CN109811089A - 一种流感病毒基因片段sers检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种流感病毒基因片段SERS检测试剂盒及其制备方法。本发明还公开了一种流感病毒基因片段SERS检测试剂盒的检测方法。本发明通过测试基片上染料分子的拉曼信号,实现对于禽流感病毒基因片段的特异性、高灵敏检测。对于H7或N9基因片段检测,第一试剂和第四试剂中的Capture链、Replace链和Probe链为针对H7或N9基因片段设计的核苷酸序列不同的DNA链。本发明公开的检测试剂盒制备简单、检测灵敏度高、特异性好,可同时测定甲型流感病毒的H7和N9亚型,在流感病毒检测等领域有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物检测和光谱学检测领域,涉及一种流感病毒基因片段SERS检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
近年来,人感染禽流感时有发生,且引发对人类生命的严重威胁。至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有:H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2和H7N9亚型。其中,2013年3月在人体上首次发现的致死性新禽流感H7N9亚型尤为引人关注。我国是流感的高发区,也是流感病毒易发生变异的地区之一,近年来流感的频频发生,更是直接威胁人类生命。因此,早期、准确地实施流感病毒及其亚型诊断,对明确致病病因,迅速实施抗病毒治疗以减少流感相关的发病率以及流感的社区播散尤为重要。目前,有诸多可用的方法用于流感病毒的检测,包括病毒分离、快速流感诊断试验、核酸扩增检测等。
流感病毒核酸检测是指利用聚合酶链式反应(PCR)或其他类分子生物学方法,以特定的流感病毒基因序列为检测目标,对人咽拭子、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物样本中的流感病毒进行体外定性检测。在实际的应用过程中,例如医学诊断,基因治疗中DNA浓度一般是较低的,因此进行DNA高灵敏度检测有着重要的理论和实际应用的意义。
近些年来,信号放大的检测方法被常常用来进行高灵敏,高选择性地检测低浓度的DNA。其中,杂交链式反应放大技术(HCR),滚环扩增技术(RCA)等应用于检测信号的放大。核酸酶被广泛地用于目标分子的循环放大检测。通常核酸外切酶、核酸内切酶、聚合酶被常用来检测核酸。其中核酸外切酶III(Exo III)不需要一个特定的识别位点,可以逐步从双链DNA的3羟基末端催化去除核苷酸。它对双链DNA的3'端突出末端或单链DNA是不活跃的。
表面增强拉曼散射(SERS)技术被认为是DNA高灵敏度检测的强有力分析手段。SERS光谱用于检测和分析核酸具有诸多优势:SERS光谱具有超高的灵敏度,达到了单分子检测的水平;SERS检测对样品需求量很小,且无需特殊处理;水的拉曼散射非常弱,不会干扰样品的拉曼信号;SERS光谱可直接检测含水样品,适合生物样品检测;拉曼光谱具有分子特异性,提供了大量独特且尖锐的振动带,因此SERS光谱非常适合于多元检测。
发明内容
发明目的:本发明所要解决技术问题是提供了一种流感病毒基因片段SERS检测试剂盒。
本发明还要解决的技术问题是提供了流感病毒基因片段SERS检测试剂盒的制备方法。
本发明还要解决的技术问题是提供了流感病毒基因片段SERS检测试剂盒的检测方法。
本发明以银纳米棒阵列型SERS基片为载体,制备得到用于流感病毒基因片段SERS检测试剂盒,并公开了该类试剂盒用于流感病毒基因片段的快速、联合检测方法,为拓展SERS技术在流感病毒检测中的广泛应用提供技术支持。
技术方案:为了解决现有技术存在的问题,本发明采用以下技术方案:一种流感病毒基因片段SERS检测试剂盒,所述SERS检测试剂盒包括固相SERS基片、第一试剂和第四试剂,所述固相SERS基片是表面沉积有银纳米棒阵列的玻璃片,所述第一试剂包含能与流感病毒基因片段碱基序列完全互补的Replace链,以及能与Replace链部分碱基互补的Capture链,所述Replace链与Capture链的部分核苷酸序列互补杂交形成Replace-Capture双链;所述第四试剂为修饰有染料分子的能与Capture链互补杂交的Probe链。
其中,所述SERS检测试剂盒还包括第二试剂核酸外切酶Ⅲ和第三试剂巯基己醇。
其中,针对所述第二试剂核酸外切酶Ⅲ的浓度为0.05-0.4U/μL,所述第三试剂巯基己醇的浓度为1μM-1mM。
在一些实施方式中,针对检测流感病毒基因不同的片段,第一试剂中Capture链、Replace链,以及第三试剂中的Probe链,它们的核苷酸序列不同。
在一些实施方式中,所述的Capture链、Replace链、Probe链和核酸外切酶III为人工合成。所述核酸外切酶Ⅲ不需要一个特定的识别位点,可以逐步从双链DNA的3'端平末端或3'凹陷末端催化去除核苷酸。它对双链DNA的3'端突出末端或单链DNA是不活跃的。
其中,所述Capture-Replace双链数量多于Target数量,核酸外切酶Ⅲ切割Replace-Target双链中的Replace链并释放Target链,以此实现Target链的循环放大。
本发明通过设计合理的核酸杂交体系,利用Exo III的酶切作用,可实现目标DNA的循环使用,实现信号的放大,进一步提高检测限。
在一些实施方式中,所述的Capture链5'端修饰巯基,Probe链3'端修饰染料分子,所述染料分子为本领域常规的标记染料,包括但不限于ROX、Cy5等染料;
在一些实施方式中,所述固相SERS基片为银纳米棒阵列型基片(根据参考文献中物理真空蒸发沉积方法制备银纳米棒阵列,C.Y.Song,J.L.Abell,Y.P.He,S.H.Murph,Y.P.Cui,Y.P.Zhao.Gold-modified silver nanorod arrays:growth dynamics andimproved SERS properties.Journal of Materials Chemistry,2012,22(3):1150-1159),并在其表面用PDMS膜制备4×10阵列型小孔,孔径4mm,深度1mm。
在一些实施方式中,所述流感病毒基因片段为H7病毒基因片段;和/或N9病毒基因片段。
