JP5600671B2 - 毛小嚢及びデノボ乳頭の作製方法並びにインビトロ試験及びインビボ移植のためのそれらの使用 - Google Patents
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Description
毛嚢細胞利用療法のあるアプローチは、少数の毛嚢を取り出し、それらから適格細胞及び/又は誘導性細胞を単離し、続いて新規な毛嚢を生じる前記細胞の固有の能力を維持しながら前記細胞をex vivoで増やすことを必要とするであろう。明らかに、真皮性毛嚢細胞の誘導性能力及び毛嚢上皮性細胞の適格性を維持する細胞培養条件が、いずれのタイプの細胞利用脱毛症治療法の開発達成の前に必要である。初期の研究で真皮性細胞の誘導性特性はインビトロでは時間とともに減衰することが示されたので、毛嚢細胞の発毛特性を培養で維持することに研究の目標が置かれた。最近の進歩の多くが、完全な毛嚢及びそれらの細胞成分のための培養方法論の進歩から得られた。培養で増殖させたヒトの毛嚢は、毛嚢乳頭線維芽細胞、外毛根鞘(ORS)角化細胞及び毛母基由来の成長能力をもつ表皮性細胞を含む(Tobin et al. J Invest Dermatology 1995, 104(1):86-88)。
脱毛症のための任意のタイプの細胞利用治療に関して特記されるべき試みの大半が毛嚢形成効率及び細胞タイプの選択を含む(これらはStenn & Cotsarelis(Curr Opinion Biotech 2005, 16:493-497)によって概略されている)。毛嚢の生物工学操作の場合は、嚢胞又は他の上皮性供給源に由来する適格細胞の存在下又は非存在下において、ばらばらにした嚢胞に由来する真皮性成分を用いて開始することができよう。ばらばらにした多数の細胞を培養で増やし、続いて真皮性細胞のみを又は適格上皮細胞と一緒に脱毛症頭皮に再導入することができよう。以前の実験では、真皮性誘導細胞を正しく配置して開始したとき新規な嚢胞の形成が生じることが示された。更にまた、解離又は凝集した発毛促進性上皮細胞と真皮性細胞を一緒にして開始する方法もまた新規な毛嚢の効率的な作製方法であることが立証された。
毛嚢の生物工学操作のためのまた別の可能なアプローチは、インビトロミニ器官として毛嚢を実際に形成し、続いてこの新規に作製された嚢胞を脱毛頭皮に移植しなおす工程を必要とする。擬似真皮又は擬似真皮調製物を、適切な担体上もしくは適切なマトリックス中に培養真皮乳頭細胞を含む擬似乳頭又は適切なマトリックス形成媒体(in situでマトリックスを形成することができる)上に培養真皮乳頭細胞を含む擬似乳頭前駆体とともに提供し、前記擬似乳頭又は擬似乳頭前駆体を前記擬似真皮又は擬似真皮調製物に導入することによって、皮膚及び毛の等価物を作製できることがDE10162814B4から知ることができる。この種のアプローチは、真皮細胞及び表皮細胞の両細胞を正常な毛嚢の三次元的構造物へと分化させるために、おそらく適切な増殖因子とともに埋め込まれた三次元的マトリックスを含むはるかに複雑な細胞培養系を必要としよう。特に、乳頭構造物は、前記擬似真皮中に腔を形成し(例えば穴を開けるか又は穿刺することによる)、更にその中に前記擬似乳頭を配置することによってのみ得られる(PDに形成された腔に擬似乳頭の寸法が一致するように擬似乳頭は形成される)。前記アプローチは、直接的細胞接触と同様にほぼ生理学的な乳頭構造における意図的な細胞編成を欠いている。
したがって、本発明の基礎をなす技術的課題は、従来技術の上述の欠点を回避すること、及び生理学的DPのサイズ及び形状に自由に及び容易に編成される再構築毛嚢及び乳頭の作製方法を提供することである。本発明が目指すまた別の問題は毛の等価物又は皮膚代替物を見つけることであり、それらは、インビトロモデルとして、より具体的には活性な物質の試験及び/又は評価のため、更に具体的には毛嚢での試験及び/又は評価に適しているであろう。
(a)少なくとも1つのデノボ乳頭を提供する工程、
(b)線維芽細胞、角化細胞及びメラニン細胞の群から選択される少なくとも1つの他の細胞集団を提供する工程、及び
(c)前記デノボ乳頭を前記少なくとも1つの他の細胞集団と一緒に非接着性培養条件下で同時培養する工程。
