JP2009278866A - Ｄｎａに於けるｄｎａ結合性タンパク質の結合部位の検出方法 - Google Patents

Ｄｎａに於けるｄｎａ結合性タンパク質の結合部位の検出方法 Download PDF

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Abstract

【課題】 簡便に且迅速に、ＤＮＡ結合性タンパク質と結合するＤＮＡの結合部位を含むＤＮＡの領域を検出する方法を提供すること。
【解決手段】 本発明の方法は、蛍光標識したＤＮＡ結合性タンパク質とそのタンパク質が結合することが既知である第一のＤＮＡとを含む第一の混合液と、第二のＤＮＡと蛍光標識したＤＮＡ結合性タンパク質とを含む第二の混合液を調製し、第一及び第二の混合液の蛍光強度に基づいて、第一の混合液中のＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さと第二の混合液中のＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さとに差があるか否かを判定して、その結果に基づいて、ＤＮＡの結合部位を含む領域を検出することを特徴とする。
【選択図】 図２

Description

本発明は、ＤＮＡの或る特定の領域又は塩基配列を検出又は同定する方法に係り、より詳細には、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）にあるＤＮＡ結合性タンパク質（ＤＮＡに結合するタンパク質）との相互作用に関わる塩基配列（結合配列）又は結合部位を含む領域を検出する方法に係る。
ＤＮＡ結合性タンパク質は、ＤＮＡ中の特定の塩基配列に結合し、多くの生物のＤＮＡの塩基配列により決定される遺伝子の発現の制御機構及び代謝や発生、疾患など幅広い生理現象に於いて、重要な役割を担っていると考えられている。例えば、ゲノム上に存在する遺伝子が、タンパク質として発現されて機能を発揮するべく、ｍＲＮＡへと転写される制御（転写制御）に於いて、特定のタンパク質群がゲノムを構成するＤＮＡに結合して、そのＤＮＡと相互作用することが知られている。そのような相互作用の例は、大腸菌のLacIタンパク質（リプレッサー）とラクトースオペレーターとの結合による転写制御、ショウジョウバエの胚発生の各段階で働く母性効果遺伝子産物、分節遺伝子産物及びホメオドメイン遺伝子産物による転写制御、ヒトのがん抑制遺伝子として知られるp53の遺伝子産物による転写制御に於いて観察されている。また、ＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡとの相互作用が関与する転写制御を人為的に操作して、未知のタンパク質の同定（非特許文献１）や特定の化合物の検出（非特許文献２）に応用することも試みられている。更に、最新医療の分野では、ＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡ（プロモーター配列）の相互作用を制御する「アンチセンス／デコイＤＮＡ」が開発され、かかるＤＮＡを体内に投与する事で、ＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡの相互作用が関わる転写制御を人為的に操作して心筋梗塞などの病気を治療することが試みられている（非特許文献３）。
上記の如きＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡの相互作用に関する研究やＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡの相互作用を利用した治療方法の開発の現場に於いて、ＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡの相互作用の検出又はＤＮＡ結合性タンパク質と相互作用するＤＮＡの塩基配列の検出の方法は、種々提案されている。例えば、非特許文献４には、プロモーター配列に発光タンパク質の一種であるルシフェラーゼをコードした遺伝子を接続するとともに、プロモーター配列に欠失変異を導入して、ルシフェラーゼの発現の有無（発光するか否かを判定）により、転写制御（即ち、ＤＮＡ結合性タンパク質との相互作用）に必要なＤＮＡの塩基配列を同定することが開示されている。また、非特許文献５に記載された「ヌクレアーゼプロテクションアッセイ」では、タンパク質と相互作用させた放射性標識したＤＮＡをヌクレアーゼにより処理したＤＮＡ断片を電気泳動により分離して、プロモーター配列中にあるタンパク質と結合する領域と結合しない領域を、ヌクレアーゼによる感受性の違いを利用することにより同定することが可能である。更に、特許文献１に於いては、蛍光標識された短い（約５０ｂｐ以下）のＤＮＡ断片を用いて、蛍光相関分光法により、ＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質との反応を検出する方法が提案されている。
特開２００５−００６５６６公報 特表２００２−５４３４１４公報 ホール等、ザ・プラント・セル（The Plant Cell）、２００３年、１５巻、ｐ２７１９−２７３９ ティナ・ケー・バンダイク、アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー、１９９４年、６０巻、p.1414-1420 モリシタ等、ネイチャーメディシィン(Nature Medicine)、１９９７年３（８）巻、ｐ.834-835 マイケル等、２００２年、プラントフィジオロジー（Plant Physiology）、２００２年、１３０巻、ｐ．６２７−６３８ マイケル等、１９９３年、ジーントランスクリプション：プラクティカルアプローチ、ｐ．２２９−２７６
ところで、或るタンパク質がＤＮＡに結合することが分かっている場合、又は、或るタンパク質が転写制御などのＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡの相互作用に関わっていることが分かっている場合に、そのタンパク質が具体的にＤＮＡのどの塩基配列に結合するか、即ち、ＤＮＡの塩基配列中に於けるＤＮＡ結合性タンパク質との相互作用に関わる塩基配列（結合配列）が同定されれば、ＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡの相互作用に関する研究及びそれを利用した治療方法の開発に於いて、非常に有用な情報となる。結合配列が分かれば、転写制御等のＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡの相互作用の人為的な制御又は操作に於いて、無駄な試行錯誤を行う必要が低減され、前記の研究又は治療方法の確立に於いて費用と時間が節約できることとなる。
しかしながら、従来の技術に於いて、或る所与のＤＮＡ結合性タンパク質の結合配列を、簡便に或いは迅速に検出又は同定する方法は提案されていない。当業者にとって知られているように、ゲノム上の塩基配列は、非常に膨大な数であるところ、例えば、プロモーター配列のうち実際にＤＮＡ結合性タンパク質に結合する結合配列は、６〜５０ｍｅｒ程度の比較的短いＤＮＡ配列であると考えられている。従って、上記に例示した如き、細胞に於いて所定の遺伝子が発現されたか否かにより特定のＤＮＡ塩基配列を検出する方法では、膨大な塩基配列のうちの結合配列を同定することは、非常に多くの時間と労力を要することとなる。また、従前のいくつかの塩基配列を同定する方法は、放射性同位元素や電気泳動法を用いるなど、試料の取り扱いや使用する試料量が多いなどの不具合を有する。従って、もし或るタンパク質についてそのタンパク質がＤＮＡに結合するか否か、或いは、結合する場合にどの塩基配列が結合配列なのかが容易に且迅速に決定できる方法があれば、ＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡの相互作用に関する研究及びかかる相互作用を利用した治療方法の開発に非常に有用となろう。また、かかる新規な方法に於いては、多量の試料を要しないことが好ましい。
かくして、本発明の一つの目的は、多量の試料を要せず、比較的簡便に且迅速に、ＤＮＡ結合性タンパク質と相互作用するＤＮＡ中の結合配列を同定するために有利に用いられるＤＮＡ結合性タンパク質と結合するＤＮＡの結合部位を含むＤＮＡ分子又はその領域若しくはその塩基配列を検出する方法を提供することである。
また、本発明のもう一つの目的は、上記の如き方法であって、試験管内の系で、ＤＮＡ結合性タンパク質に対するＤＮＡ中の結合配列を含むＤＮＡ分子又はその領域若しくはその塩基配列を検出する方法を提供することである。
また更に、本発明のもう一つの目的は、上記の如き方法であって、遺伝子の発現又は転写制御に関わるプロモーター配列に於けるＤＮＡ結合性タンパク質に対するＤＮＡ中の結合配列を同定するための方法を提供することである。