在一些实施方式中,第一试剂中的Capture链、Replace链为针对H7或N9基因片段设计的核苷酸序列不同的DNA链,Replace链与Capture链的部分核苷酸序列互补杂交形成Replace-Capture双链,加入Target链与Replace-Capture双链中的Replace链互补杂交形成Replace-Target双链,并释放出Capture链。Capture链5'端修饰巯基,可通过S-银键固定到基片表面。
在一些实施方式中,Probe链为针对H7或N9基因片段设计的核苷酸序列不同的DNA链,Probe探针链3'端修饰染料分子,Probe链与Capture链的部分核苷酸序列互补杂交,将修饰染料分子的Probe链捕获到基片上,实现拉曼信号的检测。
在一些实施方式中,所述流感病毒基因片段为H7病毒基因片段时,所述Replace链碱基序列如SEQ ID NO:1所示,所述Capture链碱基序列如SEQ ID NO:2所示;和/或所述流感病毒基因片段为N9病毒基因片段时,所述Replace链的碱基序列如SEQ ID NO:3所示,所述Capture链碱基序列如SEQ ID NO:4所示。
其中,所述流感病毒基因片段为H7病毒基因片段时,所述Probe链的碱基序列如SEQ ID NO:5所示;和/或所述流感病毒基因片段为N9病毒基因片段时,所述Probe链的碱基序列如SEQ ID NO:6所示。
在一些实施方式中,所述的检测对象(Target)分别为H7和N9的基因片段,核苷酸序列如下表所示;所述的Capture链、Replace链、Probe链分别根据检测对象(Target)H7和N9基因片段特殊设计,所述的试剂盒可以同时检测H7和N9基因片段。
在一些优选实施方式中,第二试剂的浓度和用量不同。对于H7病毒基因片段,核酸外切酶Ⅲ浓度为0.05-0.3U/μL,最优为0.1U/μL;对于N9病毒基因片段,核酸外切酶Ⅲ浓度0.2-0.4U/μL,最优为0.3U/μL。当核酸外切酶Ⅲ浓度过低时,酶催化Replace-Target双链不完全,实验Target循环放大效果不明显;当核酸外切酶Ⅲ浓度过高时,酶会将催化除Replace-Target双链之外的Capture单链和Target单链,减少捕获的修饰有染料分子的Probe链数量和减弱Target循环效果。
在一些优选实施方式中,第三试剂的浓度使用不同。对于H7病毒片段,第三试剂巯基己醇的浓度为1-100μM,最优浓度为10μM;对于N9病毒片段,巯基己醇的浓度为10μM-1mM,最优浓度为100μM。当巯基己醇浓度过低时,固相SERS基片封闭不完全,将会有大量Probe链非特异性吸附在基片上,产生过强的非特异性拉曼信号;当巯基己醇浓度过高时,巯基己醇与银结合会取代掉固定在基片上的Capture链,导致特异性捕获的Probe链数量,引起信号减弱。
本发明内容还包括所述的流感病毒基因片段SERS检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
1)固相SERS基片的制备;
2)第一试剂的获得:根据所述流感病毒基因片段设计对应的Replace链,再根据Replace链设计Capture链;
3)第四试剂的获得:根据Capture链设计修饰有染料分子的Probe链。
在一些优选实施方式中,所述固相SERS基片为银纳米棒阵列型基片,根据文献(C.Y.Song,J.L.Abell,Y.P.He,S.H.Murph,Y.P.Cui,Y.P.Zhao.Gold-modified silvernanorod arrays:growth dynamics and improved SERS properties.Journal ofMaterials Chemistry,2012,22(3):1150-1159.)方法制备,基片表面覆盖一层开有阵列型4×10小孔的PDMS膜。
其中,所述Capture链和Replace链浓度相同,浓度为1~10μM,在一些优选实施方式中,浓度为1-2μM。当Capture链和Replace链浓度过低时,无足够的Capture-Replace双链与target链反应,会影响Target的循环放大效果以及基片上Capture链的修饰密度,进而导致被捕获的Probe链减少,减低SERS信号灵敏度;当Capture链和Replace链浓度过高时,Target加入并通过核酸外切酶通过酶切循环放大后,仍有过多的Captur-Replace双链存在于溶液中,当于基片共培养后,Replace-Capture双链与Capture单链会共同结合到基片上,因只有Capture单链能够与Probe链杂交,因而影响杂交捕获的Probe链数量,导致SERS检测信号灵敏度低。
其中,所述Probe链的浓度为1~10μM,在一些优选实施方式中,浓度为1-2μM。所设计的Probe链浓度与第一试剂中的Capture链和Replace链浓度相同,确保足够Probe链能够与Capture单链结合。
本发明内容还包括一种流感病毒基因片段SERS检测试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
1)用纯水多次清洗试剂盒中的固相SERS基片,并在其表面用PDMS膜制备4×10阵列型小孔,孔径4mm,深度1mm;
2)向试剂盒的第一试剂中加入检测样品共培养;
3)向步骤2)中加入第二试剂;
4)将步骤1)得到的固相SERS基片与步骤3)溶液共培育;
5)缓冲液冲洗步骤4)得到的基片后,用第三试剂封闭基片表面;
6)缓冲液冲洗步骤5)得到的基片后,将第四试剂滴加到SERS基片表面共培育;
7)纯水冲洗步骤6)得到的基片后,进行拉曼检测。
其中,所述步骤2)中的共培养条件为20-30℃,培养1-1.5h,所述步骤3)中加入第二试剂后培养条件为35-40℃,30-40min;所述步骤4)的培育条件为20-30℃,培养3-4h;所述步骤5)的培养条件为20-30℃,静置培养10-20min。所述步骤6)的培养条件为20-30℃,静置培养1-1.5h。
作为进一步优选,步骤2)中所述第一试剂和待检测样品培养条件为25℃,培养1h。
作为进一步优选,步骤3)中加入核酸外切酶Ⅲ后培养条件为37℃,30min。
作为进一步优选,步骤4)中所述固相SERS基片与步骤3)溶液共培育为取20μL溶液滴于基片表面小孔中,培养条件为25℃,80%湿度环境,培养3h。
作为进一步优选,步骤5)中所述对于H7病毒片段,加入巯基己醇最优浓度为10μM;对于N9病毒片段,加入巯基己醇最优浓度为100μM,体积为20μL,培养条件为25℃,80%湿度环境,静置培养10min。
