CN103243181B - 甲型h7n9流感病毒检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
甲型h7n9流感病毒检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103243181B CN103243181B CN201310176109.6A CN201310176109A CN103243181B CN 103243181 B CN103243181 B CN 103243181B CN 201310176109 A CN201310176109 A CN 201310176109A CN 103243181 B CN103243181 B CN 103243181B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- influenza virus
- rnasep
- detection
- virus
- type
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
本发明公开了一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒及检测方法，是分别选取H7N9禽流感病毒MP、HA、NA、NP基因设计特异性引物和探针，在样本RNA核酸纯化之后采用荧光RT-PCR技术对病毒RNA进行定性检测，以达到对流感病毒的确认、初步分型以及是否H7N9型的最终确定。本发明的试剂盒以及其检测方法，操作简单，出结果快，检测结果准确，为甲型H7N9禽流感病毒快速检测提供了可行手段，具有积极的社会价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种H7N9病毒的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
2013年3-4月份，我国华东多地突发人感染禽流感疫情，多人致死，并逐渐扩散传播到多地。截至5月1日，已确诊H7N9禽流感病例127例，26人死亡，涉及北京、上海、江苏、浙江、安徽、江西、湖南、山东、福建和河南等省市。研究证实，该次疫情的致病源是一种新型的基因重组H7N9型禽流感病毒。目前均为散发病例，尚未发现病例间有流行病学关联。传染源目前尚不明确，根据以往经验及本次病例流行病学调查，推测可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类及其分泌物或排泄物。病毒经呼吸道传播，也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被感染。现尚无人与人之间传播的确切证据。
甲型H7N9流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属，病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。禽流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。可感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3，此次报道的为人感染H7N9禽流感病毒。该病毒为新型重配病毒，其内部基因来自于H9N2禽流感病毒。该病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因分别为H7，N9型，但其他基因片段与H9N2流感病毒同源。
此次人感染H7N9禽流感，目前尚无确切证据显示人类对H7N9禽流感病毒易感。现有确诊病例均为成人。根据流感的潜伏期及现有H7N9禽流感病毒感染病例的调查结果，潜伏期一般为7天以内。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。
综上，亟需能够实现快速、有效且准确检测H7N9禽流感病毒的产品，以用于人感染H7N9禽流感疫情的防控和流行病学调查。流感病毒检测的“金标准”是病毒培养，但病毒培养操作复杂，实验室硬件要求高，周期长，阳性率低，限制了其应用。目前尚无成型的快速检测试剂盒，本文描述了一种H7N9病毒快速检测试剂盒。该试剂盒采用一步荧光RT-PCR方法，可对鼻咽或口咽洗液或拭子、支气管肺泡灌洗液、气管抽吸物、痰或胸水样本中甲型H7N9禽流感病毒(2013)RNA进行定性检测，可用于临床对甲型H7N9禽流感病毒(2013)感染的辅助诊断及药物治疗效果的监测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒及检测方法，以实现快速检测该病毒。
本发明提供的一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒，是对甲型H7N9流感病毒MP、HA、NA、NP基因设计特异性引物和探针，在样本RNA核酸纯化之后采用荧光PCR对病毒RNA进行检测，以达到对流感病毒的确认、初步分型以及是否H7N9型的最终确定。该试剂盒包括特异性引物和探针，所用引物和探针核苷酸序列分别如下：
甲型流感病毒通用型检测体系(5’-3’)：
Infa-F1(W)：CGATCCTGTCACCTCTGACTAAG，
Infa-R1(W)：AGGGCATTTTGGCAAAGC，
Infa-FP1(W)：FAM-TGCCCAGTGAGCGAGGACTGC-BHQ1，
RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，
RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，
RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1；
H7检测体系：
rH7(S)-F5：CATTCCGACAAATGCAGACAA，
rH7(S)-R5：CACTCCTCTTTCAGTTAATGTGTTTACTTT，
rH7(S)-FP5：FAM-ATCTGCCTCGGACATCATGCTGTGTC-BHQ1，
RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，
RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，
RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1；
N9检测体系：
rH7N9(S)-F5：CAGAAGGCCTGTTGCAGAAAT，
rH7N9(S)-R5：TGGCAYACACATTCAGATTCCT，
rH7N9(S)-FP5：FAM-AACACATGGGCCCGAAACATACTAAGAACA-BHQ1，
RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，
RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，
RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1；
NP(2013)检测体系：
H7N9(NP)-F1：GAGGGAACACCAACCAACAGA，
H7N9(NP)-R1：GCCATAATGGTTGCTCTTTCG，
H7N9(NP)-FP1：FAM-CAGGTCAGCGTTCAACCCACTTTCTCAG-BHQ1，
RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，
RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，
RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1。
所述试剂盒的统一浓度和1人份测试用量统一标准为：
Infa-F1(W) 10pmoL/μL 1.5μL，
Infa-R1(W) 10pmoL/μL 1.5μL，
Infa-FP1(W) 2.5pmoL/μL 1.5μL，
rH7(S)-F5 10pmoL/μL 1.0μL，
rH7(S)-R5 10pmoL/μL 1.0μL，
rH7(S)-FP5 2.5pmoL/μL 1.5μL，
rH7N9(S)-F5 10pmoL/μL 2.0μL，
rH7N9(S)-R5 10pmoL/μL 2.0μL，
rH7N9(S)-FP5 2.5pmoL/μL 2.0μL，
H7N9(NP)-F1 10pmoL/μL 1.5μL，
H7N9(NP)-R1 10pmoL/μL 1.5μL，
H7N9(NP)-FP1 2.5pmoL/μL 1.5μL，
RnaseP-F1 10pmoL/μL 0.5μL，
RnaseP-R 10pmoL/μL 0.5μL，
RnaseP-FP1 2.5pmoL/μL 0.5μL。
采用上述试剂盒的检测方法为：
(6)取样本：取鼻咽或口咽洗液或拭子、支气管肺泡灌洗液、气管抽吸物、痰或胸水；
(7)样本处理：利用商品化的病毒RNA提取试剂盒处理样本和H7N9阳性质控品，根据提取试剂盒的要求，吸取待检样本至离心管，震荡混匀后进行提取操作；
(8)体系配制：引物和探针由焦碳酸二乙酯水溶解至所需浓度；
(9)检测：利用荧光定量PCR仪上机检测：
(10)结果判定：
A、对于InfA结果为阳性，H7、N9和NP结果均为阴性，判定为甲型流感病毒非H7N9型；
B、对于InfA、H7和N9结果为阳性，NP结果为阴性，判定为甲型流感病毒H7N9型；
C、对于InfA、H7、N9和NP结果均为阳性，判定为甲型流感病毒H7N9(2013)，即2013年人感染H7N9型禽流感病毒。
本发明提供了一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒和检测方法，是分别选取H7N9禽流感病毒MP、HA、NA、NP基因设计特异性引物和探针，在样本RNA核酸纯化之后采用荧光PCR对病毒RNA进行检测，以达到对流感病毒的确认、初步分型以及是否H7N9型的最终确定。本发明采用一步法RT-PCR技术与Taqman荧光探针技术相结合，病毒RNA模板首先反转录为cDNA，然后在Taq酶的作用下对靶区域进行扩增，同时利用Taqman荧光探针技术实时监测扩增产物的累积。Taqman探针带有一个荧光发光基团和一个荧光淬灭基团，完整的探针在特定光源激发下，发光基团所产生的荧光被淬灭基团全部吸收，样品无荧光。PCR过程中，Taq酶在延伸DNA链的同时，可通过自身的5’→3’核酸外切酶活性降解与模板结合的特异性荧光探针，使荧光报告基团与淬灭基团分离，分离后的荧光报告基团在特定光源激发下产生荧光。通过监测整个PCR过程荧光信号的变化，对未知模板进行定性分析。同时本发明采用人源化内标质控体系，用于监测反应体系可能存在的抑制因素。内标选择人源化的基因，针对人核糖核酸酶P(RNase P)设计的引物探针，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突的另一检测通道。本发明的试剂盒以及其检测方法，操作简单，出结果快，120分钟可以出结果，检测结果准确，为甲型H7N9流感病毒快速检测提供了可行手段，具有积极的社会价值。
附图说明
图1为2013H7N9型禽流感病毒样本检测结果；
图2为非2013H7N9型禽流感病毒样本检测结果；
图3为甲型H7N2型流感病毒样本检测结果；
图4为甲型H1N1(2009)流感病毒，甲型H3N2流感病毒，季节性H1N1流感病毒样本，以及乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，副流感病毒，腺病毒，冠状病毒，肠道病毒EV71/CA16样本的检测结果；
图5为试剂盒灵敏度评估(仅显示NP基因扩增曲线)。
具体实施方式
下面对本发明的试剂盒和检测方法作进一步说明。
实施例1
试剂盒包括四个指标，即一个样本含四管检测，其引物和探针的浓度，体积以及核苷酸序列如下：
1、体系(1)：甲型流感病毒通用型检测
甲型流感病毒通用型检测引物和探针具体组成如表1
表1通用型检测引物及探针浓度和体积
| 依次加入 | 加入成份 | 1人份测试用量 |
| ① | Infa-F1(W)(10pmoL/μL) | 1.5μL |
| ② | Infa-R1(W)(10pmoL/μL) | 1.5μL |
| ③ | Infa-FP1(W)(2.5pmoL/μL) | 1.5μL |