本発明によれば、上記の課題を解決する新規なＤＮＡ結合性タンパク質と結合するＤＮＡの結合部位を含む領域を検出する方法が提供される。本発明の方法は、蛍光標識したＤＮＡ結合性タンパク質と該ＤＮＡ結合性タンパク質が結合することが既知である第一のＤＮＡとを含む第一の混合液を調製する過程と、第一のＤＮＡ上の結合配列を含んでいるか否かが検査される第二のＤＮＡと前記蛍光標識したＤＮＡ結合性タンパク質とを含む第二の混合液を調製する過程と、第一及び第二の混合液の蛍光強度を測定する過程と、第一及び第二の混合液の蛍光強度に基づいて、第一の混合液中のＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さと第二の混合液中のＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さとに差があるか否かを判定する過程とを含み、ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さに差があるか否かに基づいて、第一のＤＮＡに於ける結合部位を含む領域を検出することを特徴とする。
上記の本発明の方法は、概して述べれば、種々の鎖長や配列のＤＮＡ分子に結合したＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さの違いを観測することにより、該タンパク質の結合するＤＮＡの結合部位を含むＤＮＡ分子又はその領域を特定しようというものである。水溶液中に於いて、ＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡとが結合すると、ＤＮＡ結合性タンパク質はＤＮＡと一体となるので、ＤＮＡ結合性タンパク質のブラウン運動の速さは、結合したＤＮＡ分子の大きさ又は形状によって変化する。そこで、ＤＮＡ結合性タンパク質を予め蛍光標識しておき、その蛍光標識されたタンパク質と種々の鎖長や配列のＤＮＡ分子とを相互作用させて、タンパク質の蛍光標識の蛍光強度を測定し、測定された蛍光強度から得られるＤＮＡ結合性タンパク質のブラウン運動の速さの情報に基づいて、ＤＮＡ結合性タンパク質が如何なる塩基配列を有するＤＮＡ分子又は如何なる種類のＤＮＡ分子に結合しているかを特定する。
より詳細には、上記から理解される如く、まず、蛍光標識されたＤＮＡ結合性タンパク質が、そのＤＮＡ結合性タンパク質と結合することは分かっているが、ＤＮＡ結合性タンパク質が具体的に結合する部位がどこに在るかが未知のＤＮＡ分子（第一のＤＮＡ）と、第一のＤＮＡ上の結合配列を含んでいるか否かが検査されるＤＮＡ（第二のＤＮＡ）のそれぞれと混合され、次いで、第一の混合液（ＤＮＡ結合性タンパク質と第一のＤＮＡとの混合液）と第二の混合液（ＤＮＡ結合性タンパク質と第二のＤＮＡとの混合液）の蛍光測定により、第一の混合液と第二の混合液に於けるＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さに差があるか否かが判定される。第一の混合液では、タンパク質は第一のＤＮＡに結合することとなる。しかしながら、第二の混合液では、第二のＤＮＡの塩基配列がＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位を含んでいる場合に、ＤＮＡ結合性タンパク質と第二のＤＮＡが結合する。即ち、第二のＤＮＡ中の塩基配列にＤＮＡ結合性タンパク質が結合するか否かにより、第二の混合液でのＤＮＡ結合性タンパク質のＤＮＡへの結合状態又はＤＮＡ結合性タンパク質の結合するＤＮＡの分子種が異なり、水溶液中のＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さが変化することとなる。従って、第一のＤＮＡと結合したタンパク質の運動の速さを基準として、第二のＤＮＡと混合されたタンパク質の運動の速さを参照することにより、ＤＮＡ結合性タンパク質が第二のＤＮＡに結合しているか否かが決定され、かくして、第一のＤＮＡと第二のＤＮＡに共通する塩基配列がＤＮＡ結合性タンパク質と結合する部位を含んでいるか否かが決定されることとなる。なお、上記の方法に於いて、第一のＤＮＡの全ての塩基配列が、分かっていても分かっていなくてもよい。しかしながら、第一のＤＮＡ上の結合配列の詳細な位置を効率的に絞り込むためには、第二のＤＮＡは、第一のＤＮＡの塩基配列の少なくとも一部と同一の塩基配列を有するものであることが好ましい。また、本発明の方法に於いて使用されるＤＮＡ分子は、水溶液中で略棒状を為しているものであってよい。その場合、蛍光測定で観測されるＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さは、ＤＮＡ結合性タンパク質が結合するＤＮＡ分子の長さの関数であるとみなしてよい。
上記の本発明の第一の態様に於いては、第二のＤＮＡは、第一のＤＮＡより短いＤＮＡ断片であってよく、第二の混合液が第一の混合液にＤＮＡ断片を加えることにより調製されてよい。第一の混合液に第一のＤＮＡより短いＤＮＡ断片を混合した場合、もしその混合したＤＮＡ断片がＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位を含んでいると、第一の混合液中に初めから存在する第一のＤＮＡに結合していたタンパク質の幾分かの量が新たに加えられたＤＮＡ断片に移ることとなる（ＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡとの結合は、通常、可逆的であるので、第一のＤＮＡとＤＮＡ断片が競合関係となる）。ＤＮＡ結合性タンパク質がＤＮＡ断片に移ると、ＤＮＡ結合性タンパク質が結合するＤＮＡ分子の平均の長さが低減することとなり、かくして、蛍光測定で観察されるＤＮＡ結合性タンパク質の運動がみかけ上速くなる。他方、もしその混合したＤＮＡ断片がＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位を含んでいなければ、ＤＮＡ結合性タンパク質は、ＤＮＡ断片に移らないので、蛍光測定で観察されるＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さに変化は生じない。かくして、この態様に於いては、ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さに差があると判定された場合に、ＤＮＡ断片にある塩基配列に於いて、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位が含まれていると特定することができる。また、第一の混合液に追加されるＤＮＡ断片の塩基配列を通常の方法により特定すれば、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位の塩基配列を具体的に決定できることとなる。なお、この態様に於いて、複数の種類の、第一のＤＮＡより短いＤＮＡ断片を調製し、複数の種類のＤＮＡ断片の各々を、別々に第一の混合液へ加えて複数の第二の混合液を調製し、複数の第二の混合液に於ける蛍光強度により、それぞれ、第一の混合液の場合とＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さの差があるか否かを判定すれば、複数のＤＮＡ断片のうち、どの断片に結合部位が存在するかが特定できることとなる。また、この態様に於いて、第二のＤＮＡとなるＤＮＡ断片として、第一のＤＮＡの一部分と同一の塩基配列から成るものを選択すれば、効率的に、第一のＤＮＡに於ける結合部位の位置を絞り込むことができる。
上記の本発明の第二の態様としては、第二の混合液が第一の混合液へ制限酵素を加えることにより調製されてよい（第二のＤＮＡは、制限酵素で処理された第一のＤＮＡである。）。この場合、もし第一のＤＮＡが、添加された制限酵素により切断される塩基配列を含んでいれば、第一のＤＮＡは、断片化され、その結果、ＤＮＡ結合性タンパク質の運動が速くなるので、蛍光測定によってその変化が観察されるはずである。従って、この場合、第二の混合液中のＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さに差があった（運動が速くなった）と判定された場合には、制限酵素で切断される第一のＤＮＡの塩基配列にＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位が含まれていることを特定することができる。
