CN115485365A - 含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题是提供一种血管再生能力高且引发炎症的可能性低的含有成熟脂肪细胞的组合物。本发明的解决手段是一种含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法,其包含:切割过滤工序,其将未进行酶处理的脂肪组织进行切割过滤,而获得微小脂肪;微小脂肪培养工序,其在切割过滤工序后,使用培养用培养基培养微小脂肪,而获得成熟脂肪细胞;以及含有成熟脂肪细胞的组合物取得工序,其获得含有成熟脂肪细胞的组合物,所述含有成熟脂肪细胞的组合物包含成熟脂肪细胞及经过微小脂肪培养工序所得到的条件培养基,并且,培养用培养基为包含自体血清的培养基,或为包含FBS、氢化可的松及FGF‑2的培养基。
Description
技术领域
此发明涉及含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法。更详细而言是涉及包含成熟脂肪细胞及条件培养基(例如成熟脂肪细胞的上清液)的含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法,其可提高移植用脂肪组织的血管再生并提高脂肪移植的植活率。
背景技术
乳癌切除后所进行的作为乳房重建手术的脂肪移植被认为是不会促进癌转移且安全的。因此,在整形外科及美容外科的领域中频繁地进行乳房重建手术。但是,乳房的组织量非常庞大,因此至今为止即使将吸取活体的脂肪组织所获得的脂肪组织片进行移植,也只能获得30-45%的植活率(Zhou人等,非专利文献1)。
在受体环境中的吸取脂肪组织片的生存率低的主要原因是没有供养血管。经移植的脂肪组织片因为从原本的供养血管分离,所以会营养不良而坏死。已知脂肪组织片在移植后会被认作为异物,而会发生吸收、囊肿形成、钙化。接下来,作为提高植活率的方法,已报导将脂肪组织和脂肪源性干细胞(ASC)一起移植的方法(cell-assisted lipotransfer,细胞辅助脂肪移植:CAL(Eto人等,非专利文献2)),所述脂肪源性干细胞存在于基质血管部分中的SVF(small vascular fraction,基质血管组分),所述基质血管部分存在于脂肪组织的血管周围。此方法是将吸取脂肪组织进行酶处理并去除脂肪成分,而获得血管周围中的细胞、SVF脂肪祖干细胞,并和吸取脂肪组织一起移植的方法。SVF的特征为进行自体再生的能力高及具有多能性(Zuk PA人等,非专利文献3)。
Zhou人等在系统评估中系统性评论了包含387件案件的17篇文章(Zhou人等,非专利文献1)。比起单独吸取脂肪移植组,CAL组的脂肪生存率明显较高(60%对45%,p=0.0096)。CAL大幅改善脸部的脂肪生存率(19%),并减少多次手术的发生率(13.6%)。但是,在乳房脂肪移植中,仅改善9%的脂肪生存率,没有统计学上的意义。
另一方面,相较于脸部病例,乳房病例的CAL:Cell assisted liptransfer,细胞辅助脂肪移植技术(Eto人等,非专利文献2))的并发症的发生率较高(p<0.001)。CAL是利用将脂肪组织进行酶处理而获得基质血管组分(SVF:small vascular fraction)中所存在的脂肪源性干细胞(ASC),并将使血管再生的细胞ASC及脂肪组织一起移植的方法。大多数的CAL会发生移植脂肪的吸收而以失败告终。作为其原因,被认为是经移植的脂肪组织会从原本的供养血管分离,因此虽然会残留一部分(300微米以下的脂肪),但大多会营养不良而坏死。
至今为止,作为成功的血管再生用细胞,已开发有脂肪祖细胞,即脂肪干细胞(ASC),以及去分化脂肪细胞(DFAT)这两种。
ASC为脂肪祖细胞,不仅会分化成脂肪细胞,也是具有分化成骨细胞、肌肉细胞、软骨细胞等的多分化能力的干细胞(ZukPA人等,非专利文献3)。并且,因为有促进癌转移的报告,所以不适合在乳癌切除后的乳房重建手术中频繁地进行。并且,ASC因为在低氧下会诱导大量的TNF-α,所以有可能引起炎症,因为无法抑制由移植后的炎症诱发所造成的吸收,所以不适合于移植。
并且,DFAT细胞诱导血管的因子尚未被特定,其机制的不明确性也是阻碍其适应人类的原因。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Zhou Y,Wang J,Li H,et al.Efficacy and Safety of Cell-Assisted Lipotransfer:A Systematic Review and Meta-Analysis.Plast ReconstrSurg 2016:137:44e-57e.
非专利文献2:Eto H,et al.:The fate of adipocyte after non vascularizedfat grafting:Evidence of early death and replacement of adipocytes.PlastReconstr Surg.2012;129(5):1081-92.
非专利文献3:Zuk PA.et al.:Human adipose tissue is a source ofmultipotent stem cells.Mol Biol Cell 2001;13:4279-95.