“デノボ乳頭”又は“新生乳頭”という用語は、本明細書では相互に用いられ、哺乳動物の真皮性毛乳頭線維芽細胞(DPF)の細胞凝集物を意味し、前記は単離後の毛嚢の生理学的な真皮乳頭(DP)の少なくとも半分のサイズ及び近似の形状を有する。デノボ乳頭は、1つ又は多数の異なる細胞外マトリックスタンパク質(好ましくはコラーゲンIV、フィブロネクチン及び/又はラミニン)を含むコーティングを含むことができる。そのようなコーティングは、デノボ乳頭そのものを形成するDPFによって生成されてもよく、又はデノボ乳頭が毛小嚢作製方法の工程(c)にしたがって同時培養される前の任意の段階で添加されてもよい。
これらの工程はデノボ乳頭の提供を含む。本発明にしたがえば、提供されるべきデノボ乳頭は任意の適切な方法によって作製することができる。好ましくは、下記に開示する本発明のデノボ乳頭の作製方法の1つにしたがって作製されたデノボ乳頭が用いられる。
前記工程は更に他の細胞集団の提供を含む。他の細胞集団は哺乳動物の毛嚢から、好ましくはDP調製物に用いられる同じ毛嚢から誘導することができ、更にデノボ乳頭を少なくとも1つの他の細胞集団と非接着性培養容器で同時培養することができる。少なくとも4つの異なる細胞集団(即ち、DPF、結合組織鞘の線維芽細胞(CTSF)、角化細胞(KC)及びメラニン細胞(MC))を所定の態様で哺乳動物の毛嚢から単離し、標準的条件下で別々に培養し、続いて倍増させることができる。これらの単離物から長期生育能力をもつ細胞培養を形成すること及びそれらを例えばスクリーニング方法のための使用に供することもまた可能である。
他の細胞集団を線維芽細胞、角化細胞及びメラニン細胞の群から選択することは、本発明の好ましい実施態様である。前記線維芽細胞、角化細胞及び/又はメラニン細胞は哺乳動物の毛嚢に由来する必要はないが、前記細胞は哺乳動物の他の組織から誘導してもよい。前記線維芽細胞は好ましくは結合組織鞘から誘導される。
好ましくは、前記少なくとも1つの他の細胞集団は哺乳動物の毛嚢から誘導可能であるか又は前記に由来し、前記細胞集団は、結合組織鞘線維芽細胞、角化細胞及び/又はメラニン細胞の群から選択される。
(a)デノボ乳頭を提供し、
(b)デノボ乳頭をKC、MC又は予め決定した比を有するKC及びMCの混合物と接触させ、更に非接着性容器で予め決定した期間同時培養し、
(b’)場合によって工程(b)を繰り返し、好ましくは1回目に用いたものと異なる細胞タイプの細胞を接触及び同時培養に用い、
(c)場合によって工程(b)又は(b’)の被覆されたデノボ乳頭を、工程(d)の前及び/又は工程(d)と同時に細胞外マトリックスタンパク質(好ましくはコラーゲンIV)で被覆してもよく、
(d)工程(b)、(b’)又は(c)の被覆されたデノボ乳頭を、非接着性培養容器で予め決定した期間CTSFと同時培養する。
本発明はまた、以下の工程を含むデノボ乳頭の作製方法を提供することを目的とする。
(a)少なくとも1つの哺乳動物の毛嚢に由来する少なくとも1つの真皮乳頭(DP)を提供する工程、
(b)DPを細胞培養容器の表面に機械的に固定し、それにより基底板に穴を開けて真皮性毛乳頭線維芽細胞(DPF)を流出させることによって、前記DPから前記DPFを単離する工程、
(c)コラーゲンコーティング無しに単離DPFを単層培養で増殖させ、前記DPFを少なくとも1回継代する工程、
(d)増殖DPFを凝縮させて生理学的DPのサイズ及び形状を示す細胞凝集物にし、前記DPFを1.000から100.000DPF/cm2の培養容器表面当りの細胞濃度にて非接着性培養容器中で分化させ、前記増殖DPFを少なくとも48時間凝縮させる工程、
(e)前記デノボ乳頭を細胞外マトリックスタンパク質、好ましくはコラーゲンIV、フィブロネクチン及び/又はラミニンで被覆する工程。
(a)少なくとも1つの真皮乳頭(DP)を少なくとも1つの哺乳動物の毛嚢から提供する工程、
(b)DPを細胞培養容器の表面に機械的に固定し、それにより基底板に穴を開けて真皮性毛乳頭線維芽細胞(DPF)を流出させることによって、前記DPからを前記DPF単離する工程、
(c)コラーゲンコーティング無しに単離DPFを単層培養で増殖させ、前記DPFを少なくとも1回継代する工程、
