JP4022196B2 - 再構成皮膚の構築方法 - Google Patents
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Description
これらの動物は、SPFの環境下で1匹/1ケージの条件下で飼育することが好ましい。斯かる動物は、日本クレア株式会社より入手可能である。
図1は下部にツバ部を有し、細胞注入が可能な構造を有する帽子型チャンバーの平面図、図2に断面図を示す。本発明のチャンバーは、図3に示すように、同様の形状を有する上側チャンバーaと下側チャンバーbを組み合わせる(図3c)ことが好ましい。この場合には、チャンバーのずれ防止、チャンバー内からの細胞の漏洩の防止という利点がある。
図1及び図2において、1はツバ部、2は筒部、3は上底部、4は頂上部を示す。頂上部には、細胞懸濁液を注入するための直径2〜4mmの小孔5が開けられている。
ヒト培養繊維芽細胞としては、例えば成人皮膚(乳房)由来、新生児皮膚(包皮)由来のものを用いることができ、以下のような方法により得ることができる。例えば、包皮の表皮と真皮を物理的に分離し、真皮を細かくばらばらにして、10%fetal bovine serum (Invitrogen Corporation)を含むDulbecco's modified Eagle'smedium (Invitrogen)で培養する。真皮組織から成長してくる細胞が繊維芽細胞である。斯かるヒト培養繊維芽細胞は、市販品、例えば正常ヒト新生児包皮皮膚繊維芽細胞を購入し、培養、継代して用いることもできる。
チャンバーとして、上記の上側チャンバー(内径12mm,外径24mm)と下側チャンバー(内径11mm,外径24mm)の組合せを用いた場合は、初回の切断では頂上部から約5mm程度のところで切断し、一定期間経過後に、筒部を全面開口させるように(頂上部から約8mmのところで)切断すればよい(図4b参照)。
例えば、美白剤のスクリーニングに使用する場合は、被験物質を本発明の再構成皮膚に濃度を変えて塗布し、色差計を用いて皮膚色を評価することにより、被験物質の美白剤としての適否をスクリーニングすることができる。また、UV吸収剤のスクリーニングに使用する場合は、OpticalCoherence Tomography(ISIS optronics GmbH)とImage pro 4.0画像解析ソフトを組み合わせて表皮肥厚を測定することにより、被験物質のUV吸収剤としての適否をスクリーニングすることができる。
(1)細胞の培養
ヒト培養線維芽細胞(大日本製薬株式会社)を10% fetal bovine serum (Invitrogen Corporation)を含むDulbecco'smodified Eagle's medium (Invitrogen)で、37℃、CO2 5%のインキュベーター内で培養した。T175フラスコ(FALCONCorporation)でコンフルエントの状態になるまで培養した。
マウスの背部の皮膚を円状に切除し、上部に直径2〜4mmの穴を開けたチャンバー(upper part-内径12mm,外径24mmとlower part-内径11mm,外径24mmを組み合わせたもの)(RennerGMBH)を挿入した。チャンバーの周辺部のマウス皮膚を巾着の口のように縫合して、チャンバーを固定した。
トリプシンではがした(6-8)×106個のヒト培養線維芽細胞と6×106個のヒト培養ケラチノサイト、それから2×105〜2×106個のヒト培養メラノサイトを同一チューブ内で遠心して回収し、上清を捨てた。これをチャンバー内に上部の穴から注入した。
移植(graft)してから1週間後、チャンバーの上部を上から5mm程度のところで切り取り、その上に金網を取り付けた。さらに1〜2週間後に金網を外し、チャンバーの上部を完全にカットした。この時点から生理食塩水を2〜4日に一度、再構成皮膚上に滴下し、急激な乾燥を避けるようにした。graftして約4〜5週間後にチャンバーをマウス皮膚に縫合した糸にはさみを入れ、自発的にチャンバーが外れるのを待った。一般的にはgraftしてから6〜7週間後にチャンバーは外れる。