发明内容
发明所欲解决的课题
有鉴于上述背景,期望血管再生能力高的含有成熟脂肪细胞的组合物。并且,期望引起炎症的可能性低的含有成熟脂肪细胞的组合物。
再者,期望包含如上述般的含有成熟脂肪细胞的组合物的血管再生促进剂、能使用作为皮下脂肪组织的替代品的组合物、用于乳房增大手术、乳房重建手术或组织凹陷成形手术用的含有脂肪的剂。
解决课题的技术手段
本发明基本上是基于由下述实施例所得的发现,所述实施例是将脂肪组织进行切割过滤并使用培养基培养微小脂肪而获得成熟脂肪细胞,且同时,包含此培养时所获得的条件培养基(培养上清液)的组合物会包含大量IL-8、GRO、MCP-1或VEGF(血管内皮细胞生长因子)等会促进血管形成的趋化因子/细胞因子,若使用此组合物,则会非常顺利地进行例如乳房重建手术。
此说明书所记载的第一发明涉及含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法。此方法包含切割过滤工序、微小脂肪培养工序及含有成熟脂肪细胞的组合物取得工序。
切割过滤工序是用于将未进行酶处理的脂肪组织进行切割过滤而获得微小脂肪的工序。
微小脂肪培养工序是用于在切割过滤工序后使用培养用培养基而培养所述微小脂肪并获得成熟脂肪细胞的工序。培养用培养基包含氢化可的松及FGF-2。
含有成熟脂肪细胞的组合物取得工序是用于获得含有成熟脂肪细胞的组合物的工序,所述含有成熟脂肪细胞的组合物包含所述成熟脂肪细胞及经过所述微小脂肪培养工序所得到的条件培养基(conditioned medium)。
脂肪组织的优选例是已在清洗吸取脂肪后去除血液成分的脂肪组织。
切割过滤工序的优选例包含进行离心分离并去除沉淀的基质血管组分(SVF)的工序。
成熟脂肪细胞的优选例是相较于IL-6使趋化因子/细胞因子,即IL-8、GRO、MCP-1分别表达4倍以上(优选为10倍以上,更优选为20倍以上)的细胞。条件培养基(conditionedmedium)优选为包含此等趋化因子/细胞因子的培养基。条件培养基(conditioned medium)优选为包含IL-6的0.5倍以上且1.5倍以下的血管内皮细胞生长因子(VEGF)的培养基。
含有成熟脂肪细胞的组合物的优选利用例是使用作为皮下脂肪组织的替代品。并且,含有也可将成熟脂肪细胞的组合物用于乳房增大手术、乳房重建手术或组织凹陷成形手术。
此说明书所记载的第二发明涉及能使用作为皮下脂肪组织的替代品的组合物。此组合物为通过上述任一含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法所制造的含有成熟脂肪细胞的组合物,且能使用作为皮下脂肪组织的替代品。此组合物例如被用于乳房增大手术、乳房重建手术或组织凹陷成形手术。
此说明书所记载的第三发明涉及血管再生促进剂。此血管再生促进剂例如包含通过上述任一含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法所获得的含有成熟脂肪细胞的组合物。含有成熟脂肪细胞的组合物包含血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)2或阳性细胞及血小板衍生生长因子(PDGFR)β。
发明功效
通过第一发明所获得的含有成熟脂肪细胞的组合物通常会使血管形成促进能力高的IL-8、GRO、MCP-1或VEGF高表达。因此,此含有成熟脂肪细胞的组合物的血管再生能力高。
并且,如同上述,ASC因为会在低氧下诱导大量的TNF-α,所以有引起炎症的可能性,不适合于移植。另一方面,通过第一发明所获得的含有成熟脂肪细胞的组合物会使促进血管形成的IL-8、GRO及MCP-1高表达,且另一方面使TNF-α、IL-1β、INF-γ几乎不表达。因此,通过上述方法所获得的含有成熟脂肪细胞的组合物引起炎症的可能性低。
然后,如同上述,第二发明因为包含含有成熟脂肪细胞的组合物,所以可使用作为皮下脂肪组织的替代品,且可用于乳房增大手术、乳房重建手术或组织凹陷成形手术。再者,含有成熟脂肪细胞的组合物因为会使促进血管形成的IL-8、GRO及MCP-1高表达,所以可使用作为血管再生促进剂。
附图说明
[图1]图1是取代图并表示将已细切过滤并碎解的微小脂肪放入培养瓶的状态的照片;
[图2]图2是取代图并表示培养下的成熟脂肪细胞的位相差显微照片;
[图3]图3是取代图并已将培养下的成熟脂肪细胞进行苏丹III染色时的照片;
[图4]图4是取代图并表示条件培养基的细胞因子/趋化因子分析的结果的图表;
[图5]图5是取代图并表示在裸鼠腹部单独移植人类吸取脂肪片而得的组织的移植6个月后的摘除标本的照片;
[图6]图6是取代图并取代图并表示裸鼠腹部的已共移植人类脂肪组织、培养脂肪细胞及条件培养基的移植后6个月的摘除标本的照片;
[图7]图7是取代图并表示裸鼠腹部的已共移植人类脂肪组织、培养脂肪细胞及条件培养基的移植后6个月的摘除标本的照片;
[图8]图8是取代图并表示左乳癌手术后的乳房重建手术的例子的照片;
[图9]图9是取代图并表示培养脂肪细胞膜上的VEGFR2及PDGFRβ的免疫染色的结果的照片;
[图10]图10是取代图并表示脂肪细胞的传代培养可能数及PDL的图表;