(d)増殖DPFを凝縮させて生理学的DPのサイズ及び形状を示す細胞凝集物にし、前記DPF1.000から100.000DPF/cm2の培養容器表面当りの細胞濃度で非接着性培養容器中で分化させ、前記増殖DPFを少なくとも48時間凝縮させる工程、
(e)場合によって、前記デノボ乳頭を細胞外マトリックスタンパク質、好ましくはコラーゲンIV、フィブロネクチン及び/又はラミニンで被覆する工程。
従来技術の毛の成長誘導におけるこれら細胞の使用の制限因子となるのは特に単離DPFの増殖及び生理学的な投与の形態である。必要量の細胞に到達するために数回の増殖サイクルを要し、その過程のあいだ細胞は単層培養として培養され、特に真皮乳頭線維芽細胞の培養はそれらの誘導能力を喪失させ、即ち、経験によって示されるとおり5−8週間後に誘導能力を喪失させる。このように処理された細胞は脱分化し幹細胞マーカーを発現するが、もはや毛嚢を生じさせるために用いることはできない。
工程(a)の前に、毛嚢を患者又はドナーである哺乳動物から採取する。サンプルは特にヒト、げっ歯類、ブタ、イヌ、サル、ヒツジ、ネコ又はイヌ、好ましくはヒトから採集する。組織サンプルは皮膚生検によって採集すること、特に罹患場所の近くから採取することが本質的に好ましい。本発明では、毛嚢サンプルは、好ましくは頭髪、あごひげ、眉毛、陰毛又は他の体毛から回収される。毛嚢の回収は推奨医療実施要領(good medical practice)にしたがう。サンプルを精製して障害物質を除去することができる。
その後工程(b)で単離した真皮乳頭を細胞培養容器に移し、容器の表面に機械的に固定する。好ましくは、単離した真皮乳頭を酵素的分離に付すのではなくそれらをピンの先端又は外科用メスを用いて培養容器の底に機械的に固定することによってDPFを入手する。培養容器当り1から8DPをインキュベートするのが好ましい。特に2から4DPが例えば6ウェル又は12ウェルの細胞培養プレートの各ウェルに移され、プレートの底に固定される。結果として、基底板に小さな穴が開くが、乳頭の形態はほぼ維持され、DPFが真皮乳頭から遊走し増殖する。
自由な接触の結果として、数日後に細胞は一定のサイズに凝集して、サイズ及び形状が本来の乳頭に類似する凝集物を形成する。増やしたDPFを好ましくは少なくとも48時間、2から5日間、より好ましくは2から3日間、もっとも好ましくは実質的に2日間、凝縮させ、場合によって更に3から15日間、好ましくは5から10日間、又は2から21日間培養する。形成される凝縮物のサイズ及び形状は皮膚生検が取り出された領域に左右される。DPF(あごひげ、体毛、眉毛、陰毛、又は頭髪から取り出し、増やされる)は種々のサイズの凝集物を形成し、この凝集物は順次それぞれの毛の形状、サイズ及び長さを決定する。更に重要なことは容器に接種される最初の細胞数であり、前記は容器表面に対して相応な比率でなければならない。本方法の別の実施態様では、工程(d)の容器表面当りの細胞濃度は、2.000から50.000DPF/cm2、好ましくは3.000から20.000DPF/cm2、より好ましくは5.000から10.000DPF/cm2、もっとも好ましくは実質的に6.666DPF/cm2である。
本発明のデノボ乳頭及び/又は毛嚢はともに皮膚等価物の作製に用いることができる。好ましくは、皮膚等価物は例えばマトリダーム(Matriderm; Dr. Suwelack Skin & Health Care AG)を用い標準的な方法にしたがって構築され、小嚢の挿入部位には、2-光子レーザーを用いて規則的な間隔で切れ目をつけるか、又はパンチで予め穴を開ける。結果として、本発明のデノボ乳頭及び/又は毛嚢を含む皮膚等価物は本発明のまた別の目的である。再構築真皮乳頭の他に、前記皮膚等価物は1層以上の角化細胞(前記は表皮性構造物又は真皮周囲構造物中にそれら自体を形成することができる)及び場合によって1層以上のメラニン細胞(前記は真皮乳頭構造物を覆うことができる)を含む。
本発明のデノボ乳頭及び/又は毛嚢はまた移植片として用いることができる。したがって、本発明の更に別の目的は、本発明のデノボ乳頭及び/又は本発明の毛嚢を、場合によって医薬的に許容できるアジュバントと一緒に含む移植片である。
