JP2024028920A - ｈＭＰＣの集団をゼノフリー生成するための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、骨格筋由来のヒト筋前駆細胞の集団を生成する方法を提供する。
【解決手段】少なくとも以下のステップ：ヒト患者の骨格筋生検によってヒト組織サンプルを得るステップ、ヒト組織サンプルから脂肪組織及び／又は腱組織及び／又は結合組織を外科的に取り除くステップ、ヒト組織サンプルを細かく刻み、酵素消化するステップ、線維芽細胞の数を減らし、これによってヒト筋前駆細胞の集団を得るステップ、ヒト筋前駆細胞を、コラーゲンコーティングしたディッシュに定着させるステップ、少なくとも１回の継代のために、ヒト筋前駆細胞を細胞成長培地中で増殖させるステップを含む、方法である。
【選択図】図１５

Description

本発明は、ヒト筋前駆細胞（ｈＭＰＣ）の集団をゼノフリー生成するための方法、これらのｈＭＰＣを含む組成物、及び、骨格筋機能障害、特に緊張性尿失禁を処置するための組成物の生産におけるこれらのｈＭＰＣの使用に関する。

尿失禁、すなわち不随意的な排尿は、４５歳を超える女性集団のおよそ半分及び７０歳を超える男性の１７％が罹患している、大きな医療問題である。排泄抑制能力及び排尿には、尿道の閉鎖と排尿筋の活動との間のバランスが関係する。排泄抑制能力は、尿道括約筋、膀胱頚の位置、尿道平滑筋、神経の完全性、血管網、及び周辺組織の支持の、複雑な相互作用によって成される。

緊張性尿失禁及び切迫性尿失禁などの異なるタイプの尿失禁が存在する。緊張性尿失禁（ＳＵＩ）は、咳、笑い、くしゃみ、運動、又は腹部内の圧力を増大させ、ひいては膀胱に対する圧力を増大させる他の動きに伴う、少量の排尿である。骨格筋でできている、したがって体性神経系の随意的な制御下にある、横紋筋の外尿道括約筋が、ほとんどの場合、ＳＵＩの予防を担っている。外尿道括約筋の損傷は主に分娩の際、外科的処置の際、又は加齢の影響として生じる。ＳＵＩは、世界中で２億を超える人が罹患している疾患であり、女性は男性の２倍であり、毎日の活動の制限、不快な感覚、臭い、及び尿用パッドが濡れていることによって生じる感染が理由で、患者のクオリティー・オブ・ライフを低下させている。発生している医療費は著しい。

ＳＵＩの現行の治療選択肢としては、主に、非外科療法（膀胱のトレーニング、食事の改善）、薬物療法、及び外科療法が含まれる。これらの治療法は短期間の軽減をもたらすにすぎず、これらの治療法の全体的な成功は、合併症（外科手術の侵襲性、尿路感染症の割合を増大させる周辺組織の損傷）又は副作用（薬物、非分解性の生体材料による組織の損傷など）によって制限されることが多い。尿失禁を処置するための細胞療法アプローチの進歩は、患者自身の細胞を使用して根底にある病因を正すことについての有望な結果を示している。細胞ベースの治療法の最近の進歩は、ＳＵＩを有する患者において損傷した括約筋の機能を回復させるための様々な解決法を提供している。

特許文献１は、マウスにおける筋力低下を処置するための筋芽細胞の使用を開示している。筋再生のための、より進歩したアプローチは、筋芽細胞を、外因性の増殖因子と共に又はそれを伴わずに、再構成された基底膜の３次元ゲルに組み込むことによるものである（非特許文献１）。これらのプロトコルにおいては、筋芽細胞の増殖及び分化を促進するための高濃度の様々な増殖因子を含有する、市販の、マウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチンタンパク質混合物（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））が使用された。

特許文献２は、市販されている材料（生体適合性の糊、（ヒトフィブリノーゲン及びヒトトロンビンの）フィブリン糊、又は生体適合性のゲルを含む）の組み合わせを含む「再生糊」と、骨髄又は脂肪組織由来の間葉系幹細胞とを注射することによる、ＳＵＩを処置するための方法を開示している。この糊は、代替させる目的で、恥骨尿道靭帯が損傷した、不在の、又は傷ついた部位に注射された。

特許文献３は、平滑筋機能障害を処置するための平滑筋前駆細胞の使用の可能性を開示している。

テフロン（登録商標）、ウシコラーゲン、シリコーン粒子、及び炭素ビーズなどの注射可能な充填剤の使用によって、短期間の成功が得られている。しかし、これらの充填剤が慢性炎症、異物巨細胞の応答、尿道周囲膿瘍、尿道のびらん、尿閉をもたらす下部尿路の閉塞、並びに内部器官への移動及び肺塞栓症を生じさせ得ることが報告されている（非特許文献２）。

ＭＰＣの移植は、遺伝的及び後天的な筋肉障害のための処置として研究されている。ＭＰＣは、衛星細胞として不活性なステージである休眠状態では、筋線維の周囲にある基底層の下に存在する。これらの細胞は、外傷又は損傷を受けると活性化し、そして、傷ついた区域に向かって移動し、増殖し、互いに融合して、最終的に筋線維に成熟する筋管を形成することによって、組織の再生に参加する。ＭＰＣの大部分は、筋原細胞系統に大きく関与しており、したがって、骨格筋のバイオエンジニアリングに最も適している。ＭＰＣは優れた成長能力を有しており、培養で容易に増殖する。筋管が形成された後、これらの細胞は有糸分裂後の状態となり、成熟線維に分化し始め、インビボでの制御されていない組織成長を阻害する。ＳＵＩの処置のための注射可能な培養されたＭＰＣの使用の可能性は、齧歯動物モデル及びイヌモデルにおいて調査されており、括約筋の機能を回復させるための第１選択治療となる可能性を有している（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。しかし、これらの動物モデルは、ヒト患者において見られる状態を十分には反映していない。

筋由来の幹細胞及び自己筋芽細胞の注射は、これまでのところ、ヒトにおける最も調査された治療選択である。しかし、過去にいくらかの試みが行われたにもかかわらず、尿道括約筋の再生療法はいまだ臨床に達しておらず、泌尿器科での日常的な診療を構成してはいない。

ウシ胎児血清（ＦＢＳ）に対する懸念に起因して、ウシ胎児血清の代替は、この治療法の臨床現場への移行を容易にするために必要である。これまでのところ、ＦＢＳは、標準的な培地添加物、並びに細胞培養及び組織工学のための増殖因子の源であった。前駆細胞をインビトロで培養増殖させる際のＦＢＳの使用は、タンパク質及び高分子に起因する潜在的な危険性を有し得る。幹細胞中へのこれらの高分子の内在化は、ウイルス疾患／プリオン疾患を伝染させる可能性がある。さらに、高分子は、移植された細胞に対して抗原性基質として作用し、免疫反応を生じさせる。異種免疫化、病原体の伝染、及びＦＢＳ収集に伴う倫理的問題のリスクに起因して、臨床的細胞療法製品を製造するための適切なヒト代替物が至急に必要である。ＦＢＳは、したがって、安全性及び他の懸念に起因して、臨床適用には望ましくない。一部の調査研究において、アナフィラキシー及び他のアレルギー反応が、ＦＢＳを添加した細胞を移植された患者において認められている。

治療アプローチにおいて適用されるあらゆる薬物として、細胞製品はまた、規制要件を満たす必要がある。これらの生産プロセスは、患者における安全な適用を可能にするために、適正製造基準（ＧＭＰ）に従う必要がある。したがって、細胞培養培地からあらゆる動物由来添加物を除去することは、ＳＵＩに罹患している患者への筋幹細胞療法を臨床に移行させるための重要なステップであり、これによって、異種タンパク質への拒絶反応が回避される。細胞培養方法論におけるこの変更は、ｈＭＰＣの主要な特徴、すなわち収縮筋組織を形成するその能力に影響することなく、行われるべきである。

ＦＢＳに代わる考えられる代替物は、ヒト血清、ヒト血小板誘導体、同種の臍帯血血清を添加した培地、又は化学合成培地である。

ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含有する細胞培養培地又は成長培地は、それぞれ、間葉系間質細胞の臨床スケールの増殖のための、又は、治療適用のためにヒト間葉系幹細胞を増殖させるための、ＦＢＳ含有培地の考えられる代替物として記載されている（非特許文献６、非特許文献７）。しかし、この血清の変化は、全ての細胞型が耐容性であるわけではないかもしれないし、一部の培養細胞の機能性に影響するかもしれない。以前の研究によって、ｈＰＬがヒト骨格筋細胞の培養におけるＦＢＳの適切な代替物ではないこと、及び細胞を筋管に分化させないことが見出された（非特許文献８）。

細胞の増殖は培地依存性であり、増殖因子を単に添加するだけでは、細胞の増殖の維持には不十分である。

米国特許第５，１３０，１４１号 米国特許出願第２０１４／０２２７２３３Ａ１ ＷＯ２０１６／１３８２８９Ａ１

Ｂａｒｂｅｒｏら、Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｍａｔｒｉｇｅｌ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｅｃｔｏｐｉｃ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ － ａ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００１年２月、１８６（２）：１８３～９２ Ｋｉｉｌｈｏｌｍａ Ｐ．ら、Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｔｅｆｌｏｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｔｒｅｓｓ ｕｒｉｎａｒｙ ｉｎｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅ、Ｎｅｕｒｏｕｒｏｌ． Ｕｒｏｄｙｎ １２：１３１～１３７（１９９３） Ｙｏｋｏｈａｍａら、Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｍｕｓｃｌｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｌｏｗｅｒ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｔｒａｃｔ、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００１、７（４）、３９５～４０４頁 Ｙｉｏｕら、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｕｎｉｔｓ ｉｎ ａ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｓｐｈｉｎｃｔｅｒ Ｉｎｊｕｒｙ ｂｙ Ｍｕｓｃｌｅ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｃｅｌｌ Ａｕｔｏｇｒａｆｔｓ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００３、７６（７）：１０５３～６０頁 Ｅｂｅｒｌｉら、Ａ ｃａｎｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｕｒｅｔｈｒａｌ ｓｐｈｉｎｃｔｅｒ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ． ＢＪＵ Ｉｎｔ、２００９、１０３（２）：２４８～５３頁 Ｓｃｈａｌｌｍｏｓｅｒら、Ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｙｓａｔｅ ｃａｎ ｒｅｐｌａｃｅ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｓｃａｌｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００７、４７：１４３６～１４４６ Ｃａｓｔｅｇｎａｒｏら、Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｌｙｓａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ． Ｃｕｒｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ． ２０１１、６（２）：１０５～１４ Ｋｒａｍｅｒら、Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐｌｙｓａｔｅ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ． Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４８、８９、２００５

したがって、本発明の目的は、ｈＭＰＣの増殖をもたらし、移植後のインビボでの組織工学で得られた収縮筋の効率的な形成を可能にする、細胞培養培地中のＦＢＳの代替物を提供することである。したがって、本発明の目的は、倫理的及び安全性の目的で、新規なゼノフリーの（又は動物成分を含まない）、したがって安全な、ｈＭＰＣの培養及び増殖のための、すなわち、治療適用において使用するため、特にヒト女性患者におけるＳＵＩの再生処置のためにｈＭＰＣ集団を含む組成物を生産するための、ＧＭＰに準拠したプロトコルを開発することである。

最後に、本発明は、骨格筋機能障害のための改善された処置方法を提供することを目的としている。

ニューロモデュレーション及び運動トレーニングが、欠損した骨格筋の考えられる処置として提案されている。ヒトにおいて、四頭筋の周りに巻かれた磁気コイルは、努力が不要な筋肉の疲労及びトレーニングを誘発することが実証されている。磁気パルスが椅子のシートの内部に置かれたコイルに向かって集中する、骨盤底を運動させるための類似の装置が設計された（Ｃｈａｎｄｉら、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｆｅｍａｌｅ ｕｒｉｎａｒｙ ｉｎｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅ：「ｔｈｅ ｃｈａｉｒ」． ＢＪＵ Ｉｎｔ、２００４．９３（４）：５３９～４２頁）。

筋肉をピクピクと動かす、神経筋電磁刺激（ＮＭＥＳ）が、骨格筋疾患のための治療法として提案されている。Ｂｌａｇａｎｊｅらは、２０１２年に、外尿道括約筋への超音波誘導性の自己筋芽細胞注射を行い、その前及び後に電気刺激を行うことによる、ＳＵＩの成功した処置を開示した。したがって、細胞及び刺激を使用する、ヒト女性患者におけるＳＵＩの最適化された処置方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。

組織工学におけるヒト筋前駆細胞（ｈＭＰＣ）の利用は、収縮性筋肉を再生することによる緊張性尿失禁（ＳＵＩ）の処置のための有望なアプローチである。この目的のために、このような治療適用において薬剤として使用するための組成物を生成するための方法が提案される。組成物は、骨格筋由来のｈＭＰＣ（又は筋肉再生細胞）の集団を含み、この集団の生成もまた、本発明の方法として提供される。

本発明は、第１の態様に従うと、したがって、少なくとも以下のステップを含む、骨格筋由来のヒト筋前駆細胞の自己集団を生成する方法に関する。

まず、ヒト組織サンプルを、ヒト患者の骨格筋生検によって得る。好ましくは、骨格筋生検はヒト女性患者から得られるが、しかし、例えば前立腺切除後の考えられるＳＵＩを処置するために、男性患者の骨格筋生検も有用であり得る。好ましくは、骨格筋生検は、ヒラメ筋、腹直筋、大腿四頭筋、外側広筋からなる群から選択される組織から採取される。

ヒラメ筋（左脚又は右脚の）が、その組成が括約筋に類似していることから、及びアクセスが容易であることから、生検に選ばれる。代替として、例えば、外側広筋を使用することができる。外科的切除の後に生検の輸送が必要なケースでは、生検は、抗生物質及びＰＢＳを含有する輸送媒体中で輸送することができる。

洗浄及び消毒の後、筋生検は、残っている脂肪組織及び／又は腱組織及び／又は結合組織を外科的に取り除き、次いで、細かく刻み、好ましくはコラーゲナーゼ及びディスパーゼを含有する混合物によって消化する。好ましくは、Ｉ型コラーゲナーゼ０．２％（ｗ／ｖ）及びディスパーゼ０．４％（ｗ／ｖ）の混合物を使用する。酵素反応を、好ましくは細胞培養培地、すなわち、１０％ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）、好ましくは１０％のプールされたヒト血小板溶解物（ｐｈＰＬ）を含有する成長培地で、停止する。その後、個々の線維を厳密なピペッティングによって遊離させ、１００μｍの孔サイズを好ましくは有するストレーナーを通して濾過する。遠心分離の後、ペレットを、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（この継代０ステップでのみ添加する）を添加した成長培地中に再懸濁し、コラーゲン又はフィブロネクチン、好ましくはＩ型コラーゲン（好ましくは１ｍｇ／ｍｌ）などの細胞外マトリクスタンパク質でコーティングした３５ｍｍのディッシュ（６ウェル）に移す。

消化した後、２４時間後、接着していないｈＭＰＣを含有する上清を、混入している線維芽細胞の数を減らすために、Ｉ型コラーゲンコーティングしたディッシュに再び播種し、これによって、ヒト筋前駆細胞の集団を得る。これらのヒト筋前駆細胞を、コラーゲンコーティングしたディッシュに定着させたまま残し、次いで、少なくとも１回の継代、好ましくは少なくとも２回の継代にわたり、さらに好ましくは全部で３回又は４回の継代にわたり、成長培地中で増殖させる。

好ましい細胞培養培地、すなわち成長培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含まない。本発明の好ましい実施形態に従うと、成長培地は、以下に記載するように組成される。

好ましくは、ｈＭＰＣは、好ましくは濾過されている、ｈＰＬ、好ましくはｐｈＰＬを含む成長培地を使用して増殖させられる。好ましいタイプのｐｈＰＬは、ＢＧ Ｏ（血小板）／ＡＢ（血漿）である。好ましくは、成長培地中のｐｈＰＬの最終濃度は、５～２０％、さらに好ましくは７～１２％、最も好ましくは約１０％（容積パーセント）である。

ヒト筋前駆細胞の増殖に使用される、特に有利な成長培地は、抗凝固因子、好ましくはヘパリンをさらに含む。この目的では、例えば、ヘパリン－Ｎａ（ヘパリン－ナトリウム）（２５０００ＩＵ／５ｍｌ）を使用することができる。ヘパリンを、濾過されたｐｈＰＬに好ましくは添加し、こうして混合物を形成し、その後、前記混合物を、成長培地１ｍｌ当たり１～１０ＩＵ、さらに好ましくは２～６ＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは約２ＩＵ／ｍｌの好ましい最終濃度まで、成長培地の栄養溶液に添加する。代替として、凝固を予防する他の物質（例えばＥＤＴＡ）を使用することができる。フィブリノーゲンが枯渇したｐｈＰＬを使用するケースでは、活性な凝固因子がもはや存在しないため、抗凝固剤は添加してはならない。

成長培地は、好ましくはさらに、それぞれｈＰＬ又はｐｈＰＬ、及び抗凝固因子の他に、以下の成分を含む：
－ 栄養溶液、好ましくはダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、さらに好ましくは、１：１のＤＭＥＭ／Ｆ１２栄養ミックス（ＤＭＥＭ及びハムＦ－１２の１：１ミックス）、
－ 栄養溶液に好ましくは添加されて、２～２０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度となる、ヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、
－ 栄養溶液に好ましくは添加されて、０．５～２ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１ｎｇ／ｍｌの最終濃度となる、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ）、
－ 栄養溶液に好ましくは添加されて、５～２０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１０μｇ／ｍｌの最終濃度となる、インスリン、好ましくはヒトインスリン、
－ 栄養溶液に好ましくは添加されて、０．２～０．８μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約０．４μｇ／ｍｌの最終濃度となる、デキサメタゾン。

最終濃度について示されるパーセンテージは、栄養溶液に対する容積パーセントで計算されるが、しかし、簡潔にする目的で、栄養溶液の総容積５００ｍｌ当たりの最終容積を計算に使用し（それぞれ１００ｍｌの栄養溶液当たりのｘ容積）、最終細胞培養培地／成長培地組成物（これは、ｐｈＰＬを添加したために５５０ｍｌをわずかに超える）は使用しなかった。さらに、ヘパリンの用量は、グラム数は同一ではないが、国際単位（ＩＵ）は同一である。１単位は、ＣａＣｌ_２を３７℃で添加した後、１時間の期間にわたり、クエン酸塩を含む血漿１ｍｌの凝固を防止する。

本発明はさらに、上記の方法に従った方法で生成された骨格筋由来のヒト筋前駆細胞（ｈＭＰＣ）の集団に関する。好ましくは、骨格筋由来のｈＭＰＣの集団のタンパク質発現パターンは、好ましくは以下の通りである：Ｐａｘ７（好ましくは少なくとも６０％）、デスミン（好ましくは少なくとも６０％）、ＭｙＨＣ（好ましくは約３０～５０％）、及びアルファ－アクチニン（好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％）。細胞は、好ましくは１５％に満たないＣＤ３４を発現し、ネガティブコントロールとして機能する。フローサイトメトリー分析において典型的に使用されるように、パーセンテージは、蛍光性細胞の数の、計数に依存しない測定基準である、「陽性細胞のパーセント」、すなわち、問題となっているタンパク質を発現する細胞の総数の示されたパーセンテージである。

本発明の骨格筋由来のｈＭＰＣの集団は、特に例えば緊張性尿失禁（ＳＵＩ）などの骨格筋機能障害を処置するための、薬剤として使用することができる。

さらに、本発明は、骨格筋機能障害を処置するためのｈＭＰＣの前記集団を生成／生産するための、ＦＢＳを含まない細胞培養培地又は成長培地の有利な組成物を提供する。本発明の成長培地は、好ましくは、上記の組成物を含む。

好ましい実施形態に従うと、細胞成長培地は、しかし、唯一、継代０では、抗生物質を含有する、好ましくはペニシリン及びストレプトマイシンを含有する溶液を、好ましくは約１％の最終濃度（２０℃で、ペニシリン／ストレプトマイシン：１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨの安定性のため）中に１００００単位／ｍｌのペニシリン及び１００００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）でさらに含む。

上記のような、本発明に従った細胞成長培地は、好ましくは、以下のステップを行うことによって調製される：
－ 栄養溶液、好ましくはＤＭＥＭ溶液、さらに好ましくはＤＭＥＭ／Ｆ１２の１：１栄養ミックスを用意するステップ、
－ 好ましくは栄養溶液中で約１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度に達するように、ｈＥＧＦを添加するステップ、
－ 好ましくは約１ｎｇ／ｍｌの最終濃度に達するように、ｈｂＦＧＦを添加するステップ、
－ 好ましくは約１０μｇ／ｍｌの最終濃度に達するように、インスリン、好ましくはヒトインスリンを添加するステップ、
－ ヘパリン、好ましくはヘパリン－Ｎａを、濾過されたｐｈＰＬに好ましくは添加することによって、濾過されたヒト血小板溶解物と、抗凝固因子、好ましくはヘパリン、さらに好ましくはヘパリン－Ｎａとの混合物を調製し、混合物を（ＤＭＥＭ）栄養溶液に添加する前に、混合物が、５～２０％のｐｈＰＬ最終濃度、好ましくは７～１２％のｐｈＰＬ最終濃度、さらに好ましくは約１０％のｐｈＰＬ最終濃度に好ましくは達するようにし、好ましくは、ヘパリンは、１～１０ＩＵ／ｍｌ、さらに好ましくは２～６ＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは２ＩＵ／ｍｌのヘパリン最終濃度に達し、その後、ｐｈＰＬとヘパリンとの混合物を栄養溶液に添加するステップ、
－ 好ましくは０．２～０．８μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約０．４μｇ／ｍｌの最終濃度に達するように、デキサメタゾンを添加するステップ。

本発明はさらに、担体マトリクスとしてのコラーゲン溶液中に懸濁された骨格筋由来のｈＭＰＣの集団を含む組成物を提供する。前記組成物は、骨格筋機能障害の処置における使用に適している。

本発明はさらに、骨格筋由来のｈＭＰＣの集団を含むこのような組成物を生産するための方法を提供し、ここで、ｈＭＰＣの集団は、上記の方法に従って好ましくは調製される。骨格筋機能障害の処置において使用することができる組成物の生産では、ヒト筋前駆細胞の集団は、好ましくは０．５～４ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１～２ｍｇ／ｍｌの、好ましくは低パーセンテージのコラーゲン溶液中に、好ましくは、コラーゲン溶液１ｍｌ当たり１０００万～４０００万個細胞、好ましくはコラーゲン溶液１ｍｌ当たり２０００万～３０００万個細胞の濃度で、懸濁される。有利には、コラーゲン溶液は、好ましくはブタ、ウシ、又はヒト由来のＩ型コラーゲンを好ましくは含有する。

各患者に注射するための目標細胞数は、好ましくは、全部で６０００万～１億個細胞の範囲である。注射の前に、質及び純度の分析が行われる。

好ましい最低でも８０００万個のｈＭＰＣを、少なくとも８０％の生存能力で、２０００万個細胞／ｍｌの最終濃度で送達するために、培養された細胞（８０００万個）は、４ｍｌのコラーゲン溶液中に懸濁される。最終生成物は、温度測定装置によって制御されている５℃（＋／－３℃）の箱の中の１０ｍｌのシリンジに好ましくは移される。外科手術室では、最終生成物は、好ましくは、注射の前に穏やかに混合される。

上記の組成物を患者、好ましくはヒト患者、好ましくは女性患者に、さらに好ましくは筋生検を採取した同一のヒト女性患者に注射することによって、患者において骨格筋組織を再生させることができる。言い換えると、本発明に従ったｈＭＰＣの集団は、ヒト患者における骨格筋機能障害を処置するための薬剤の製造において使用することができる。

本発明のさらなる目的は、上記のような本発明に従った組成物を使用する、骨格筋機能障害、特に外尿道括約筋の欠陥を処置する方法、及び／又はヒト患者において骨格筋組織を再生する方法である。前記処置方法は、少なくとも以下のステップを含む：
－ 上記の方法に従って好ましくは調製された、コラーゲン溶液中に懸濁した骨格筋由来のヒト筋前駆細胞の集団を含む組成物を用意するステップ、
－ 組成物を、ヒト患者、好ましくはヒト女性患者の泌尿器括約筋に、好ましくは超音波誘導下で注射するステップ、
－ 組成物を注射した後、ヒト患者の骨盤底が神経筋電磁刺激（ＮＭＥＳ）に好ましくはかけられるステップ。

したがって、上記の処置方法は、外尿道括約筋の欠陥によってとりわけ生じ得る緊張性尿失禁を処置するために使用することができる。

ヒト患者、好ましくはヒト女性患者の骨盤底への、標準化された注射を可能とするために、細胞は超音波誘導下で注射される。好ましくは、８～１２個のアリコートが骨盤底に注射され、この場合、好ましくは、総量は４ｍｌを超えない。

細胞懸濁液を注射した後のＮＭＥＳ処置は、筋肉－神経のクロストークを活性化することによって筋肉及び神経の再生をサポートし、神経筋接合部の成熟を誘発する。そのシートに大きな電磁コイルを含有する椅子（専用の磁気椅子「ＢｉｏＣｏｎ－２０００」など）によって骨盤底に適用され得る、この非侵襲性の処置は、機能的な筋組織の持続的な形成をサポートし得る。

骨盤底電磁刺激は、制御された筋再生、隣接する神経の脱分極、及び筋肉の収縮を誘発する。パルス磁場の生理学的刺激は、高度に収束した磁場、及び磁場の進展縁での非常に急な勾配の変化を可能にする、一部の空間設計特徴に依存する。これらの特徴は、頻度及び強度を容易に調節可能な、迅速にパルスする磁場を生じさせる。臨床的効果のためには、患者の衣服を脱がせることに利点はない。最大アウトプットでの誘導電界の強度は、刺激コイルの表面で１２０Ｖ／ｍであり、これは、刺激コイルからの距離で指数関数的に低下する。刺激コイルの５ｃｍ上では、磁場は２２Ｖ／ｍである。

磁場がパルスするにつれて、磁束は、パルスを含む磁場を生じさせることによって、組織を流れる小さな渦電流を誘導する。これらの電流は神経軸索の脱分極を誘発し、近位方向及び遠位方向の両方に伝わる伝搬性の神経インパルスが生じる。これが末端運動神経の軸索である場合、伝搬性のインパルスは運動神経終板に伝わり、そしてアセチルコリンの強制的放出を生じさせ、そして対応する筋線維の脱分極及びこれらの筋線維の収縮が生じる。磁束が調節されるため、筋線維の収縮速度を、通常の生理学的範囲内で調整することができる。筋線維の収縮速度を、５０Ｈｚ程度で、最大生理的速度にすることが可能である。

この体外の磁気処置の臨床的有効性は、骨盤筋の活性を変化させることであり、末端運動神経線維が繰り返し活性化されると、運動神経終板は、筋力及び持久力の観点で強化される傾向がある。