[图11]图11是取代图并表示仅α-MEM(对照组)P2培养第4天的培养脂肪细胞的照片;
[图12]图12是取代图并表示间充质干细胞无血清培养基P2培养第4天的培养脂肪细胞的照片;
[图13]图13是取代图并表示添加α-MEM+10%胎牛血清(FCS)的培养基的培养脂肪细胞的照片。
具体实施方式
以下,针对用于实施本发明的实施方式进行说明。本发明并不受限于以下所说明的形态,也包含在本领域的技术人员清楚知道的范围内从以下的形态进行适当修正而成的形态。
此说明书所记载的第一发明涉及含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法。所谓含有成熟脂肪细胞的组合物,例如是包含源自人体的成熟脂肪细胞的组合物。例如,在日本专利第5991687号公报中记载有单离成熟脂肪细胞的方法。如此成熟脂肪细胞为已知。成熟脂肪细胞的大小(有最大长度的部分的长度)可为60-100μm,优选为1μm以上且60μm以下」,也可为5μm以上且40μm以下。
此方法包含切割过滤工序、微小脂肪培养工序及含有成熟脂肪细胞的组合物取得工序。
切割过滤工序
切割过滤工序是用于将未进行酶处理的脂肪组织进行切割过滤而获得微小脂肪的工序。脂肪组织的优选例是在将吸取脂肪清洗后已去除血液成分的脂肪组织。也可将已去除血液成分的脂肪组织通过利用抗生素进行除菌后再进行过滤,而使细胞细碎。切割过滤工序优选为包含进行离心分离并去除沉淀的基质血管组分(SVF)的工序。此情形,只要仅回收通过离心分离所得到的浮于液相的上部的脂肪成分而获得微小细胞即可。离心分离只要适当采用已知方法即可。
微小脂肪培养工序
微小脂肪培养工序是用于在切割过滤工序后使用培养用培养基培养微小脂肪而获得成熟脂肪细胞的工序。此成熟脂肪细胞被包含在培养细胞群中。培养用培养基是包含氢化可的松及FGF-2的培养基。优选的培养用培养基是包含自体血清的培养基,或是包含FBS、氢化可的松及FGF-2的培养基。培养用培养基也可为包含自体血清、氢化可的松及FGF-2的培养基。
本发明的培养基只要在基本培养基中添加适当需要的要素即可。基本培养基的例子是α-MEM培养基、伊格尔基础培养基及DMEM。试剂只要适当添加用于培养基的已知物即可。试剂的例子是胎牛血清(FBS)、HC(氢化可的松)、FGF2、IGF(类胰岛素生长因子)、胰岛素、PDGF(platelet derived growth factor,血小板衍生生长因子)、ACTH(肾上腺皮质刺激激素)、LIF(白血病抑制因子)、TGFβ、BMP、类固醇、脂肪酸、大豆胰蛋白酶抑制剂、抗坏血酸、透明质酸、脯氨酸、地塞米松、胰岛素、运铁蛋白、亚硒酸。将抗坏血酸等添加至培养基的情形,也可添加2-磷酸盐等盐的形态者。只要分别在培养基中添加0.1ng/mL以上且20μg/mL以下(或0.2ng/mL以上且10μg/mL以下)即可。此等只要因应纯化的程度、需要量而适当调整并添加即可。也可取代FBS而添加自体血清。并且,也可使用无血清培养基。无论如何,培养基中优选为添加HC(氢化可的松)及FGF-2。
培养用培养基的例子是在α-MEM培养基中添加1-10%胎牛血清(FBS)、20ng/ml以上且100ng/ml以下的氢化可的松(Hydrocortisone)、5ng/ml以上且20ng/ml(或50ng/ml)的FGF2(Fibroblast Growth Factor 2,成纤维细胞生长因子2)而成的培养基。也可取代1-10%胎牛血清(FBS)或和其一起添加1-10%自体血清。此等量也可适当调整。例如,也可在培养基包含0.1%-20%的FBS及自体血清。
可将微小脂肪在通常的培养条件下进行培养、增殖。细胞量能为10%前后至100%汇合状态,并且,也能为在如大于100%汇合般的高密度、迭层的状态下的培养。也可在移植后立刻或是稍为静置后再移至低氧状态。低氧培养例如可使用将市售的氮气等进行混合而使氧分压下降的类型的低氧培养箱,也可将氮气等吹入适当的空间而降低氧分压等再进行培养。
培养条件优选为在3%以上且20%以下的碳酸气体、1%以上且10%以下的氧气下进行,也可在5%以上且20%以下的碳酸气体、2%以上且10%以下的氧气下,也可在8%以上且12%以下的碳酸气体、3%以上且7%以下的氧气下。
含有成熟脂肪细胞的组合物取得工序
含有成熟脂肪细胞的组合物取得工序是用于获得含有成熟脂肪细胞的组合物的工序,所述含有成熟脂肪细胞的组合物包含成熟脂肪细胞及经过微小脂肪培养工序所得到的条件培养基(conditioned medium)。含有成熟脂肪细胞的组合物也可为包含成熟脂肪细胞及培养上清液的组合物。
成熟脂肪细胞的优选例是相较于IL-6使趋化因子/细胞因子,即IL-8、GRO及MCP-1分别表达4倍以上的细胞。也可为相较于IL-6使IL-8、GRO及MCP-1中任一种或两种以上表达10倍以上的细胞,也可为相较于IL-6使IL-8、GRO及MCP-1中任一种或两种以上表达20倍以上的细胞,也可为相较于IL-6使IL-8、GRO及MCP-1中任一种或两种以上表达20倍以上的细胞。通过如此包含血管再生促进能力高且炎症性低的细胞因子/趋化因子,而含有成熟脂肪细胞的组合物在已移植时不会引起炎症且会发挥高的血管促进能力,因此适合于移植。此含有成熟脂肪细胞的组合物特别优选为包含从进行移植的患者采取的脂肪的组合物。
成熟脂肪细胞的优选例是相较于TNF-α使IL-8、GRO及MCP-1中任一种或两种以上表达10倍以上的成熟脂肪细胞,优选为相较于TNF-α使IL-8、GRO及MCP-1中任一种或两种以上表达50倍以上的成熟脂肪细胞,优选为相较于TNF-α使IL-8、GRO及MCP-1中任一种或两种以上表达100倍以上的成熟脂肪细胞,优选为相较于TNF-α使IL-8、GRO及MCP-1中任一种或两种以上表达500倍以上的成熟脂肪细胞。
成熟脂肪细胞的优选例是相较于IL-1-β使IL-8、GRO及MCP-1中任一种或两种以上表达10倍以上的成熟脂肪细胞,优选为表达相较于IL-1-β使IL-8、GRO及MCP-1中任一种或两种以上表达50倍以上的成熟脂肪细胞,优选为相较于IL-1-β使IL-8、GRO及MCP-1中任一种或两种以上表达100倍以上的成熟脂肪细胞,优选为相较于IL-1-β使IL-8、GRO及MCP-1中任一种或两种以上表达500倍以上的成熟脂肪细胞。
成熟脂肪细胞的优选例是相较于INF-γ使IL-8、GRO及MCP-1中任一种或两种以上表达10倍以上的成熟脂肪细胞,优选为相较于INF-γ使IL-8、GRO及MCP-1中任一种或两种以上表达50倍以上的成熟脂肪细胞,优选为相较于INF-γ使IL-8、GRO及MCP-1中任一种或两种以上表达100倍以上的成熟脂肪细胞,优选为相较于INF-γ使IL-8、GRO及MCP-1中任一种或两种以上表达500倍以上的成熟脂肪细胞。
含有成熟脂肪细胞的组合物只要因应目的而包含适合的量的成熟脂肪细胞、条件培养基(或培养上清液)即可。并且,此组合物只要和通常的组合物同样地可收纳于需要的容器并视需要利用即可。成熟脂肪细胞的量例如可为每一次使用1×104细胞以上且1×1010细胞,也可为每一次使用1×105细胞以上且1×108细胞。
包含培养上清液作为有效成分的剂,例如如同日本特开2013-18756号公报、日本专利第5139294号及日本专利第5526320号公报所揭示为已知。因此,包含条件培养基的组合物可使用已知方法进行制造。
成熟脂肪细胞的培养上清液的例子有:将通过离心分离使培养上清液固液分离而得到的上清液成分,即培养上清液,通过冷冻干燥去除水分而获得的处理物;使用蒸发器等将培养上清液减压浓缩而获得的处理物;使用超滤膜等将培养上清液浓缩而获得的处理物;或使用过滤器将培养上清液固液分离而获得的处理物;或进行如上述般的处理之前的培养上清液的原液。并且,例如也可将本发明的已培养成熟脂肪细胞的上清部分进行离心分离(例如1,000×g,10分钟)后,用硫酸铵(例如65%饱和硫酸铵)进行划分,将沉淀物悬浮于适合的缓冲液后,进行透析处理,用注射器过滤器(例如0.2μm)进行过滤,而获得无菌的培养上清液。也可将所采取的培养上清液直接使用,并且,也可先冷冻保存并在使用时解冻使用。并且,也可加入药学上可接受的载体,以成为容易操作的液量的方式分注至灭菌容器。再者,作为感染性病原体风险的对策,也可通过病毒清除过滤器、紫外线照射而处理培养上清液。含有成熟脂肪细胞的组合物中,将培养上清液设为1投药单位,优选为包含1mL以上且1,000mL以下,更优选为30mL以上且300mL以下。
含有成熟脂肪细胞的组合物的优选利用例是使用作为皮下脂肪组织的替代品。此说明书也提供皮下脂肪组织替代方法,其包含对于人类,即患者投药含有成熟脂肪细胞的组合物的工序。此时的含有成熟脂肪细胞的组合物优选为除了包含成熟脂肪细胞、条件培养基以外,进一步包含患者的脂肪组织。并且,也可将含有成熟脂肪细胞的组合物使用于乳房增大手术、乳房重建手术或组织凹陷成形手术。例如,乳房重建手术包含将含有成熟脂肪细胞的组合物注入缺损脂肪成分的乳房的工序。
此说明书所记载的第二发明涉及能使用作为皮下脂肪组织的替代品的组合物。此组合物是通过上述的任一含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法所制造的含有成熟脂肪细胞的组合物,且能使用作为皮下脂肪组织的替代品。此组合物例如被使用于乳房增大手术、乳房重建手术或组织凹陷成形手术。
本说明书所记载的第三发明涉及血管再生促进剂。此血管再生促进剂例如包含通过上述的任一含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法所获得的含有成熟脂肪细胞的组合物。亦即,此血管再生促进剂和上述的含有成熟脂肪细胞的组合物同样。血管再生促进剂例如也可为注射剂。只要在注射器内事先含有上述的含有成熟脂肪细胞的组合物,并视需要和患者的组织进行混合并移植至患者的需要处即可。
实施例1
培养法培养脂肪的培养基的组成
取得知情同意书后,用直径2mm以下(并无限定直径)的插管从腹部、大腿部、臀部、上臂部吸取采取脂肪组织。将所吸取采取的脂肪进行清洗并去除血液成分。将此组织用抗生素除菌后,细切过滤,使脂肪细碎,进行离心,仅培养浮于液相上部的脂肪成分。SVF在进行离心后会成为颗粒(pellet)而沉淀在下层,因此会被去除。
将此微小脂肪放入培养瓶并开始培养。图1是取代图并表示将已细切过滤并碎解的微小脂肪放入培养瓶的状态的照片。如同图1所示,SVF被去除,仅残留脂肪成分。培养时的培养基量是组织不会浮起的少量程度。在培养5天后,因为从组织片确认到出现粘附的细胞,所以追加培养基并持续培养。
培养基是使用在α-MEM培养基中添加5%胎牛血清(FBS:Fetal Bovine Serum)、40ng/ml的氢化可的松(Hydrocortisone)、10ng/ml的FGF2(Fibroblast Growth Factor 2,成纤维细胞生长因子2)而成的培养基。培养条件是在10%碳酸气体、5%氧气下进行。
在初代培养第12天回收2-3×106细胞的培养细胞。将此细胞的一部分进行冷冻,将其他细胞用4-5×104/cm2的密度进行接种并培养5天。6天后,用PBS(-)清洗3次,在已从上述的培养基成分去除FBS的培养基中培养两天。将此培养基作为条件培养基(conditionedmedium)而用于分析。
图2是取代图并表示培养下的成熟脂肪细胞的位相差显微照片。如同图2所示,脂肪细胞包含大量脂肪颗粒。为了确认培养下的成熟脂肪细胞,而进行苏丹III染色。在脂肪的特殊染色,即在苏丹III中,成熟脂肪细胞也特异性地染红。将其结果揭示于图3。图3是取代图并已将培养下的成熟脂肪细胞进行苏丹III染色时的照片。如同图3所示,可知培养基包含大量脂肪颗粒。
实施例2
利用抗体固定磁珠法(Antibody-Immobilized Magnetic Beads法)进行培养成熟脂肪细胞的条件培养基(Conditioned Medium)的细胞因子/趋化因子分析。将条件培养基(Conditioned Medium)样品以13,000G、4℃离心5分钟,将所获得的上清液使用于测量。使用Luminex(注册商标)系统,测量条件培养基(Conditioned Medium)内的40的目标蛋白质的浓度。以每孔25μL使用经前处理的样品,进行3次测量。基于手册而将标准液追加1份,将5倍稀释系列准备7份,并进行3次测量。对象蛋白质40品名为EGF、FGF-2、嗜酸粒细胞趋化因子、TGF-α、G-CSF、Flt-3L、GM-CSF、不规则趋化因子、IFNα2、IFNγ、GRO、IL-10、MCP-3、IL-12P40、MDC、IL-12P70、PDGF-AA、IL-13、PDGF-AB/BB、IL-15、sCD40L、IL-17A、IL-1RA、IL-1α、IL-9、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TNFα、TNFβ及VEGF。
图4是取代图并表示条件培养基(Conditioned Medium)的细胞因子/趋化因子分析的结果的图表。如图4所示,证明培养成熟脂肪细胞的条件培养基会大量(ng/ml)产生血管再生能力高的细胞因子,即IL-8、GRO、MCP-1。另一方面,脂肪干细胞中增加的引发炎症的TNF-α或炎症诱发力强的IL-1-β、INF-γ在此细胞中几乎没有产生,因此也显示其是安全的。
实施例3
对于裸鼠的脂肪移植实验
-小鼠的移植实验及移植组织影像的探讨-
取得知情同意书,并从腹部吸收采取脂肪组织。利用和上述同样的方法进行除菌并接种。在初代培养第12天回收2×106细胞的培养脂肪细胞。将此细胞暂时冷冻保存。在移植前将细胞解冻,用5×104细胞/cm2的密度进行接种,培养5天。对于要进行移植的0.6-0.7g的脂肪,添加利用酶处理而回收的3×106细胞的培养脂肪细胞并进行混合,在隔天移植至裸鼠的背部皮下。对照组的小鼠仅移植脂肪。在移植后第6个月进行摘除,并提供进行组织染色。在仅人类脂肪组织的单独移植中,脂肪组织几乎都被吸收,但在培养细胞及人类脂肪的共移植中,脂肪组织完整地残留。而且,在中心确认到血管的形成。
将人类吸取脂肪片单独移植至裸鼠腹部,将所得的组织的移植6个月后的摘除标本使用油红O进行染色。图5是取代图并表示在裸鼠腹部单独移植人类吸取脂肪片而得的组织的移植6个月后的摘除标本的照片。图5的放大倍率为100倍。在周围一部分确认到形成有脂肪组织的部分,但中央部是空洞化,是移植后脂肪已被吸收的部位。其周围组织形成有瘢痕组织及部分脂肪。
将人类脂肪组织、培养脂肪细胞及条件培养基(Conditioned Medium)共移植至裸鼠腹部,将移植后6个月的摘除标本使用油红O进行染色。图6是取代图并表示裸鼠腹部的已共移植人类脂肪组织、培养脂肪细胞及条件培养基(Conditioned Medium)的移植后6个月的摘除标本的照片。图6的放大倍率为100倍。在标本组织整体的95%以上形成有脂肪组织。在内部也确认到血管组织。
将人类脂肪组织、培养脂肪细胞及条件培养基(Conditioned Medium)共移植至裸鼠腹部。为了确认脂肪是人类来源细胞,而使用荧光免疫染色(人类核抗原抗体231-1[AlexaFluor(注册商标)488]Novus公司Southpark Way US)进行染色。图7是取代图并表示裸鼠腹部的已共移植人类脂肪组织、培养脂肪细胞及条件培养基(Conditioned Medium)的移植后6个月的摘除标本的照片。在标本组织整体形成有脂肪组织。在内部也确认到类血管组织。