同様に、本発明の皮膚等価物はトランスプラントとして用いることができる。活性な成分として本発明の皮膚等価物の有効量を、場合によって医薬的に許容できるアジュバントと一緒に含むトランスプラントを提供することは、本発明の更に別の目的である。
導入の態様に応じて、移植片又はトランスプラントはそれぞれ多様な態様で処方することができる。処方物中の治療的に活性な成分の濃度は約0.1から100wt%で変動し得る。それらは単独で投与しても又は他の処置と併用してもよい。
本発明に関係する毛量減少という病的状態は、脱毛症(例えば男性ホルモン性脱毛症、円形脱毛症など)、遺伝性禿頭、瘢痕、火傷、放射線療法、化学療法、疾患関連脱毛、事故による損傷、毛嚢の損傷、外科手術跡、切開創、又は皮膚移植に起因するドナー部位創の結果であり得る。
本発明はまた、毛量減少症状の予防的又は治療的処置のために移植片又はトランスプラントをそれぞれ作製するために、本発明のデノボ乳頭、毛小嚢及び/又は皮膚等価物を使用することに関する。前記移植片及びトランスプラントは、哺乳動物(好ましくはヒトの個体)の脱毛の開始及びその結果生じる問題を前もって防止するために、又は生じた症状及び持続症状を治療するために投与することができる。
本発明の範囲で、デノボ乳頭及び毛小嚢を作製する方法が初めて提供される。前記方法は、三次元培養及び一定比率の細胞濃度対容器表面という手段による、増殖DPFの生理学的細胞凝集物への凝縮を利用する。毛幹を生じる小嚢の形成から、更に遺伝子及びタンパク質発現の解析という手段によって分るように、DPFは特異的な凝縮後にそれらの本来の誘導性特性を取り戻す。細胞のこの誘導性特性は本方法の過程で再び確立され得るので、細胞を増やすための継代数は重要ではない。したがって、非接着性培養容器での三次元的培養を用いるときは、一定で多数の出発細胞を用い、更に再現性のある態様で培養液の制御的供給を実施することが有利である。一般的な分化実験のための他の三次元培養(例えばミクロマス、ペレット培養又は懸垂ドロップ法)と比較して、本発明の培養系の細胞は細胞間接着を強いられることはないが、個々の結合が可能で細胞凝集物を形成し、DPFの場合には乳頭様凝縮物を形成する。
本明細書に記載の方法及び材料と類似するか又はそれらと等価の方法及び材料を本発明の実施又は試験で用いることができるが、適切な実施例が下記に記載されている。下記の実施例は制限のためではなく例示として提供される。実施例では、夾雑活性を含まない標準的な試薬及び緩衝液が用いられる。
ヒト嚢胞の真皮乳頭線維芽細胞(DPF)、結合組織鞘線維芽細胞(CTSF)、角化細胞(KC)及びメラニン細胞(MC)の単離及び培養
必要な規制の下で一般に受け入れられているリフティング手術の余剰分に由来するヒト頭皮サンプルを顕微鏡下で切開後に単一毛嚢を入手した。マトリックスKC及びMC、CTSF並びに真皮乳頭線維芽細胞(DPF)を単離するために、皮膚を外科用メスにて真皮皮下境界面で切開し、発育相ステージ(成長期)の毛嚢を解剖用顕微鏡の下でピンセットを用いて引き出した。
以前に記載した単離技術(例えばMargel et al., Methods Exp Dermat, 2002, 11:381-385)とは対照的に、切開毛嚢の上方部分の結合組織を長軸に沿ってスライスすることによって所望の細胞集団の純粋な分画を得た。一方の側に毛幹を固定することによって、CTSを毛のマトリックスに沿って下方の基部部分に向かって長軸方向に引っ張ることができる。この技術によりDP細胞が自動的に露出され、損傷及び細胞タイプの混じり合いが回避される。したがって、KC及びMC細胞を含む毛マトリックスと同様に、CTS及び真皮乳頭を外科用メスで容易に切り離すことができる。
DP及びCTS単離物を、それらを針で6-ウェルの細胞培養プレートに固定することによって、前記培養プレートで別々に培養した(1つのウェルに2−4個)。線維芽細胞の急速な成長を可能にするが同時に包の形態及び線維芽細胞の適切な位置を維持するために、その薄い膜をわずかに引っかいて細胞外マトリックス成分(ECM)をほぐした。線維芽細胞の増殖が観察されるまで(ドナーのバリエーションに応じて1−2週間後)、細胞をDMEM+(Gibco/インビトロgen)プラス10%ウシ胎児血清(FCS)で培養した。続いて細胞を25cm2の培養フラスコに移してもう1週間置き、更に75cm2の培養フラスコに継代した。サブコンフルエンスに達した後、継代3代目を3つの75cm2フラスコに分割しそれぞれ1.5−2百万個のDPF又はCTSFをそれぞれ得た。