図5は、構築された再構成皮膚の外観写真である。当該再構成皮膚は一定以上の大きさが維持され、皮膚表面には瘡蓋がなく、均一であり、ヒト皮膚に極めて類似したツヤを呈していた(図5(A)及び(B))。また、メラノサイトを含むことから再構成皮膚の表面は全体的に茶色を帯びていた(図5(B))。
SCIDマウスに移植してから 週間経過した再構成皮膚に対する紫外線の照射は東芝FL20SEランプのUVB光源のみを用いて実施した。再構成皮膚の構築に用いた表皮ケラチノサイトとメラノサイトはcaucasian由来のものを用いたので、caucasianの最小紅斑量の約2倍量に相当する150mJ/cm2のUVBを1回照射した。黒化度を測定する目的で再構成皮膚中心部の明度(L値)をUVB照射前、UVB照射から1日後、2日後、14日後に色彩色差計(日本電色工業300A)を用いて測定したところ、図6に示したようにUVBを照射してから14日経過した時点では顕著にL値が減少しており、メラニン合成が促進していることが示唆された。実際にこの黒化度の促進がメラニン合成の促進によるものであることを検証するために、14日後の測色を終了した時点で、パラフィン切片を作成し組織学的解析を試みた。なお、免疫組織化学染色試薬としてOMNITAGPLUS/HRPAEC kit(Thermo Shandon Corporation)を使用したため、陽性所見は赤色で示している。
次に、活性化メラノサイトのマーカーであるHMB45抗体(DAKO Corporation)を用いて、再構成皮膚内のメラノサイトがメラニンを合成しているかどうかについて検討した。図8に示したように表皮基底層に陽性所見が認められた。さらに、同切片をフォンタナ・マッソン染色することにより、表皮基底層からその上側の有棘層にかけて顕著なメラニン色素を観察することができた(図9)。
ヒトの皮膚は紫外線を浴びると肥厚するため、再構成皮膚においても同様な変化が認められるかどうか検討した。表皮肥厚の測定については無侵襲での解析が可能なOpticalCoherence Tomography(ISIS optronics GmbH)とImage pro 4.0画像解析ソフトを組み合わせて測定した。経時的に解析したところ、UVBを照射してから1日後において顕著に表皮が肥厚していることを確認できた(図10、図11)。その肥厚は紫外線を照射してから14日経過した時点でも確保されていた。
2:筒部
3:上底部
4:頂上部
5:小孔(細胞注入口)
a:上側チャンバー
b:下側チャンバー
Claims (4)
- ヒト皮膚組織を非ヒト動物の体表面で再構成する方法であって、(a)非ヒト動物の皮膚を切除し、細胞注入が可能な筒型のチャンバーを免疫不全非ヒト動物の背部皮膚に埋植し、(b)チャンバー内にヒト培養線維芽細胞、ヒト培養ケラチノサイト及びヒト培養メラノサイトを含有する細胞懸濁液を注入し、(c)細胞移植後7〜10日目に、チャンバーの上底部を切断することにより筒部を開口せしめ、それから7〜10日間放置した後、更にチャンバーの上底部を切断して、筒部を全面開口せしめ、次いで、(d)14〜21日経過後にチャンバーを固定する縫合糸を切断し、当該チャンバーを自発的に脱離させることを特徴とするヒト皮膚組織の構築方法。
- 細胞移植後7〜10日目に、チャンバー筒部の断面積の6〜8割が開口するように上底部を切断せしめるものである請求項1記載の方法。
- 上底部の一部を切断した後、当該切断部位に気体が通過可能な部材を取り付けるものである請求項1又は2記載の方法。
- チャンバーの免疫不全非ヒト動物の背部皮膚への埋植が縫合埋植であって、該チャンバー筒部を全面開口せしめた後、水分補給を行うものである請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
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