| ④ | RnaseP-F1(10pmoL/μL) | 0.5μL |
| ⑤ | RnaseP-R1(10pmoL/μL) | 0.5μL |
| ⑥ | RnaseP-FP1(2.5pmoL/μL) | 0.5μL |
序列
表2通用型检测体系病毒靶基因引物、探针核苷酸序列
| Infa-F1(W) | CGATCCTGTCACCTCTGACTAAG |
| Infa-R1(W) | AGGGCATTTTGGCAAAGC |
| Infa-FP1(W) | FAM-TGCCCAGTGAGCGAGGACTGC-BHQ1 |
通用型检测体系内标基因引物、探针的核苷酸序列为：
RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC
RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA
RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1
引物和探针委托生工生物工程(上海)有限公司合成及纯化。引物和探针由焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate，DEPC)水溶解至上述浓度。单个反应体系25μl，其中包括SuperScriptIII Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System(购自美国Invitrogen公司)12.5μl，SuperScript III Platinum RT/Platinum Taq Mix0.5μl，引物、探针体积、浓度如表1，DEPC水补齐至25μl，样本核酸洗脱液5.0μl。
2、体系(2)：H7检测体系
H7检测体系引物及探针浓度和体积见表3
表3H7检测体系引物及探针浓度和体积
| 依次加入 | 加入成份 | 1人份测试用量 |
| ① | rH7(S)-F5(10pmoL/μL) | 1.0μL |
| ② | rH7(S)-R5(10pmoL/μL) | 1.0μL |
| ③ | rH7(S)-FP5(2.5pmoL/μL) | 1.5μL |
| ④ | RnaseP-F1(10pmoL/μL) | 0.5μL |
| ⑤ | RnaseP-R1(10pmoL/μL) | 0.5μL |
| ⑥ | RnaseP-FP1(2.5pmoL/μL) | 0.5μL |
H7检测体系引物核苷酸序列如表4所示。
表4H7检测体系病毒靶基因引物、探针核苷酸序列
| rH7(S)-F5 | CATTCCGACAAATGCAGACAA |
| rH7(S)-R5 | CACTCCTCTTTCAGTTAATGTGTTTACTTT |
| rH7(S)-FP5 | FAM-ATCTGCCTCGGACATCATGCTGTGTC-BHQ1 |
H7检测体系内标基因引物、探针核苷酸序列
RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC
RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA
RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1
引物和探针委托生工生物工程(上海)有限公司合成及纯化。引物和探针由焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate，DEPC)水溶解至上述浓度。单个反应体系25μl，其中包括SuperScriptIII Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System(购自美国Invitrogen公司)12.5μl，SuperScript III Platinum RT/Platinum Taq Mix0.5μl，引物、探针体积、浓度如上，DEPC水补齐至25μl，样本核酸洗脱液5.0μl。
3、体系(3)：N9检测体系
N9检测体系中的引物浓度及体积见表5
表5N9检测体系引物浓度及体积
表6N9检测体系病毒靶基因引物、探针核苷酸序列
| rH7N9(S)-F5 | CAGAAGGCCTGTTGCAGAAAT |
| rH7N9(S)-R5 | TGGCAYACACATTCAGATTCCT |
| rH7N9(S)-FP5 | FAM-AACACATGGGCCCGAAACATACTAAGAACA-BHQ1 |
N9检测体系内标基因引物、探针核苷酸序列
RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC
RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA
RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1
引物和探针委托生工生物工程(上海)有限公司合成及纯化。引物和探针由焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate，DEPC)水溶解至上述浓度。单个反应体系25μl，其中包括SuperScriptIII Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System(购自美国Invitrogen公司)12.5μl，SuperScript III Platinum RT/Platinum Taq Mix0.5μl，引物、探针体积、浓度如上，DEPC水补齐至25μl，样本核酸洗脱液5.0μl。
4、体系(4)：NP(2013)，即H7N9禽流感病毒(2013)检测体系
NP(2013)检测体系引物及探针浓度和体积见表7
表7NP(2013)检测体系引物及探针浓度和体积
| 依次加入 | 加入成份 | 1人份测试用量 |
| ① | H7N9(NP)-F1(10pmoL/μL) | 1.5μL |
| ② | H7N9(NP)-R1(10pmoL/μL) | 1.5μL |
| ③ | H7N9(NP)-FP1(2.5pmoL/μL) | 1.5μL |
| ④ | RnaseP-F1(10pmoL/μL) | 0.5μL |