KC及びメラニン欠乏毛嚢MCを残余の毛幹及び付着した毛マトリックスからトリプシン消化(0.05%トリプシン及び0.53mM EDTA)によって取り出し、文献(Tobin et al. J Invest Dermatology, 1995, 104(1):86-88)に記載された標準的方法で培養した。
新生乳頭の形成
500.000の最適数のDPFをDMEM+を含む75cm2の超低付着性培養フラスコ(Corning)に播種し、細胞凝集物を形成させた。48時間それらを動かさずに維持した後、これらの凝集物は、相当な大きさの天然のヒト毛嚢真皮乳頭を形成する。続いて凝縮物を6-ウェルの超低付着性プレートに移し、ラミニン(最終濃度11.5μg/mL)、フィブロネクチン(最終濃度10μg/mL)、及びコラーゲンIV(最終濃度40μg/mL)の混合物を前記ウェルに添加した。24−48時間培養後に、固有のECM及び添加タンパク質は安定なマトリックス膜を構築し、新生乳頭が形成された。より迅速なECM蓄積及び分化を促進するために、増殖因子、すなわち肝細胞増殖因子(30ng/mL)及び/又は結合組織増殖因子(20ng/mL)のどちらかを培養液に添加することができる。これらの新生乳頭はただちに皮膚にインビボ移植して毛の誘導特性を発展させることができる。
新生嚢胞の形成
250.000のKC及びMC(10:1)を超低付着性培養フラスコ(6ウェル、Corning)の新生乳頭に添加し、DMEM+培養液を所定の角化細胞無血清培養液(Gibco)に交換した。1週間後、被覆された新生乳頭は毛嚢様構造物を形成する。これらの新生嚢胞は既に試験に用いられた。多層の新生嚢胞(毛嚢の構造及び機能によりいっそう類似する)を得るために、DMEM+ 10%FCSを含む超低付着性プレート中で、作製された新生嚢胞をコラーゲンIV(60μg/mL)及びCTSF(200.000細胞)の混合物で更に2日間被覆し、更に3日目毎に培養液を交換することができる。
新生嚢胞を有する皮膚等価物の作製
小児のヒト包皮線維芽細胞を以前に報告された方法(Toma et al. Stem Cells, 2005, 23:727-37)を用いて単離し、DMEM+ 10%FCSで培養した。250.000の真皮線維芽細胞(DPF又はCTSFも用いたが、包皮線維芽細胞が取り扱いの理由から好ましかった)をフィブリノゲン溶液(Sigma、3mg/mL)と混合し、更に2.0%(v/v)のアプロチニン(20μg/mL)及び2.5%(v/v)のトロンビン1.25U/mLを添加した。前記の冷却溶液をトランスウェル培養チャンバーに気泡を避けながら添加した。温度を2−3分間室温に調節した後、30−40の新生嚢胞を前記溶液に穏やかに導入し、37℃で10分間重合させてゲルを得た。作製したマトリックスをDMEM+培養液に48時間浸漬した。
顔面のリフティング手術又は包皮より入手した皮膚生検から真皮角化細胞を単離した(Barrandon & Green, Proc Natl Acad Sci, 1985, 82:5390-4)。略記すれば、下層の脂肪組織及び真皮を切り離し、残余の表皮をトリプシン/EDTA溶液(PAA)で一晩4℃にて消化した。細胞スクレーパーを用いてKCを採集し、70μmの細胞ろ過器(Becton Dickinson)を通した後で前記をコラーゲンI被覆培養フラスコに播種した。所定の角化細胞無血清培養液(Gibco)を用いて1週間に2回交換し、KCを60−80%コンフルエンシーで継代又は採集した。
KC(250.000)を前記マトリックスの上に添加し、それらを24時間接着させた。所定の角化細胞無血清培養液(Gibco)を交換することによって余分な細胞を取り、トランスウェルチャンバーを気体-液体境界面に持ち上げてKCが分化できるようにした。
