CN103667522A - 甲型h7n9流感病毒(2013)核酸检测试剂盒 - Google Patents

甲型h7n9流感病毒(2013)核酸检测试剂盒 Download PDF

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刘涛
夏懿
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Abstract

本试剂盒针对2013年中国区特有H7N9禽流感病毒设计了特异性的引物探针，该试剂盒可以在荧光PCR仪器上面特异性检测2013中国区H7N9禽流感病毒。

Description

甲型H7N9流感病毒(2013)核酸检测试剂盒
技术领域
本发明属于第三类医疗器械-分子诊断领域，涉及一种使用荧光RT-PCR方法，结合FRET荧光探针对2013年甲型H7N9流感病毒进行检测的方法及试剂盒。
背景技术
H7N9型禽流感是用一种新型禽流感，于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现。H7N9型禽流感是全球首次发现的新亚型流感病毒，至2013年4月初尚未有疫苗推出。被该病毒感染均在早期出现发热等症状，至2013年4月尚未证实此类病毒是否具有人传染人的特性。2013年4月经调查，H7N9禽流感病毒基因来自于东亚地区野鸟和中国上海、浙江、江苏鸡群的基因重配。
国家卫生和计划生育委员会发布的人感染H7N9禽流感诊疗方案（2013年第2版）指出，人感染H7N9禽流感潜伏期一般为7天以内。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病 情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39 以上，出现呼吸困难，可伴有咳血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。
核酸检测（nucleic acid testing，NAT）是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称，可在尚未检测到抗原或抗体前，先检测到病毒核酸，其基本步骤包括核酸提取、扩增和检测。也就是常说的基因检测，是通过血液、其他体液或细胞对 DNA进行检测的技术，可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。由于核酸检测是直接检测病原体核酸，具有高敏感，高特异和短检测窗口期等优点，为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。 核酸检测技术已经从定性检测发展到实时荧光定量检测。针对有些临床需要，除能够依据阴阳性判断确证病例以外还可以依据核酸的载量判断感染程度。
检测设备根据国家标准，H7N9禽流感病毒的核酸检测采用的荧光RT-PCR检测需要实时荧光定量PCR仪用于定量检测，或PCR基因扩增仪用于定性检测，以及依据H7N9人感染禽流感的核酸特定序列研制的基于引物和探针的PCR检测试剂盒。
2013年4月2日，国家CDC 已经启动应急程序，将检测H7N9禽流感病毒的核酸检测PCR试剂探针及引物下发至各地方CDC和各个诊断实验室，以保证H7N9的准确诊断。
在此基础上，我们开发了一种检测2013年甲型H7N9流感病毒进行检测的方法及试剂盒，该试剂盒利用RT荧光PCR对2013年甲型H7N9流感病毒进行特异性的检测。
发明内容
1、本发明目的在于提供一种方法和试剂盒，这种试剂盒可以检测特异性的检2013年甲型H7N9流感病毒。
2、本试剂盒提供的方法可以在2管内完成2013年甲型H7N9流感病毒检测，加样后全程闭管检测，不需要开盖检测，极大的降低了实验室污染情况，而且操作简单。
3、本试剂盒引物设计使用MAP引物设计方法，将引物分为三段式引物，其中3~8个次黄嘌呤可以在序列的特定位置。
4、引物设计：引物设计使用MAP三段引物设计方法，其中n代表次黄嘌呤。
SEQ ID NO:1：GAGTCTGCTGCTAGnnnnnCAACAGG  
SEQ ID NO:2：GTCTGAAACCATACCnnnnnAACCATC
SEQ ID NO:3：GRGCTGCAATTGCnnnnnTCACACT
SEQ ID NO:4：CTTCCATTTGGATGTTnnnnnGGTGATGT
5、探针设计：SEQ ID NO:5: GTTCCTGAGATTCCAAAGGGAAGAGGCCTA
SEQ ID NO:6: CCTGAAACAACCAACACAAGCCA
本试剂盒采用单独的非竞争性模板作为内参设计区域，这样可以使引物之间的配合更好，不相互干扰，这种引物设计采取独特的环形引物设计，具体方法为在非竞争引物5’末端增加一段互补序列，成环的tm值要低于退火温度，这样当退火温度以下时。
6、固体反应物制备：
反应体系和固体反应物的制备：每人份反应物包括正向引物每种为0.4μM，负向引物浓度为10μM, 2ul dUTPs (2.5 mM of each dUTP),  5mM MgCl2,1.5U热启动聚合酶，0.2U焦磷酸酶、0.2U UNG酶、10%的海藻糖，1%的甘油，每种荧光探针100nM，以上混合液低温冻干，依据上面的分组，分为A颗粒和B颗粒。