上記の態様に於いて、第一のＤＮＡが複数の種類のＤＮＡから成り、そのうちの少なくとも一つがＤＮＡ結合性タンパク質と結合することが既知であるがどのＤＮＡに結合するかが未知であるＤＮＡ混合物であってよく、第二の混合液が第一の混合液へ任意の制限酵素（第一の制限酵素）を加えて調製される。この場合、第二のＤＮＡは、ＤＮＡ混合物の一部を第一の制限酵素により断片化してなるＤＮＡ断片を含むこととなる。もし第二の混合液中のＤＮＡ結合性タンパク質の運動が速くなったとすれば、ＤＮＡ結合性タンパク質が結合するＤＮＡ分子が制限酵素により断片化され、そのＤＮＡ分子の長さが変わったことになる。即ち、第一及び第二の混合液中のＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さに差があったと判定された場合には、第一のＤＮＡのうち第一の制限酵素により切断されたＤＮＡ分子の塩基配列中にＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位が含まれていることを特定できることとなる。なお、この態様に於いて、もし第一のＤＮＡに含まれる複数の種類のＤＮＡが互いに異なる制限酵素により切断されることがわかっていれば、それらの制限酵素を第一の混合液へ別々に又は順次追加し（それらを第二の混合液として）、蛍光測定を行い、ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さに差があった（運動が速くなった）と判定された際の制限酵素を特定することにより、第一のＤＮＡに含まれる複数の種類のＤＮＡのうちどのＤＮＡにＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位が含まれているかが特定できることとなる。
更に、上記の第二の態様に於いて、第一又は第二の混合液若しくはそれまで調製された混合液へ第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素又はそれまで添加された制限酵素とは異なる制限酵素を更に加えて、第三の混合液又は新たな混合液を調製し、上記と同様に蛍光測定により、それまで調製された混合液中のＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さと新たに調製された混合液中のＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さとに差があるか否かを判定されてよい。もし新たに制限酵素が添加された混合液中のＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さが速くなったとすれば、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合するＤＮＡが切断されたこととなる。従って、それまで調製された混合液及び新たな混合液中のＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さに差があった場合に、それまで調製された混合液中に含まれるＤＮＡのうち、新たに添加された制限酵素により切断されたＤＮＡの塩基配列にＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位が含まれていることが特定されることとなる。更に、それまで添加した制限酵素とは異なる制限酵素を、それまで調製された混合液へ添加して蛍光測定を行ってＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さの変化の有無を観測することを反復すれば、ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さの変化が検出される毎に、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位の存在する領域をより詳細に絞っていくことが可能となる。
上記の本発明の更に別の態様として、前記の態様と同様に、第一のＤＮＡを、複数の種類のＤＮＡから成り、そのうちの少なくとも一つがＤＮＡ結合性タンパク質と結合することが既知であるがどのＤＮＡに結合するかが未知であるＤＮＡ混合物とすると共に、複数の制限酵素を各々別々に、ＤＮＡ混合物を含む第一の混合液へ与えることにより複数の第二の混合液を調製するようになっていてよい。この場合、複数の第二の混合液に於いて、対応する制限酵素によりＤＮＡ混合物の一部が断片化され、それぞれＤＮＡ断片（各々の断片が第二のＤＮＡとなる）が生成される。第一の混合液のＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さと複数の第二の混合液のいずれかのうちのＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さとに差があった場合に、その差があった第二の混合液に於いて、ＤＮＡ結合性タンパク質が結合するＤＮＡが切断されたことになるので、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位が、第一のＤＮＡのうち、ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さに差を生じた第二の混合液に加えられた制限酵素により切断されたＤＮＡの塩基配列に含まれていることが特定できることとなる。
ところで、ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さの変化を観察するための蛍光強度の測定方法は、具体的には、蛍光相関分光法、蛍光偏光解消法など、蛍光標識された分子の大きさの変化に伴う分子運動の変化を検出できる任意の蛍光測定方法であってよい。蛍光偏光解消法は、二次元蛍光強度分布分析法（例えば、特許文献２を参照）を用いたものであってもよい。なお、上記以外のＤＮＡに結合したＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さの変化を検出できる任意の蛍光測定分析技術が、本発明に於いて採用されてよいことは理解されるべきであり、そのような場合も本発明の範囲に属する。
本発明の方法は、上記の説明から理解されるように、従来のＤＮＡ結合性タンパク質が結合するＤＮＡの結合部位を同定又は検出する方法、例えば、細胞への遺伝子の導入及び発現の有無の判定などを用いる方法とは異なり、従来に比して簡単で比較的短時間にＤＮＡ結合性タンパク質と結合するＤＮＡの結合部位を含む領域を検出することが可能である。また、本発明の処理過程に於いては、端的に述べれば、所定の試料を調製した後には、ＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡ（及び制限酵素）を試験管内で反応させることと、その反応液の蛍光測定に行うだけで、結果が得られることとなり、放射性同位元素や電気泳動法或いはクロマトグラフィなどの煩雑な操作や試料の分画を行わなくてもよく、検出に要する試料量を従前に比して大幅に低減できることが期待される。更に、蛍光測定の際、前記の如き蛍光相関分光分析等に用いられる共焦点光学顕微鏡の光学系を備えた装置を用いれば、試料量は、より一層低減することが可能となる。
特に、試料量を従前に比して低減できるということは、ＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡの相互作用に関する研究を含む生化学的研究の分野及び治療方法の開発の研究の分野に於いて、非常に有利であることは理解されるべきである。この分野の現場に於いて使用される試薬又は物質は、しばしば、高価であったり、或いは稀少であるために、大量に入手することが困難である場合がある。しかしながら、本発明の方法は、少量の試料でも検査ができるので、極めて有効である。また、本発明によれば、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合配列を含む領域を特定する際、事前に検査されるべきＤＮＡの塩基配列が分かっていなくても、ＤＮＡ試料が入手できれば（従前に比して少量でよい。）、ＤＮＡ上のＤＮＡ結合性タンパク質との結合部位（又は結合部位を含む領域）を特定することができる。本発明の方法の処理過程では、使用されたＤＮＡは、(制限酵素で切断されることを除き)実質的に変性しないので、結合部位が分かった後に、その部位のみを取り出して、その部位のみの塩基配列を調べることも可能である。
更に、本発明の方法は、特に、ＤＮＡの転写制御に関わるプロモーター配列に於けるＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位をより詳細に特定するために有利に用いることができる。プロモーター配列の長さは、数ｋｂｐ程度に及び、しかも、長さ又はゲノム上の位置も生物種によって異なる。かかる状況に於いて通常２０ｂｐ〜１００ｂｐ程度であると考えられるＤＮＡ結合性タンパク質の結合配列を特定することは、従前の方法では、時間と労力を多く必要とするが、本発明の方法によれば、プロモーター配列中のＤＮＡ結合性タンパク質の結合配列を含む領域を、初めは大雑把に特定した後、本発明の方法の過程を繰り返すことで、効率的に絞り込むことが可能となるので、従前に比して、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合配列を特定するための作業速度を速くすることができると期待される。また、本発明の方法は、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合配列を、従前に比して少ない手間にて、検出できるので、短い結合配列を利用した転写制御を介する生体内のシグナルや生体外の環境を検出するシステムの開発、例えば、短い配列を直接生体に対してデコイＤＮＡとして導入する核酸医薬の開発に於いて、有利に用いることができるであろう。勿論、本発明は、プロモーター配列以外の任意のＤＮＡの配列とＤＮＡ結合性タンパク質との相互作用の部位又は結合部位を特定するために用いられてもよい。
