CN103276108A

CN103276108A - 禽流感病毒h7型rt-pcr检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN103276108A
Application number: CN2013101757391A
Authority: CN
Inventors: 夏时畅; 张严峻; 李辉
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2013-05-10
Filing date: 2013-05-10
Publication date: 2013-09-04

Abstract

本发明涉及禽流感病毒H7型RT-PCR检测试剂盒及检测方法。目的是提供的检测试剂盒应具有使用方便、检测准确的特点，提供的方法应具有检测准确性高、检测简单方便的特点。技术方案是：禽流感病毒H7型荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括脱氧三磷酸核苷、MgCl2、RT-PCR缓冲液、禽流感病毒H7基因标准品、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及DNA聚合酶；其特征在于荧光定量RT-PCR检测试剂盒还包括上游引物、下游引物和特异性探针；一种禽流感病毒H7型荧光定量RT-PCR检测方法，按以下步骤进行：（1）提取样品RNA；（2）进行RT-PCR反应；（3）对RT-PCR反应产物进行荧光检测。

Description

禽流感病毒H7型RT-PCR检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及禽流感病毒H7型核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法，可应用于禽流感病毒H7型引起暴发疫情的实验室应急检测。

背景技术

禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。禽甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型（H1～H16）和9个N亚型（N1～N9）。禽甲型流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。以往研究发现可感染人的禽流感病毒亚型为H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3。目前，全球首次发现人感染H7N9禽流感病毒。人感染H7N9禽流感是由H7N9亚型禽流感病毒引起的急性呼吸道传染病。据报道，自2013年2月以来，我国上海市、安徽省、江苏省先后发生不明原因重症肺炎病例，其中确诊人感染H7N9禽流感3例，2例死亡。3例均为散发病例，目前尚未发现3例病例间有流行病学关联。此次报道的为人感染H7N9禽流感病毒。该病毒为新型重配病毒，其内部基因来自于H9N2禽流感病毒。

流行病学调查显示H9N2禽流感病毒的传染源目前尚不明确，根据以往经验及本次病例流行病学调查，推测可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类及其分泌物或排泄物。H7N9禽流感病毒经呼吸道传播，也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被感染，现尚无人与人之间传播的确切证据。根据流感的潜伏期及现有H7N9禽流感病毒感染病例的调查结果，潜伏期一般为7天以内。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。

根据流行病学调查结果发现，H7N9禽流感病毒感染致死率较高，且暂时并没有相应的保护性疫苗可供使用。因此，疾病防控机构强烈需要快速、有效的H7N9禽流感病毒检测方法来加强对禽流感感染疑似病例及相关禽类中的H7N9禽流感病毒检测，从而提高我们对H7N9禽流感病毒感染的防制能力。目前，实验室病原学检测方法主要是病毒分离：从患者呼吸道标本中分离H7N9禽流感病毒。上述检测方法的不足是检测速度尚不能满足要求（通常需要5天左右）；而且操作比较复杂。

发明内容

本发明的目的是提供一种禽流感病毒H7型的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该检测试剂盒应具有使用方便、检测准确的特点。

本发明的另一目的是提供一种禽流感病毒H7型的荧光定量RT-PCR检测方法，该方法应具有检测准确性高、检测简单方便的特点。

本发明采用的技术方案是：

禽流感病毒H7型荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括脱氧三磷酸核苷、MgCl₂、RT-PCR缓冲液、禽流感病毒H7基因标准品、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及DNA聚合酶；其特征在于所述荧光定量RT-PCR检测试剂盒还包括上游引物、下游引物和特异性探针，所述上游引物、下游引物和特异性探针的序列如下：

上游引物H7-FP:5’-CACTGCARAATAGAATACAGATWGAC-3’

下游引物H7-RP:5’-GTGCACYGCATGTTTCCATT-3’

探针特异性H7-P:5’-FAM-TTATGGTTTAGCTTCGGGGCATCATG-BHQ1-3’，其中FAM-为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团；