7、阳性对照和阴性对照的制备：
本试剂盒采取人工合成H7N9片段作为阳性对照。用H7N9引物对插入到pMD-T vector中的H7N9基因进行扩增。PCR反应体系为50ul，包含l0x buffer，5.0ul；25mM MgCl2，6.0 ul；l0mM dNTP，0.5ul；l00uM引物混合物，0. 5ul；ddH2O，35. 4ul；UNGase (IU/ul)，0.2ul；TaqDNA聚合酶和RT酶各0.4ul；模板RNA2.0ul，共50ul。
8、提取。常规方法从患者样本获得的RNA，其样本来源包括外周血，患者病变组织，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片、冰冻切片等，包括柱法提取和磁珠提取方法。
9、RT-QPCR反应体系和反应程序：
50℃ 2min
95℃ 2min
95 ℃ 10 s, 60℃ 1min  50 次循环
具体实施方案：中检院测试参考品检测。
样本RNA的提取，本提取方法来自天根生化有限公司DP322中的方法。
每100l液体样品加1 ml RNAtrip，置冰上1-3分钟。RNAtrip Liq (Cat# R1020)产品专门用于液体标本RNA提取。  
2. 将裂解物转移到1.5 ml离心管，置冰上10分钟。优化步骤：如果裂解物含较多的碎片，或提取植物组织，12,000g 4 oC 离心10 分钟，取上层裂解液，弃管底碎片和粘稠DNA。如果提取脂肪组织，12,000g 4 oC 离心10 分钟，小心吸掉最上面的油层，弃去。再取裂解液，弃管底碎片和粘稠DNA。取出的裂解液如带少量油滴不影响提取。  
3.  加入0.2体积的氯仿(0.2ml)，充分颠倒混匀，冰浴5 分钟，溶液分相。有时分相不明显，不影响提取。  
4. 12,000 g 4 ℃离心10分钟，溶液分为两相。RNA在上层水相，下层为有机相，两相界面是一层薄膜其厚度与组织细胞类型和多少有关。小心吸出0.5ml上层水相转移到新离心管。注意：取上清液时应保留0.5-1 mm厚的水相，以免扰
动和吸入下面的碎片和有机相。如果吸入，应将所取的上清液放回管中并重新离心10分钟，再次吸取水相。这一点至关重要，违背此原则容易导致RNA降解和DNA污染。如需同时提取DNA或蛋白质，则保留中间相和下层有机相，向公司索要操作方法。 
5. 加入等体积异丙醇(0.5ml)于上清液充分混匀。冰上孵育10 分钟沉淀RNA。用更低的温度和更长的时间进行沉淀并不必要。如果起始组织细胞的量很少，－20 oC放置一至数小时可沉淀几乎所有的RNA。 
注意：从富含多糖的植物组织或富含糖原的动物肝脏组织提取RNA时，按以下步骤进行：以每1 ml RNAtrip裂解组织，加氯仿后离心得到约0.5 ml上清液计算，分别加入上清液一半体积即0.25 ml 的高盐溶液(0.8 M 柠檬酸钠和1.2 M NaCl)和0.25 ml异丙醇，混匀。执行下面的离心沉淀步骤6。离心后可有效沉淀RNA，但多糖或糖原存留在上清可被弃去。从富含多糖的植物和动物肝脏组织提取RNA时，推荐使用植物RNA分离试剂Plant RNAtrip或Plant RNA Extraction Kit。  
6. 12,000  g，4 oC 离心10分钟。管底可见少许RNA沉淀。注意：如初始组织细胞量少，RNA将附着在管壁，用肉眼几乎难辨沉淀，但不影响实验。如RNA 沉淀量很多并呈胶冻状，通常表明有蛋白污染。应仔细检查操作步骤。  
7. 弃上清。立即加入1 ml 75%乙醇，颠倒混匀数次洗涤沉淀。12,000 g离心5分钟。弃上清，尽量完全吸去管壁上的液体。注意：乙醇洗涤后RNA沉淀容易漂浮，勿倒掉或吸走RNA沉淀。RNA沉淀在75%乙醇中可在4 oC保存一周或在－20 oC保存一年。  
8. 敞开管口空气干燥5-10分钟使残留液体挥发，RNA略微沉淀干燥即可。用50-100 l自备的DEPC处理的高压消毒纯水或TE溶解沉淀。RNA溶液可保存于－70 oC或液氮中。注意：过分干燥将使RNA难以溶解。55 oC加热或反复冻融数次可以助溶。RNA溶液加3倍体积乙醇冻存于－20 oC，用时离心沉淀。
11.制备的样本RNA待用。
第二步：PCR扩增
1      将试剂盒中冻干的PCR固体反应物A，B分别加超纯水10μl，加入DNA模板，加水补足至20ul。
2      反应程序为：
50℃ 2min
95℃ 2min
95 ℃ 10 s, 60℃ 1min  50 次循环
选择FAM通道进行荧光收集。
第三步：结果判断
以高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值。根据FAM通道的Ct值判断反应管结果。
具体判断如下表：
Ct值 反应管结果判断
Ct≤45 阳性
45<Ct<50 检测灰区，建议复检
Ct=50 阴性
注1：若Ct=50时，某些PCR仪软件可能显示为>50、无值或UNDET等。
注2：45<Ct<50为检测灰区，建议重复检测2次，如检测结果至少1次Ct<50且扩增曲线有对数增长期则判断为阳性。否则，判断该管为阴性。
 