更に細胞株(すなわちKCのためにはHaCat及び線維芽細胞のためにはHS27)もまた同様な皮膚モデルの作製について試験した(なぜならば細胞株は培養がより容易であり、ドナーによる変動が少ないからである)。細胞株は5%ウシ胎児血清(FCS、Gibco)補充DMEM+で増殖させた。
哺乳動物の毛嚢に由来しない細胞を含む新生嚢胞の形成
下記に概略するように入手したKC及びMCを用いて、実施例3に記載したように新生嚢胞を調製した。
ヒト包皮角化細胞及び線維芽細胞の細胞培養:ヒト包皮線維芽細胞及び角化細胞を以前に報告された方法(Toma et al. Stem Cells, 2005, 23:727-37)を用い環状切除から単離した。略記すれば、下層の脂肪組織及び真皮を切り離し、残余の表皮をディスパーゼ溶液(4mg/mL、Sigma)で一晩4℃にて消化した。細胞スクレーパーを用いて角化細胞を採集し、70μmの細胞ろ過器(Becton Dickinson)を通した後で培養フラスコに播種する。全ての角化細胞をコラーゲンI被覆細胞培養フラスコ及び所定の角化細胞無血清培養液(Gibco)を用いて増殖させた。培養液を1週間に2回交換し、角化細胞を60−80%コンフルエンシーで継代又は採集した。線維芽細胞はDMEM+ 10%FCSで培養した。
ヒト表皮メラニン細胞の細胞培養:ヒト成人表皮メラニン細胞(CellMadeから購入)から出発し、製造業者のプロトコルにしたがい細胞培養手順を実施した。略記すれば、15mLのメラニン細胞増殖培養液をT75培養フラスコに添加した。バイアルの下半分を37℃の水浴に1分間置くことによって、細胞を迅速に融解させた。メラニン細胞増殖培養液を含むT-75フラスコに細胞を再懸濁した。T-75フラスコを37℃の5%CO2湿潤インキュベーターに置いた。メラニン細胞増殖培養液は2−3日毎に交換した。培養が80%コンフルエンシーに達したときに細胞を継代した。
得られた新生嚢胞を図3に示す。哺乳動物の毛嚢と異なる供給源に由来するKC及びMCを用いて作製した新生嚢胞の種々の発達段階が示されている。ステージ1では、新生乳頭(外因性細胞外マトリックスタンパク質は添加されていない)はメラニン細胞及び角化細胞に取り囲まれている(前記メラニン細胞及び角化細胞は初期マルチ細胞凝縮物を形成する超低付着性プレートに添加された)。結合のゆるい凝集物が形成された。ステージ2では、超低付着性培養で嚢胞構造の形成を示す最初の徴候を認めることができる。付着した細胞は新生乳頭に接着し、扁平な形状を示し、一方、突出が凝縮物の上部に構築された。約1週間後に、新生嚢胞は毛嚢様の鞘を含む形態を発達させ始めた。出来上がった新生嚢胞内には初期毛幹がはっきりと見えるようになる。
Agilent全ヒトゲノムオリゴマイクロアレイ(単色)を用いる、細胞サンプル由来の種々のヒト真皮乳頭の遺伝子発現の解析
1.SuperAmp TM RNA増幅
単離した2つの天然真皮乳頭、1x103の単層培養真皮乳頭線維芽細胞、48時間後の再凝縮真皮乳頭線維芽細胞及び14日後の再凝縮真皮乳頭線維芽細胞を上記に記載したように調製した。SuperAmpTM溶解緩衝液を用いて前記4つのヒト細胞サンプルを溶解した。
表2:サンプルリスト
SuperAmpTM RNA増幅はMiltenyi Biotec’sの手順にしたがって実施した。略記すれば、増幅はmRNA-誘導cDNAを用い包括的PCRプロトコルにしたがう。mRNAは磁性ビーズ技術により単離した。増幅cDNAサンプルはND-1000分光光度計(NanoDrop Technologies)を用いて定量した。
表3:cDNA収量の要旨
cDNAの完全性はAgilent2100バイオアナライザープラットフォーム(Agilent Technologies)により確かめた。バイオアナライザー操作の結果はAgilent 2100バイオアナライザーエキスパートソフトを用いゲル画像及び電気泳動図により解析した。大量に増幅されたcDNA生成物の平均長は200−1,000bpの範囲であった。
2.Agilent全ゲノムオリゴマイクロアレイのハイブリダイゼーション