作为进一步优选,步骤6)中所述第四试剂滴加到SERS基片小孔中共培育,第四试剂浓度1μM,体积20μL,培养条件为25℃,80%湿度环境,静置培养1h。
作为进一步优选,步骤7)所述拉曼检测为检测Probe链上标记的染料分子的拉曼信号。
其中,本发明所述的流感病毒基因片段SERS检测试剂盒的检测方法,分别加入不同浓度禽流感病毒H7N9中H7和N9基因片段的缓冲液,得到不同浓度基因片段对应的SERS信号强度,以H7,N9基因片段浓度为横坐标,以SERS信号强度为纵坐标做出工作曲线。最后,通过加入待测样品溶液共培养后,最后测试得到SERS信号,对照工作曲线计算得出待测样品中流感病毒基因片段的浓度。
本发明的该试剂盒的检测浓度范围为1fM-100pM。
本发明的检测原理:向第一试剂中加入待检测样品,样品中的待检测禽流感病毒基因片段(命名为Target链)与第一试剂中Replace-Capture双链中的Replace链互补杂交形成Replace-Target双链,并释放出Capture链。之后加入第二试剂核酸外切酶Ⅲ,核酸外切酶Ⅲ切割Replace-Target双链中的Replace链并释放Target链,以此实现Target链的循环放大。随后,将固相SERS基片与上述试剂混合培育,溶液中的Capture链通过S-银键固定到基片表面。然后将第三试剂滴加到SERS基片表面进行封闭,减少基片非特异性吸附。最后,将第四试剂滴加到SERS基片表面,Probe链与Capture链的部分核苷酸序列互补杂交,形成Capture-Probe双链,将修饰染料分子的Probe链捕获到基片上,实现拉曼信号的检测,通过测试基片上染料分子的拉曼信号,实现对于禽流感病毒基因片段的特异性、高灵敏检测。
本发明面向流感病毒快速检测需求,结合SERS技术与信号放大技术,构建了用于流感病毒基因片段检测的SERS检测试剂盒,并公开了其检测方法。为流感病毒高灵敏、特异性检测提供了方法,也拓展SERS技术在流感病毒检测中的应用。
有益效果:与现有技术相比,本发明的优点是:本发明利用银纳米棒阵列型SERS基片作为检测基片,具有优异的SERS性能,并结合核酸外切酶Ⅲ信号放大技术,运用酶切DNA双链的3'凹陷末端将加入的Target链进行循环使用,进一步提高检测灵敏度,该传感器检测限达到十阿摩尔/升级(~10aM),可实现病毒基因片段的联合检测。同时对各种病毒基因片段检测具有的普适性。本发明通过测试基片上染料分子的拉曼信号,实现对于禽流感病毒基因片段的特异性、高灵敏检测。对于H7或N9基因片段检测,第一试剂和第四试剂中的Capture链、Replace链和Probe链为针对H7或N9基因片段设计的核苷酸序列不同的DNA链。本发明公开的检测试剂盒制备简单、检测灵敏度高、特异性好,可同时测定甲型流感病毒的H7和N9亚型,在流感病毒检测等领域有广泛的应用前景。
附图说明
图1是流感病毒基因片段SERS检测试剂盒工作原理图;
图2实施例1,实施例2,实施例3中SERS检测试剂盒H7基因片段核酸外切酶Ⅲ浓度优化。
图3实施例4,实施例5,实施例6中SERS检测试剂盒H7基因片段巯基己醇浓度优化。
图4实施例7,实施例8,实施例9中SERS检测试剂盒N9基因片段核酸外切酶Ⅲ浓度优化实验。
图5实施例10,实施例11,实施例12中SERS检测试剂盒N9基因片段巯基己醇浓度优化实验。
图6实施例13中SERS检测试剂盒H7基因片段特异性检测,(a)是试剂盒检测N9基因片段、单碱基错配序列、双碱基错配序列、完全非互补序列缓冲液样品的SERS谱图;(b)是(a)中SERS谱线1360cm-1处峰值统计。
图7是实施例13中SERS检测试剂盒用于缓冲液中H7基因片段检测的工作曲线;
图8实施例14中SERS检测试剂盒N9基因片段特异性检测,(a)是试剂盒检测N9基因片段、单碱基错配序列、双碱基错配序列、完全非互补序列缓冲液样品的SERS谱图;(b)是(a)中SERS谱线1503cm-1处峰值统计。
图9是实施例14中SERS检测试剂盒用于缓冲液中N9基因片段检测的工作曲线;
图10是实施例15中SERS检测试剂盒用于(双元)联合检测同时含有H7,N9基因片段缓冲液样品,H7基因片段的工作曲线(a),N9基因片段的工作曲线(b)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例是为了对本发明作进一步详细说明,并非对发明的限制。
本发明所使用的8种DNA单链片段均为人工合成得到,其中Replace链与TargetDNA链由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其余DNA链及第二试剂由大连Takara生物科技公司合成。第三试剂巯基己醇由Sigma-Aldrich合成。
2种检测病毒基因片段H7,N9碱基序列为:
H7:5'-CATCTGCGGGAATGCAGCATTATCTGTGTTTGACAGGAGCCATTTCATTTCT-3'
N9:5'-ATAAGGGTCATTACACTTACCTATATTTGGGTCATTCGGTCGGGGATTGTCT-3'
H7病毒基因片段对应的Capture,Replace,Probe碱基序列为:
Capture:5'-SH-TCCACGGGAATGCAGCATTATCTGTGTTTGACAGGAGCTCCCCA-3';
Replace:5'-GAAATGGCTCCTGTCAAACACAGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-3';Probe:5'-TGCATTCCCGTGGATTTT-Cy5-3'。
H7基因片段特异性验证对应的核酸序列:
单碱基错配序列(SM):
5'-SH-CATCTGCGGGAATGGAGCATTATCTGTGTTTGACAGGAGCCATTTCATTTCT-3';
双碱基错配序列(TM):
5'-SH-CATCTGCGGGAATGGAGCATTATCTGTGTTTTACAGGAGCCATTTCATTTCT-3';
完全非互补序列(NC):
5'-SH-
ATCGGTAATCGGCTTGCGCAGTGGACATGCGTGGCTTGATGCGCAGATTTCT-3';
N9病毒基因片段对应的Capture,Replace,Probe碱基序列为:
Capture:5'-SH-TCCAGTCATTACACTTACCTATATTTGGGTCATTCGGTATTTTC-3';
Replace:5'-TCCCCGACCGAATGACCCAAATATAGGTAAGTGTAATGACCCTTAT-3';
Probe:5'-GTGTAATGACTGGACCCC-ROX-3'。