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
以下に添付の図を参照しつつ、本発明を幾つかの好ましい実施形態について詳細に説明する。図中、同一の符号は、同一の物質又は部位を示す。
第一の実施形態
第一の実施形態では、概して述べれば、蛍光標識されたＤＮＡ結合性タンパク質と、そのＤＮＡ結合性タンパク質と結合することは分かっているが、ＤＮＡ結合性タンパク質が具体的に結合する部位がどこに在るかが未知のＤＮＡ分子（第一のＤＮＡ）との混合液（第一の混合液）と、かかる混合液に、第一のＤＮＡ上の結合配列を含んでいるか否かが検査される第一のＤＮＡより短いＤＮＡ断片（第二のＤＮＡ）を加えた混合液（第二の混合液）とが調製され、蛍光相関分光法又は蛍光偏光解消法などの蛍光測定により、第一及び第二の混合液中のＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さの違いを観測する。上記の如く調製された混合液に於いて、第一の混合液中では、ＤＮＡ結合性タンパク質と第一のＤＮＡとが結合しているものと考えられる。一方、第二の混合液では、ＤＮＡ断片が、ＤＮＡ結合性タンパク質との結合部位を含んでいなければ、ＤＮＡ結合性タンパク質は、第一のＤＮＡと結合したままであるが、ＤＮＡ断片が、ＤＮＡ結合性タンパク質との結合部位を含んでいれば、ＤＮＡ結合性タンパク質の一部は、ＤＮＡ断片と結合する（第一のＤＮＡ分子とＤＮＡ断片の間で競合が生ずる）。その結果、ＤＮＡ断片が、ＤＮＡ結合性タンパク質との結合部位を含んでいる場合には、第二の混合液中のＤＮＡ結合性タンパク質の結合するＤＮＡ分子の平均の長さが短くなり、蛍光測定で観測されるＤＮＡ結合性タンパク質の運動が速くなる。かくして、ＤＮＡ結合性タンパク質の運動を速くさせるＤＮＡ断片と同一の塩基配列中にＤＮＡ結合性タンパク質との結合部位が存在することが特定できることとなる。
図１は、本発明の方法の好ましい第一の実施形態に於ける処理過程をフローチャートの形式で表したものであり、図２は、図１の処理に於いて想定される分子の状態の変化を模式的に示したものである。
図１及び図２を参照して、本発明の方法の実施を開始する当たり、予め、第一のＤＮＡ１と、蛍光標識されたＤＮＡ結合性タンパク質７と、第一のＤＮＡ１より短いＤＮＡ断片２〜５とが準備される。なお、ＤＮＡ断片２〜５は、好ましくは、第一のＤＮＡ１の一部分と同一の塩基配列から成るものであり、例えば、第一のＤＮＡ１を断片化して調製されたものでよく、又、図に例示されているよりも、細かく断片化されていてもよい。実験を実施する際には、ＤＮＡ断片のいずれかにＤＮＡ結合性タンパク質７との結合部位（塩基配列）６が存在するようＤＮＡ断片が準備されていることが望ましい。なお、図２では、説明の目的で、結合部位６が断片３に存在するよう示されているが、実際には、どの断片に存在するかはわかっていない。
ＤＮＡ結合性タンパク質の調製及び蛍光標識は、任意の方法でなされてよい。例えば、ＤＮＡ結合性タンパク質の調製した後、タンパク質中の特定の基を標的にしたケミカルラベリング法により、蛍光分子がタンパク質に付加されてよい（特定のアミノ酸配列を持つタンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて作成し、そのアミノ酸配列の特徴を元に蛍光色素を付加してもよい。）。蛍光色素としては、この分野で通常使われる任意の蛍光色素、例えば、TAMRA（carboxymethylrhodamine）、TMR(tetramethylrhodamine)、Alexa647、Rhodamine Green、Alexa488などであってよいが、これらに限定されない。或いは、遺伝子組み換え技術を用いて蛍光発光するＤＮＡ結合性タンパク質（ＧＦＰ融合タンパク質など）が調製されてもよい。
第一のＤＮＡ分子１は、ＤＮＡ結合性タンパク質と結合することがわかっている任意のＤＮＡであってよいが、ＤＮＡ結合性タンパク質と相互作用するプロモーター配列である場合には、好ましくは、転写制御が行われている遺伝子の近傍にある１ｋｂｐ程度の断片が用いられてよい。かかる１ｋｂｐの範囲は、生物種によって大きく異なる。プロモーター配列は、ゲノムサイズが小さいシロイヌナズナなどの場合は、転写開始点から１ｋｂｐ程度に上流に存在するが、ヒトやマウスなどの哺乳類のゲノム上では、遺伝子から２０〜３０ｋｂｐ程度離れた位置に存在することもある。従って、ＤＮＡ結合性タンパク質の種類に応じて、適切な範囲の１ｋｂｐのＤＮＡが任意の方法で選択されることが好ましい。プロモーター配列は、どのような生物種のプロモーター配列を用いる場合でも、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを用いて増幅したものが用いられてよい。また、ＤＮＡ断片２〜５は、前記の第一のＤＮＡを任意の方法で断片化したものであってよく、プロモーター配列を鋳型としたＰＣＲを用いて増幅したものであってよい。
かくして、上記の試料が準備された後、まず、第一のＤＮＡ１と蛍光標識されたＤＮＡ結合性タンパク質７とが混合され、第一の混合液が調製される（ステップ１）。上記から理解される如く、第一の混合液では、図２（Ｂ）に模式的に示されている如く、ＤＮＡ結合性タンパク質７が第一のＤＮＡ１に結合することとなる。なお、第一の混合液の水溶液の条件及び温度は、ＤＮＡ結合性タンパク質７がＤＮＡに結合する適当な条件に設定される。かかる条件は、当業者に於いて任意に選択することができる。また、ＤＮＡ結合性タンパク質７が第一のＤＮＡ１に十分に結合するよう、タンパク質とＤＮＡの混合後、適当な時間インキュベーションされてよい。
次いで、まず、第一の混合液の蛍光測定が行われる（ステップ２）。蛍光測定は、蛍光標識されたＤＮＡ結合性タンパク質７の運動の早さの変化を検出することのできる蛍光相関分光法、蛍光偏光解消法などを有利に用いることができる。
蛍光相関分光法では、微小の蛍光観察領域をブラウン運動により通過する分子の移動（並進運動）の速さが観測される。分子の並進運動の速さは、測定された蛍光強度の時間を変数とした自己相関関数の形状に反映される（図２（Ｅ）参照）。分子の並進運動の速さの指標としては、測定開始時から自己相関関数の値が半分になるまでの時間の長さ（並進拡散時間）が用いられる。分子の移動は、分子の大きさが小さいほど、速くなるので、並進拡散時間が短くなる。本発明の場合、ＤＮＡ結合性タンパク質７の結合するＤＮＡが短いほど、ＤＮＡ結合性タンパク質７の運動が速くなり、従って、並進拡散時間が短くなるので、並進拡散時間の変化からＤＮＡ結合性タンパク質７の運動の速さの変化、従って、ＤＮＡ結合性タンパク質７の結合するＤＮＡの長さの変化の有無を検出することができる。
蛍光偏光解消法では、この分野に於いて知られている如く、分子の回転ブラウン運動（自転）の速さが観測される。分子の回転運動の速さは、測定された蛍光の縦偏光と横偏光の強度の割合又は偏光度に反映される。分子の回転は、分子の大きさが小さいほど、速くなるので、偏光度が小さくなる。本発明の場合、ＤＮＡ結合性タンパク質７の結合するＤＮＡが短いほど、ＤＮＡ結合性タンパク質７の回転運動が速くなり、従って、偏光度が下がるので、偏光度の変化から、ＤＮＡ結合性タンパク質７の運動の速さの変化、従って、ＤＮＡ結合性タンパク質７の結合するＤＮＡの長さの変化の有無を検出することができる。なお、蛍光偏光解消法による測定は、蛍光相関分光法と同一の光学系を用いた二次元蛍光強度分散分析法により行われてよい。
第一の混合液の蛍光測定の後、第一の混合液へＤＮＡ断片２〜５が添加される。ＤＮＡ断片の添加に際して、一つの態様としては、第一の混合液を添加されるべきＤＮＡ断片の種類の数の分だけ分注しておき、分注されたそれぞれに一種類のＤＮＡ断片が添加されてよい（ステップ３−４）。ＤＮＡ断片を添加すると、結合部位を含まない断片が添加された混合液に於いては、図２（Ｄ）に示す如く、ＤＮＡ結合性タンパク質７は、第一のＤＮＡ１に結合したままである。しかしながら、ＤＮＡ結合性タンパク質７とＤＮＡの結合反応は、可逆的であり、ＤＮＡ結合性タンパク質７は、所定の結合定数にて、ＤＮＡに結合するので、結合部位を含む断片が添加された混合液に於いては、図２（Ｃ）に示す如く、ＤＮＡ結合性タンパク質７と第一のＤＮＡ１との結合反応と、ＤＮＡ結合性タンパク質７とＤＮＡ断片３との結合反応とが競合し、ＤＮＡ結合性タンパク質７の一部がＤＮＡ断片３へ移動することとなる。かかるＤＮＡ結合性タンパク質７のＤＮＡ断片３への移動が多ければ多いほど、ＤＮＡ結合性タンパク質７の運動の速さの変化は顕著に成るので、ＤＮＡ断片の添加後、ほとんどのタンパク質がＤＮＡ断片へ移るように、ＤＮＡ断片の量は、第一のＤＮＡ１の分子数より過剰に多いことが好ましい。