| ⑤ | RnaseP-R1(10pmoL/μL) | 0.5μL |
| ⑥ | RnaseP-FP1(2.5pmoL/μL) | 0.5μL |
NP(2013)检测体系病毒靶基因引物、探针核苷酸序列：
H7N9(NP)-F1 GAGGGAACACCAACCAACAGA
H7N9(NP)-R1 GCCATAATGGTTGCTCTTTCG
H7N9(NP)-FP1 FAM-CAGGTCAGCGTTCAACCCACTTTCTCAG-BHQ1
NP(2013)检测体系内标基因引物、探针核苷酸序列：
RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC
RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA
RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1
实施例2应用实施例1的试剂盒检测甲型H7N9流感病毒的方法如下：
1、取样本：
人鼻咽或口咽洗液或拭子、支气管肺泡灌洗液、气管抽吸物、痰、胸水。
2、样本处理：
利用商品化的病毒RNA提取试剂盒处理样本和H7N9阳性质控品。根据提取试剂盒的要求，吸取待检样本至1.5ml离心管(无菌/RNase-Free)，震荡混匀后进行提取操作，具体操作参见该试剂盒说明书。建议使用QIAGen RNeasy Mini Kit RNA提取试剂盒(catalog#74104)。
3、配制反应体系
按实施例1配制反应体系。
4、上机检测
取样本提取液各分别加入四组反应管中，低速离心数秒后，加入ABI7500荧光定量PCR仪中，
根据表8操作条件进行反应。
表8PCR反应条件
样本推荐摆放位置如表9所示。
表9推荐样本摆放位置
| 名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| InfA | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ | ⑥ | ⑦ | ⑧ | ⑨ | ⑩ | STD | NTC |
| H7 | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ | ⑥ | ⑦ | ⑧ | ⑨ | ⑩ | STD | NTC |
| N9 | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ | ⑥ | ⑦ | ⑧ | ⑨ | ⑩ | STD | NTC |
| NP(2013) | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ | ⑥ | ⑦ | ⑧ | ⑨ | ⑩ | STD | NTC |
注：①至⑩代表样本；STD代表阳性质控品，阳性质控品为灭活的病毒培养物；NTC代表阴性质控品
五、结果判定
根据每个反应管结果是阳性还是阴性，按表10进行判断。
表10不同反应结果病毒类型判断标准
实验例
为考察实施例1试剂盒按实施例2的方法进行检测，其特异性和灵敏度，进行如下实验。
实施例(一)
选择2例2013H7N9型禽流感病毒，1例非2013H7N9型禽流感病毒，1例甲型H7N2流感病毒，1例甲型H1N1(2009)流感病毒，1例甲型H3N2流感病毒，1例季节性H1N1流感病毒咽拭子样本进行检测。为了验证检测方法的特异性，收集乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，副流感病毒，腺病毒，冠状病毒，肠道病毒EV71/CA16样本，对该方法的特异性进行验证。
检测方法如上所述，检测结果如下：
(1)2013H7N9型禽流感病毒样本四个检测指标，即MP，HA，NA，NP均为阳性。
(2)非2013H7N9型禽流感病毒样本MP，HA，NA检测阳性，NP检测阴性。
(3)甲型H7N2型流感病毒样本MP，HA检测阳性，NA和NP检测阴性。
(4)甲型H1N1(2009)流感病毒，甲型H3N2流感病毒，季节性H1N1流感病毒样本仅MP检测阳性，HA，NA，NP检测阴性。
(5)乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，副流感病毒，腺病毒，冠状病毒，肠道病毒EV71/CA16样本检测四个指标，即MP，HA，NA，NP均为阴性。
上述检测结果证明了该方法的准确性和特异性。
实施例(二)
取较高浓度2013H7N9型禽流感病毒培养物(灭活后)，将其浓度稀释至如下梯度：5.0×105PFU/mL，2.0×105PFU/mL，2.0×104PFU/mL，2.0×103PFU/mL，1.0×103PFU/mL，1.0×102PFU/mL，然后利用上述方法进行检测。结果5.0×105PFU/mL，2.0×105PFU/mL，2.0×104PFU/mL，2.0×103PFU/mL，1.0×103PFU/mL浓度样本四个基因指标检测均为阳性，1.0×102PFU/mL浓度样本检测阴性。所以该方法的最低检出限为1.0×103PFU/mL。
图1为2013H7N9型禽流感病毒样本检测结果，图中左边4条S型曲线与右边四条S型曲线分别代表2例2013H7N9型禽流感病毒样本的MP，HA，NA，NP基因检测结果。平直线为阴性质控的检测结果，显示无扩增。
图2为非2013H7N9型禽流感病毒样本检测结果，图中S型曲线分别代表非2013H7N9禽流感病毒的MP，HA，NA基因检测结果，平直线代表NP基因和阴性质控的检测结果，显示无扩增。。
图3为甲型H7N2型流感病毒样本检测结果，图中S型曲线分别代表M和HA基因检测结果，平直线为NA，NP基因和阴性质控的检测结果，显示无扩增。
图4为甲型H1N1(2009)流感病毒，甲型H3N2流感病毒，季节性H1N1流感病毒样本，以及乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，副流感病毒，腺病毒，冠状病毒，肠道病毒EV71/CA16样本的检测结果。S型曲线分别代表甲型H1N1(2009)流感病毒，甲型H3N2流感病毒，季节性H1N1流感病毒M基因阳性扩增结果，平直线为HA，NA、NP基因和阴性质控，以及乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，副流感病毒，腺病毒，冠状病毒，肠道病毒EV71/CA16样本的检测结果，显示无扩增。