5.2 样本结果判断：
反应管Ⅰ 反应管Ⅱ 样本结果判断
阳性 阳性 阳性
阴性 阳性 阴性
阳性 阴性 阴性
阴性 阴性 阴性
结论：本发明所述试剂盒能够快速、准确检测2013年H7N9，对于预防流感具有重大的意义。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  上海星耀医学科技有限公司
       上海复星医药（集团）股份有限公司
       刘,  涛
       夏, 懿
       吴, 大治
 
<120>  甲型H7N9流感病毒(2013)核酸检测试剂盒
 
<130>  甲型H7N9流感病毒(2013)核酸检测试剂盒
 
<160>  22   
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  29
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(27)
<223>  n= Hypoxanthine
 
<400>  1
GAGTCTGCTGCTAGnnnnnCAACAGG                                       27
 
 
<210>  2
<211>  32
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(27)
<223>  n= Hypoxanthine
 
<400>  2
GTCTGAAACCATACCAnnnnnACCATC                                   27
 
 
<210>  3
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<222>  (1)..(25)
<223>  n= Hypoxanthine
<400>  3
TGCAATTGCTCACAnnnnnCTCACA
                                      25
 
<210>  4
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
AAACATCCGAGCTCTnnnnnCTCCA                                      25
 
<210>  5
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<222>  (1)..(29)
<223>  n= Hypoxanthine
<400>  5
GTTCCTGAGATTCCAAAGGGAAGAGGCCTA                                  29
 
 
<210>  6
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
CCTGAAACAACCAACACAAGCCA                                              23
 
 

Claims (2)

1.一种2013年甲型流感H7N9的检测方法和试剂盒，其特征在于使用特别的引物设计方式配合荧光杂交探针以判断结果、以及选择性包括了固体形式存在的1xPCR反应物（由引物混合物、tris-cl、Kcl、MgCl2 、热启动聚合酶、UNG酶、焦磷酸酶和冻干保护剂组成）、其特殊之处在于：
a：特殊的三段式引物，其三段式引物设计及后继的扩增为独创的MAP（多重单链PCR扩增）技术，其序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；
b：特殊的探针，所选取的2个探针具有良好的特异性和保守性，可以精确判断2013年H7N9，探针序列为SEQ ID NO:5~SEQ ID NO.6；
c:  权利要求1中所述的试剂盒，其用途在于特异性的检测中国区2013甲型流感H7N9。
2.权利要求1中的试剂盒，其PCR产物的检测方法除了荧光探针杂交外，还可以是斑点杂交，反向斑点杂交、液相杂交平台。
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