かくして、ＤＮＡ断片が添加された混合液の各々について、任意に適当な時間インキュベーションした後、前記と同様に蛍光測定が行われる（ステップ５）。上記から理解される如く、ＤＮＡ断片が結合部位を含む場合には、ＤＮＡ結合性タンパク質７の運動の速さが速くなり、このことは、蛍光相関分光法に於ける並進拡散時間が短くなり、或いは、蛍光偏光解消法に於ける偏光度が低減することにより検出することができる。例えば、蛍光相関分光法の場合、図２（Ｅ）に例示されている如く、第一のＤＮＡ１からＤＮＡ断片３へタンパク質が移動した図２（Ｃ）の混合液の自己相関関数は、混合液中のタンパク質７の運動の速さが速くなることで、図２（Ｂ）及び図２（Ｄ）の混合液の自己相関関数より速く減衰し、並進拡散時間が短くなる。かくして、ステップ２の並進拡散時間又は偏光度の値とステップ５の並進拡散時間又は偏光度の値とが有意に異なるか否かが判定され（ステップ６）、異なる場合には、その断片に結合部位が含まれており（ステップ７）、有意な差が認められない場合は、その断片に結合部位が含まれていないと判定される（ステップ８）。
上記のステップ３−５に於いて、第一の混合液が分注されていたが、ＤＮＡ断片を一種類ずつ添加する毎に蛍光測定を行うようにしてもよい。その場合、蛍光測定の並進拡散時間又は偏光度の値に有意な差を発生した際に、そのときに加えられたＤＮＡ断片に結合部位が含まれていると判定される。また、上記の一連の過程により、結合部位を含むＤＮＡ断片が特定された後、ＤＮＡ断片を更に断片化して、上記の手順を実行すれば、更に詳細に結合部位を特定することができる（結合部位を絞り込むことができる。）。
なお、上記に於いては、第一の混合液に第二のＤＮＡ、即ち、第一のＤＮＡよりも短いＤＮＡ断片を加えて第二の混合液を調製したが、第一のＤＮＡを含まない第二のＤＮＡとタンパク質とを含む溶液を第二の混合液として、第一の混合液と第二の混合液との蛍光測定の結果を比較する場合でも原理的には、同様の結果が得られる。従って、そのような場合も本発明の範囲に属すると理解されるべきである。しかしながら、第一の混合液にＤＮＡ断片を混合して第二の混合液を調製する場合の方が、試料量が低減され、また、タンパク質又はＤＮＡ試料の個体差又は各調製ロットの差の観点から試料の信用度が高くなるので好ましいであろう。
ところで、上記の方法に於いて、ＤＮＡ断片の各々に、第一のＤＮＡの不存在下で、直接にＤＮＡ結合性タンパク質７を与えた場合には、ＤＮＡ断片に結合したＤＮＡ結合性タンパク質７と、フリーのＤＮＡ結合性タンパク質７との運動の速さの差により、結合部位を含む断片が特定できそうである。しかしながら、ＤＮＡ断片が結合部位の長さと同等レベルの長さになると、通常、ＤＮＡ断片に結合したＤＮＡ結合性タンパク質７とフリーのＤＮＡ結合性タンパク質７との運動の速さの差が蛍光測定では観測が困難となる。一方、本発明によれば、第一のＤＮＡに結合したＤＮＡ結合性タンパク質７と、ＤＮＡ断片に結合したＤＮＡ結合性タンパク質７との運動の速さの差を見ているので、ＤＮＡ断片が結合部位の長さと同等レベルの長さまで落としても、蛍光測定により、ＤＮＡ断片に結合部位があるかないかを特定することができる。
更に、第二のＤＮＡとして第一のＤＮＡよりも長いＤＮＡを採用してもよいことは、理解されるべきである。例えば、第一のＤＮＡよりも長く、且、或る特定の領域のみ、第一のＤＮＡと同じ塩基配列を持つＤＮＡが調製され、第二の混合液の調製に用いられてよい。その場合、第二のＤＮＡが結合部位をもっていれば、第二の混合液中のタンパク質の運動の速さは遅くなる。
第二の実施形態
第二の実施形態では、概して述べれば、蛍光標識されたＤＮＡ結合性タンパク質と、そのＤＮＡ結合性タンパク質と結合することは分かっているが、ＤＮＡ結合性タンパク質が具体的に結合する部位がどこに在るかが未知のＤＮＡ分子（第一のＤＮＡ）との混合液（第一の混合液）と、かかる混合液に、制限酵素を添加した混合液（第二の混合液）とが調製され、前記の第一の実施例と同様に、蛍光測定により第一及び第二の混合液中のＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さの違いを観測する。この場合、第一及び第二の混合液の双方に於いて、ＤＮＡ結合性タンパク質は、ＤＮＡと結合しているものと考えられるところ、第二の混合液では、もしＤＮＡ結合性タンパク質との結合部位を含むＤＮＡ分子が、制限酵素により切断されて断片化される場合（第二のＤＮＡの生成）には、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合するＤＮＡ分子の平均の長さが短くなり、蛍光測定で観測される第二の混合液中のＤＮＡ結合性タンパク質の運動は、第一の混合液中の場合に比して速くなる。かくして、ＤＮＡ結合性タンパク質との結合部位を含むＤＮＡの塩基配列に制限酵素により切断される塩基配列が存在することが特定される。
例えば、第一のＤＮＡに複数種のＤＮＡ分子が含まれている場合、即ち、複数種のＤＮＡ分子のうちの少なくとも一つが前記ＤＮＡ結合性タンパク質と結合することが既知であるがどのＤＮＡに結合するかが未知であるＤＮＡ混合物に於いて、或る制限酵素を添加して、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合するＤＮＡ分子が切断されれば、そのことが蛍光測定で観測できる。かくして、上記の如き制限酵素によりＤＮＡを処理した前後のＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さの変化を観測する手法によれば、複数種のＤＮＡ分子のうち、添加された制限酵素で切断される部位をもつＤＮＡ分子に、ＤＮＡ結合性タンパク質との結合部位が存在することが特定できることとなる。また、その溶液に、更に別の制限酵素（第二の制限酵素）を添加して、蛍光測定をして、ＤＮＡ結合性タンパク質の運動が速くなることが観測されれば、第二の制限酵素の添加直前の溶液中に存在するＤＮＡ又はＤＮＡの断片（先に添加された制限酵素によるＤＮＡの切断で生成された断片）のうち、第二の制限酵素により切断される塩基配列にＤＮＡ結合性タンパク質との結合部位が存在することが特定できることとなる。以上の如く、ＤＮＡと蛍光標識されたＤＮＡ結合性タンパク質との混合液に種々の制限酵素を順次加えていく毎に、蛍光測定により、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合するＤＮＡ分子が切断された否かを判定することを繰り返せば、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合する部位を含む領域を絞ることができることとなる。（なお、更に結合部位を絞るために、ＤＮＡ結合性タンパク質との結合部位が存在することが特定されたＤＮＡを第一のＤＮＡとして、前記の第一の実施形態の方法が実施されてよいことは理解されるべきである。）
上記の制限酵素を用いた手法は、次の例の如く実行されてよい。
第一の例として、例えば、図３（Ａ）に模式的に示されている如く、少なくとも２種類の第一の実施形態の第一のＤＮＡと同様の、１００ｂｐ以上（典型的には、１ｋｂｐ程度）のプロモーター配列の一部であるＤＮＡの混合物Ａ（ＤＮＡ８、９、１０）が在り、その複数種のＤＮＡのうちの少なくとも一つがＤＮＡ結合性タンパク質と結合することがわかっている場合を考える。なお、図３（Ａ）では、三種類のＤＮＡ８、９、１０が示されているが、混合物に含まれるＤＮＡの種類は、いくつであってもよい。また、説明の目的でＤＮＡ８にタンパク質の結合部位１１が存在するよう記載されているが、実際には、混合物に含まれるＤＮＡのうちいずれの分子種に結合部位１１が存在するかは、分かっていないものとする。