实施例4
对于人体的脂肪移植(乳房完全切除重建手术)
实施例4-1:对于左乳癌手术后的乳房重建的培养成熟脂肪细胞、条件培养基(Conditioned Medium)及自体脂肪移植例-
对于左乳癌手术后的46岁女性,在乳癌切除时将组织扩张器留置于胸部,扩张(expansion)皮下组织及胸大肌,在胸中制造隆起。然后,应本人的要求而预定进行本方法。从腹部吸取采取2cc的脂肪,进行除菌并进行接种培养。在初代培养第14天回收3×106细胞的培养脂肪细胞。将此培养脂肪细胞暂时冷冻保存。在移植前,进行解冻并将细胞在底面积150cm2的12个烧瓶中培养6天。将移植所使用的吸取脂肪组织、成熟培养细胞及条件培养基(Conditioned Medium)进行混合并移植。第一次移植是在皮下组织扩张器的周围将合计252ml(17.16×107细胞)直接移植至左胸部皮下。在约6个月后,在拔除组织扩张器时在内腔及其周围将8个烧瓶合计258ml(11.44×107细胞)直接移植至左胸部皮下。
作为初代培养及配养解冻后的细胞时的培养基,使用已添加10%自体血清、40ng/ml的氢化可的松及10ng/ml的FGF2的培养基。此外,已确认即使使用FBS取代10%自体血清,也能获得同样的培养基。
利用MRI图像分析移植1年后的移植脂肪组织的结果,显示经移植的脂肪组织未被吸收,维持原来的大小。将其结果揭示于图8。图8是取代图并表示左乳癌手术后的乳房重建手术的例子的照片。画面中,由MRI的水平剖面中从下方观看的结果,能确认在健康侧的乳腺组织乳头。在重建侧,经移植的脂肪并未被吸收,而接近几乎100%植活。脂肪组织的亮度较白,可知全层性的形成有脂肪。并且,在内部确认到大量的血管的运行。未确认到脂肪坏死、囊肿、钙化、肿块(硬结)。确认到稳定形成脂肪(在其他10个病例中也获得相同结果)。因为是俯卧位拍摄,所以健康侧呈现下垂
对于人体的脂肪移植(乳房保存重建手术)
实施例4-2:对于左乳癌保存手术术后及右乳房萎缩再生不良的培养成熟脂肪细胞、条件培养基(Conditioned Medium)及自体脂肪移植例
对于左乳癌手术后的44岁女性,在左乳癌保存手术后确认到明显的乳房凹陷变形(1/2以上的变形),右乳房确认到再生不良及萎缩。应本人的要求而预定进行本方法。从腹部吸取采取2cc的脂肪,进行除菌并进行接种培养。在初代培养第14天回收3.4×106细胞的培养细胞。将此培养细胞暂时冷冻保存。在移植前,将已解冻的细胞在底面积150cm2的15个烧瓶中培养7天。作为初代培养及培养解冻后的细胞时的培养基,使用已添加10%自体血清、40ng/ml的氢化可的松及10ng/ml的FGF2的培养基。将移植所使用的吸取脂肪组织、培养脂肪细胞、成熟培养细胞及条件培养基(Conditioned Medium)进行混合并移植。移植总量为310ml(21.45×107细胞)。在左乳癌保存部中,在皮下组织整体合计注入移植220ml。在右乳房萎缩再生不良部中,注入移植90ml。移植1年后,脂肪组织未被吸收且维持大小,且未确认到肿块(硬结)等,外貌形态良好。
对于人体的脂肪移植(脸部凹陷变形成形手术)
实施例4-3:对于脸部萎缩的培养成熟脂肪细胞、条件培养基(ConditionedMedium)及自体脂肪移植例
左乳癌手术后的68岁女性因为右脸部萎缩所以确认到凹陷变形。并且,因为在其他医院接受腹部、大腿等的脂肪吸取,所以是难以进行一般的脂肪采取的病例。应本人的要求而预定进行本方法。从腹部吸取采取2cc的脂肪,进行除菌并进行接种培养。在初代培养第16天回收4.4×106细胞的培养细胞。将此培养细胞暂时冷冻保存。在移植前,进行解冻并将细胞在底面积175cm2的5个烧瓶中培养7天。作为初代培养及培养解冻后的细胞时的培养基,使用已添加10%自体血清、40ng/ml的氢化可的松及10ng/ml的FGF2的培养基。将移植所使用的吸取脂肪组织、培养细胞、成熟培养细胞及条件培养基进行混合并移植。移植总量为35ml(8.35×107细胞)。移植1年后,脂肪组织未被吸收且维持大小,且未确认到肿块(硬结)等,外貌形态良好。
并且,漏斗胸因为是胸的胸壁凹陷变形,所以和实施例4-2同样地,可认为是医学上凹陷变形严重的疾病,因此是本方法的适用疾病。
考察
以往的概念中,包含脂肪干细胞的SVF(ASC)被认为是通过促进血管新生而若与脂肪进行共移植则可提高移植的存活率。动物研究中,移植片的能生存区域是从周缘起约1.50.5mm,生存细胞内的脂肪细胞的60%会死亡。即使对脂肪细胞添加SVF所含有的脂肪源性基质细胞(ASCs),生存区也只能获得低于300μm的生存区。并且,在人类研究中被称为细胞辅助脂肪移植(CAL),乳房的脂肪移植被报导为和通常的脂肪移植并无差异,通常的脂肪移植为39%,CAL为65%(Toyserkani MN.,Quaade ML,and Sorensen.JA.Cell-AssistedLipotransfer:A Systematic Review of Its Efficacy.Aesthetic Plast Surg.2016;40:309-318)。10份报导中的5份报告记载了对于乳房的CAL的存活率,为51.8%、47%、40%-80%、54%、50%,并不稳定(Cell assisted lipotransfer in breastaugmentation and reconstruction:A systematic review of safety,efficacy,use ofpatient reported outcomes and study quality.Arshad Z,Karmen L,Choudhary R,Smith JA,Branford OABrindley DA,Pettitt D and Davies BM.JPRAS OPEN.2016Dec;10:5-20)。
文献(Caunt M,1Liang Hu,1Thomas Tang,1Peter C.Brooks,2Sherif Ibrahim,3and Simon Karpatkin Growth-regulated Oncogene Is Pivotal in Thrombin-InducedAngiogenesis.Cancer Res 2006;66(8):4125 -32;Keglowich1 L,Roth M,Philippova1M,Resink T,Tjin G,Bronchial Smooth Muscle Cells of Asthmatics PromoteAngiogenesis Through Elevated Secretion of CXC-chemokines(ENA-78,GRO-α,andIL-8)PLoS One.2013;8(12):e81494.doi:10.1371/journal.pone.0081494)揭示GRO的血管形成能力。
文献(Mikula-Pietrasik J Kuczmarska A,Kucin′ska M.MuriasetM.al.Resveratrol and its synthetic derivatives exert opposite effects onmesothelial cell-dependent angiogenesis via modulating secretion of VEGF andIL-8/CXCL8.Angiogenesis 2012;15:361-376及上述Keglowich1人等)也揭示IL-8的血管形成能力。
另一文献(6.Niu J,Azfer A,Zhelyabovska O,Fatma S,andKolattukudyPE.Monocyte Chemotactic Protein(MCP)-1Promotes Angiogenesis via aNovel Transcription Factor,MCP-1-induced Protein(MCPIP).J Biol Chem2008May23;283(21):14542-51.doi:10.1074/jbc.M802139200)中将MCP-1报导作为血管新生趋化因子,也揭示血管形成能力。并且,文献(3.Hong KH,Ryu J,Han KH.MonocyteChemoattractant protein-1-induced Angiogenesis Is Mediated by VascularEndothelial Growth factor-A.Blood 2005;105:1405-1407DOI:10,1182/blood-2004-08-3178)揭示MCP-1对VEGF的血管形成能力进行介导。血管形成中需要出动巨噬细胞,MCP-1为进行此动作的必要因子。
因此,显示实施例中的培养脂肪细胞所分泌的存在于条件培养基中的4种细胞因子(MCP-1、IL-8、GRO、VEGF)皆具有血管形成能力。
实施例5
将成熟培养脂肪细胞P2接种1×104/6孔(8cm2/孔),制作成熟培养脂肪细胞单独组及成熟培养脂肪细胞+吸取脂肪的共培养组并培养5天,进行VEGFR2(Vascularendothelial growth factor receptor 2,血管内皮细胞生长因子受体2)及PDGFRβ(platelet-derived growth factor beta,血小板衍生生长因子β)的免疫染色。
使用药品为抗VEGFR2多克隆抗体(Funakoshi:bs-10412)抗PDGFRbeta多克隆抗体[Y92]-C-末端(ab32570)山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)DAB底物试剂盒(Funakoshi:CSK-4100,VEC)。
将所得的结果揭示于图9。显示2组皆存在VEGFR2及PDGFRβ强烈表达的细胞。
VEGFR2为VEGF信号的主要应答者,仅在血管内皮细胞及其祖细胞表达,因此表示血管生成。PDGFRβ会在脂肪祖细胞的其PPARγ被脂肪酸等刺激时表达。因此,获得也包含脂肪祖细胞的结果。因包含两者的细胞,故认为在移植后会同时促进血管形成及脂肪形成。并且,以前的血管促进因子(MCP-1、IL-8、GRO、VEGF)也大量出现,因此成为移植后的血管形成(成对使用:细胞种+因子),可知具有非常强的血管新生作用。并且,显示在将成熟脂肪细胞及吸取脂肪进行共培养的组中,VEGFR2及PDGFRβ也强烈表达。
实施例6
已肿瘤化的细胞具有增殖不会停止而持续进行增殖的特性。以确认本次制作的培养脂肪细胞的安全性为目的,进行脂肪细胞的老化(Aging)检査。此检査是培养脂肪细胞并持续进行传代(passage)以确认增殖何时停止的检查。
将6名的培养脂肪细胞培养3个月,且测量到增殖停止为止的PDL(CPD)。此等意指已分裂几次。将其结果揭示于图10。图10是取代图并表示脂肪细胞的传代培养可能数及PDL的图表。如同图10所示,确认到发生由老化所造成的增殖停止。
P14=共102天培养:纵轴CDL(=PDL)。
49岁(在102天停止),40岁(在95天停止),60岁(在67天停止),54岁(在61天停止),52岁(在62天停止),50岁(在67天停止)。
实施例7
进行培养脂肪细胞能否用无血清培养基培养的实验,结果即使是市售的间充质干细胞无血清培养基(Lonza PT-3001:Lonza.KK),比起胎牛血清,增殖状况虽然不好但仍有增殖。
基础培养基:
A:仅α-MEM,未添加血清(对照组)。
添加的HC及FGF的浓度与临床相同。
B:已添加间充质干细胞无血清培养基(Lonza PT-3001)者。
C:已将胎牛血清(FCS)以成为10%的方式添加至α-MEM者(阳性对照组)。
将以上进行比较讨论。其结果表示于图11-图13。图11是取代图并表示仅α-MEM(对照组)P2培养第4天的培养脂肪细胞的照片。图12是取代图并表示无血清培养基(Lonza PT-3001)P3培养第4天的培养脂肪细胞的照片。图13是取代图并表示添加α-MEM+10%胎牛血清(FCS)的培养基的培养脂肪细胞的照片。表1表示各培养基中的细胞数。
表1
产业可利用性
此发明能利用于医疗机器的领域等。
Claims (9)
1.一种含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法,其特征在于,包含:
切割过滤工序,其将未进行酶处理的脂肪组织进行切割过滤,而获得微小脂肪;
微小脂肪培养工序,其在切割过滤工序后,使用培养用培养基培养所述微小脂肪,而获得成熟脂肪细胞;以及
含有成熟脂肪细胞的组合物取得工序,其获得含有成熟脂肪细胞的组合物,所述含有成熟脂肪细胞的组合物包含所述成熟脂肪细胞及经过所述微小脂肪培养工序所得到的条件培养基(conditioned medium),
所述切割过滤工序包含进行离心分离而去除沉淀的基质血管组分(SVF)的工序,
所述培养用培养基为包含氢化可的松及FGF-2的培养基。
2.根据权利要求1所述的含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法,其特征在于,
所述脂肪组织是已在清洗吸取脂肪后去除血液成分的脂肪组织。
3.根据权利要求2所述的含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法,其特征在于,
所述切割过滤工序还包含将通过离心分离所得的漂浮于液相的上部的脂肪成分进行回收而获得所述微小细胞的工序。
4.根据权利要求3所述的含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法,其特征在于,
所述条件培养基(conditioned medium)分别包含IL-6的4倍以上的IL-8、GRO及MCP-1。
5.根据权利要求3所述的含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法,其特征在于,
所述条件培养基(conditioned medium)包含IL-6的0.5倍以上且1.5倍以下的血管内皮细胞生长因子(VEGF)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法,其特征在于,
所述含有成熟脂肪细胞的组合物能使用作为皮下脂肪组织的替代品。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法,其特征在于,
所述含有成熟脂肪细胞的组合物是用于乳房增大手术、乳房重建手术或组织凹陷成形手术。
8.一种血管再生促进剂的制造方法,其特征在于,
包含通过如权利要求1至5中任一项所述的含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法所获得的含有成熟脂肪细胞的组合物。
9.根据权利要求8所述的血管再生促进剂的制造方法,其特征在于,
所述含有成熟脂肪细胞的组合物包含血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)2或阳性细胞及血小板衍生生长因子(PDGFR)β。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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