CN102943130B - 禽肺炎病毒的lamp检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种禽肺炎病毒的LAMP检测试剂盒。该试剂盒中含有针对禽肺炎病毒F基因保守区域的8个区域设计的6条引物组成的引物组，其核苷酸序列如序列表序列1至序列6所示。本发明所提供的试剂盒可特异检出禽肺炎病毒，最低检出限为100fg/μL，其敏感性为常规RT-PCR的100倍。本发明具有检测快速且成本低，不需要昂贵的仪器并且操作方法更简单，适于临床快速检测。

Description

禽肺炎病毒的LAMP检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种禽肺炎病毒的LAMP检测试剂盒。

背景技术

禽肺炎病毒（Avian pneumo virus,APV)是禽偏肺炎病毒属的成员，属于禽副黏病毒科。该病毒主要危害火鸡和不同品种的鸡，包括种鸡、商品肉鸡和鸡蛋，发病日龄一般在4—7周龄，5—6周龄为发病高峰，主要引起上呼吸道的症状，以喷嚏，眼结膜潮红，泪腺肿，头部出现皮下水肿，俗称肿头；产蛋鸡感染主要引起产蛋下降2%—40%，孵化率降低；随着病情的发展，还表现出神经症状；该病引起的发病率在1%—90%之间，引起鸡死亡率在1%—20%，在发病期间继发其它疾病的感染，会引起更大的死亡，造成对养禽业尤其是种禽的极大危害。

目前，检测禽肺炎病毒的方法有病毒鸡胚分离、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光技术（IFA）、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)、基因芯片(Gene chips)。传统的病毒鸡胚分离方法准确、简便，但耗时太长，通常需要两天到一周的时间；IFA、ELISA快速但需要特殊试剂；RT-PCR、RRT-PCR、Gene chips检测技术快速、灵敏，但都需要特殊仪器和技术人员，且成本较高，不适合在基层推广使用。

环介导等温基因扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的链置换DNA聚合酶（即Bst DNA聚合酶），在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应，整个反应不需要特殊的仪器设备，仅在水浴锅中就可完成。LAMP技术在目的基因保守区设计针对6个特异区域的4条引物（内引物两条分别为FIP和BIP、外引物两条分别为F3和B3），为了进一步提高反应的特异性，还可设计两条环引物；LAMP反应结果的观察方法非常简便，反应结束后可通过肉眼在可见光或紫外线下直接观察反应液的颜色变化来判定结果。LAMP具有简便、快速、灵敏、特异的优势，尤其适合在基层检测应用。在LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测禽肺炎病毒的环介导等温基因扩增引物组。

本发明所提供的引物组包括引物1、引物2、引物3和引物4；

所述引物1的核苷酸序列如序列表序列1所示；

所述引物2的核苷酸序列如序列表序列2所示；

所述引物3的核苷酸序列如序列表序列3所示；

所述引物4的核苷酸序列如序列表序列4所示。

在上述引物组中，还包括引物5和引物6；所述引物5的核苷酸序列如序列表序列5所示；所述引物6的核苷酸序列如序列表序列6所示；

在上述引物组中，所述引物组具体由所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6组成。

在上述引物组中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为（15-17）:（15-17）:（7.5-8.5）:（7.5-8.5）:（7.5-8.5）:（7.5-8.5）；具体可为16:16:8:8:8:8。

本发明的另一个目的是提供一种检测禽肺炎病毒的环介导等温基因扩增试剂。

本发明所提供的环介导等温基因扩增试剂由上述任一所述的引物组、环介导等温基因扩增缓冲液、链置换DNA聚合酶（即Bst DNA聚合酶）、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱、钙黄绿素、氯化锰和水组成。

在上述试剂中，所述引物组中的所述引物1在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为15μmol/μL—17μmol/μL；具体可为16μmol/μL；

所述引物组中的所述引物2在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为15μmol/μL—17μmol/μL；具体可为16μmol/μL；

所述引物组中的所述引物3在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为7.5μmol/μL—8.5μmol/μL;具体可为8μmol/μL；

所述引物组中的所述引物4在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为7.5μmol/μL—8.5μmol/μL；具体可为8μmol/μL；

所述引物组中的所述引物5在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为7.5μmol/μL—8.5μmol/μL；具体可为8μmol/μL；

所述引物组中的所述引物6在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为7.5μmol/μL—8.5μmol/μL；具体可为8μmol/μL。

在上述试剂中，所述链置换DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱、钙黄绿素、氯化锰的终浓度分别为0.32U/μL、1.4mmol/L、2mmol/L、1mol/L、25μmol/L、0.5mmol/L。

本发明的还提供一种检测禽肺炎病毒的环介导等温基因扩增试剂盒。

本发明所提供的试剂盒包括上述任一所述引物组或所述环介导等温基因扩增试剂。

本发明保护上述任一所述的引物组或所述环介导等温基因扩增试剂或所述环介导等温基因扩增试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有禽肺炎病毒产品中的应用。

在上述应用中，所述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有禽肺炎病毒包括用上述任一所述引物组或所述环介导等温基因扩增试剂或所述环介导等温基因扩增试剂盒对所述待测样品进行环介导等温基因扩增反应的步骤。

本发明针对禽肺炎病毒F基因保守序列设计了六条特异的LAMP引物组，利用该引物组进行LAMP检测可特异检出禽肺炎病毒，最低检出限为100fg/μL，其敏感性为常规RT-PCR的100倍。本发明具有检测快速且成本低，不需要昂贵的仪器并且操作方法更简单，适于临床快速检测。

附图说明

图1为本发明禽肺炎病毒LAMP检测试剂盒的特异性检测结果。

图2为本发明禽肺炎病毒LAMP检测试剂盒的敏感性检测结果。

图3为RT-PCR检测禽肺炎病毒的敏感性结果。

图4为本发明禽肺炎病毒LAMP检测试剂盒对临床样品的检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的毒株或菌株的信息如下：

禽肺炎病毒毒株MN2a：文献：Bruce S.Seal,Holly S.Sellers,Richard J.Meinersmann.Fusion protein predicted amino acid sequence of the firstUS avian pneumovirus isolate and lack of heterogeneity among other US isolates.Virus Research.66(2000)139–147.公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

鸡新城疫病毒毒株Lasota、禽脑脊髓炎病毒毒株Van Roekel；鸡毒霉形体毒株S6、鸡传染性支气管炎病毒毒株Mass41、鸡传染性喉气管炎病毒毒株北京株、禽呼肠孤病毒毒株S1133和禽巴氏杆菌菌株C48-1：文献：Zhiqin Xie（谢志勤）等，Reversetranscriptase polymerase chain reaction to detect avian Encephalomyeliti svirus，Avian Disease(美国禽病杂志)，2005,49:227-230；谢志勤等，应用二温式多重PCR技术鉴别鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒，广西科学，2001,8（2）：152-153；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

实施例1、禽肺炎病毒的LAMP引物设计及其试剂盒

一、引物设计

根据禽肺炎病毒(Avian pneumovirus,APV)的F基因（Genbank号：AF187154，如序列表序列7所示）保守区域，设计并合成如下LAMP引物（方向均为从5’-3’端）：

内引物1：AGCAGGACAATGAGGACTATCACTA-GTCAAACAAGATATTGGATAGCAC（如序列表序列1所示，横线前序列与序列表序列7的第1515-1491位互补，横线后序列与序列表序列7的第1440-1463位相同）；

内引物2：AGTTGGTGTGGGTGTCTTCT—CCATTCATTTCCATTGGGAA（如序列表序列2所示，横线前序列与序列表序列7的第1528-1547位相同，横线后序列与序列表序列7的第1599-1580位互补）；

外引物1：GCCAGAATCTGATAGACCA（如序列表序列3所示，与序列表序列7的第1422-1440位相同）；

外引物2：GGATAAATCCTTTGTTGTTCACA（如序列表序列4所示，与序列表序列7的第1622-1560位互补）；

环引物1：ATGACAAATCCTGCATTCCC（如序列表序列5所示，与序列表序列7的第1491-1472位互补）；

环引物2：TGTGGTTAAGAAGAGAAAAGCTGC（如序列表序列6所示，与序列表序列7的第1549-1572位相同）。

二、LAMP鉴别试剂及试剂盒

LAMP反应液体系（24μL）如下：2.5μL10×环介导等温基因扩增缓冲液（Biolabs公司，产品目录号：0360912）、1μL8U/μLBst DNA聚合酶（Biolabs公司，产品目录号：0360912，反应体系中的终浓度为0.32U/μL）、3.5μL10mmol/L dNTPs（中国大连宝生物工程公司Takara产品，产品目录号：D4030RA，反应体系中的终浓度为1.4mmol/L）、2μL25mmol/L硫酸镁（反应体系中的终浓度为2mmol/L）、2μL200μmol/μL的内引物1（反应体系中的终浓度16μmol/μL）、2μL200μmol/μL的内引物2（反应体系中的终浓度16μmol/μL）、1μL200μmol/μL的外引物1（反应体系中的终浓度8μmol/μL）、1μL200μmol/μL的外引物2（反应体系中的终浓度8μmol/μL）、1μL200μmol/μL的环引物1（反应体系中的终浓度8μmol/μL）、1μL200μmol/μL的环引物2（反应体系中的终浓度8μmol/μL），5μL5mol/L甜菜碱（反应体系中的终浓度1mol/L）、1μL625μmol/L钙黄绿素（反应体系中的终浓度25μmol/L）、1μL12.5mmol/L氯化锰（反应体系中的终浓度为0.5mmol/L）。

禽肺炎病毒LAMP检测试剂盒可包括上述反应液，也可包括分别独立包装的上述引物及试剂。

实施例2、LAMP试剂盒的特异性检测

一、模板的获得

1、病毒RNA提取及cDNA的获得

1）病毒RNA提取

使用Trizol试剂提取（Invitrogen公司，产品编号为15596-026）按使用说明书，从如下病原体分别感染的鸡胚尿囊液中分别提取RNA（以提取阴性鸡胚尿囊液获得的样品为阴性对照样品）：禽肺炎病毒毒株MN2a（经测序比对证实为禽肺炎病毒）、鸡马立克氏病毒毒株MDV（南京梅里亚动物保健品公司）、鸡传染性支气管炎病毒毒株Mass41、禽呼肠孤病毒毒株S1133、鸡新城疫病毒毒株Lasota和禽脑脊髓炎病毒毒株VanRoekel。

2）cDNA的获得

将步骤1）获得的RNA样品分别按照如下反应体系和反应条件进行反转录，得到cDNA；以DEPC水作为总RNA的对照。

反应体系（10μL）：5×Reverse Transcriptase Buffer（反应缓冲液）2μL,RandomPrimer（自由引物）（50μmol/μL）0.5μL，dNTPMixture(10mM)（四种碱基）1μL，Ribonuclease Inhibitor（40U/μL）（抑制剂）0.5μL，AMV Reverse Transcriptase（5U/μL）（逆转录酶）0.5μL，模板RNA1μL，DEPC水补足至10μL。

上述反转录试剂Reverse Transcriptase Buffer、Random Primer、dNTP Mixture、Ribonuclease Inhibitor、AMV Reverse Transcriptase（均为Takara公司产品，目录号分别为DR100A、D3802、D2313A、D2313A、D2620）。

反应条件：42℃1小时，95℃5分钟。

2、对照病毒基因组DNA的提取

使用DNA提取试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司，产品编号DV807A），按照试剂盒说明书，从鸡传染性喉气管炎病毒毒株北京株感染的鸡胚尿囊液中提取病毒基因组DNA；从禽巴氏杆菌菌株C48-1和鸡毒霉形体毒株S6的培养物中分别提取基因组DNA。

3、测定核酸含量

用核酸蛋白分析仪BioPhotometer测定其OD值，得出其浓度与纯度值，并以此控制核酸质量。

二、LAMP扩增反应

在实施例1步骤二的24μL反应液体系中分别加入1μL步骤一获得的cDNA样品或DNA样品（模板），按照如下反应程序进行LAMP扩增反应：60℃90min，然后80℃5min。

三、结果

LAMP扩增反应的结果可以通过以下两个方法判断：在可见光下直接用肉眼观察颜色变化，阳性结果显示黄绿色，阴性结果显示无色；在紫外线下观察阳性结果显示明亮的绿色荧光，阴性结果显示无颜色。

可见光下观察结果如图1所示，1为禽肺炎病毒毒株MN2a株；2为鸡马立克氏病毒毒株MDV；3为鸡传染性支气管炎病毒毒株Mass41；4为鸡传染性喉气管炎病毒毒株北京株；5为禽呼肠孤病毒毒株S1133；6为禽巴氏杆菌菌株C48-1；7为鸡毒霉形体毒株S6；8为鸡新城疫病毒毒株Lasota；9为禽脑脊髓炎病毒毒株Van Roekel；10为阴性对照鸡胚尿囊液。