上記のＤＮＡ混合物Ａ中の結合部位１１を含むＤＮＡは、例えば、図４のフローチャートに記載の処理過程により特定される（蛍光標識されたタンパク質の調製、蛍光測定の方法等は、第一の実施形態の場合と同様である。）。図４を参照して、まず、ＤＮＡ混合物Ａに蛍光標識されたＤＮＡ結合性タンパク質１２が混合される（ステップ１１、図３（Ｂ））。次いで、タンパク質とＤＮＡの混合液を任意にインキュベーションした後、混合液の蛍光測定を行い、タンパク質１２の運動の速さを表す指標（並進拡散時間又は偏光度）を測定する（ステップ１２）。しかる後に、ＤＮＡ混合物Ａに含まれるＤＮＡ分子のうちのいずれかを切断することが分かっている（又は切断すると予想される）制限酵素Ｚを、混合液に添加する（ステップ１３）。制限酵素は、当業者に於いて任意に選択されてよい。次いで、混合液を任意にインキュベーションした後、混合液の蛍光測定を行い、タンパク質１２の運動の速さを表す指標を測定する（ステップ１４）。ここでもしタンパク質１２の運動の速さを表す指標がステップ１２で得られた指標から有意に変化した場合（並進拡散時間又は偏光度が低減した場合）、タンパク質１２が結合したＤＮＡ分子が断片化され長さが短くなったことになるので、タンパク質の結合部位１１が制限酵素Ｚで切断されるＤＮＡ分子に存在することが特定される（ステップ１５，１６）。他方、タンパク質１２の運動の速さを表す指標に変化がない場合には、タンパク質の結合部位１１は、制限酵素Ｚで切断されるＤＮＡとは別のＤＮＡに存在していることになるので（図３（Ｃ））、更に別の制限酵素Ｙが混合液に添加され（ステップ１７）、任意にインキュベーションした後、混合液の蛍光測定が行われる（ステップ１８）。ステップ１８でのタンパク質１２の運動の速さを表す指標がステップ１２で得られた指標から有意に変化した場合、タンパク質の結合部位１１が制限酵素Ｙで切断されるＤＮＡ分子に存在することが特定される（ステップ１９，２０）。他方、タンパク質１２の運動の速さを表す指標に変化がない場合（図３（Ｄ））には、更に別の制限酵素が混合液に添加され（ステップ２１）、任意にインキュベーションした後、混合液の蛍光測定が行われる（ステップ２２）。以上の如く、タンパク質１２の運動の速さを表す指標に変化がない場合には、次々に制限酵素の添加及び蛍光測定を繰り返して、タンパク質１２の運動の速さを表す指標の変化を観測し、最終的に指標の変化が検出された際（ステップ２３、図３（Ｅ））、タンパク質の結合部位１１がその直前に添加された制限酵素で切断されるＤＮＡ（図３の例では、ＤＮＡ８）上に存在することが特定できることとなる。もし変化が見られなければ、更に別の制限酵素が加えられ、上記の操作が実行されてよい。
制限酵素を用いる場合の第二の例として、図５に例示されている如く、少なくとも２種類の第一の実施形態の第一のＤＮＡと同様の、１００ｂｐ以上（典型的には、１ｋｂｐ程度）のプロモーター配列の一部であるＤＮＡの混合物Ｂ（ＤＮＡ１３、１４）が在り、その複数種のＤＮＡのうちの少なくとも一つがＤＮＡ結合性タンパク質と結合することがわかっている場合を考える。また、ＤＮＡ混合物に含まれるＤＮＡ分子の各々について、各ＤＮＡを切断する制限酵素（Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、Ｗ）及びその切断部位がわかっているものとする。なお、図５（Ａ）では、２種類のＤＮＡ１３、１４が示されているが、混合物に含まれるＤＮＡの種類は、いくつであってもよい。また、同図に於いて、各ＤＮＡを切断する制限酵素及びその切断部位（認識部位）は、Ｓ、Ｒ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、Ｗとなっているが、各ＤＮＡを切断する制限酵素の数と部位の位置は、例示であって、これらに限定するものではない。更に、説明の目的でＤＮＡ１３上の制限酵素Ｔ及びＵの切断部位の間にタンパク質の結合部位１１が存在するよう記載されているが、実際には、混合物に含まれるＤＮＡのうちいずれの分子種のどこに結合部位１１が存在するかは、分かっていないものとする。
上記のＤＮＡ混合物Ｂ中の結合部位１１を含むＤＮＡの領域は、例えば、図６のフローチャートに記載の処理過程により特定される（なお、蛍光標識されたタンパク質の調製、蛍光測定の方法等は、第一の実施形態の場合と同様である。）。図６を参照して、まず、前記の第一の例と同様に、ＤＮＡ混合物Ｂに蛍光標識されたＤＮＡ結合性タンパク質１２が混合され（ステップ３１、図５（Ｂ））、任意にインキュベーションした後、混合液の蛍光測定を行い、タンパク質１２の運動の速さを表す指標を測定する（ステップ３２）。しかる後に、混合液を二つに（又はＤＮＡ混合物Ｂに含まれるＤＮＡの分子種の数に）分注し（ステップ３３）、分注されたそれぞれの混合液に、別々の制限酵素、例えば、制限酵素Ｔ、Ｗ、を添加する（ステップ３４）。ここで添加される制限酵素は、互いに別のＤＮＡ分子を切断するものである。従って、それぞれの分注の混合液について蛍光測定を行うと（ステップ３５）、いずれか一つの混合液に於いて、タンパク質１２が結合するＤＮＡ分子が制限酵素により切断されているはずであるから（図５（Ｃ）、（Ｄ））、かかるタンパク質１２の運動の速さを表す指標に変化を示す溶液が決定される（ステップ３６，図５の例では、ＤＮＡ１３が制限酵素Ｔにより切断されている。）。かくして、タンパク質１２の運動の速さを表す指標の変化が在った溶液（図５（Ｄ））に添加された制限酵素で切断されるＤＮＡに、タンパク質の結合部位が存在することが特定される。なお、図では、結合部位１１が、ＤＮＡ１３が断片化されて出来たＤＮＡ断片１５上に在るように示されているが、この時点では、断片１５、１６のいずれに存在するかは分からない。
次いで、タンパク質１２の運動の速さを表す指標の変化が在った溶液を、更に二つに分注し（ステップ３６）、結合部位１１が存在すると特定されたＤＮＡを更に切断する二つの別々の制限酵素（Ｕ，Ｖ）が、分注された溶液に添加される（ステップ３７）。ここで添加される二つの制限酵素Ｕ，Ｖは、図５（Ｅ）、（Ｆ）に示されている如く、前の過程で結合部位１１を有するＤＮＡを切断した制限酵素の切断部位を挟む別々の側を切断するものであることが好ましい。これにより、ＤＮＡ断片１５は、制限酵素Ｕにより、ＤＮＡ断片１６は、制限酵素Ｖにより、それぞれ切断され、その後、蛍光測定が為されると（ステップ３８）、結合部位１１を有するＤＮＡが切断された方の溶液に於いて、タンパク質１２の運動の速さを表す指標の変化が観測され、かくして、結合部位１１がＤＮＡ断片１５、１６のいずれに存在するかが特定できることとなる。以上の操作を繰り返していけば、初めに準備されたＤＮＡ分子のどの領域に結合領域１１が存在するかを絞り込むことができることとなる。
なお、上記の図３〜６で説明した例は、制限酵素を用いて、タンパク質の結合部位を絞り込んでいく例であって、当業者に於いて、上記の例を参考にして、制限酵素の添加と蛍光測定を任意に組み合わせて、或るＤＮＡ上に於けるタンパク質の結合部位を絞り込んでいくことが可能であろう。例えば、上記の例では、複数の種類のＤＮＡを含むＤＮＡ混合物から処理が開始されているが、１種類のＤＮＡを順次制限酵素で切断しつつ、蛍光測定を行って、結合部位の位置を絞り込んでいってもよい。また、図３及び４の過程を実行した後に、図５及び６の過程を実行してもよい。
ところで、前記の第一及び第二の実施形態に於いて、ＤＮＡ結合性タンパク質が結合する第一のＤＮＡ又はＤＮＡ混合物の選択は、既に知られた知見又は任意の別の方法に於ける結果に基づいて為されてよいが、上記と同様の蛍光測定によるタンパク質の運動の速さの変化の観測に基づいて行われてもよい。溶液中のタンパク質のブラウン運動の速さは、タンパク質が検査されるべきＤＮＡに結合する場合には、フリーの状態にある場合よりも遅くなる。従って、ＤＮＡとタンパク質を含む溶液とＤＮＡが無い状態でのタンパク質を含む溶液の蛍光測定をすれば、タンパク質とＤＮＡの結合の有無は確認できる。
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
競合反応による結合配列を含む領域の特定（第一の実施形態）
図１に記載の処理過程により、ＤＮＡ結合性タンパク質の一種であるλ−ｃｒｏ（ラムダクロ）のλＤＮＡ上の結合配列を含む領域が検出されることを以下の手順により確認した。
まず、本発明の方法の実施に先立って、タンパク質λ-ｃｒｏを、ロシュ・ダイアグノスティック社製無細胞タンパク質合成キット（RTS 100 E.coli HYキット製品番号3 186 148）を用いて調製した。また、調製されたλ−ｃｒｏは、インビトロピンポイントラベリングキット５４３（オリンパス社）を用いて、蛍光分子TAMRAを付加することにより、蛍光標識した。１ｋｂｐのλＤＮＡ断片は、λＤＮＡを鋳型として結合配列
taaatctatcaccgcaagggataaatatc
を含む領域１ｋｂｐをＰＣＲ法で増幅することにより調製した。また、１ｋｂｐのλＤＮＡ断片の更に短い断片として、以下の４種類の塩基配列とその相補鎖を有する２９ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を調製した。
断片ａ taaatctatcaccgcaagggataaatatc
断片ｂ gcaagcaatgcggcgttataagcatttaa
断片ｃ ttcttttttttcataaattgctttaaggcg
断片ｄ gtgcgtgttgactattttacctctggcgg
なお、断片ａが、タンパク質λ-ｃｒｏの結合配列である。
本発明の方法の実施に於いて、まず、蛍光標識されたタンパク質TAMRA−λ-ｃｒｏと１ｋｂｐのλＤＮＡ断片を含む混合液を以下の溶液を混合することより調製した（ステップ１）。
１０ｎＭ TAMRA−λ-ｃｒｏ ２μｌ、
２×（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ）バッファ １５μｌ、