所述流感病毒H7基因标准品的序列如下：

CAATGCAAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGATACTCTGGTTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCATACTTCTAGCCATTGCAATGGGCCTTGTTTTCATATGTGTGAAGAATGGAAACATGCGGTGCAC。

所述检测试剂盒中各组分的含量是：

一种禽流感病毒H7型荧光定量RT-PCR检测方法，按以下步骤进行：

（1）提取待测样品RNA；

（2）以待测样品RNA为模板，与下列物质混合配制成反应体系进行RT-PCR反应：上游引物、下游引物、特异性探针、RT-PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷、MgCl2、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶、DNA聚合酶；

所述特异性引物和特异性探针序列如下：

上游引物H7-FP:5’-CACTGCARAATAGAATACAGATWGAC-3’

下游引物H7-RP:5’-GTGCACYGCATGTTTCCATT-3’

特异性探针H7-P:5’-FAM-TTATGGTTTAGCTTCGGGGCATCATG-BHQ-3’,其中FAM-为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团；

（3）对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果，若RT-PCR反应产物的荧光检测结果呈阳性，则待测样品含有禽流感H7型病毒。

所述步骤（2）中反应体系的各成分含量如下：

其余是DEPC水，将反应体系补足至25μl。

所述RT-PCR反应条件为50℃30min，95℃5min进行逆转录，然后95℃10s，58℃30s，在58℃进行单点荧光检测，共进行50个循环。

本发明的有益效果是：所提供的检测试剂和方法不但对于禽流感病毒H7型特异性强、灵敏度高（0.1TCID₅₀浓度下即有灵敏反应），而且检测快速（通常只需4-5小时），能够及时满足疾病防控需求；另外，采用一步法检测，步骤简单，操作方便易行。

附图说明

图1是禽流感病毒H7型荧光定量RT-PCR检测特异性评价结果示意图。

纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量RT-PCR扩增的循环数。CT值为达到阈值线所需要的循环数，图中的横线H表示阈值线。A：该体系对甲型H7流感病毒核酸检测扩增结果；B-G：该检测体系对其他病毒（季节性H1N1流感病毒、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H9N2流感病毒）及空白对照的扩增检测结果。

图2是禽流感病毒H7型荧光定量RT-PCR灵敏度检测结果示意图。

纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量RT-PCR扩增的循环数。CT值为达到阈值线所需要的循环数，图中的横线F表示阈值线。图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对1000、100、10、1、0.1TCID₅₀/ml浓度甲型H7流感病毒进行扩增检测的结果。

图3是禽流感病毒H7型荧光定量RT-PCR临床样本检测结果示意图。

纵坐标表示校正荧光强度的对数值，横坐标表示荧光定量RT-PCR扩增的循环数。CT值为达到阈值线所需要的循环数，图中的横线G表示阈值线。图中A、B、D、E、F表示采用本扩增体系对不同临床样本的扩增检测结果；图中A表示采用本扩增体系对甲型H7流感病毒核酸（阳性对照）的扩增结果。

具体实施方式

H7基因是H7N9禽流感病毒的重要抗原基因，可用作该禽流感病毒特异性检测鉴定的靶点。本发明通过基于荧光定量RT-PCR技术，建立针对H7基因的H7N9禽流感病毒快速检测方法。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1材料与方法

病毒株与临床标本：

甲型H1N1、季节性H1N1、甲型H3N1、禽流感H5N1、禽流感H9N1病毒株来源于浙江省疾病预防控制中心分离株。临床样本来源于近期浙江省甲型H7N9病毒爆发疫情疑似患者的咽拭子，样本采集后带冰运送到实验室。

1.2引物与探针

从美国的NCBI基因库上下载了世界各地的禽流感H7型病毒序列。对其进行了同源性比较，在所有禽流感病毒基因组HA基因区设计禽流感H7型病毒特异性引物与特异性探针，序列如下：

上游引物H7-FP:5’-CACTGCARAATAGAATACAGATWGAC-3’

下游引物H7-RP:5’-GTGCACYGCATGTTTCCATT-3’

特异性探针H7-P:5’-FAM-TTATGGTTTAGCTTCGGGGCATCATG-BHQ1-3’