N9基因片段特异性验证对应的核酸序列:
单碱基错配序列(SM):
5'-SH-ATAAGGGTCGTTACACTTACCTATATTTGGGTCATTCGGTCGGGGATTGTCT-3';
双碱基错配序列(TM):
5'-SH-ATAAGGGTCGTTACACTTACCTATATTAGGGTCATTCGGTCGGGGATTGTCT-3';
完全非互补序列(NC):
5'-SH-TGCGAATGTTCCTATACGGTACGCTGCGTATAGCAATAACGAATATTTGTCT-3';
以下实施例中银纳米棒阵列型SERS基片采用真空电子束蒸发镀膜技术制备,具体方法按文献(C.Y.Song,J.L.Abell,Y.P.He,S.H.Murph,Y.P.Cui,Y.P.Zhao.Gold-modifiedsilver nanorod arrays:growth dynamics and improved SERS properties.Journal ofMaterials Chemistry,2012,22(3):1150-1159.)中报道的方法制备。基片表面覆盖一层具有阵列型(4×10)小孔的PDMS膜,孔径4mm,深度1mm。
实施例1 H7基因片段检测的SERS试剂盒制备及检测方法
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)向H7病毒基因片段检测对应的第一试剂Capture链、Replace链中加入相同体积的含有H7基因片段的TM缓冲液,在20℃培育1h;Capture链和Replace链浓度为2μM,TM缓冲液中H7基因片段的浓度为100pM。
(3)向步骤(2)得到的混合液中加入核酸外切酶Ⅲ,使其最终浓度至0.05U/μL,培养条件为35℃,30min;
(4)取步骤(3)得到的混合液(1μM),20μL滴于SERS基片上的小孔中,在20℃,80%湿度环境中培育3h,然后用缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH 7.4)冲洗干净;
(5)向步骤(4)处理所得基片小孔中加入20μL浓度10μM巯基己醇,培养10min后用缓冲液轻轻冲洗干净,之后加入1μM,20μL H7的第四试剂Probe链,培养1h后纯水冲洗基片,随后进行SERS检测,测试得到染料分子Cy5的SERS谱线,获得Cy5特征峰1360cm-1处峰值,参见图2。
实施例2 H7基因片段检测的SERS试剂盒制备及检测方法
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)向H7病毒基因片段检测对应的第一试剂Capture链、Replace链中加入相同体积的含有H7基因片段的TM缓冲液,在25℃培育1h;Capture链和Replace链浓度为2μM,TM缓冲液中H7基因片段的浓度为100pM。
(3)向步骤(2)得到的混合液中加入核酸外切酶Ⅲ,使其最终浓度至0.1U/μL,培养条件为37℃,30min;
(4)取步骤(3)得到的混合液(1μM),20μL滴于SERS基片上的小孔中,在25℃,80%湿度环境中培育3h,然后用缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH 7.4)冲洗干净;
(5)向步骤(4)处理所得基片小孔中加入20μL浓度10μM巯基己醇,培养10min后用缓冲液轻轻冲洗干净,之后加入1μM,20μL H7的第四试剂Probe链,培养1h后纯水冲洗基片,随后进行SERS检测,测试得到染料分子Cy5的SERS谱线,获得Cy5特征峰1360cm-1处峰值,参见图2。
实施例3 H7基因片段检测的SERS试剂盒制备及检测方法
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)向H7病毒基因片段检测对应的第一试剂Capture链、Replace链中加入相同体积的含有H7基因片段的TM缓冲液,在30℃培育1.5h;Capture链和Replace链浓度为2μM,TM缓冲液中H7基因片段的浓度为100pM。
(3)向步骤(2)得到的混合液中加入核酸外切酶Ⅲ,使其最终浓度至0.3U/μL,培养条件为40℃,40min;
(4)取步骤(3)得到的混合液(1μM),20μL滴于SERS基片上的小孔中,在30℃,80%湿度环境中培育4h,然后用缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH 7.4)冲洗干净;
(5)向步骤(4)处理所得基片小孔中加入20μL浓度10μM巯基己醇,培养20min后用缓冲液轻轻冲洗干净,之后加入1μM,20μL H7的第四试剂Probe链,培养1.5h后纯水冲洗基片,随后进行SERS检测,测试得到染料分子Cy5的SERS谱线,获得Cy5特征峰1360cm-1处峰值,参见图2。
由实施例1-3及图2可见,H7基因片段检测最优的第二试剂(核酸外切酶Ⅲ)浓度0.1U/μL;步骤2)最优的条件为25℃,培养1h,步骤3)中加入第二试剂后最优培养条件为37℃,30min;步骤4)的最优培育条件为25℃,培养3h;步骤5)的最优培养条件为25℃,静置培养10min;步骤6)的最优培养条件为25℃,静置培养1h。
实施例4 H7基因片段检测的SERS试剂盒制备及检测方法
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)向H7病毒基因片段检测对应的第一试剂Capture链、Replace链中加入相同体积的含有H7基因片段的TM缓冲液(空白样品为TM缓冲液不加H7基因片段),在25℃培育1h;Capture链和Replace链浓度为2μM,TM缓冲液中H7基因片段的浓度为100pM。
(3)向步骤(2)得到的混合液中加入核酸外切酶Ⅲ,使其最终浓度至0.1U/μL,培养条件为37℃,30min;
(4)取步骤(3)得到的混合液(1μM),20μL滴于SERS基片上的小孔中,在25℃,80%湿度环境中培育3h,然后用缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH 7.4)冲洗干净;
(5)向步骤(4)处理所得基片小孔中加入20μL浓度1μM巯基己醇,培养10min后用缓冲液轻轻冲洗干净,之后加入1μM,20μL H7的第四试剂Probe链,培养1.5h后纯水冲洗基片,随后进行SERS检测,测试得到染料分子Cy5的SERS谱线,获得Cy5特征峰1360cm-1处峰值,参见图3。