４００ｎｇ／μｌ λＤＮＡ１ｋｂｐ断片 １μｌ、
純水 １２μｌ
総量は、３０μｌである。２×（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ）バッファは、２００μｌの１０倍濃度のリン酸緩衝溶液のストック溶液、１００μｌの１％ Ｔｗｅｅｎ２０、７００μｌの純水を混合して調製した。混合液に於ける塩濃度は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ （ｐＨ７．４）である。
かくして、調製された混合液の蛍光強度を、共焦点顕微鏡の光学系を備えた１分子蛍光分析システム ＭＦ２０（オリンパス）を用いて蛍光相関分光法により計測した（ステップ２）。また、対照試料として、上記の混合液のうち、λＤＮＡ断片を含まない溶液（TAMRA−λ-ｃｒｏのみ）を調製し、同様に計測した。一つの試料について、１回１５秒間の蛍光測定を５回行い、タンパク質の運動の速さの指標として、並進拡散時間を算出した。その結果は、TAMRA−λ-ｃｒｏのみの対照試料の並進拡散時間は、３７４（±１２．４）μ秒であったのに対し、TAMRA−λ-ｃｒｏと１ｋｂｐλＤＮＡ断片を含む混合液の並進拡散時間は、１１０７．３（±１０６．９）μ秒であった。従って、TAMRA−λ-ｃｒｏと１ｋｂｐλＤＮＡ断片とを混合すると、TAMRA−λ-ｃｒｏの運動の速さが顕著に低減することが確認された。これは、TAMRA−λ-ｃｒｏが１ｋｂｐλＤＮＡ断片に結合することで、TAMRA−λ-ｃｒｏの運動が遅くなったことを示している。
次いで、上記のTAMRA−λ-ｃｒｏと１ｋｂｐのλＤＮＡ断片を含む溶液を４つに分注し（ステップ３）、それぞれに、前記のＤＮＡ断片ａ−ｄのうちのいずれか一つを、各々最終濃度が５３．７ｎＭとなるように添加し（ステップ４）、適当な時間インキュベーションした後、各々の蛍光強度を、上記と同様に蛍光相関分光法により計測した（ステップ５）。結果は、以下の通りであった。
添加されたＤＮＡ断片 並進拡散時間（±標準偏差）（単位は、μ秒）
追加なし １０９４．４（±２８．９）
断片ａ ５４５．８（±２５．８）
断片ｂ １０７４．７（±８８．６）
断片ｃ １１２７．３（±５６．１）
断片ｄ １０３７．３（±９６．９）
上記の並進拡散時間の結果を参照して、断片ａを添加すると、TAMRA−λ-ｃｒｏの運動の速さが顕著に速くなったことが判定され、断片ａが結合配列を含んでいることを検出することができた。かくして、図１の手順によれば、ＤＮＡ結合性タンパク質が結合するＤＮＡに於ける結合配列を含む領域又は結合配列の部位を検出できることが示された。
制限酵素を用いた結合配列を含む領域の特定（第二の実施形態）
第二の実施形態のうち、図４に記載の処理過程により、複数種のＤＮＡ分子を含むＤＮＡ混合物から、ＤＮＡ結合性タンパク質λ−ｃｒｏの結合配列を含むＤＮＡ分子が検出されることを以下の手順により確認した。
蛍光標識されたタンパク質λ-ｃｒｏと１ｋｂｐのλＤＮＡ断片は、実施例１と同様に調整した。また、ＤＮＡ混合物を調製すべく、１ｋｂｐのλＤＮＡ断片の他に、human pS2遺伝子プロモーター領域中の１ｋｂｐ断片と、human cathepsin D遺伝子プロモーター領域中の１ｋｂｐ断片とを、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増幅することによって調製した。
本発明の方法の実施に於いて、まず、蛍光標識されたタンパク質TAMRA−λ-ｃｒｏと複数の１ｋｂｐのＤＮＡ（λＤＮＡの１ｋｂｐ断片、human pS2遺伝子プロモーターの１ｋｂｐ断片、human cathepsin D遺伝子プロモーターの１ｋｂｐ断片を含む混合液を以下の溶液を混合することより調製した（ステップ１１）。
１０ｎＭ TAMRA−λ-ｃｒｏ ２μｌ、
５００ｍＭ Tris−HClバッファ(pH7.5) ３μｌ、
３００ｍＭ ＭｇＣｌ２ １μｌ、
１Ｍ ＮａＣｌ ３μｌ、
３０ｍＭ ＤＴＴ １μｌ、
４００ｎｇ／μｌ λＤＮＡ１ｋｂｐ断片 １μｌ、
４００ｎｇ／μｌ human pS2ＤＮＡ１ｋｂｐ断片 １μｌ、
４００ｎｇ／μｌ human cathepsin DＤＮＡ１ｋｂｐ断片 １μｌ、
純水 １７μｌ
総量は、３０μｌである。
かくして、調製された混合液の蛍光強度を、１分子蛍光分析システム ＭＦ２０（オリンパス）を用いて二次元蛍光強度分散分析法による蛍光偏光解消法により計測した（ステップ１２）。また、実施例１と同様に、対照試料として、上記の混合液のうち、ＤＮＡ断片を含まない溶液（TAMRA−λ-ｃｒｏのみ）を調製し、同様に計測した。一つの試料について、１回１５秒間の蛍光測定を５回行い、タンパク質の運動の速さの指標として、ｍＰ値（縦偏光と横偏光の強度の差分を縦偏光と横偏光の和で割った値の１０００倍に相当する）を算出した。その結果、TAMRA−λ-ｃｒｏのみの対照試料のｍＰ値は、２０３（±１．２）であったのに対し、TAMRA−λ-ｃｒｏとＤＮＡ断片を含む混合液のｍＰ値は、２６７（±０．８）であった。従って、TAMRA−λ-ｃｒｏとＤＮＡ断片とを混合すると、TAMRA−λ-ｃｒｏの運動の速さが顕著に低減することが確認された。これは、TAMRA−λ-ｃｒｏがＤＮＡ混合物に含有されるいずれかのＤＮＡに結合したことで（本実験では、１ｋｂｐλＤＮＡ断片に結合することは予め分かっているが）、TAMRA−λ-ｃｒｏの運動が遅くなったことを示している。
次いで、上記のTAMRA−λ-ｃｒｏとＤＮＡ混合物を含む溶液に、ＤＮＡ混合物中のいずれかのＤＮＡを切断する制限酵素を添加し、制限酵素による反応が十分に進行するよう室温にて３０分静置し、しかる後に、上記と同様に蛍光測定を行い、ｍＰ値を算出した。本実験に於いては、本発明の有効性を示すための実験のため、ＤＮＡ混合物中に含まれているＤＮＡの分子種が分かっているので、制限酵素として、human cathepsin DのＤＮＡ１ｋｂｐ断片を特異的に切断する制限酵素ＮｏｔＩ、human pS2のＤＮＡ１ｋｂｐ断片を特異的に切断する制限酵素ＥｃｏＲＩ及びλＤＮＡ１ｋｂｐ断片を特異的に切断する制限酵素ＢｇｌＩＩを順々に添加し、その都度、蛍光測定を行った。測定により得られたｍＰ値は、以下の通りである。
偏光度（±標準偏差）
制限酵素添加前 ２６８（±１．５）
ＮｏｔＩ添加後 ２６７（±０．３）
ＥｃｏＲＩ添加後 ２６８（±１．３）
ＢｇｌＩＩ添加後 ２３０（±０．３）
上記の結果から理解される如く、ｍＰ値は、ＮｏｔＩ又はＥｃｏＲＩを添加しても実質的に変化せず、ＢｇｌＩＩを添加することで、初めて、変化することを示している。即ち、上記の結果は、λＤＮＡ１ｋｂｐ断片を特異的に切断するＢｇｌＩＩを添加することで、タンパク質λ−ｃｒｏが結合するＤＮＡ、即ち、λＤＮＡ１ｋｂｐ断片が切断され、これにより、λ−ｃｒｏの運動の速さが変化したことを示している。かくして、本発明の第二の実施形態に於ける制限酵素を用いた手法によれば、ＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位を含むＤＮＡ分子又は断片を特定することができることが示された。
なお、上記の実施例は、本発明の有効性を検証するために、結合部位が既知のＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質を試料としているが、結合部位が未知のＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質を用いても、ほぼ同様に上記の処理過程が実施され、結合配列又は結合配列を含む領域若しくは塩基配列を検出又は同定することができることは理解されるべきことである。
また、上記の二つの実施例を参照して、理解されるべきことは、本発明の方法に於いては、実施例に示したようにタンパク質を蛍光標識することで、未標識のオリゴＤＮＡを用いて相互作用を調べることができる点である。未標識のオリゴＤＮＡを使った場合、蛍光標識ＤＮＡを使う実験系に比べ大幅にコストを下げることができる。更には蛍光標識がタンパク質にあるため、任意の長さのＤＮＡにて相互作用の検出を行なうことができる。（蛍光標識されたＤＮＡを使うとすれば、予め、被検ＤＮＡの種類の数だけ、蛍光標識されたＤＮＡを準備する必要があるかもしれない。）また、試験管内の反応であること、或いは、同一の反応液に酵素を添加していくことで最小の反応液で実験を行うことができ、実験材料と手間を最小化することができる。