特异性引物和特异性探针委托上海辉睿生物科技有限公司合成。

1.3病毒定量标准与病毒RNA的提取：

以确证患者标本分离的禽流感H7型病毒为标准毒株，用狗肾传代细胞（MDCK）进行病毒效价滴定（1×10³TCID₅₀/ml）后作为参考株。将其稀释至1000、100、10、1、0.1TCID₅₀/ml每个反应管。病毒RNA的提取采用德国QIAGEN公司的Reansy Mini Kit，按试剂盒说明书提取，得到病毒RNA备用。

1.4荧光RT-PCR反应体系和条件的优化：

RT-PCR缓冲液为one step RT-PCR缓冲液；其终浓度为1×，是指缓冲液各组分在反应体系中的终浓度与1×one step RT-PCR缓冲液中各组分的浓度相同；通常采用反应体系1/2体积的2×one stepRT-PCR缓冲液。1×one stepRT-PCR Master Mix缓冲液的组成参见上海辉睿生物科技有限公司的one stepRT-PCR Master Mix，Code：Q40101。

反应体系为25μl，其中RT-PCR缓冲液为2×One Step RT-PCR ReactionBuffer7.5ul，脱氧三磷酸核苷5ul，DNA聚合酶4U，MMLV逆转录酶200U，RNA酶抑制剂20U，上游与下游引物(10μmol/L)各1μl，探针(10μmol/L)0.5μl,模板RNA2-3μl，反应体系中MgCl₂浓度为5mmol/L（净含量为1.25×10^-4mmol），DEPC水补足25μl。反应条件为50℃30min，95℃5min进行逆转录，然后95℃10s，58℃30s，在58℃进行单点荧光检测，共进行50个循环；结果判断：选择荧光检测模式FAM，荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。

体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从0.10～1.00μM，探针浓度从0.10～0.50μM，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值（ΔRn）选择最佳引物和探针浓度，选择最佳引物和探针浓度分别为400nmol/体系、200nmol/体系。

1.5荧光RT-PCR特异性、灵敏度和重复性试验

选择甲型H1N1、季节性H1N1、猪H1N1流感病毒毒株和2009年浙江省爆发疫情确诊患者的咽拭子临床样本，对上述病毒株和样本分别提取核酸，用甲型H1N1流感病毒荧光RT-PCR方法进行检测，验证方法的特异性；对已标定TCID50的甲型流感病毒（1×10³TCID₅₀/ml）稀释后分别提取RNA，平行进行荧光RT-PCR与RT-PCR反应，比较其灵敏度。此外，对每一个浓度的病毒稀释液作5次重复检测，得到的Ct值计算标准差，验证方法的重复性。

2结果

2.1荧光RT-PCR反应体系及条件

反应体系为25μl，其中RT-PCR缓冲液为2×One Step RT-PCR ReactionBuffer7.5ul，脱氧三磷酸核苷5ul，DNA聚合酶4U，MMLV逆转录酶200U，RNA酶抑制剂20U，上游与下游引物(10μmol/L)各1μl，探针(10μmol/L)0.5μl,模板RNA2-3μl，反应体系中MgCl₂浓度为5mmol/L（净含量为1.25×10^-4mmol），DEPC水补足25μl。反应条件为50℃30min，95℃5min进行逆转录，然后95℃10s，58℃30s，在58℃进行单点荧光检测，共进行50个循环；获得最低Ct值和最高荧光强度。

2.2特异性试验

本发明建立的荧光RT-PCR方法对禽流感H7型病毒具有较好的特异性，近期流行的禽流感H7型患者的咽拭子也显示阳性反应。而与其他流感病毒如季节性H1N1、猪H1N1、H3N1、H5N1、H9N1流感病毒等均无交叉反应（见图1）。

