CN102433396A - 一种检测禽流感病毒h7亚型的液相芯片方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测禽流感病毒H7亚型的液相芯片方法，通过对禽流感病毒H7亚型的HA基因组序列的比对和分析，找出保守区域，设计了禽流感病毒H7亚型的特异性引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示。用上述引物对禽流感病毒RNA进行RT-PCR扩增，同时将探针与微球偶联；RT-PCR扩增产物和偶联到荧光微球上的探针进行分子杂交，通过检测荧光值，建立了检测禽流感病毒H7亚型的液相芯片方法。本发明的检测方法具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点。

Description

一种检测禽流感病毒H7亚型的液相芯片方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用液相芯片的方法检测禽流感病毒H7亚型的方法。

背景技术

高致病性禽流感(HPAI)是世界动物卫生组织(OIE)列出的必报疾病，也是《中国进出境动物检疫规范》中规定的必检疾病。在英国、德国、澳大利亚、维多利亚、巴基斯坦、意大利、荷兰、比利时和美国等许多国家都有H7亚型禽流感暴发的报道。20世纪确定的高致病性禽流感的大暴发主要有12次，其中由H7亚型AIV引起的就有5次，H7亚型AIV不仅能侵袭鸡、鸭等家禽，还能使笼养宠物鸟致病(如H7N1型)，甚至能感染人类。2003年荷兰暴发H7N7禽流感病毒感染人事件，波及比利时和德国，约1000多人的H7抗体出现阳性，89人确诊感染了H7N7病毒，并且首次出现H7N7禽流感病毒致人死亡事件。

禽流感H7亚型检测方法包括传统方法和分子生物学方法，前者如病毒分离和血清学诊断等方法，其缺点是操作繁琐、诊断时间长等，而分子生物学方法如RT-PCR等具有特异、敏感、简便快捷等特点，克服了传统方法的局限性，但不能进行高通量检测，不能满足高通量检疫的要求，更不利于大量通关样品的检疫和疫情暴发时大批量样品的紧急筛查，因而需要建立一套简便、快速、准确的禽流感病毒筛查和检验技术，以满足日常检测的要求。

液相芯片称为微球体悬浮芯片(suspension array，liquid chip)，是基于xMAP(flexible Multi Analyte Profiling)技术的新型生物芯片技术平台，它是在不同荧光编码的微球上进行抗原抗体、酶、底物、配体、受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应，是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。

液相芯片技术平台是既能保证信息质量，又能提供相对高通量的新一代分子诊断技术平台，这个技术平台整合了生物检测，乳胶微球荧光编码，微液体传送系统，激光实时记录，先进电脑软件和数据处理模式等多种先进技术。液相芯片的核心技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色(固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码)。应用时，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入微量待检测标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合。结合的结果可以在瞬间经激光判定后由电脑以数据信息的形式记录下来。因为分子杂交是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。

液相芯片技术平台具有高效性：因为上百种颜色的乳胶微球可以在同一个反应体系内，所以一小份标本(血，或其它体液，组织)可以被用来同时检测上百个生理或病理指标。液相芯片技术平台具有高敏感性：每个乳胶微球上都可以满满地(以共价键牢固结合的方式)包被上抗原、抗体、或核酸。因为探针密度高，产生的信号强，加上使用荧光检测，所以敏感性大大高于任何现有分析、诊断方法，也高于其它芯片法。液相芯片技术平台是一种快速检测方法：因为杂交在悬浮的液相中进行，所以反应需要时间短杂交后常不用清洗就可以直接读数，且检测效率大大高于固相杂交，所用时间从几小时缩短到十几分钟。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测禽流感病毒H7亚型的液相芯片方法；本发明的目的还在于提供一种检测禽流感病毒H7亚型的液相芯片试剂盒。

为实现上述目的，通过从GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中收集禽流感病毒H7亚型的HA基因序列，利用Bioedit分子生物学分析软件对大量收集的序列进行分析比较，筛选禽流感病毒H7亚型特异性保守序列。在对序列分析的基础上，根据筛选的H7亚型的保守序列，参照GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中发表的禽流感病毒H7亚型HA基因组序列(登录号：AY831668)，应用DNAStar、Bioedit、Primer5.0和OMIGA软件分别对其进行初步分析筛选，设计了禽流感病毒H7亚型的特异性引物和探针，分别对引物进行生物素标记，对探针进行氨基修饰。