实施例5 H7基因片段检测的SERS试剂盒制备及检测方法
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)向H7病毒基因片段检测对应的第一试剂Capture链、Replace链中加入相同体积的含有H7基因片段的TM缓冲液(空白样品为TM缓冲液不加H7基因片段),在25℃培育1h;Capture链和Replace链浓度为2μM,TM缓冲液中H7基因片段的浓度为100pM。
(3)向步骤(2)得到的混合液中加入核酸外切酶Ⅲ,使其最终浓度至0.1U/μL,培养条件为37℃,30min;
(4)取步骤(3)得到的混合液(1μM),20μL滴于SERS基片上的小孔中,在25℃,80%湿度环境中培育3h,然后用缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH 7.4)冲洗干净;
(5)向步骤(4)处理所得基片小孔中加入20μL浓度10μM巯基己醇,培养10min后用缓冲液轻轻冲洗干净,之后加入1μM,20μL H7的第四试剂Probe链,培养1.5h后纯水冲洗基片,随后进行SERS检测,测试得到染料分子Cy5的SERS谱线,获得Cy5特征峰1360cm-1处峰值,参见图3。
实施例6 H7基因片段检测的SERS试剂盒制备及检测方法
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)向H7病毒基因片段检测对应的第一试剂Capture链、Replace链中加入相同体积的含有H7基因片段的TM缓冲液(空白样品为TM缓冲液不加H7基因片段),在25℃培育1h;Capture链和Replace链浓度为2μM,TM缓冲液中H7基因片段的浓度为100pM。
(3)向步骤(2)得到的混合液中加入核酸外切酶Ⅲ,使其最终浓度至0.1U/μL,培养条件为37℃,30min;
(4)取步骤(3)得到的混合液(1μM),20μL滴于SERS基片上的小孔中,在25℃,80%湿度环境中培育3h,然后用缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH 7.4)冲洗干净;
(5)向步骤(4)处理所得基片小孔中加入20μL浓度100μM巯基己醇,培养10min后用缓冲液轻轻冲洗干净,之后加入1μM,20μL H7的第四试剂Probe链,培养1.5h后纯水冲洗基片,随后进行SERS检测,测试得到染料分子Cy5的SERS谱线,获得Cy5特征峰1360cm-1处峰值,参见图3。
由实施例4-6及图3可见,第三试剂巯基己醇(MCH)浓度10μM时,空白样品背景信号弱,H7基因片段检测样品信号强,信噪比优。因此。对于H7基因片段检测,第三试剂(MCH)最优浓度为10μM。
实施例7 N9基因片段检测的SERS试剂盒制备及检测方法
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)向N9病毒基因片段检测对应的第一试剂Capture链、Replace链中加入相同体积的含有N9基因片段的TM缓冲液,在25℃培育1h;Capture链和Replace链浓度为2μM,TM缓冲液中N9基因片段的浓度为100pM。
(3)向步骤(2)得到的混合液中加入核酸外切酶Ⅲ,使其最终浓度至0.2U/μL,培养条件为37℃,30min;
(4)取步骤(3)得到的混合液(1μM),20μL滴于SERS基片上的小孔中,在25℃,80%湿度环境中培育3h,然后用缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH 7.4)冲洗干净;
(5)向步骤(4)处理所得基片小孔中加入20μL浓度100μM巯基己醇,培养10min后用缓冲液轻轻冲洗干净,之后加入1μM,20μL N9的第四试剂Probe链,培养1.5h后纯水冲洗基片,随后进行SERS检测,测试得到染料分子ROX的SERS谱线,获得ROX特征峰1503cm-1处峰值,参见图4。
实施例8 N9基因片段检测的SERS试剂盒制备及检测方法
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)向N9病毒基因片段检测对应的第一试剂Capture链、Replace链中加入相同体积的含有N9基因片段的TM缓冲液,在25℃培育1h;Capture链和Replace链浓度为2μM,TM缓冲液中N9基因片段的浓度为100pM。
(3)向步骤(2)得到的混合液中加入核酸外切酶Ⅲ,使其最终浓度至0.3U/μL,培养条件为37℃,30min;
(4)取步骤(3)得到的混合液(1μM),20μL滴于SERS基片上的小孔中,在25℃,80%湿度环境中培育3h,然后用缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH 7.4)冲洗干净;
(5)向步骤(4)处理所得基片小孔中加入20μL浓度100μM巯基己醇,培养10min后用缓冲液轻轻冲洗干净,之后加入1μM,20μL N9的第四试剂Probe链,培养1.5h后纯水冲洗基片,随后进行SERS检测,测试得到染料分子ROX的SERS谱线,获得ROX特征峰1503cm-1处峰值,参见图4。
实施例9 N9基因片段检测的SERS试剂盒制备及检测方法
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)向N9病毒基因片段检测对应的第一试剂Capture链、Replace链中加入相同体积的含有N9基因片段的TM缓冲液,在25℃培育1h;Capture链和Replace链浓度为2μM,TM缓冲液中N9基因片段的浓度为100pM。
(3)向步骤(2)得到的混合液中加入核酸外切酶Ⅲ,使其最终浓度至0.4U/μL,培养条件为37℃,30min;
(4)取步骤(3)得到的混合液(1μM),20μL滴于SERS基片上的小孔中,在25℃,80%湿度环境中培育3h,然后用缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH 7.4)冲洗干净;
(5)向步骤(4)处理所得基片小孔中加入20μL浓度100μM巯基己醇,培养10min后用缓冲液轻轻冲洗干净,之后加入1μM,20μL N9的第四试剂Probe链,培养1.5h后纯水冲洗基片,随后进行SERS检测,测试得到染料分子ROX的SERS谱线,获得ROX特征峰1503cm-1处峰值,参见图4。