cDNAの各々250ngをCy3標識のための鋳型として用いた(Cys標識はMiltenyi Biotec’sのプロトコルにしたがって実施した)。Cy3-標識cDNAをAgilent全ヒトゲノムオリゴマイクロアレイ4x44k(表4)とAgilentが推奨するハイブリダイゼーションチャンバー及びオーブンを用い一晩ハイブリダイズした(65℃、17時間)。
表4:ハイブリダイゼーションスケジュール
最後に、0.005%のN-ラウリルサルコシンを含む6xのSSPE緩衝液で前記マイクロアレイを1分間1回室温で洗浄し、続いて0.005%のN-ラウリルサルコシンを含み予め加温した0.06xのSSPE緩衝液で2回目の洗浄を1分間(37℃)実施した。最後の洗浄工程はアセトニトリルを用い30秒間実施した。
3.スキャンニング結果
ハイブリダイズさせたAgilentマイクロアレイの蛍光シグナルはAgilentのマイクロアレイスキャナーシステム(Agilent Technologies)を用いて検出した。
4.画像及びデータ解析
Agilentの特徴抽出ソフト(Feature Extraction Software(FES))を用いてマイクロアレイの画像ファイルを読み出して処理した。このソフトは、特徴の強度を決定し(バックグラウンドを差し引くことも含む)、範囲外の特徴を拒絶し、更に統計的信頼度を計算する。弁別的遺伝子発現を決定するために、FES誘導出力データをRosetta Resolver(商標)遺伝子発現データ解析システム(Rosetta Biosoftware)を用いて更に解析した。このソフトは、とりわけ比率実験における2つの単一強度プロフィルを比較する実行可能手段を提供する。ここでは全サンプルをCy3で標識し、前記比率実験はコントロール対サンプル実験(Resolver(商標)システムの自動化データ出力)と称される。この比率は常にコントロールのシグナル強度によりサンプルのシグナル強度を割ることによって計算される。
5.遺伝子リスト、単実験未加工データリスト、単実験標準化データリスト、遺伝子比率リスト/前選択候補遺伝子リスト
Agilentの特徴抽出ソフトの出力データは、完全な未加工データセット(単実験未加工データリストと称される)を含む遺伝子リストを含む。更にまた、単実験未加工データリストのシグナル強度は強度値をそれらの中央値で割ることによって標準化される。これらの標準化シグナル強度は共通表の単実験標準化リストに加えられる。このリストは、標準化強度値に加えて、特徴glsPosAndSignifを含み、前記は、値が1のときシグナル強度は正であってバックグラウンドを超えて有意であり、値が0のときシグナル強度は正ではなくバックグラウンドを超えて有意であることを示す。Resolver(商標)ソフトは、標準化サンプル/コントロールlog10比率及び何倍変化、配列の詳細、p-値などを含む遺伝子リスト((全遺伝子の)遺伝子比率リストと称される)の出力を可能にする。例えば、遺伝子比率リストの“-10倍変化”はしたがってサンプルと比較してコントロールで10倍高い遺伝子発現を示す。2倍を超える変化及び0.01未満のp-値を有する推定候補遺伝子は、前選択候補遺伝子リストで要約される。弁別的に発現される遺伝子のいくつかを含むそのようなリストの抽出は表5に示されている。
Claims (19)
- 哺乳動物の毛小嚢を作製する方法であって、以下の工程、
(a)少なくとも1つのデノボ乳頭を提供する工程、
(b)線維芽細胞、角化細胞及び/又はメラニン細胞の群から選択される少なくとも1つの他の細胞集団を提供する工程、及び
(c)前記デノボ乳頭を前記少なくとも1つの他の細胞集団と一緒に非接着性培養条件下で同時培養する工程、
を含み、前記工程(a)が、
(1)少なくとも1つの哺乳動物毛嚢に由来する少なくとも1つの真皮乳頭(DP)を提供する工程、
(2)DPを細胞培養容器の表面に機械的に固定し、それにより基底板に穴を開けて真皮性毛乳頭線維芽細胞(DPF)を流出させることによって、前記DPから前記DPFを単離する工程、
(3)単離したDPFをコラーゲンのコーティング無しに単層培養で増やし、前記DPFを少なくとも1回継代する工程、
(4)増やしたDPFを凝縮させて生理学的DPのサイズ及び形状を示す細胞凝集物にして、デノボ乳頭を取得する工程であって、前記DPFを1.000〜100.000DPF/cm 2 の培養容器表面当りの細胞濃度にて非接着性培養容器で分化させる工程、及び