图1的结果表明：禽肺炎病毒毒株MN2a株检测结果为阳性，而非禽肺炎病毒对鸡马立克氏病毒毒株MDV、鸡传染性支气管炎病毒毒株Mass41、鸡传染性喉气管炎病毒毒株北京株、鸡新城疫病毒毒株Lasota、禽呼肠孤病毒毒株S1133、禽巴氏杆菌菌株C48-1、鸡毒霉形体毒株S6、禽脑脊髓炎病毒毒株Van Roekel的检测结果均为阴性。

在紫外光下判断，结果与上述可见光判断结果一致。说明引物及检测方法用于检测禽肺炎病毒的特异性高。因此，上述引物及判断标准可用来判断未知样本是否含有禽肺炎病毒。

实施例3、LAMP试剂盒的敏感性检测

1、不同浓度RNA样品的制备

将实施例2步骤一中1获得的禽肺炎病毒MN2a株的RNA定量后按10倍递增稀释成100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL。

2、cDNA的获得

将步骤1获得的不同浓度RNA样品分别按照实施例2步骤一中1的2）的方法进行反转录，获得cDNA。

3、LAMP扩增及结果

取步骤2的cDNA样品分别按照实施例2步骤二的反应体系和反应程序进行LAMP扩增，肉眼可见光下观察结果如图2所示，图中的1为1ng/μL；2为100pg/μL；3为10pg/μL；4为1pg/μL；5为100fg/μL；6为10fg/μL；7为1fg/μL；其中1-5均为阳性，6-7均为阴性；即实施例1禽肺炎病毒LAMP检测试剂盒的检测限为100fg/μL。

4、PCR扩增及结果（对照）

取步骤2的cDNA样品分别按照如下体系和程序进行PCR扩增，具体如下：

PCR扩增体系（50μL）：10×PCR buffer5μL,10mM dNTPs2μL，Taq聚合酶（5U）0.5μL，上游引物5’-ATCGGGCAATGGTCAGAAGG-3’(100μmol/μL)1μL，下游引物5’-ACACCGTCATAACAGGCTACCAA-3’(100μmol/μL)1μL，cDNA样品5μL，双蒸水补足至50μL。

PCR扩增程序：95℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共进行35个循环，最后再经72℃延伸10分钟。

结果如图3所示，图中的1为100ng/μL；2为10ng/μL；3为1ng/μL；4为100pg/μL；5为10pg/μL；6为1pg/μL；7为100fg/μL；其中，泳道1-5得到424bp的PCR产物（经测序为禽肺炎病毒MN2a株F基因Genbank号为AF187154的第753-1176位核苷酸），检测限为10pg/μL。

上述结果表明，禽肺炎病毒LAMP检测试剂盒的检测限为100fg/μL，而常规RT-PCR的检测限为1pg/μL，LAMP方法敏感性比常规RT-PCR高100倍。

实施例4、禽肺炎病毒LAMP检测试剂盒对临床样品准确率检测

1、临床组织样品中RNA样品的提取

1）分别取临床编号为C20120314、C20120402、C20120427、C20120509、C20120617的鸡（25-35日龄的三黄鸡，出现头部皮下水肿，喷嚏，眼结膜潮红，出现神经症状）肺组织5g，用研磨钵磨碎后加入灭菌的PBS溶液10mL，反复冻融3次，10000转离心5分钟，收集200μL上清液，加入700μL Trizol试剂后，剧烈混匀，室温（25℃）放置10min；

2）加入200μL氯仿，剧烈混匀，室温放置5min；

3）12000×g离心15min；

4）收集500μL上清，加入500μL异丙醇，混匀，室温放置10min；

5）12000×g离心15min，去上清，加入1000μL75%乙醇，12000×g离心15min，去上清；

6）在超净台内自然干燥10min后加入20μL DEPC水溶解，即为待检RNA，-20℃保持备用，得到编号为C20120314、C20120402、C20120427、C20120509、C20120617的待检RNA。