由实施例7-9及图4可见,N9基因片段检测最优的第二试剂(核酸外切酶Ⅲ)浓度0.1U/μL。
实施例10 N9基因片段检测的SERS试剂盒制备及检测方法
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)向N9病毒基因片段检测对应的第一试剂Capture链、Replace链中加入相同体积的含有N9基因片段的TM缓冲液(空白样品为TM缓冲液不加N9基因片段),在25℃培育1h;Capture链和Replace链浓度为2μM,TM缓冲液中N9基因片段的浓度为100pM。
(3)向步骤(2)得到的混合液中加入核酸外切酶Ⅲ,使其最终浓度至0.3U/μL,培养条件为37℃,30min;
(4)取步骤(3)得到的混合液(1μM),20μL滴于SERS基片上的小孔中,在25℃,80%湿度环境中培育3h,然后用缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH 7.4)冲洗干净;
(5)向步骤(4)处理所得基片小孔中加入20μL浓度10μM巯基己醇,培养10min后用缓冲液轻轻冲洗干净,之后加入1μM,20μL N9的第四试剂Probe链,培养1.5h后纯水冲洗基片,随后进行SERS检测,测试得到染料分子ROX的SERS谱线,获得ROX特征峰1503cm-1处峰值,参见图5。
实施例11 N9基因片段检测的SERS试剂盒制备及检测方法
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)向N9病毒基因片段检测对应的第一试剂Capture链、Replace链中加入相同体积的含有N9基因片段的TM缓冲液(空白样品为TM缓冲液不加N9基因片段),在25℃培育1h;Capture链和Replace链浓度为2μM,TM缓冲液中N9基因片段的浓度为100pM。
(3)向步骤(2)得到的混合液中加入核酸外切酶Ⅲ,使其最终浓度至0.3U/μL,培养条件为37℃,30min;
(4)取步骤(3)得到的混合液(1μM),20μL滴于SERS基片上的小孔中,在25℃,80%湿度环境中培育3h,然后用缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH 7.4)冲洗干净;
(5)向步骤(4)处理所得基片小孔中加入20μL浓度100μM巯基己醇,培养10min后用缓冲液轻轻冲洗干净,之后加入1μM,20μL N9的第四试剂Probe链,培养1.5h后纯水冲洗基片,随后进行SERS检测,测试得到染料分子ROX的SERS谱线,获得ROX特征峰1503cm-1处峰值,参见图5。
实施例12 N9基因片段检测的SERS试剂盒制备及检测方法
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)向N9病毒基因片段检测对应的第一试剂Capture链、Replace链中加入相同体积的含有N9基因片段的TM缓冲液(空白样品为TM缓冲液不加N9基因片段),在25℃培育1h;Capture链和Replace链浓度为2μM,TM缓冲液中N9基因片段的浓度为100pM。
(3)向步骤(2)得到的混合液中加入核酸外切酶Ⅲ,使其最终浓度至0.3U/μL,培养条件为37℃,30min;
(4)取步骤(3)得到的混合液(1μM),20μL滴于SERS基片上的小孔中,在25℃,80%湿度环境中培育3h,然后用缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH 7.4)冲洗干净;
(5)向步骤(4)处理所得基片小孔中加入20μL浓度1mM巯基己醇,培养10min后用缓冲液轻轻冲洗干净,之后加入1μM,20μL N9的第四试剂Probe链,培养1.5h后纯水冲洗基片,随后进行SERS检测,测试得到染料分子ROX的SERS谱线,获得ROX特征峰1503cm-1处峰值,参见图5。
由实施例10-12及图5可见,第三试剂巯基己醇(MCH)浓度100μM时,空白样品背景信号弱,H7检测样品信号强,信噪比优。因此。对于N9基因片段检测,第三试剂(MCH)最优浓度为100μM。
实施例13 H7基因片段检测的SERS试剂盒制备及特异性检测
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)向H7病毒基因片段检测对应的第一试剂中加入含有H7基因片段的TM缓冲液,至第一试剂最终浓度为1μM,在25℃培育1h;
(3)向步骤(2)混合液中加入核酸外切酶Ⅲ,使其最终浓度至0.1U/μL,培养条件为37℃,30min;
(4)取步骤(3)混合液20μL滴于SERS基片上的小孔中,在25℃,80%湿度环境中培育3h,然后用缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH 7.4)冲洗干净;
(5)向步骤(4)处理所得基片小孔中加入20μL浓度10μM巯基己醇,培养10min后用缓冲液轻轻冲洗干净,之后加入1μM,20μL H7的第四试剂,培养1.5h后纯水冲洗基片,随后进行SERS检测,测试得到染料分子Cy5的SERS谱线。
(6)特异性检测:缓冲液中配制H7(100pM)、单碱基错配序列(SM)(1nM)、双碱基错配序列(TM)(1nM),完全非互补序列(NC)(1nM)、空白样品(纯缓冲液)作为检测对象,测得拉曼信号,见图6,结果显示,检测物为H7时具有较强的拉曼信号,与单碱基错配、双碱基错配、完全非互补,以及空白样品的检测信号具有显著的区分度。
(7)工作曲线:检测含有1fM,10fM,100fM,1pM,10pM,100pM H7链的缓冲液样品;检测得到各浓度样品的Cy5的SERS信号,作H7浓度和Cy5的特征SERS信号(1360cm-1)强度值的工作曲线(见图7),并得出N9检测的线性范围和检测限。(拉曼测试条件:扫描时间1s,激光功率10%,物镜放大倍率20x,累计次数1次,激发光波长633nm)。
工作曲线:IH7=725*log[CH7]+12351,线性工作范围:1fM~100pM;检测限:79aM
实施例14 N9基因片段检测的SERS试剂盒制备及特异性检测
(1)银纳米棒阵列型SERS基片用超纯水多次冲洗;
(2)向N9病毒基因片段检测对应的第一试剂中加入含有N9基因片段的TM缓冲液,至第一试剂最终浓度为1μM,在25℃培育1h;
(3)向步骤(2)混合液中加入核酸外切酶Ⅲ,使其最终浓度至0.3U/μL,培养条件为37℃,30min;