图5为试剂盒灵敏度评估(仅显示NP基因扩增曲线)。将高浓度2013H7N9型禽流感病毒培养物进行稀释，结果5.0×105PFU/mL，2.0×105PFU/mL，2.0×104PFU/mL，2.0×103PFU/mL，1.0×103PFU/mL浓度样本四个基因指标检测均为阳性，1.0×102PFU/mL浓度样本检测阴性。显示该方法的最低检出限为1.0×103PFU/mL。
Claims (2)
1.一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒，包括特异性引物和探针，所用引物和探针核苷酸序列如下：
甲型流感病毒通用型检测体系（5’-3’）：
Infa-F1(W)：CGATCCTGTCACCTCTGACTAAG，
Infa-R1(W)：AGGGCATTTTGGCAAAGC，
Infa-FP1(W)：FAM-TGCCCAGTGAGCGAGGACTGC-BHQ1，
RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，
RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，
RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1；
H7检测体系：
rH7(S)-F5：CATTCCGACAAATGCAGACAA，
rH7(S)-R5：CACTCCTCTTTCAGTTAATGTGTTTACTTT，
rH7(S)-FP5：FAM-ATCTGCCTCGGACATCATGCTGTGTC-BHQ1，
RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，
RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，
RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1；
N9检测体系：
rH7N9(S)-F5：CAGAAGGCCTGTTGCAGAAAT，
rH7N9(S)-R5：TGGCAYACACATTCAGATTCCT，
rH7N9(S)-FP5：FAM-AACACATGGGCCCGAAACATACTAAGAACA-BHQ1，
RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，
RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，
RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1；
NP（2013）检测体系：
H7N9(NP)-F1：GAGGGAACACCAACCAACAGA，
H7N9(NP)-R1：GCCATAATGGTTGCTCTTTCG，
H7N9(NP)-FP1：FAM-CAGGTCAGCGTTCAACCCACTTTCTCAG-BHQ1，
RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，
RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，
RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1。
2.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒的浓度和1人份测试用量标准为：
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310176109.6A CN103243181B (zh) | 2013-05-14 | 2013-05-14 | 甲型h7n9流感病毒检测试剂盒及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310176109.6A CN103243181B (zh) | 2013-05-14 | 2013-05-14 | 甲型h7n9流感病毒检测试剂盒及检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103243181A CN103243181A (zh) | 2013-08-14 |
| CN103243181B true CN103243181B (zh) | 2014-08-27 |
Family
ID=48923057
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310176109.6A Active CN103243181B (zh) | 2013-05-14 | 2013-05-14 | 甲型h7n9流感病毒检测试剂盒及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103243181B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667522A (zh) * | 2013-09-13 | 2014-03-26 | 上海星耀医学科技发展有限公司 | 甲型h7n9流感病毒(2013)核酸检测试剂盒 |
| CN104099430A (zh) * | 2014-08-01 | 2014-10-15 | 中国检验检疫科学研究院 | H7n9亚型禽流感病毒诊断环介导等温扩增试剂盒及使用方法 |
| CN107586776A (zh) * | 2016-07-05 | 2018-01-16 | 上海市计量测试技术研究院 | 适用于h7n9禽流感病毒实时荧光定量pcr检测的质粒标准物质 |
| CN108680743A (zh) * | 2018-05-11 | 2018-10-19 | 合肥安为康医学检验有限公司 | 一种快速检测甲型流感病毒的方法 |