2.3灵敏度试验

对禽流感H7型病毒毒株，采用MDCK细胞进行病毒效价测定（100TCID50/ml），将其稀释至1000、100、10、1、0.1TCID₅₀/ml。病毒RNA的提取采用德国QIAGEN公司的Reansy Mini Kit，按试剂盒说明书提取，得到病毒RNA。用荧光RT-PCR方法进行检测，结果荧光RT-PCR方法检测灵敏度达到0.1TCID₅₀（见图2）。

2.4重复性试验

禽流感H7型病毒毒株按10倍梯度稀释成3个不同的浓度，对每一个浓度的样本作5个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.10～0.31之间，具有较好的重复性（表1）。

表1荧光RT-PCR法检测肠道病毒的重复性试验

2.5临床样本的检测

从近期浙江省各地报告的禽流感H7型爆发疫情疑似患者的咽拭子、含漱液共20份临床样本中直接提取病毒RNA，用本发明甲型H7N9病毒荧光RT-PCR方法检测病毒核酸，结果本发明方法检测出H7禽流感病毒核酸阳性14份（如图3所示）。本发明荧光RT-PCR方法用于临床样本检测的验证在4个平行实验室进行，均获得了满意的结果。

序列表

<110>浙江省疾病预防控制中心

<120>禽流感病毒H7型病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法

<160>4

<170>WinBlastv.0.2.0

<210>1

<211>核苷酸26

<212>DNA/PRT

<213>人工序列

<220>

<222>核苷酸序列（1）…（26）

<223>上游引物

<400>1

CACTGCARAATAGAATACAGATWGAC 26

<110>浙江省疾病预防控制中心

<160>4

<170>WinBlastv.0.2.0

<210>2

<211>核苷酸20

<212>DNA/PRT

<213>人工序列

<220>

<222>核苷酸序列（1）…（20）

<223>下游引物

<400>2

GTGCACYGCATGTTTCCATT 20

<110>浙江省疾病预防控制中心

<160>4

<170>WinBlastv.0.2.0

<210>3

<211>核苷酸26

<212>DNA/PRT

<213>人工序列

<220>

<222>核苷酸序列（1）…（26）

<223>特异性探针

<400>3

FAM-TTATGGTTTAGCTTCGGGGCATCATG-BHQ1 26

<110>浙江省疾病预防控制中心

<160>4

<170>WinBlastv.0.2.0

<210>4

<211>核苷酸136

<212>DNA

<213>甲型流感病毒属

<220>

<222>核苷酸序列（1514）…（1670）

<223>目的片段

<400>4

caatgcaaaa tagaatacag attgacccag tcaaactaag cagcggctac aaagatgtga 60

tactctggtt tagcttcggg gcatcatgtt tcatacttct agccattgca atgggccttg 120

ttttcatatg tgtgaagaat ggaaacatgc ggtgcac 157

Claims

1.禽流感病毒H7型荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括脱氧三磷酸核苷、MgCl₂、RT-PCR缓冲液、禽流感病毒H7基因标准品、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及DNA聚合酶；其特征在于所述荧光定量RT-PCR检测试剂盒还包括上游引物、下游引物和特异性探针，所述上游引物、下游引物和特异性探针的序列如下：

上游引物H7-FP:5’-CACTGCARAATAGAATACAGATWGAC-3’

下游引物H7-RP:5’-GTGCACYGCATGTTTCCATT-3’

所述流感病毒H7基因标准品的序列如下：

2.根据权利要求1所述的禽流感病毒H7型荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中各组分的含量是：

3.一种禽流感病毒H7型荧光定量RT-PCR检测方法，按以下步骤进行：

（1）提取待测样品RNA；

所述特异性引物和特异性探针序列如下：

上游引物H7-FP:5’-CACTGCARAATAGAATACAGATWGAC-3’

下游引物H7-RP:5’-GTGCACYGCATGTTTCCATT-3’

4.根据权利要求3所述的禽流感病毒H7型荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中反应体系的各成分含量如下：

其余是DEPC水，将反应体系补足至25μl。

5.根据权利要求4所述的禽流感病毒H7型荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于：所述RT-PCR反应条件为50℃30min，95℃5min进行逆转录，然后95℃10s，58℃30s，在58℃进行单点荧光检测，共进行50个循环。