(4)取步骤(3)混合液20μL滴于SERS基片上的小孔中,在25℃,80%湿度环境中培育3h,然后用缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH 7.4)冲洗干净;
(5)向步骤(4)处理所得基片小孔中加入20μL浓度100μM巯基己醇,培养10min后用缓冲液轻轻冲洗干净,之后加入1μM,20μL N9的第四试剂,培养1.5h后纯水冲洗基片,随后进行SERS检测,测试得到染料分子ROX的SERS谱线。
(6)特异性检测:缓冲液中配制N9(100pM)、单碱基错配序列(SM)(1nM)、双碱基错配序列(TM)(1nM),完全非互补序列(NC)(1nM)、空白样品(纯缓冲液)作为检测对象,测得拉曼信号,见图8,结果显示,检测物为N9链时具有较强的拉曼信号,与单碱基错配、双碱基错配、完全非互补,以及空白样品的检测信号具有显著的区分度。
(7)工作曲线:检测含有1fM,10fM,100fM,1pM,10pM,100pM N9链的缓冲液样品;检测得到各浓度样品的ROX的SERS信号,作N9浓度和ROX的特征SERS信号(1503cm-1)强度值的工作曲线,见图9,并得出N9检测的线性范围和检测限。(拉曼测试条件:扫描时间1s,激光功率10%,物镜放大倍率20x,累计次数1次,激发光波长633nm)。
工作曲线:IN9=517*log[CN9]+9847,线性工作范围:1fM~100pM;检测限:20aM
实施例15 H7,N9部分基因片段联合检测的SERS试剂盒制备和特异性检测、回收率、准确性检测
(1)制备固体SERS基片,然后用纯水多次冲洗;
(2)向H7病毒基因片段检测对应的第一试剂Capture链、Replace链中加入含有H7和N9基因片段的TM缓冲液,在25℃培育1h得到H7检测混合液,Capture链和Replace链终浓度均为1μM;同时,向N9病毒基因片段检测对应的第一试剂Capture链、Replace链中加入含有H7和N9基因片段的TM缓冲液,在25℃培育1h得到N9检测混合液,Capture链和Replace链终浓度均为1μM;
(3)向步骤(2)得到的H7检测混合液中加入核酸外切酶Ⅲ,使其最终浓度分别为0.1U/μL;同时,向步骤(2)得到的N9检测混合液中加入核酸外切酶Ⅲ,使其最终浓度为0.3U/μL,培养条件为37℃,30min;
(4)取步骤(3)得到的两种混合液20μL分别滴于SERS基片上不同的小孔中(H7检测小孔和N9检测小孔),在25℃,80%湿度环境中培育3h,然后用缓冲液(10mM磷酸盐,100mM氯化钠,pH 7.4)冲洗干净;
(5)向步骤(4)处理所得基片上H7检测小孔中加入20μL 浓度10μM巯基己醇,N9检测小孔中加入20μL浓度100μM巯基己醇,培养10min后用缓冲液轻轻冲洗两个检测孔,之后在H7检测小孔和N9检测小孔分别加入1μM,20μL的H7和N9各自对应的第四试剂,培养1.5h后纯水冲洗基片,随后进行SERS检测,测试得到Cy5、ROX分子的SERS信号。
(6)工作曲线:分别检测含有相同浓度H7和N9的混合液,浓度分别为1fM,10fM,100fM,1pM,10pM,100pM;检测得到ROX、Cy5的信号,分别作H7浓度和Cy5的SERS信号(1360cm-1)强度的工作曲线,作N9浓度和ROX的SERS信号(1503cm-1)强度的工作曲线,并计算试剂盒对H7和N9基因片段联合检测是各自的线性范围和检测限(见图10)。(拉曼测试条件:ROX:扫描时间1s,激光功率10%,物镜放大倍率20x,累计次数1次,激发光波长633nm;Cy5:扫描时间1s,激光功率5%,物镜放大倍率20x,累计次数1次,激发光波长633nm)。
线性工作区间为:1fM-100pM;
工作曲线分别为:
H7:IH7=678*log[CH7]+11929;检测限:32aM
N9:IN9=567*log[CN9]+9731;检测限:50aM
(7)流感病毒基因片段SERS检测试剂盒用于H7和N9基因片段双元(联合)检测方法:步骤(2)中加入含有H7和N9的待检测样品,检测到Cy5、ROX分子的SERS信号,将H7检测1360cm-1峰位强度与H7工作曲线对照,得出待检测样品中H7的浓度;将N9检测1503cm-1峰位强度与N9工作曲线对照,得出待检测样品中N9的浓度。
两种待检测样品测试(第一检测样品配制方法为向TM缓冲液中同时加入H7和N9,H7浓度为4.8×10-11M,N9浓度为4.8×10-11M;第二检测样品配制方法为向TM缓冲液中同时加入H7和N9,H7浓度为6.2×10-12M,N9浓度为1.5×10-12M。)
两种检测样品及其检测浓度及回收率:
第一检测样品和第二检测样品中H7和N9检出的浓度与配置值接近,回收率在97.4-106.4%之间,样品检出准确性高。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 一种流感病毒基因片段SERS检测试剂盒及其制备方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> H7病毒基因片段(H7 )
<400> 1
catctgcggg aatgcagcat tatctgtgtt tgacaggagc catttcattt ct 52
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> N9病毒基因片段(N9)
<400> 2
ataagggtca ttacacttac ctatatttgg gtcattcggt cggggattgt ct 52
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> H7病毒基因片段对应的Capture链(Capture H7)
<400> 3
tccacgggaa tgcagcatta tctgtgtttg acaggagctc ccca 44
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> H7病毒基因片段对应的Replace链(Replace H7)
<400> 4
gaaatggctc ctgtcaaaca cagataatgc tgcattcccg cagatg 46
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> H7病毒基因片段对应的Probe链(Probe H7)
<400> 5
tgcattcccg tggatttt 18
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> N9病毒基因片段对应的的Capture (Capture N9)
<400> 6
tccagtcatt acacttacct atatttgggt cattcggtat tttc 44
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> N9病毒基因片段对应的的Replace链(Replace N9)
<400> 7
tccccgaccg aatgacccaa atataggtaa gtgtaatgac ccttat 46
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> N9病毒基因片段对应的的Probe 链(Probe N9)
<400> 8
gtgtaatgac tggacccc 18
<210> 9
<211> 52
<212> DNA
<213> H7基因片段对应的单碱基错配序列(SM)
<400> 9
catctgcggg aatggagcat tatctgtgtt tgacaggagc catttcattt ct 52
<210> 10
<211> 52
<212> DNA
<213> H7基因片段对应的双碱基错配序列(TM)
<400> 10
catctgcggg aatggagcat tatctgtgtt ttacaggagc catttcattt ct 52
<210> 11
<211> 52
<212> DNA
<213> H7基因片段对应的完全非互补序列(NC)
<400> 11
atcggtaatc ggcttgcgca gtggacatgc gtggcttgat gcgcagattt ct 52
<210> 12
<211> 52
<212> DNA
<213> N9基因片段对应的完全非互补序列(SM)
<400> 12
ataagggtcg ttacacttac ctatatttgg gtcattcggt cggggattgt ct 52
<210> 13
<211> 52
<212> DNA
<213> N9基因片段对应的双碱基错配序列(TM)
<400> 13
ataagggtcg ttacacttac ctatattagg gtcattcggt cggggattgt ct 52
<210> 14
<211> 52
<212> DNA
<213> N9基因片段对应的完全非互补序列(NC)
<400> 14
tgcgaatgtt cctatacggt acgctgcgta tagcaataac gaatatttgt ct 52
Claims (10)
1.一种流感病毒基因片段SERS检测试剂盒,其特征在于,所述SERS检测试剂盒包括固相SERS基片、第一试剂和第四试剂,所述固相SERS基片是表面沉积有银纳米棒阵列的玻璃片,所述第一试剂包含能与流感病毒基因片段碱基序列完全互补的Replace链,以及能与Replace链部分碱基互补的Capture链,所述Replace链与Capture链的部分核苷酸序列互补杂交形成Replace-Capture双链;所述第四试剂为修饰有染料分子的能与Capture链互补杂交的Probe链。
2.根据权利要求1所述的流感病毒基因片段SERS检测试剂盒,其特征在于,所述SERS检测试剂盒还包括第二试剂核酸外切酶Ⅲ和第三试剂巯基己醇。
3.根据权利要求1所述的流感病毒基因片段SERS检测试剂盒,其特征在于,所述流感病毒基因片段为H7病毒基因片段;和/或N9病毒基因片段。
4.根据权利要求1所述的流感病毒基因片段SERS检测试剂盒,其特征在于,所述流感病毒基因片段为H7病毒基因片段时,所述Replace链碱基序列如SEQ ID NO:1所示,所述Capture链碱基序列如SEQ ID NO:2所示;和/或所述流感病毒基因片段为N9病毒基因片段时,所述Replace链的碱基序列如SEQ ID NO:3所示,所述Capture链碱基序列如SEQ ID NO:4所示。
5.根据权利要求1或4所述的流感病毒基因片段SERS检测试剂盒,其特征在于,所述流感病毒基因片段为H7病毒基因片段时,所述Probe链的碱基序列如SEQ ID NO:5 所示;和/或所述流感病毒基因片段为N9病毒基因片段时,所述Probe链的碱基序列如SEQ ID NO:6所示。
6.权利要求1~5任一项所述的流感病毒基因片段SERS检测试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)固相SERS基片的制备;
2)第一试剂的获得:根据所述流感病毒基因片段设计对应的Replace链,再根据Replace链设计Capture链;
3)第四试剂的获得:根据Capture链设计修饰有染料分子的Probe链。
7.根据权利要求6所述的流感病毒基因片段SERS检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述Capture链和Replace链浓度相同,浓度范围均为1-10 µM。
8.根据权利要求6所述的流感病毒基因片段SERS检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述Probe链的浓度范围为1-10 µM。
9.权利要求1~5任一项所述的流感病毒基因片段SERS检测试剂盒的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)用纯水多次清洗试剂盒中的固相SERS基片;
2)向试剂盒的第一试剂中加入检测样品共培养;
3)向步骤2)中加入第二试剂;
4)将步骤1)得到的固相SERS基片与步骤3)溶液共培育;
5)缓冲液冲洗步骤4)得到的基片后,用第三试剂封闭基片表面;
6)缓冲液冲洗步骤5)得到的基片后,将第四试剂滴加到SERS基片表面共培育;
7)纯水冲洗步骤6)得到的基片后,进行SERS检测。
10.根据权利要求9所述的流感病毒基因片段SERS检测试剂盒的检测方法,其特征在于,所述步骤2)中的共培养条件为20-30℃,培养1-1.5 h,所述步骤3)中加入第二试剂后培养条件为35-40℃,30-40 min;所述步骤4)的培育条件为20-30℃,培养3-4 h;所述步骤5)的培养条件为20-30℃,静置培养10-20 min;所述步骤6)的培养条件为25-30℃,静置培养1-1.5 h。
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