(5)前記細胞凝集物を細胞外マトリックスタンパク質で被覆する工程、
を含むことを特徴とする、哺乳動物の毛小嚢を作製する方法。 - 前記少なくとも1つの他の細胞集団が、哺乳動物の毛嚢から誘導することができるか及び/又は哺乳動物の毛嚢に由来し、結合組織鞘線維芽細胞、角化細胞及び/又はメラニン細胞の群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックスタンパク質が、コラーゲンIV、フィブロネクチン及び/又はラミニンである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記増やしたDPFを少なくとも48時間凝縮させる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(4)で非誘導性DPFを凝縮させる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法によって作製される毛小嚢。
- デノボ乳頭を作製する方法であって、以下の工程、
(a)少なくとも1つの哺乳動物毛嚢に由来する少なくとも1つの真皮乳頭(DP)を提供する工程、
(b)DPを細胞培養容器の表面に機械的に固定し、それにより基底板に穴を開けて真皮性毛乳頭線維芽細胞(DPF)を流出させることによって、前記DPから前記DPFを単離する工程、
(c)単離したDPFをコラーゲンのコーティング無しに単層培養で増やし、前記DPFを少なくとも1回継代する工程、
(d)増やしたDPFを凝縮させて生理学的DPのサイズ及び形状を示す細胞凝集物にする工程であって、前記DPFを1.000〜100.000DPF/cm2の培養容器表面当りの細胞濃度にて非接着性培養容器で分化させる工程、及び
(e)前記細胞凝集物を細胞外マトリックスタンパク質で被覆する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記DPFを少なくとも48時間凝縮させる、請求項7に記載の方法。
- 前記増やしたDPFを2〜21日又は3〜15日凝縮させる、請求項7又は8に記載の方法。
- 工程(d)で非誘導性DPFを凝縮させる、請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法によって作製されたデノボ乳頭。
- 請求項6に記載の毛小嚢又は請求項11に記載のデノボ乳頭を含むことを特徴とする皮膚等価物。
- 活性成分として請求項6に記載の毛小嚢及び/又は請求項11に記載のデノボ乳頭を含むことを特徴とする移植片。
- 活性成分として請求項12に記載の皮膚等価物を、場合によって医薬的に許容できるアジュバントとともに含むことを特徴とするトランスプラント。
- 毛量減少症状の予防的又は治療的処置のための請求項6に記載の毛小嚢、請求項11に記載のデノボ乳頭及び/又は請求項12に記載の皮膚等価物。
- 請求項6に記載の毛小嚢、請求項11に記載のデノボ乳頭、請求項12に記載の皮膚等価物、請求項13に記載の移植片及び/又は請求項14に記載のトランスプラントを含むことを特徴とするキット。
- 物質の毛調整作用をインビトロで試験するための、請求項6に記載の毛小嚢、請求項11に記載のデノボ乳頭及び/又は請求項12に記載の皮膚等価物の使用。
- 物質の毒性作用をインビトロで試験するための、請求項6に記載の毛小嚢、請求項11に記載のデノボ乳頭及び/又は請求項12に記載の皮膚等価物の使用。
- 毛の特性を調整する物質を高処理スクリーニングする方法であって、以下の工程、
(1)請求項11に記載のデノボ乳頭、請求項6に記載の毛小嚢及び/又は請求項12に記載の皮膚等価物のサンプルを提供する工程、
(2)それぞれのサンプルを部分に分ける工程、
(3)少なくとも1つの部分をスクリーニングされるべき物質とインキュベートする工程、及び
(4)毛の特性パラメータを前記部分と物質とインキュベートされなかった別の部分とで比較する工程、
を含むことを特徴とする方法。
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