図１は、本発明の方法の好ましい第一の実施形態に於ける処理過程をフローチャートの形式にて示したものである。 図２は、図１の実施形態の処理過程中に於けるＤＮＡ分子の構造の変化を模式的に表したものである。（Ｅ）は、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）の状態の蛍光相関分光法に於ける蛍光強度の自己相関関数の時間変化の例を示す。 図３は、本発明の方法の好ましい第二の実施形態の複数種のＤＮＡを含むＤＮＡ混合物からＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位を含むＤＮＡ分子を検出する過程に於けるＤＮＡ分子の構造の変化を模式的に表したものである。 図４は、図３に例示されるＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位を含むＤＮＡ分子を検出する処理過程をフローチャートの形式にて示したものである。 図５は、本発明の方法の好ましい第二の実施形態のＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位を絞り込む過程に於けるＤＮＡ分子の構造の変化を模式的に表したものである。 図６は、図５の例示されるＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位を絞り込む処理過程をフローチャートの形式にて示したものである。
符号の説明
１、８−１０、１３、１４…ＤＮＡ
２−５…ＤＮＡ断片
６、１１…結合部位
７、１２…ＤＮＡ結合性タンパク質
１５、１６…ＤＮＡ断片

Claims (15)

  1. ＤＮＡ結合性タンパク質と結合するＤＮＡの結合部位を含む領域を検出する方法であって、
    蛍光標識したＤＮＡ結合性タンパク質と該ＤＮＡ結合性タンパク質が結合することが既知である第一のＤＮＡとを含む第一の混合液を調製する過程と、
    前記第一のＤＮＡ上の結合配列を含んでいるか否かが検査される第二のＤＮＡと前記蛍光標識したＤＮＡ結合性タンパク質とを含む第二の混合液を調製する過程と、
    前記第一及び第二の混合液の蛍光強度を測定する過程と、
    前記第一及び第二の混合液の蛍光強度に基づいて、前記第一の混合液中の前記ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さと前記第二の混合液中の前記ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さとに差があるか否かを判定する過程とを含み、
    前記ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さに差があるか否かに基づいて、前記第一のＤＮＡに於ける結合部位を含む領域を検出することを特徴とする方法。
  2. 請求項１の方法であって、前記第二のＤＮＡが前記第一のＤＮＡの塩基配列の少なくとも一部と同一の塩基配列を有することを特徴とする方法。
  3. 請求項１の方法であって、前記ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さが前記ＤＮＡ結合性タンパク質の結合するＤＮＡ分子の長さの関数であることを特徴とする方法。
  4. 請求項１の方法であって、前記第二のＤＮＡが前記第一のＤＮＡより短いＤＮＡ断片であり、前記第二の混合液が前記第一の混合液に前記ＤＮＡ断片を加えることにより調製され、前記ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さに差があると判定された場合に、前記ＤＮＡ断片にある塩基配列が前記ＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位を含んでいると判定することを特徴とする方法。
  5. 請求項４の方法であって、複数の種類の前記第一のＤＮＡより短いＤＮＡ断片が調製され、前記複数の種類のＤＮＡ断片が各々前記第一の混合液へ加えられて複数の第二の混合液が調製されることを特徴とする方法。
  6. 請求項４の方法であって、前記ＤＮＡ断片が、前記第一のＤＮＡの一部分と同一の塩基配列から成ることを特徴とする方法。
  7. 請求項１の方法であって、前記第二の混合液が前記第一の混合液へ第一の制限酵素を加えて調製され、前記ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さに差があると判定された場合に、前記制限酵素で切断される第一のＤＮＡに前記ＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位が含まれていると判定することを特徴とする方法。
  8. 請求項１の方法であって、前記第一のＤＮＡが複数の種類のＤＮＡから成り、そのうちの少なくとも一つが前記ＤＮＡ結合性タンパク質と結合することが既知であるがどのＤＮＡに結合するかが未知であるＤＮＡ混合物であり、前記第二の混合液が前記第一の混合液へ第一の制限酵素を加えて調製され、前記第二のＤＮＡが前記ＤＮＡ混合物の一部を前記第一の制限酵素により断片化してなるＤＮＡ断片を含み、前記第一及び第二の混合液中の前記ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さに差があった場合に、前記第一のＤＮＡのうち前記第一の制限酵素により切断されたＤＮＡに前記ＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位が含まれていると判定することを特徴とする方法。
  9. 請求項８の方法であって、前記第一のＤＮＡに含まれる前記複数の種類のＤＮＡが互いに異なる制限酵素により切断されることを特徴とする方法。
  10. 請求項７乃至９の方法であって、更に、前記第一又は第二の混合液に前記第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素を加えて第三の混合液を調製する過程と、前記第三の混合液の蛍光強度を測定する過程とを含み、前記第一又は第二及び第三の混合液の蛍光強度に基づいて、前記第一又は第二の混合液中の前記ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さと前記第三の混合液中の前記ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さとに差があるか否かを判定する過程とを含み、前記第一又は第二及び第三の混合液中の前記ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さに差があった場合に、前記第一又は第二のＤＮＡのうち前記第二の制限酵素により切断されたＤＮＡに前記ＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位が含まれていると判定することを特徴とする方法。
  11. 請求項７乃至９の方法であって、更に、それまで調製された混合液に更にそれまで追加された制限酵素とは別の制限酵素を加えて新たな混合液を調製する過程と、前記新たな混合液の蛍光強度を測定する過程と、前記それまで調製された混合液の蛍光強度と前記新たな混合液の蛍光強度とに基づいて、前記それまで調製された混合液及び前記新たな混合液中の前記ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さに差があった場合に、前記それまで調製された混合液中に含まれるＤＮＡのうち前記別の制限酵素により切断されたＤＮＡに前記ＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位が含まれていると判定する過程を少なくとも一回反復することを特徴とする方法。
  12. 請求項１の方法であって、前記第一のＤＮＡが複数の種類のＤＮＡから成り、そのうちの少なくとも一つが前記ＤＮＡ結合性タンパク質と結合することが既知であるがどのＤＮＡに結合するかが未知であるＤＮＡ混合物であり、複数の第二の混合液が、複数の制限酵素を各々別々に前記第一の混合液へ与えることにより調製され、前記複数の第二の混合液の各々の第二のＤＮＡが、対応する制限酵素により前記ＤＮＡ混合物の一部を断片化してなるＤＮＡ断片を含み、前記第一の混合液の前記ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さと前記複数の第二の混合液のいずれかのうちの前記ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さとに差があった場合に、前記第一のＤＮＡのうち、前記ＤＮＡ結合性タンパク質の運動の速さに差を生じた第二の混合液に加えられた制限酵素により切断されたＤＮＡに前記ＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位が含まれていると判定することを特徴とする方法。
  13. 請求項１乃至１２の方法であって、前記混合液の蛍光強度の測定が蛍光相関分光法により行われることを特徴とする方法。
  14. 請求項１乃至１２の方法であって、前記混合液の蛍光強度の測定が蛍光偏光解消法により行われることを特徴とする方法。
  15. 請求項１乃至１２の方法であって、前記混合液の蛍光強度の測定が二次元蛍光強度分布分析法による蛍光偏光解消法により行われることを特徴とする方法。
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