| CN111088397B (zh) * | 2019-12-17 | 2021-08-06 | 中国农业大学 | 一种检测h7n9亚型禽流感病毒基因组包装变异的实时荧光绝对定量rt-pcr方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1814805A (zh) * | 2005-12-01 | 2006-08-09 | 上海交通大学 | H5、h7、h9亚型禽流感病毒的实时荧光定量pcr检测方法 |
| CN1904068A (zh) * | 2006-05-10 | 2007-01-31 | 浙江省疾病预防控制中心 | 一种h5n1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法 |
-
2013
- 2013-05-14 CN CN201310176109.6A patent/CN103243181B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1814805A (zh) * | 2005-12-01 | 2006-08-09 | 上海交通大学 | H5、h7、h9亚型禽流感病毒的实时荧光定量pcr检测方法 |
| CN1904068A (zh) * | 2006-05-10 | 2007-01-31 | 浙江省疾病预防控制中心 | 一种h5n1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103243181A (zh) | 2013-08-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103275862B (zh) | 一种检测甲型流感病毒h7n9亚型的荧光定量rt-pcr试剂盒 | |
| CN103243181B (zh) | 甲型h7n9流感病毒检测试剂盒及检测方法 | |
| Gall et al. | Universal primer set for amplification and sequencing of HA0 cleavage sites of all influenza A viruses | |
| CN111500776A (zh) | 新型冠状病毒2019-nCoV荧光RPA检测引物和探针、试剂盒和方法 | |
| CN102703603B (zh) | 通用型甲型流感病毒(iav)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 | |
| CN103276110A (zh) | 用于快速检测新型h7n9亚型禽流感病毒的多重荧光rt-pcr试剂盒及方法 | |
| CN103276109A (zh) | 禽流感h7n9病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| Li et al. | A two-tube multiplex reverse transcription PCR assay for simultaneous detection of sixteen human respiratory virus types/subtypes | |
| CN103233082B (zh) | 一种利用实时荧光定量pcr检测h7n9禽流感病毒的试剂盒 | |
| Xiao et al. | Simultaneous detection and differentiation of highly virulent and classical Chinese-type isolation of PRRSV by real-time RT-PCR | |
| CN104846121A (zh) | 一种病毒三重荧光定量rt-pcr检测方法及其试剂盒 | |
| CN102071263B (zh) | 禽流感病毒h5亚型套式荧光rt-pcr检测试剂及检测试剂盒 | |
| CN106435036B (zh) | 一种用于检测d型流感病毒的荧光pcr引物和探针及检测方法 | |
| CN103320530B (zh) | 一种h1n1/h5n1型禽流感病毒检测试剂盒及其应用 | |
| Li et al. | Simultaneous detection of eight avian influenza A virus subtypes by multiplex reverse transcription-PCR using a GeXP analyser | |
| CN105603058A (zh) | 一种h7n9亚型禽流感病毒检测试剂盒及其使用方法 | |
| CN110669872A (zh) | H9和h10亚型禽流感病毒三重rt-pcr检测引物组、试剂盒及方法 | |
| WO2023109031A1 (zh) | 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用 | |
| CN103276108A (zh) | 禽流感病毒h7型rt-pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| Sun et al. | Development of a multiplex probe combination-based one-step real-time reverse transcription-PCR for NA subtype typing of avian influenza virus | |
| Teng et al. | Development of a TaqMan MGB RT-PCR for the rapid detection of H3 subtype avian influenza virus circulating in China | |
| CN111004867B (zh) | 一种甲型流感病毒检测引物、探针及其试剂盒 | |
| CN104073571B (zh) | H7n9亚型禽流感病毒双重荧光rt-pcr引物、探针及其检测试剂盒和检测方法 | |
| CN103602756A (zh) | 一种新城疫病毒的检测方法 | |
| CN109628643B (zh) | 一种h5亚型禽流感病毒的快速检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |