KR100196062B1 - 세포를 성장시키기 위한 방법, 조성물 및 장치 - Google Patents

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로버트 에프. 게이민
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Abstract

배양액에서 조혈세포를 성장시키기 위한 방법, 조성물 및 장치가 제공된다. 적절한 수준의 영양분 및 성장 인자가 실질적으로 계속 보유되면서 한편으로 바람직하지 않
은 대사 산물이 제거되는 생물반응기가 제공된다. 형질전환된 간질세포, 특히 이종성 세포에 의한 분비를 통해서 최소한 하나의 성장 인자가 제공된다. 간질세포와 조혈세포를 별도로 유지하여 조혈세포의 제거를 용이하게 하기 위한수단이 제공된다.

Description

[발명의 명칭]
세포를 성장시키기 위한 방법, 조성물 및 장치
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본 발명은 정상 포유동물 세포를 배양액에서 성장시키는 것에 관한 것이다.
[배경]
광범위한 치료 목적으로 세포를 사용하는 능력에 대해 관심이 모아져 있다. 조혈계는 병원체, 독소, 종양 세포, 및 그 밖의 질병으로부터 포유동물 숙주를 보호하는데 관여하는 특수 범위의 세포를 예시한다. 조혈계는 단일의 간세포에서 진화한 것으로 믿어지며, 이러한 간세포로부터 모든 계통의 조혈계가 유래된다. 간세포가 증식하고 분화하여 계통으로 결정되는 특정한 방식은 완전히 이해되어 있지 않고, 인자도 규명되어 있지 않다. 그러나, 간세포가 특정 계통이 되면, 다수의 인자, 예컨대 간세포를 특정 성숙 세포계통으로 만들거나 유도시킬 수 있는 콜로니 자극 인자가 드러난다.
혈구는 다양한 용도로 사용된다. 혈소판은 출혈에 대한 보호작용을 할 뿐만 아니라 혈소판 유도된 성장 인자의 공급원으로도 사용된다. 적혈구는 산소운반을 유지시키기 위해 수혈에 사용될 수 있다. 특이적인 림프구는 각종 질병의 치료에 사용될 수 있으며, 이러한 경우 림프구는 항원의 에피토프를 특이적으로 감작한다. 상기 목적과 그 밖의 다수의 목적이 고려될 수 있다.
이러한 세포를 제공하기 위하여, 포유동물 숙주에 투여하기 전에 또는 투여한 후에, 세포를 배양액 중에서 성장시켜 소망하는 성숙 세포를 생성시킬 수 있는 수단을 제공하는 것이 필요할 것이다. 조혈세포는 골수의 일부로서, 뼈에서 성장하여 성숙하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 골수와 실질적으로 동일한 환경을 제공할 뿐만 아니라, 배양액에서 성장하는 이들 세포를 특정 계통으로 유도시킬 수 있는 시스템을 재생성하는 것에 관심이 대두되고 있다.
[관련 문헌]
조혈세포의 성장을 위해 지질세포를 포함하는 3차원 시스템이 설명되어 있는 미합중국 특허 제4,721,096호(이 문헌에서 인용되는 참고문헌도 참조가능). 마우스의 메탈로티오네인-l 유전자를 설명하고 있는 글랜빌 등의 문헌[Glanville, et al, Nature 292 : 267-269 (1981)]. 사람 GM-CSF를 설명하고 있는 웡 등의 문헌[Wong, et al, Science 228 : 810-815 (1985)]. 조혈간세포에 대한 마아커로서의 레트로바이러스-매개 유전자 전달과, 이식후 조혈 간세포의 동태의 추적을 설명하고 있는 레미쉬카 등의 문헌[Lemischka, et al., Cell 45 : 917-927 (1986)]. 사람 IL-3을 설명하는 양 등의 참고문헌[Yang, et al., Cell 47 : 3-10(1986)]. 플라스미스 DNA에 의한 포유동물 세포의 형질전환을 설명하고 있는 첸 및 오까야마의 문헌[Chen and Okayama, Mol. Cell. Biol. 7 : 2745-2752 (1987)]. 사람 CD2 유전자를 설명하고 있는 그리에이브스 등의 문헌[Greaves, et al, Cell 56 : 979-986 (1989)].
[발명의 요약]
본 발명은 간세포를 포함하여 조혈세포, 특히 성숙 초기단계의 세포를 배양액에서 효율적으로 증식시키는 반응기 및 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 성장인자의 구성적 또는 유도적 생성을 제공하는 형질전환된 지질세포를 사용하는데, 이러한 세포는 조혈세포를 용이하게 분리시키기 위해 물리적으로 분리된다. 연속적인 관류를 제공함으로써, 고밀도 및 고수율로 생존가능한 조혈세포를 수득할 수 있다. 반응기는 지질세포용으로 및 지질세포와 조혈세포의 분리를 유지시키기 위해 단백질 표면을 사용한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 관류 챔버의 개략도이고,
제2도는 관류 배지 경로를 개략적으로 도시한 흐름 설명도이다.
[특정 구체예의 설명]
본 발명은 성장 인자를 제공하는 형질전환된 섬유아세포, 형질전환된 세포와 조혈세포의 혼합물에 첨가되는 단백 성분, 및 효과적인 성장 환경을 유지시키기 위한 실질적으로 연속적인 관류를 사용하여, 배양액에서 조혈세포를 성장시키기 위한 방법을 제공한다. 따라서, 방법에 대한 설명은 관류조건에 대한 설명, 반응기 및 이것의 내부 구조에 대한 설명, 및 형질전환된 섬유아세포에 대한 설명으로 나누어질 수 있다.
반응기는 필요한 세포 분포, 영양분 및 산소의 유입을 가능하게 하고, 노폐 대사 생성물의 분리 및 세포의 수집이 가능한 편리한 형태를 가질 수 있는 용기를 포함한다. 반응기는 실질적으로 뼈 관류를 모방하는 조건을 제공해야 한다. 생체내에서는 1분에 골수 1㎖당 약 0.08㎖의 혈청이 관류된다. 이는 하루에 106개의 세포당 약 3㎖의 혈청이 관류되는 것으로 표현된다. 따라서, 배지는 성장을 제한하지 않는 대사 생성물의 수준을 유지하기 위하여 임의의 24시간 동안에 평균적으로 50% 이상, 바람직하게는 100% 이상이 교환될 것이다. 교환율은 일반적으로 하루에 106개의 세포당 약 5 내지 10㎖의 관류 배지일 것이며, 이러한 값은 생체내 관류율을 실험적으로 모방한 값이다.
조혈세포 및 지질세포를 성장시키기 위하여 다양한 배지가 사용될 수 있다. 예시적인 배지로는 5 내지 20%의 우태아 혈청, 5 내지 20%의 우혈청 및 5 내지 15%의 말혈청의 조합물이 보충될 수 있는 MEM, IMDM, RPMI, 또는 PDGF, EGF, FGF 또는 지질세포나 간세포를 자극하는 그 밖의 성장 인자로 보충되는 무혈청 배지가 있다. 형질전환된 섬유아세포에 의해 제공되는 성장 인자를 보충하기 위하여, 추가의 성장 인자를 관류 배지에 포함시킬 수 있으며, 특히 특정계통의 전용 세포를 소망하는 경우에 그러하다. 지질세포 분비 또는 첨가에 의하여 관류 배지에 포함시킬 수 있는 성장 인자에는 GM-CSF, G-CSF, 또는 M-CSF, 인터루킨 1 내지 7(특히, 1, 3, 6 및 7), TGF-α 또는 β, 에리트로포이에틴 등이 있고, 특히 사람 인자가 있다. 하나 이상, 바람직하게는 둘 이상의 성장 인자가 형질전환된 세포로부터 분비되어 제공될 것이며, 이러한 세포는 관류 배지내에서 인자를 소망하는 수준으로 유지시키기에 충분한 양으로 존재할 것이라고 이해된다.
편의상, 반응기내의 온도는 생리적 온도, 즉 37℃가 사용될 것이지만, 33℃를 포함하여, 일반적으로 25℃ 이상인 보다 낮은 온도도 사용될 수 있다. 습도는 일반적으로 약 100%이며, 이 경우 공기는 약 5%의 이산화탄소를 함유할 것이다. 관류 배지는 반응기 외부에서 또는 반응기 내부에서 산소화될 수 있으며, 내부 산소화를 위하여 다양한 수단이 제공된다. 내부 산소화는 중공 섬유, 다공성 소결 디스크, 실리콘 튜브 또는 적당한 다공성 및 소수성을 갖는 그 밖의 막에 의해 달성될 수 있다. 영양분 수준과 대사 생성물 수준은 일반적으로 비교적 좁은 범위로 유지될 것이다. 글루코오스 수준은 통상 약 5 내지 20mM, 대개는 약 10 내지 20mM이고, 락테이트 농도는 통상 약 35mM 미만으로 유지되며, 20mM를 초과할 수 있다. 글루타민 농도는 일반적으로 약 1 내지 3mM, 대개는 1.5내지 2.5mM로 유지되는 반면에, 암모니아 농도는 대개 약 2.5mM 미만, 바람직하게는 약 2.0mM 미만으로 유지될 것이다.
유체의 흐름은 중력, 펌프, 또는 그 밖의 수단에 의해 이루어질 것이며, 여기서, 흐름은 반응기내의 충전 특징에 따라 임의의 한 방향 또는 여러방향으로 일어날 수 있다. 바람직하게는, 흐름이 실질적으로 반응기를 가로질러 수평으로 일어나는 경우에는 좌우 흐름이 사용될 수 있으며, 흐름이 반응기의 기저부에서 상층으로 또는 그 역으로 일어나는 경우에는 상하 유동이 사용될 수 있다.
반응기에는 세포의 부착성 성장을 제공하는 반면에, 지질세포와 조혈세포 사이의 약간의 물리적 분리를 유지하고 간질세포와 조혈세포 사이의 약간의 접촉 또는 밀접한 병치를 가능하게 하기 위해 다양한 충전이 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 지질세포에 의해 분비된 인자는 조혈세포에 의해 쉽게 흡수되어 조혈세포의 증식 및 필요에 따라, 분화 및 성숙을 촉진시킨다.
세포 지지용 단백질 매트릭스는 조각난 콜라겐 입자, 예를 들어 스폰지 또는 다공성 콜라겐 비이드, 골수로부터의 세포외 뼈 매트릭스 단백질로 구성된 스폰지 또는 비이드, 또는 단백질 피복된 막의 형태를 가질 수 있으며, 이러한 경우에 단백질은 콜라겐, 피브로넥틴, 헤멕틴, RGDS 펩티드, 혼합된 골수 매트릭스 단백질 등 일 수 있다. 막의 구멍 크기는 상이한 세포타입 간의 상호작용이 가능하지만 여전히 물리적인 분리를 유지시키기 위하여 약 1 내지 5μ인 것이 일반적이다.
막은 단백질로 피복된 것이 사용될 수 있다. 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리술포네이트 등과 같은 다양한 막 물질이 사용될 수 있다. 다양한 단백질, 특히 콜라겐 도는 앞서 언급한 그 밖의 단백질이 사용될 수 있다. 막의 구멍은 형질전환된 세포가 막을 통과할 수 없을 정도로 충분히 작아야 하지만, 형질전화된 세포가 성장하여 막의 한쪽 면에 컨플루언트층을 형성할 수 있고, 세포막의 일부를 구멍안으로 확장시킬 수 있을 정도여야 한다. 일반적으로 구멍의 크기는 약 1 내지 5μ일 것이다. 이러한 방식으로, 조혈 간세포는 막의 반대쪽 면에서 성장하여 형질전환된 세포와 상호반응함으로써, 인자들은 형질전환된 세포로부터 조혈성 선구 세포로 직접 전달될 수 있다. 선구세포, 즉 간세포는 구멍에 들어간 관입된 세포질 돌출부에 부착될 수 있다. 간세포로부터 조혈세포로의 분화는 막의 한쪽면에서 일어나며, 분화된 프로제니는 섬유아세포로부터의 세포질 돌출부에 의하여 이미 대부분이 점유된 구멍에 다시 파고들 수 없다. 조혈세포가 성숙하여 분화됨에 따라, 조혈세포는 막으로부터 영양 배지로 방출될 것이다.
반응기의 중심부에 다양한 입자가 충전되어 중심 챔버가 규정되고, 이러한 중심 챔버는 상부 챔버 및 하부 챔버와 분리될 것이다. 다른 방법으로, 하나 또는 다수의 막이 도입될 수 있으며, 이 경우 2개의 막이 지질세포 또는 조혈세포의 어느 하나와 관련된 영역을 규정할 것이고, 이러한 영역에는 지질세포와 조혈세포가 교대로 올 것이다. 이러한 방식으로, 조혈세포 및 지질세포의 챔버 사이에 차동 관류율을 제공할 수 있다. 배지 교환율은 일반적으로 상기에 언급한 범위에 속할 것이다.
제1도는 관류 챔버의 개략도이다. 반응기(10)는 커버 플레이트(12)와 플로어(floor) 플레이트가 볼트(16)에 의해 결합되어 있고, 윙 너트(18)에 의해 고정되어 있다. 휨을 방지하기 위하여 3개의 볼트가 사용된다. 챔버(20)는 3부분으로 이루어지며, 중심부(22)는 지질세포에 대한 지지 매트릭스, 지질세포의 베드 및 골수 세포를 함유하고 있다. 중심부(22)는 막 또는 메쉬(28 및 29)에 의해 상부(24)와 기저부(26)로부터 각각 분리되어 있다. 편의상, 폴리술포네이트 막, 또는 스테인레스 강 메쉬가 사용될 수 있는데, 이 경우 메쉬 크기는 세포가 챔버의 중심부내에 함유되어 있을 정도로 충분히 작다. 분리 인터페이스는 별도의 기계적 지지력을 제공하기 위해 구획화시킨 내부 실린더(27)를 사용하여 챔버내에 위치시킬 수 있다. 상부(24)와 기저부(26)는 동일할 필요는 없고, 튜브 또는 막을 가질 것이며, 이러한 튜브 또는 막을 가로질러 액체 배지와 기체가 교환된다. 기체는 소수성 튜브, 예를 들어 실리콘 튜브를 가로질러 교환되며, 튜브의 길이(및 이에 따른 기체/액체 접촉면적)는 중심부에서 대사중인 세포 개체군의 필요량을 유지시키기에 충분한 기체 유량을 제공하도록 변할 수 있다. 배지는 포트(32)를 통해서 상부 또는 기저부로부터 직접 펌프되거나 흡출될 수 있고, 전달 튜브(34)를 통해서 공급될 수 있다.
소망에 따라, 상부와 기저부는 외부 산소화기를 사용하여 제거될 수도 있다. 이러한 경우, 분리 막은 원통형 그루브 플레이트(12 및 14)와 합치되어 있는 유리 실린더(36) 아래의 적절한 위치에 고정되며, 그루브 플레이트의 내부 영역은 막을 가로지르는 양호한 흐름 분포를 제공하도록 만입되어 있다. 이러한 기하학적 형태는 한정된 수의 입구 포트로부터 유입되는 유체를 혼합시키고 압력을 평형시킴으로써, 분리 막을 교차하는 액체 흐름을 균일하게 한다. 이러한 구성은 비교적 세포가 거의 없어 산소화가 제한을 받지 않는 챔버에 적당하다.
제2도에는 관류 챔버를 사이드 배지 저장기, 산소화기, 센서 챔버, 및 샘플/주입 포트와 연결시킨 루프가 개략적으로 도시되어 있다.
외부의 신선한 배지 공급원(50)은 펌프(52)에 의하여 라인(56)을 통해서 배지 저장기로 펌프되고, 소모된 배지는 펌프(52)에 의해 저장기(54)로부터 라인(58)을 통해 추가 가공용 소모 배지 컨테이너(60)로 흡출된다. 제2 펌프(62)는 배지를 배지 저장기(54)로부터 라인(64)을 통해서 중공 섬유 산소화기(66)로 펌프시킨다. 배지는 라인(68)을 통해서 생물반응기의 제1 챔버(70)에 전달된다. 필요에 따라, 배지 성분 주입용 수단(82)을 제공하여, 성분을 라인(68)에 도입시킴으로써 배지에 의해 생물반응기의 제1 챔버(70)내로 운반시킨다. 성분으로는 시험 성분, 추가 인자등이 있다. 생물반응기(70)로부터의 배지는 중심 챔버(72)를 통하여 생물반응기의 제2 챔버(74)로 전달된다. 배지는 제2 챔버로부터 라인(76)에 의하여 인라인(in-line) 센서(78)로 전달되어 배지 조성의 변화가 검출된다.
예를 들어, 글루타민 대 글루코오스 비율은 사용되는 세포계통에 따라 약 1:5-8인 것이 바람직하며; 예를 들어, 트랜스펙션된 3T3 세포에 대해서는 1:8이 바람직하다. 또한, 암모늄 농도는 약 2.0mM 미만인 것이 바람직하고, 락테이트 농도는 약 40mM 미만인 것이 바람직하다. 생물반응기로부터의 유출액을 모니터링함으로써, 생물반응기에 도입되는 배지를 조절할 수 있고, 산소 분압을 변화시킬 수 있으며, 기체 유속을 변화시킬 수 있고, 다양한 성분을 증대시킬 수 있거나 관류율을 감소 또는 증가시킬 수 있다.
배지는 센서(78)로부터 펌프(62)에 의해 라인(80)을 통하여 저장기(54)로 전달된다.
전술한 흐름 경로에 의하여, 사이드 저장기 내의 배지는 별도의 펌프를 사용하여 서서히 교환된다. 이러한 구성으로 배지 교환율(외부펌프) 및 산소화기와 관류 챔버를 통과하는 유속을 개별적으로 제어할 수 있다. 전자는 배지 조성 및 관류의 장기간 변화를 제어하기 위해 사용되는 반면에, 후자는 챔버내에서의 용존산소 분압 및 흐름 패턴을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 작은 메쉬의 생체적합성 막을 사용함으로써, 챔버내에서 플러그(피스톤) 흐름이 가능해지고, 이에 따라 매우 정확한 양으로 조혈세포 및 지질세포에 도입시키고자 하는 성장 인자 및 그 밖의 특수 화합물의 전달이 정확하게 제어될 수 있다.
챔버 및 루프의 구성요소를 가압멸균시킨 후에, 반응기를 멸균 환경하에서 조립한다. 배지는 수일 동안 사이드 루프 및 챔버를 통해서 순환시킬 수 있으며, 이 동안에 오염의 표시가 모니터링된다. 멸균 어셈블리가 완성된 경우, 챔버의 중심부를 세포외 매트릭스만으로 또는 지질세포를 함유하는 예비접종된 세포외 매트릭스 지지체로 접종한다. 그런 다음, 지질세포에 대해 다음의 2가지 방법중 하나를 수행한다: 1) 수 일동안 챔버내에 방치하여 지질세포의 대사능 및/또는 성장 인자 반응성을 모니터링하고, 결과가 만족스러운 경우 골수를 접종시키거나; 2) 즉시 골수와 함께 시이딩(seeding)시킨다. 어느 경우이든지 세포층은 관류 챔버의 중심부의 기저에 유지된다. 세포는 추가의 세포외 매트릭스에 놓여지고, 세포층은 분리막에 부착된다. 이 경우, 챔버를 뒤집어서 세포층을 중심부의 상부에 위치시킬 수 있다. 이러한 구성에서, 성숙한 세포는 지질층에 대한 부착성의 소실로 인해 중심 챔버의 기저에 침강할 것이다. 이러한 특징은 성숙 세포 및/또는 덜 성숙한 조혈세포에 의해 유발되는 지질층의 손상을 방지하는 데에 중요하다. 이런한 특징은 성숙 세포의 연속적인 분리를 보다 용이하게 한다.
이들 세포는 주사기로 세포를 빼내거나, 관류시킨 배지의 압력에 의하여 출구 튜브를 통해 챔버 밖으로 연속적으로 유동시킴으로써 수집된다.
지질세포는 대부분의 경우에 소망하는 조혈세포 성장인자를 제공하는 하나 이상의 유전자로 형질전환된 섬유아세포일 것이다. 동일하거나 상이한 세포가 숙주 세포의 특정한 선택에 따라 유전자로 트랜스펙션될 수 있으며, 동일하거나 상이한 세포가 다수의 유전자에 대해 사용될 수 있다.
광범위한 정상 세포 또는 안정한 계통이 사용될 수 있다. 그러나, 일부 세포 계통의 형질전환은 세포의 과잉 성장을 초래할 수 있기 때문에 모든 세포 계통이 허용되는 것이 아님이 밝혀졌다. 바람직하게는, 사용되는 세포가 종양성이 아니며, 지지체에 대해 부착성일 필요가 있다. 포유동물 세포는 사람이나 영장류의 세포일 필요는 없다. 정상 사람 골수 부착성 세포, 정상 사람 비장 부착성 세포 및 정상 사람 흉선 상피 세포를 포함하여 다양한 비형질전환된 세포도 부착성 세포층에 포함될 수 있다.
섬유아세포를 포함하여 포유동물 세포를 형질전환시키는 방법은 널리 공지되어 있으며, 광범한 문헌이 존재하지만 이중이 일부만이 앞서 인용되어 있다. 구성물에는 프로모터 및 필요에 따라, 인핸서를 포함하는 자연발생적인 전사 개시 조절 영역이 사용될 수 있거나 유도적 또는 구성적일 수 있는 상이한 전사 개시 영영기 사용될 수 있다.
유도적 또는 구성적인 다수의 전사 개시 영역이 이용가능한데, 이들 영역은 자연발생적인 인핸서 또는 제공될 수 있는 인핸서와 결합될 수 있으며, 특정 세포 타입에서만 유도될 수 있거나, 다수 또는 모든 세포 타입에서 기능적일 수 있다. 전사 개시 영역은 바이러스, 즉 자연발생적인 유전자로부터 유래될 수 있거나 합성될 수 있으며, 이들의 조합물일 수 있다.
입수가능하고 용도가 밝혀진 프로모터로는 마우스 또는 사람 메탈로티오네인-Ⅰ 또는 Ⅱ 프로모터, β-액틴 프로모터 등과 같은 염색체성 프로모터, 또는 예를 들어 SV40 초기 유전자 프로모터, CMV 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, 레트로바이러스의 LTR과 결합된 프로모터 등과 같은 바이러스성 프로모터가 있다. 이들 프로모터는 입수가능하며, 관심있는 유전자 뿐만 아니라 전사 개시 영역의 삽입을 위한 폴리링커를 포함하는 적절한 벡터에 용이하게 삽입될 수 있다. 그 밖의 경우에, 전사 개시 영역과 전사 종결 영역 사이에 폴리링커를 제공하며, 또한 번역을 위한 메신저의 프로세싱과 관련된 다양한 신호, 즉, 캡 부위와 폴리아데닐화 신호를 제공하는 발현벡터가 이용가능하다. 조절 영역과 구조 유전자를 포함하는 발현 카세트의 구성에는 하나 이상의 제한 효소, 어댑터, 폴리링커, 생체외 돌연변이 유발, 프라이머 수정, 절제 등이 사용될 수 있다.
발현 카세트는 통상 마아커와 하나 이상의 복제 시스템을 포함하는 벡터의 일부일 것이다. 마아커는 발현 카세트와 마아커가 도입되는 세포를 검출 및/또는 선택할 수 있다. 다양한 마아커가 사용될 수 있는데, 독소, 특히 항생물질에 대한 내성을 제공하는 마아커가 사용될 수 있다. 포유동물 세포 숙주의 경우에 G418에 대한 내성을 제공하는 겐타마이신 내성을 사용하는 것이 바람직하다. 복제 시스템은 원핵 생물의 복제 시스템을 포함할 수 있으며, 이러한 시스템은 발현 카세트의 개개의 성분이 합쳐지는 다양하는 단계 동안에 클로닝시킬 수 있다. 복제 시스템은 대부분 숙주의 염색체로 발현 카세트를 일체화시키기 위해 선택되지만, 그 밖의 복제 시스템이 숙주 세포에서 에피솜 요소를 유지시키기 위해 사용될 수 있다.
발현 카세트를 숙주로 도입시키기 위하여, 칼슘 침전 DNA를 이용한 형질전환, 트랜스펙션, 인펙션, 일렉트로포레이션, 충격 입자법을 포함하는 통상의 방법이 이용될 수 있다. 숙주 세포가 형질전환되면, 숙주 세포를 선택제가 함유된 적절한 영양배지에서 증폭시킴으로써 마아커를 포함하는 세포가 선택된다. 그런 다음, 생존하는 세포를 증폭시켜 사용할 수 있다.
사용될 수 있는 숙주 세포로는 아프리카 그린 원숭이 세포계통 CV1, 마우스 세포 NIH-3T3, 정상 사람 골수 섬유아세포, 사람 비장 섬유아세포, 정상 마우스 골수 섬유아세포, 및 정상 마우스 비장 섬유아세포가 있다. 일부의 경우에는 벡터 및 세포계통의 선택 여하에 따라 세포가 종양성이 될 수 있음을 주지해야 한다. 생성되는 형질전환된 세포는 부착성을 가질 수 있어서, 형질전환된 세포가 단백질 스폰지, 단백질 피복된 막 등과 같은 지지체에 결합된 상태가 유지되는 것이 중요하다.
적절한 성장 인자를 발현시키기 위한 벡터가 구성되면, 이러한 벡터는 임의의 편리한 수단에 의해서 세포를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다. 그런 다음, 생성되는 형질전환된 세포는 전술한 바와 같은 지지체에 시이딩하기 위해 사용될 수 있다. 이들 지지체는 반응기에 도입될 수 있거나, 반응기에 시이딩할 때에 존재할 수 있다. 세포는, 생존가능하고 소망하는 성장 인자를 생성할 수 있음을 보장하기에 충분한 시간동안 성장시킨다.
그런 다음, 반응기는 필요에 따라, 조혈세포로 시이딩될수 있다. 조혈세포로는 실질적으로 순수한 간세포, 실질적으로 하나 이상의 계통의 성숙한 조혈세포가 없는 조혈세포의 혼합물, 또는 성숙도가 다양한 단계에 있는 모든 또는 실질적으로 모든 다양한 계통의 조혈 시스템을 포함하는 혼합물이 있을 수 있다.
세포는 반응기를 통해 실질적으로 연속적인 관류에 의해 성장시키면서, 포함된 각종 영양분 및 인자를 모니터링한다. 대부분의 경우에, 주로 인자는 지질세포에 의해 제공되어, 성장 인자의 정상 상태 농도가 일반적으로 달성될 것이다. 상태조절된 상징액이 조혈세포의 성장에 효과적인 것으로 밝혀졌기 때문에, 반응기에서 성장 인자를 적절한 농도수준으로 유지시킬 지질세포 대 조혈세포의 비율을 제공할 수 있다.
트랜스펙션된 지질은 사람 간세포에 유전자를 도입시킬 수 있다. 마우스의 경우, 레트로바이러스 매개된 간세포로의 유전자 전달은 마우스를 5-FU로 전처리한 후에, 수집된 골수 세포를 IL-3과 GM-CSF를 함유하는 WEHI 상태조절된 배지에서 성장시킴으로써 가능해진다(Lemischka, Cell 45 : 917, 1986). 관심있는 레트로바이러스 벡터를 분비하는 레트로바이러스 패키징 세포계통과 함께 성장시킨 합성 지질은 유전자를 사람 간세포에 효율적으로 도입하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 사람 T세포는 T세포에서의 조직 특이적 발현을 가능하게 하는 CDC2 조절 서열(Greaves, Cell 56 : 979-986, 1986)의 제어하에서 HIV 안티센스 서열을 함유하는 레트로바이러스 벡터로 간세포를 감염시킴으로써 HIV 감염에 대한 내성을 부여할 수 있다. 레트로바이러스의 복제에 필수적인 레트로바이러스 패키징 세포계통에 의해 제공되는 1가지 인자가 존재할 것이며; 이러한 인자는 조혈성 표적 세포에는 없을 것이다. 바이러스가 조혈성 표적 세포에 전달된 경우, 바이러스는 더 이상 복제가 불가능할 것이다.
다음의 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것이 아니다.
[실험예]
[Ⅰ. 형질전환체의 형성]
성장인자 사람 GM-CSF(Wong, Science, 228 : 810-815 (1985))를 진핵 발현 벡터에 삽입하였다. hGM-CSF cDNA(EcoRI서 AhaIII까지 대략 700bp의 단편)를 pSP65(Melton, Nucl. Acids Res. 2 : 7035-7056 (1984))의 EcoRI에서 PstI까지의 단편에 클로닝시켰다. 생성되는 플라스미드는 pSP65 GM-CSF였다. 마우스 메탈로티오네인 프로모터(Glan ville, Nature, 292 : 267-269 (1981))를 EcoRI과 BgI II로 소화시켜, 프로모터를 함유하는 약 2kb의 단편을 pSP65의 EcoRI에서 BamHI까지의 단편에 삽입시켜 p65MT를 생성하였다. 그런 다음, pSP65GM-CSF를 EcoRI을 소화시키고, 돌출한 부분을 DNA 중합효소 I의 클레노우 단편으로 채운 후, 생성되는 선형 DNA를 Hind III로 소화시켜 GM-CSF의 코딩영역을 포함하는 700bp 단편을 분리함으로써 플라슴드 pMT GM-CSF를 제조하였다. 이 단편을 p65MT의 SaII 충정/Hind III 부위에 서브클로닝시켰다. 그런 다음, 메탈로티오네인 프로모터와 GM-CSF 코딩 영역을 포함하는 2.7kb 단편을 단리하여, SV-40 프로모터가 제거된 pSV2n대(Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet 1 : 327 (1982))에 위치시켰다. 이렇게 하여 GM-CSF 코딩 서열의 다운스트림에 있는 SV-40 폴리 A 신호를 생성시켰다.
항생물질 겐타마이신(G418)에 대한 내성을 부여하는 항 네오마이신 유전자는, 약 3kb의 Pvu II-EcoRI 단편을 단리시키고, Eco RI 링커를 Pvu II 부위상에 위치시킴으로써 pSV2neo로부터 취하였다. Eco RI 말단을 지닌 neo 내성 유전자를 GM-CSF 발현 플라스미드의 Eco RI 부위에 서브클로닝시켜 플라스미드 MTGM-CSFneo를 생성시켰다.
플라스미드 MTGM-CSFneo를, 단독으로 및 SV-40 프로모터와 폴리 A 부위의 제어하에 긴팔원숭이 IL-3 유전자를 코드화하는 플라스미드(Yang, Cell 47 : 3-10 (1986))와의 코트랜스펙션으로, 아프리카 사바나원숭이 세포계통 CV1과 마우스 세포계통 NIH 3T3 세포에 선형 DNA의 일렉트로포레이션에 의해 트랜스펙션시켰다. 형질전환체를 500㎎/㎖의 G418을 함유하는 배지에서의 선택에 의하여 선택하고, 단리시키고, AML-193 세포(Adams, etal., Leukemia 3 : 314 (1989))를 사용하여 상등액을 생물학적 검정에 의해 GM-CSF 또는 IL-3의 생성에 대해 스크리닝하였다. 그런 다음, 여러 개의 양성라인을 덱스터(Dexter) 배양에서 사람 골수 세포에 대한 지질로서 사용하였다.
또한, 정상 마우스 골수 세포를 오까야마(Okayama)의 칼슘/인산염 방법(Chen, Mol. Cell. Biol. 7 : 2745-2752 (1987))을 사용하여 상기 플라스미드로 트랜스펙션시킨 경우, 도입된 유전자를 효율적으로 발현시키는 것으로 밝혀졌다.
형질전환된 섬유아세포에 의한 GM-CSF와 IL-3 분비를 조사하였다. 혈청없이 72시간 배양한 상등액을 NIH-3T3 세포로부터 수득하여, 토끼 항-GM-CSF 또는 항-IL-3 항체를 중화시킴으로써 억제가능한 표적 세포에 대한3H 흡수에 의해 hGF 분비를 검정하였다. 20㎎/㎖의 GM-CSF에 의해 유도된 증식은 100 유니트의 GM-CSF로서 평가되고, 10ng/㎖의 IL-3에 의해 유도된 증식은 100 유니트의 IL-3으로서 평가되었다. 코트랜스펙션된 세포는 약 35유니트/㎖의 GM-CSF 및 약 57유니트/㎖의 IL-3을 생성하였다.
[Ⅱ. 관류 챔버]
관류챔버는 변형없이 가압 멸균이 가능하도록 델린 캡(Derlin cap)이 장착되고 생체적합성이 있는 유리 실린더이다. 캡에는 유리 실린더가 꼭맞게 끼워질수 있는 원통형 그루브가 있다. 그루브의 기저에는 챔버의 루멘을 밀봉하기 위해 O-형 고리가 놓여있다. 캡에는 여러 개의 구멍이 있어, 이 구멍내로 루어(Luer Lok) 기구가 제공되며, 배지 및 기체전달 라인 뿐만 아니라, 챔버의 중심부애로 연장된 튜브가 샘플 부착성 및/또는 비-부착성 세포까지 연장된 튜브가 놓여있다. 캡에는 유리 실린더의 외부에 위치하는 3개의 긴 볼트가 120°간격으로 부착되어 있고, 윙 너트와 와셔가 어셈블리를 단단히 조이기 위해 사용된다.
챔버는 사이드 저장기에 갈고리에 의해 걸려 있다. 루프는 사이드 배지 저장기에 부가하여 펌프, 온-라인 센서를 갖는 챔버, 산소화기, 및 샘플 및 주입 포트를 함유한다. 그런 다음, 사이드 저장기내의 배지는 별도의 펌프를 사용하여 서서히 교환된다. 이러한 구성에 의하여, 산소화기 및 관류 챔버를 통한 배지 교환율 및 유속의 별도의 제어가 가능해진다. 전자는 배지 조성 및 관류의 보다 장기간의 변화를 제어하는데 사용되는 반면에, 후자는 챔버내의 용존 산소압력 및 흐름 패턴을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 메쉬가 작은 폴리술폰산염 막을 사용함으로써, 챔버에서의 플러그 흐름이 가능해지며, 매우 정확한 양으로 생물 반응기에 도입시키고자 하는 성장 인자 및 그밖의 특수 화합물의 전달의 정확한 제어가 가능해진다. 트랜스펙션시킨 지질세포를 조각난 콜라겐 스폰지의 상에 시이딩하거나 지질세포를 콜라겐으로 에비피복된 5μ 다공성 폴리카보네이트 필터의 한쪽 면에 위치시킴으로써, 지질세포를 수 시간에 걸쳐 필터에 부착시킨다.
세포는 한족 면에서 컨플루언트하게 되어 구멍을 통하여 세포질 돌출부를 배출시킬 때까지 적절한 영양 배지에서 성장시킨다. 그런 다음, 골수세포를 막의 다른 쪽 면에 시이딩시키면, 간세포는 구멍을 통해 밀려나온 세포질 돌출부에 부착한다.
챔버 및 루프의 구성요소를 가압멸균시킨 후에, 반응기를 멸균 환경에서 조립한다. 그런 다음, 배지를 사이드 루프 및 챔버를 통해 수 일동안 순환시키면서 오염 여부를 모니터링한다. 생물 반응기의 중심부를 세포외 매트릭스 단독으로 또는 지질세포를 함유하는 예비접종된 세포외 매트릭스 지지체로 접종시킨다. 그런 다음, 지질세포를 수 일동안 챔버내에 유지시키면서 이것의 대사 성능 및/또는 성장 인자 반응성을 모니터링하　, 이 경우, 결과가 만족스러우면 골수를 접종시키거나 즉시 골수를 시이딩한다. 어느 경우이든지, 세포층은 관류 챔버의 중심부 기저에 유지시킨다.
세포를 추가의 세포외 매트릭스 아래에 놓으면, 세포층은 지지체에 부착한다. 막을 사용하는 경우, 챔버를 뒤집어서 세포층을 중심부의 상부에 위치시킬 수 있다. 이러한 구성에서, 성숙세포는 지질층에 대한 부착성의 소실로 인해 중심 챔버의 기저에 침강한다. 그런 다음, 비부착성 세포를 배지 관류 압력에 의하여 생성되는 출구 튜브내로의 일정한 세포 흐름에 의하여 수득한다.
전형적인 작동에서, 챔버를 제 1일에 조각낸 콜라겐 스폰지 지지체상에 NIH-3T3 세포로 접종시켰다. 처음 40일 동안에는 관류율과 그 밖의 작동 변수를 조정하였다. 40일째에 합당한 정상상태가 달성되었고, 이 상태를 약 20동안 유지시켰다. 64일째에 챔버에 33×106개의 사람 골수세포를 시이딩하였다. 처음 10일 동안에 수득된 세포의 수는, 3일마다 생선되는 약 7-8×105개의 세포의 정상 상태로 침강될 때까지 감소하였다. 유량세포계산 분석결과, 일정한 분률, 즉 약 20%의 수득 세포가 HLA-DR 양성인 것으로 나타났다. 90일째에 펌프가 고장났고, pH가 밤새 6.9 밈반으로 떨어졌다. 관류율이 회복되었을 때, 비-점착 세포의 생성률이 회복되었고, 오염 이전의 정상상태 생성률에 근접하였으며, 이때에 세균오염이 일어났다. 이 시점에서 실험을 종결지었다.
상기 결과는 관류 챔버가 생체외 조혈을 수행할 수 있으며, 이러한 조혈은 pH 강하 후에도 생체외에서 회복될 수 있음을 입증하며, 글루코오스 농도 데이타는 조혈세포가 글루코오스를 영양분으로 하여 주로 호기적으로 성장한다는 것을 보여주는데, 그 이유는 접종후 글루코오스 농도가 락테이트의 농도 증가없이 감소하였고, 이는 산소화가 제한적임을 나타내기 때문이다. 글루코오스/락테이트(혐기성) 대사는 주로 NIH-3T3 지질 베드에 의한 것으로 역겨진다. 유사하게, 글루타민 및 암모니아 농도는 조혈세포수의 수준이 감소하면 전-접종물의 수준에 이르게 되는데, 이는 골수 세포에 의한 글루타민 소모가 지질 베드에 의한 소모보다 훨씬 적음을 암시한다.
[Ⅲ. 대사 생성물의 모니터링]
글루타민과 암모니아 뿐만 아니라 글루코오스와 락테이트의 소모율 및 생성률을 트랜스펙션된 NIH-3T3 세포에 대하여 측정하였다. (배지는 IMDM+20% FCS임). 글루코오스 소모율의 증가는 매일 공급된 T-플라스크에서만 관찰된 반면에, 공급 회수가 보다 적었던 모든 배양물은 서서히 감소하는 동일한 글루코오스 흡수율 패턴을 따른다. 매일 50%씩 교환하던 배양액을 18일째에 매일 100% 교환하는 계획으로 변경하였고, 그 결과 1일째부터 매일 100% 교환시킨 배양액에 대하여 관찰된 것과 동일한 경향을 따르는 글루코오스 소모의 즉시 증가가 나타났다. 락테이트 생성률도 유사한 패턴을 따르는데, 이는 글루코오스에 대한 락테이트 수율이 본질적으로 일정하기 때문이다(0.9 락테이트/글루코오스; 주로 호기성 지질 대사를 나타냄).
글루타민과 암모니아 농도는 글루코오스/락테이트 대사와유사한 패턴을 나타낸다. 37℃에서의 글루타민의 화학적 분해에 대하여 보정된 값을 이용함으로써, 글루타민 소모율 대 글루코오스 소모율은 상대적인 흡수율이 일정함을 나타낸다(약 1:8의 글루타민:글루코오스). 예측되는 최적 비율은 산소 흡수율에 따라 변하며, 최적 흡수율이 증가함에 따라 비율은 강하한다.
유사한 결론이 정상 골수 지질 섬유아세포로부터 유도된 글루코오스/락테이트 대사 데이타에 의해 지지된다. 빈번하지 않은 배지 교환 조건하에서 배양은 주로 혐기적이고, 이 경우 락테이트의 고정상상태 수준이 신속하게 달성되고 유지되었다. 배지가 보다 빈번하게 교환되면 세포 대사는 더욱 신속해져서, 글루코오스 소모 및 락테이트 생성이 증가되었다. 글루타민의 검출가능한 소모는 자발적인 화학적 분해에 대한 데이타를 보정한 후에는 관찰되지 않았다. 3T3 세포 및 정상 사람 골수 세포 모두에 대하여, 세포는 모두 혈청/배지 교환율이 대치 계획으로 나타나는 비율을 초과하는 경우 분열을 계속해서 군집을 이룬다.
혈청의 관류율 대 영양분의 관류율의 상대적인 중요성을 추가로 확인하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다 : 1) 한 세트의 T형 플라스크안에 20% 혈청 함유 배지를 넣고 배지를 매일 교환해 준다; 2) 두 세트의 T형 플라스크에, 한 세트에는 20% 혈청을 함유한 배지를 넣고 2일에 1회씩 교환해 주고, 나머지 세트에는 10% 혈청을 함유한 배지를 넣고 배지를 매일 교환해 준다; 3) 2 세트의 T형 플라스크에, 한 세트에는 10% 혈청이 함유된 배지를 넣고 배지를 2일에 1회씩 교환해 주고, 나머지 세트에는 5% 혈청이 함유된 배지를 넣고 배지를 매일 교환해 준다; 4) 2 세트의 T형 플라스크를 준비하여, 한 세트에는 5% 혈청이 함유된 배지를 넣고 배지를 2일에 1회씩 교환해 주고, 나머지 세트에는 2.5% 혈청이 함유된 배지를 넣고 배지를 매일 교환해 준다. 혈청 교환율은 각각의 그룹이 동일한 반면에, 영양분 함유 배지의 교환율을 상이하다. 이들 실험으로부터의 결과는 혈청 교환율이 중요함을 보여준다. 실험 1) 동안에 글루코오스 소모가 증가하였고, 4일째까지 약 9.5mmoles/1일로 실질적으로 변화가 없었지만, 그 밖의 모든 경우 글루코오스 소모량은 그룹 I의 원래의 글루코오스 소모량 이하에서 출발하여, 2배의 혈청량이 사용되고 2일에 1회 교환되든지 1/2의 혈청량이 사용되고 매일 교환되는지에는 관계없이 실질적으로 선형으로 강하하였다. 이것은 지질세포의 대사적 성장 방식에 영향을 미치는 혈청 또는 하나 이상의 혈청 성분의 임계 관류율에 대한 필요성을 뒷받침한다.
상기 결과로부터, 조혈세포를 생물반응기에서 효율적인 방식으로 성장시킬 수 있음이 자명해진다. 지질세포는 동종 또는 이종의 공급원으로부터 제공될 수 있으며, 이 지질세포는 중요한 성장인자를 제공하기 위하여 유전자로 트랜스펙션시켰다. 이런 방식에서는, 세포의 성장을 지지하기 위하여 혈청이 배지에 첨가될 필요가 없다. 지질세포로부터 조혈세포를 분리시키는 방식으로 지지체에 부착되는 지질세포를 제공함으로써, 조혈세포가 사용을 위해 계속해서 수득될 수 있다. 성장 인자의 조합물을 적절히 선택하여 특정 계통의 조혈세포를 성장시킬 수 있다. 또한, 소망에 따라, 지질세포는 조혈세포로 유전자를 도입시키기 위한 트랜스펙션용 바이러스의 저장소를 제공할 수 있다.
본 명세서에서 인용된 모든 공보 및 특허출원은 각각의 공보 및 특허출원이 상세하게 및 개별적으로 참고문헌으로 포함된 것으로 표시된 경우 본원에 참고문헌으로 포함되어 있다.
전술한 발명이 이해를 명확히 할 목적으로 예시 및 실시예에 의하여 어느 정도 상세하게 기술되었지만, 당업 분야의 숙련자에게는 본 발명이 교시하는 바에 비추어, 첨부되는 특허청구 범위의 사상 또는 범주로부터 벗어남이 없이 본 발명에 대해 특정한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 자명할 것이다.

Claims (12)

  1. 단백질 기질에 부착하는 지질세포를 포함하는 반응기 용기에, 사람 조혈계에서 발견되는 사람 간세포 또는 선구 세포를 포함하는 사람 조혈 세포를 접종시키는 단계(여기서, 지질 세포의 일부 또는 전부는 단백질표면에 부착할 수 있고 간세포 또는 선구 세포의 증식, 분화 또는 이들 모두를 유도하는 하나 이상의 성장 인자를 분비할 수 있는 형질전환된 섬유아세포임); 반응기내의 세포를 간세포 또는 선구 세포의 증식, 분화 또는 이들 모두에 필요한 추가의 성장 인자를 포함하는 영양 배지로 연속적으로 관류시키면서, 대사 산물을 제거하고, 고갈된 영양분을 공급하며, 반응기를 생리적으로 허용되는 조건하에서 유지시키는 단계; 및 반응기로부터 조혈 세포를 수득하는 단계를 포함하여, 사람 조혈 세포를 배양액에서 성장시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 지질 세포가 하나 이상의 콜로니 자극 인자 또는 인터루킨을 분비함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 콜로니 자극 인자가 사람 GM-CSF이고, 인터루킨이 사람 IL-3임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단백질 기질이 단백질 피막 또는 단백질 스폰지임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 단백질이 콜라겐임을 특징으로 하는 방법.
  6. 구멍크기가 약 1 내지 5μ인 단백질 막 기질의 한쪽 면에 부착하는 이종 지질 세포를 포함하는 반응기 용기에, 사람 조혈계에서 발견되는 사람 간세포 또는 선구 세포를 포함하는 사람 조혈 세포를 지질 세포의 부착면과 반대쪽 면에 접종시키는 단계(여기서, 지질 세포의 일부 또는 전부는 단백질 표면에 부탁할 수 있고 간세포 또는 선구 세포의 증식, 분화, 또는 이들 모두를 유도하는 하나 이상의 성장 인자를 분비할 수 있는 형질전환된 섬유아세포임); 반응기내의 세포를 간세포 또는 선구 세포의 증식, 분화 또는 이들 모두에 필요한 추가의 성장 인자를 포함하는 영양 배지로 연속적으로 관류시키면서, 대사 산물을 제거하고, 고갈된 영양분을 공급하며, 반응기를 생리적으로 허용되는 조건하에 유지시키는 단계; 및 반응기로부터 조혈 세포를 수득하는 단계를 포함하여, 사람 조혈 세포를 배양액에서 성장시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 조혈 세포가 골수 세포임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 관류에 의해 글루코오스 농도가 약 5 내지 20mM로 제공되고, 글루타민 농도가 약 1 내지 3mM로 제공되는 반면에, 락테이트 농도는 약 35mM 미만으로 유지되고, 암모니아 농도는 약 2.5mM 미만으로 유지됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 영양 배지가 1일당 50% 이상의 교환율로 24시간 후에 반응기내엣 관류됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 영양 배지가 1일당 106개의 세포당 5 내지 10㎖의 관류 배지의 비율로 반응기내에서 관류됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제6항에 있어서, 영양 배지가 1일당 50% 이상의 교환율로 24시간 후에 반응기내에서 관류됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제6항에 있어서, 영양 배지가 1일당 106개의 세포당 5 내지 10㎖의 관류 배지 비율로 반응기내에서 관류됨을 특징으로 하는 방법.
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