本发明提供的用液相芯片检测禽流感病毒H7亚型的引物，其核苷酸序列为：

H7-FP：5’-ATCAACAGTCCTTTGTACCGAGTC-3’，

H7-RP：5’-CTTGCACGGTCTGGAGCT-3’，在H7-RP引物的5’端用生物素标记。

本发明提供了一种用液相芯片检测禽流感病毒H7亚型的探针，其核苷酸序列为：5’-CAATAGCAGAGCAGTAGGAAAATGT-3’，在其5’端用氨基修饰。

本发明提供了一种液相芯片，是特异性检测探针与荧光标记微球偶联制成的特异性检测微球，该特异性检测探针为：

5’-CAATAGCAGAGCAGTAGGAAAATGT-3’，在其5’端用氨基修饰。

本发明提供了一种用液相芯片检测禽流感病毒H7亚型的方法，其特征在于，用上述引物，对样品RNA进行RT-PCR反应，RT-PCR产物与偶联在荧光微球上的探针分子杂交后，检测荧光值，确定样品中是否含有禽流感病毒H7亚型。

具体地，包括下列步骤：

1)提取样本中禽流感病毒RNA；

2)以步骤1)提取的样本RNA为模板，以上述引物(H7-FP和H7-RP)进行RT-PCR反应；

3)将上述氨基修饰的探针与荧光标记微球偶联；

4)杂交：将带有生物素标记的步骤2)中的RT-PCR产物与步骤3)中偶联到荧光微球上的探针在PCR仪上杂交；

5)检测荧光值，以平均荧光值大于100且为阴性对照3倍以上荧光值所对应的检测标本为阳性。

其中，步骤2)的RT-PCR反应50μL反应体系为：

RT-PCR反应条件为：

其中步骤3)中每1.25×10⁶个荧光微球加入浓度为0.1nmol/μL的特异性探针4μL。

其中步骤4)采用以下方法进行杂交：杂交体系为50μL，其中微球33μL，步骤2)中的RT-PCR产物为5μL，加入TE补充体积至50μL；杂交条件为：95℃变性5min后，50℃杂交30min。

本发明提供了一种试剂盒，含有特异性检测探针，其为：

5’-CAATAGCAGAGCAGTAGGAAAATGT-3’，在其5’端用氨基修饰。

本发明提供了一种试剂盒，含有生物素修饰的特异性引物、偶联到荧光微球上的特异性检测探针，该特异性检测探针为：

NH₂-CAATAGCAGAGCAGTAGGAAAATGT。

本发明提供了上述液相芯片及试剂盒在检测禽流感病毒H7亚型上的应用。

本发明提供了用于检测禽流感病毒H7亚型的生物素标记引物和特异性探针，利用该引物和探针建立一种检测禽流感病毒H7亚型的液相芯片方法，该方法具有速度快，操作简单、敏感性高、特异性好等优点，适合于临床标本中禽流感病毒H7亚型的检测。

附图说明

图1为H7亚型HA基因PCR扩增电泳结果，其中泳道1-3分别为禽流感病毒H7亚型阳性对照，阳性样品和阴性对照，M为DL2000DNA Marker；

图2为样品检测柱状图，其中X1-5分别代表感染H7亚型禽流感病毒样品RNA；

图3为普通RT-PCR方法对禽流感病毒H7亚型不同浓度模板的HA基因敏感性电泳图，其中M为DL2000 DNA Marker，泳道1-9分别为禽流感病毒H7亚型模板浓度1ng/μL，10^-1ng/μL，10^-1ng/μL，10^-2ng/μL，10^-2ng/μL，10^-3ng/μL，10^-3ng/μL，10^-4ng/μL，10^-4ng/μL，10为阴性对照。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

实施例1探针和引物的设计与修饰

从GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中收集禽流感病毒H7亚型HA基因序列，利用Bioedit分子生物学分析软件对大量收集的序列进行分析比较，根据实验目的筛选禽流感病毒H7亚型特异性保守序列。

在对序列分析的基础上，根据筛选的每个亚型的保守序列，参照GenBank中发表的禽流感病毒H7亚型的HA基因组序列(登录号：AY831668)，应用DNAStar、Bioedit、Primer5.0和OMIGA软件分别对其进行初步分析筛选，寡核苷酸探针设计原则是(1)探针序列应为特异性强和灵敏度高的寡核苷酸，一般25bp左右。(2)探针碱基组成中G+C含量应在40％～60％，超过此范围，非特异性杂交将增加。(3)探针内部应无互补序列区域存在，即不应有远远大于4的碱基反向互补配对序列，否则会形成探针内部发卡结构。(4)探针最好应避免同一碱基的连续出现，大于4bp，如：-GGGGG-。(5)探针与其它已知的各种基因序列进行同源性的比较，若与非靶基因序列有70％以上的同源性或连续8个以上的碱基序列相同，则最好不用。(6)各探针的Tm值最好保持一致，Tm值相差越小越好，最好是最小Tm值与最大Tm值的差值不要超过5℃。

本发明经过反复研究，多次试验，设计了一对禽流感病毒H7亚型的特异性引物以及特异性探针，分别对引物进行生物素标记，对探针进行氨基(NH₂)修饰。引物和探针的序列如下表所示：

表1禽流感病毒H7亚型液相芯片引物和探针

实施例2禽流感病毒RNA的提取和扩增

1、禽流感H7亚型病毒RNA的提取(在农业部动物流感重点开放实验室按照CDC规定标准操作提取RNA)。

参照QIAamp Viral RNA Mini Kit说明书进行，具体步骤如下：

①取140μL禽流感H7亚型病毒尿囊液加到含有560μL BufferAVL(包括carrier RNA)于1.5mL eppendorf管中，涡旋器涡旋15s。

②室温孵育10min，轻轻离心一下。

③取560μL无水乙醇于上述样品中，涡旋、离心。

④取600μL③中的液体加到QIAamp Mini spin column中，8000r/min离心1min，弃滤液。

⑤重复步骤④一次。

⑥加500μL Buffer AW1，8000r/min离心1min，弃滤液和离心管。

⑦加500μL Buffer AW2，14000r/min离心3min，弃滤液和离心管，

将QIAamp Mini spin column置新的离心管中，离心1min。

⑧将QIAamp Mini spin column置新的1.5mL eppendorf管中，加60μLBuffer AVE，室温孵育1min，8000r/min离心1min，-80℃保存。

2、病毒RNA的扩增

参照一步法RT-PCR试剂盒(购自QIAGEN公司)操作说明，修改后进行操作(P1、P2分别为表1中禽流感H7亚型病毒上、下游引物，RNA模板为步骤1中提取获得的禽流感H7亚型病毒RNA)。

反应体系(50μL)如下：

反应条件如下：

反应结束后取5μL扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。预期目的条带为147bp，电泳结果显示泳道1、2扩增条带大小约为150bp，结果见图1，扩增出与预期大小相同的目的条带，测序结果说明，扩增产物序列与预期H7亚型HA基因序列一致，说明本实施例所用的禽流感病毒H7亚型的特异性引物能有效扩增出禽流感H7亚型的目的条带。

实施例3液相芯片检测方法的建立

1、探针与微球偶联

涡旋仪上以最高转速2800rpm的速度悬浮荧光编码微球，然后在超声清洗仪上常温超声微球30s。取50μL(含6.25×10⁵个)微球到离心管中，12000g离心2min。弃上清，用10μL 0.1M pH4.5的MES(2-吗啉乙磺酸)重悬微球，涡旋仪上以最高转速2800rpm涡旋30s，使微球分散。加入2μL实施例1中表1的(0.1nmol/μL)H7-探针。制备新鲜的EDC【1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺】溶液(10mg/mL)，加2μL EDC溶液至微球中，混匀。室温黑暗条件下孵育30min。加入1mL 0.02％Tween 20(吐温-20)，稍微涡旋混匀。12000g离心1-2min。弃上清，用0.1％SDS重悬沉淀40s。12000g离心2min。用20μL pH8.0 TE buffer重悬沉淀。涡旋仪上2800rpm漩涡30s。混合偶联探针的微球于4℃黑暗条件下储存。以上步骤所需体积如下表：

表2探针微球偶联用量表(μL)

2、扩增产物的液相杂交

在标准PCR管中，加入33μL实施例3制得的微球的混合物。在每个管中分别加入PCR产物5μL，加入TE补充至50μL。反复吸打每个管，充分混匀。在PCR仪上杂交，杂交条件：95℃变性5min，50℃杂交30min。

准备新鲜制备的用1×TMAC溶解的3μg/mL的SAPE(3mL1×TMAC，9μL 1mg/mL的SAPE)。需要事先把滤板(96孔可拆卸酶标板)预热到退火温度。把样品加入到滤板中(96孔可拆卸酶标板每8个孔为一列，每孔分别为A、B、C、D、E、F、G、H，每个样品重复一次，以A1、A2表示，即两孔加的样是一样的。以此类推)。加入100μL SAPE(链霉亲和素藻红蛋白，避光)到每个孔中，反复吸打混匀。50℃烘箱中孵育5min。使用Bio-Plex 200悬浮芯片系统分析荧光值：以平均荧光值大于100且数值为空白对照3倍以上为阳性判断标准。

检测荧光值所使用的仪器是Bio-Plex 200悬浮芯片系统，参数设置为每region为100个微球，gate value设定为5000～25000。

禽流感H7亚型液相芯片杂交结果见图2，表3。可知空白对照(B)的荧光值较小，而H7亚型样品的荧光值都大于100，且数值均为空白对照荧光值3倍以上，说明禽流感H7亚型液相芯片检测方法能有效的检测出H7亚型禽流感病毒。

表3禽流感H7亚型液相芯片杂交结果

分析项	类型	孔	荧光值	标准差	变异系数％
						H7a(34)	B	A1，A2	100.8	2.47	2.46

H7a(34)	C1	A3，A4	206.3	34.29	6.63
						H7a(34)	X1	B1，B2	4954	99.7	2.01
H7a(34)	X2	C1，C2	5328.5	42.75	8.12
						H7a(34)	X3	D1，D2	5717.8	75.34	3.56
H7a(34)	X4	E1，E2	6219.5	82.43	2.93
						H7a(34)	X5	F1，F2	5992.8	12.37	0.21

注：B：空白对照；C1：阴性对照；X1-X5：检测样品。H7a(34)：34号荧光微球偶联H7探针

实施例4本发明方法的特性检测

1、特异性试验结果

采用本研究建立的液相芯片检测方法分别对购自中国兽医药品监察所的禽传染性支气管炎病毒(IBV)AV10、禽呼肠孤病毒(ARV)AV2311CEK3、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)等常见病毒核酸进行检测，禽流感AIV H5N1、H7N1、H9N2亚型验证毒株进行液相芯片杂交检测，H7病毒核酸为阳性对照，B为空白对照，每个样品重复3次。结果如表所示，IBV、ARV、IBDV、NDV、AIV H5N1、AIVH9N2等病原的液相芯片检测结果荧光值与空白对照差异不大，小于空白对照荧光值的3倍，表明检测结果均为阴性，而AIV H7亚型病毒的荧光值均大于100，并且大于空白对照荧光值的3倍；AIV H7亚型探针与扩增产物无交叉。表明该液相芯片方法与禽类常见病毒和禽流感其他亚型无交叉反应，具有良好的特异性

表4液相芯片特异性试验结果(H7探针：34号微球)

病毒种类	荧光值	变异系数％
			B(空白对照)	52.0	7.2
IBV	21.9	7.4
			ARV	21.1	2.8
IBDV	12.2	2.2

NDV	23.2	8.8
			H5	104.2	9.4
H7	2952.5	5.1
			H9	44.3	9.8

2、灵敏度试验结果

提取H7亚型禽流感病毒RNA，用H7引物扩增后，采用常规方法制备含有H7亚型HA基因的质粒DNA，测定浓度后对其进行10倍系列稀释，采用本研究建立的液相芯片方法进行敏感性检测。

电泳检测结果见图3，RT-PCR方法可见最低可检测到10^-3ng/μL的病毒量，而液相芯片最低可检测到10^-6ng/μL，荧光值为297，大于100，并且大于空白对照荧光值(58)的3倍。说明本发明建立的液相芯片方法检测禽流感病毒H7亚型具有很高的灵敏度。

表5禽流感H7亚型灵敏度杂交结果

分析项	类型	孔	荧光值	标准差	变异系数％
						H7(34)	B	A1，A2	58	1.41	6.8
H7(34)	C1	B1，B2	46	2.82	9.2
						H7(34)	X1	C1，C2	208735.1	56.26	4.9
H7(34)	X2	D1，D2	30950.7	21.67	3.7
						H7(34)	X3	E1，E2	9857.6	19.28	5.0
H7(34)	X4	F1，F2	4927.3	21.03	5.9
						H7(34)	X5	G1，G2	1988.2	19.64	7.9
H7(34)	X6	H1，H2	1096.8	7.70	7.5
						H7(34)	X7	A3，A4	297.0	5.34	6.3
H7(34)	X8	B3，B4	93.5	5.03	5.7
						H7(34)	X9	C3，C4	67.2	8.31	9.6

注：C1为阴性对照，X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8，X9对应模板浓度1ng/μL，10^-1ng/μL，10^-2ng/μL，10^-3ng/μL，10^-4ng/μL，10^-5ng/μL，10^-6ng/μL，10^-7ng/μL，10^-8ng/μL

实施例5用本发明方法对实际标本进行大通量检测

用禽流感病毒H7亚型液相芯片检测方法对临床采集的41份田间样品进行检测，结果见表6，其中检测得到阳性样品10份，阴性样品31份。

表6禽流感病毒H7亚型液相芯片检测结果

编号	荧光值	结果	编号	荧光值	结果	编号	荧光值	结果	编号	荧光值	结果
												B	50.2
PC	3159.5	+	9	582.8	+	20	319.3	+	31	918.3	+
												NC1	52.6	-	10	63.5	-	21	59.5	-	32	51.9	-
NC2	37.2	-	11	49.8	-	22	43.7	-	33	34.3	-
												1	1437.8	+	12	74.2	-	23	1109.5	+	34	48.0	-
2	92.1	-	13	82.8	-	24	96.4	-	35	80.1	-
												3	39.9	-	14	52.5	-	25	1203.5	+	36	1151.8	+
4	28.3	-	15	49.9	-	26	90.8	-	37	31.8	-
												5	25.8	-	16	33.0	-	27	59.5	-	38	55.5	-
6	3155.5	+	17	72.5	-	28	110.9	-	39	91.8	-
												7	3159.5	+	18	92.5	-	29	91.8	-	40	61.8	-
8	2225.8	+	19	122.5	-	30	37.8	-	41	73.9	-

B空白对照，PC阳性对照，NC1和NC2为阴性对照。

采用传统的病毒分离方法同时对临床采集的41份田间样品进行检测。检测结果得到10份阳性样品，31份阴性样品，且检测的10份阳性样品与本发明建立的液相芯片方法检测得到10份阳性样品一致。说明本发明建立的液相芯片检测禽流感病毒H7亚型的方法准确、可靠，且操作简便。

Claims (10)

1.一种用液相芯片检测禽流感病毒H7亚型的引物，其核苷酸序列为：

H7-FP：5’-ATCAACAGTCCTTTGTACCGAGTC-3’，

H7-RP：5’-CTTGCA CGGTCTGGAGCT-3’，在H7-RP引物的5’端用生物素标记。

2.一种用液相芯片检测禽流感病毒H7亚型的探针，其核苷酸序列为：5’-CAATAGCAGAGCAGTAGGAAAATGT-3’，在其5’端用氨基修饰。

3.一种液相芯片，其特征在于，是权利要求2所述的特异性检测探针与荧光标记微球偶联制成的特异性检测微球。

4.一种用液相芯片检测禽流感病毒H7亚型的方法，其特征在于，用权利要求1所述的引物，对样品RNA进行RT-PCR反应，将带生物素标记的RT-PCR产物与权利要求3所述的液相芯片进行分子杂交后，检测荧光值，确定样品中是否含有禽流感病毒H7亚型。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)提取样本中禽流感病毒RNA；

2)以步骤1)提取的样本RNA为模板，以权利要求1所述的引物进行RT-PCR反应；

3)将权利要求2所述的探针与荧光标记微球偶联；

4)杂交：将带有生物素标记的步骤2)中的RT-PCR产物与步骤3)中的偶联到荧光微球上的探针在PCR仪上杂交；

5)检测荧光值，以平均荧光值大于100且为阴性对照3倍以上荧光值所对应的检测标本为阳性。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)的RT-PCR反应50μL反应体系为：一步法RT-PCR 5×buffer 10.0μL，10mmol/LdNTP 2.0μL，酶混合物2.0μL，RNA酶抑制剂0.5μL，RNA模板5.0μL，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物1.0μL，不含RNA酶的d dH₂O 29.0μL；RT-PCR反应条件为：50℃30min；95℃15min，94℃30s，52℃40s，72℃1min，共35个循环；72℃10min。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其中步骤3)中每1.25×10⁶个荧光微球加入浓度为0.1nmol/μL的特异性探针4μL。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其中步骤4)采用以下方法进行杂交：杂交体系为50μL，其中微球33μL，步骤2)中的RT-PCR产物为5μL，加入TE补充体积至50μL；杂交条件为：95℃变性5min后，50℃杂交30min。

9.一种试剂盒，其特征在于，含有特异性检测探针，其为：

5’-CAATAGCAGAGCAGTAGGAAAATGT-3’，在其5’端用氨基修饰。

10.权利要求3所述的液相芯片和权利要求9所述的试剂盒在检测禽流感病毒H7亚型中的应用。

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