2、禽肺炎病毒LAMP试剂盒对临床样品的检测

分别以上述编号为C20120314、C20120402、C20120427、C20120509、C20120617的待检RNA为模板，按照实施例2步骤二的LAMP反应体系和LAMP反应程序进行反应。以MN2a株的RNA为阳性对照，以正常鸡肺组织的RNA为阴性对照。

结果如图4所示，图中1为MN2a株阳性对照；2为C20120314鸡肺样品；3为C20120402鸡肺样品；4为C20120427鸡肺样品；5为C20120509鸡肺样品；6为C20120617鸡肺样品；7为阴性对照；通过肉眼在日光下直接观察结果，1-2为阳性，3-7为阴性，说明C20120314的鸡肺样品中含有禽肺炎病毒。

同时按照实施例3中步骤3的RT-PCR对C20120314、C20120402、C20120427、C20120509、C20120617鸡肺样品的待检RNA进行验证，结果编号为C20120314鸡肺样品的RNA得到424bp的PCR产物（经过测序，为禽肺炎病毒MN2a株F基因genbank号为AF187154的第753-1176），而编号为C20120402鸡肺样品的RNA、C20120427鸡肺样品的RNA、C20120509鸡肺样品的RNA、C20120617鸡肺样品的RNA没有该大小的目的片段。

上述结果表明，本发明所提供的LAMP试剂盒可准确检出禽肺炎病毒。

Claims (10)

1.检测禽肺炎病毒的环介导等温基因扩增引物组，其特征在于：所述引物组中包括引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6；

所述引物1的核苷酸序列如序列表序列1所示；

所述引物2的核苷酸序列如序列表序列2所示；

所述引物3的核苷酸序列如序列表序列3所示；

所述引物4的核苷酸序列如序列表序列4所示；

所述引物5的核苷酸序列如序列表序列5所示；

所述引物6的核苷酸序列如序列表序列6所示。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为（15-17）:（15-17）:（7.5-8.5）:（7.5-8.5）:（7.5-8.5）:（7.5-8.5）。

3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为16:16:8:8:8:8。

4.检测禽肺炎病毒的环介导等温基因扩增试剂，其特征在于：所述试剂由权利要求1或2所述的引物组、链置换DNA聚合酶、环介导等温基因扩增缓冲液、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱、钙黄绿素、氯化锰和水组成。

5.根据权利要求4所述的环介导等温基因扩增试剂，其特征在于：

所述引物组中的所述引物1在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为15μmol/μL—17μmol/μL；

所述引物组中的所述引物2在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为15μmol/μL—17μmol/μL；

所述引物组中的所述引物3在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为7.5μmol/μL—8.5μmol/μL；

所述引物组中的所述引物4在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为7.5μmol/μL—8.5μmol/μL；

所述引物组中的所述引物5在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为7.5μmol/μL—8.5μmol/μL；

所述引物组中的所述引物6在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为7.5μmol/μL—8.5μmol/μL。

6.根据权利要求5所述的环介导等温基因扩增试剂，其特征在于：

所述引物组中的所述引物1在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为16μmol/μL；

所述引物组中的所述引物2在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为16μmol/μL；

所述引物组中的所述引物3在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为8μmol/μL；

所述引物组中的所述引物4在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为8μmol/μL；

所述引物组中的所述引物5在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为8μmol/μL；

所述引物组中的所述引物6在所述环介导等温基因扩增试剂中的终浓度为8μmol/μL。

7.根据权利要求4-6中任一所述的环介导等温基因扩增试剂，其特征在于：所述试剂中的所述链置换DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱、钙黄绿素和氯化锰的终浓度分别为0.32U/μL、1.4mmol/L、2mmol/L、1mol/L、25μmol/L、0.5mmol/L。

8.检测禽肺炎病毒的环介导等温基因扩增试剂盒，包括权利要求1-3中任一所述的引物组或权利要求4-7中任一所述环介导等温基因扩增试剂。

9.权利要求1-3中任一所述的引物组或权利要求4-7中任一所述环介导等温基因扩增试剂或权利要求8所述环介导等温基因扩增试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有禽肺炎病毒产品中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于：所述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有禽肺炎病毒包括用权利要求1-3中任一所述的引物组或权利要求4-7中任一所述环介导等温基因扩增试剂或权利要求8所述环介导等温基因扩增试剂盒对所述待测样品进行环介导等温基因扩增反应的步骤。

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