用实施例3的试剂盒，按照实施例2建立的巢式RT-PCR方法进行检测，重复三次，保证实验的准确性。同时对这96份样品进行抗生素处理后，用鸡胚法分离病毒，通过HA、HI实验验证该方法的准确性。

结果显示，在广西南宁市96份活禽市场样品中，巢式RT-PCR检测结果有5份呈现H3亚型AIV阳性；病毒分离鉴定结果为5份阳性样品。这表明所建立的巢式RT-PCR检测检测结果与病毒分离鉴定结果一致，该法具有良好的实用性。

Claims (9)

1.H3亚型禽流感病毒巢式RT-PCR检测引物组，其特征在于包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的H3亚型禽流感病毒巢式RT-PCR检测引物组，其特征在于：所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为0.5-1∶0.5-1∶1∶1。

3.根据权利要求2所述的H3亚型禽流感病毒巢式RT-PCR检测引物组，其特征在于：所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为1∶1∶1∶1。

4.权利要求2所述H3亚型禽流感病毒巢式RT-PCR检测引物组在巢式RT-PCR扩增方面的应用，其特征在于：所述巢式RT-PCR第一次和第二次扩增的退火温度均为53.0℃-60.0℃。

5.权利要求4所述的应用，其特征在于：所述巢式RT-PCR第一次和第二次扩增的退火温度分别为56.0℃和57.0℃。

6.一种H3亚型禽流感病毒巢式RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括引物组、PCR缓冲液和水；

所述引物组包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列，其浓度均为25μmol/L，在PCR反应体系中的终浓度为0.1μmol/L-0.5μmol/L；

所述PCR缓冲液为2×Taq PCR Mix。

7.根据权利要求6所述H3亚型禽流感病毒巢式RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述引物1和2、引物3和4在PCR反应体系中的终浓度为0.2μmol/L。

8.权利要求7所述H3亚型禽流感病毒巢式RT-PCR检测试剂盒在巢式RT-PCR扩增方面的应用，其特征在于：所述巢式RT-PCR第一次和第二次扩增的退火温度均为53.0℃-60.0℃。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述巢式RT-PCR第一次和第二次扩增的退火温度分别为56.0℃和57.0℃。