電磁刺激は、外傷後の炎症性浸潤及び瘢痕の形成の存在を著しく最小にすることによって、筋再生を改善する。このことは、外傷後の筋萎縮を回避し、筋肉の肥大を誘発し、筋肉の代謝及びターンオーバーを増大させ、筋肉マーカーの発現を３倍にし、並びに外傷後の筋肉機能の回復を大きく向上させる。

ＳＵＩの提案される処置は、ＮＭＥＳと組み合わせた自己ｈＭＰＣの移植に基づく治療戦略である。将来的な構想される最適化された方法において、ＳＵＩを処置するための細胞ベースの医薬品の成分としてのｈＭＰＣの集団を生産するための、バイオリアクターの使用は、生産コストを低下させ、このことによって、広範囲の罹患した個体が利用しやすい治療法が得られる。

さらなる開発は、動物成分を省くためのＧＭＰに準拠した方法に従って生産されたヒトコラーゲン製剤の使用による、本発明のプロセスの最適化を含む。さらに、括約筋における本発明の組成物の送達は、将来的に、精度の観点で最適化される。

本発明のさらなる実施形態は、従属請求項に定められている。

本発明の好ましい実施形態は、図面を参照して以下に記載されており、図面は、本発明の好ましい実施形態を説明する目的のためのものであり、本発明の好ましい実施形態を限定する目的のためのものではない。図面においては、以下の通りである。

培養中のｈＭＰＣの分化を略図で示す図である。 異なる成長培地における、培養されているｈＭＰＣの形態学の比較を示す図である。 異なる成長培地における、培養されているｈＭＰＣの成長能力の比較を示す図である。 異なる成長培地における、培養されているｈＭＰＣのフローサイトメトリー分析の比較を示す図である。 筋原性の特徴付けのための、２つの異なる条件で培養されたｈＭＰＣの比較を示す図であり、図５ａでは継代１のｈＭＰＣのフローサイトメトリー分析が示されている。 筋原性の特徴付けのための、２つの異なる条件で培養されたｈＭＰＣの比較を示す図であり、図５ｂでは継代２のｈＭＰＣのフローサイトメトリー分析が示されている。 筋原性の特徴付けのための、２つの異なる条件で培養されたｈＭＰＣの比較を示す図であり、図５ｃでは継代３の、ｈＭＰＣのフローサイトメトリー分析が示されている。 ＦＢＳ又は１０％ｐｈＰＬのいずれかを含有する分化培地において培養されたｈＭＰＣの線維形成アッセイを示す図である。 ＦＢＳを含有する分化培地において培養されたｈＭＰＣと１０％ｐｈＰＬを含有する分化培地において培養されたｈＭＰＣとを比較する線維形成分析を示す図である。 ＦＢＳ（図８ａ）又は１０％ｐｈＰＬ（図８ｂ）のいずれかを含有する分化培地で培養されたｈＭＰＣを皮下注射することで生成された組織工学で得られた筋肉における線維形成を示す図である。 ２つのレベルの刺激で行った器官槽分析を示す図である。 ヌードマウスにおいてｈＭＰＣを皮下注射した後の、Ｈ＆Ｅ染色による、組織工学で得られた骨格筋における線維形成の特徴付けを示す図である。 ＭＲＩによる、移植されたｈＭＰＣの追跡を示す図である。 Ｔ２^＊ＭＲＩによる移植されたｈＭＰＣの追跡についてのシグナル減衰曲線を示す図である（ＭＲＩ画像は示されていない）。 イヌモデルにおける括約筋機能の機能的評価を示す図であり、図１３Ａでは、代表的な尿道プロファイルが示されている。 イヌモデルにおける括約筋機能の機能的評価を示す図であり、図１３Ｂでは、経時的な括約筋圧を示すグラフが示されている。 ６カ月目のイヌ括約筋区域のレントゲン写真を示す図であり、Ａでは正常な動物括約筋の、Ｂでは損傷した括約筋の、ＣではＭＰＣで処置した損傷した括約筋の、画像が示されている。 細胞培養物の生検ステップから処置ステップまでのシーケンスを示す図である。

図１５において、本発明に寄与するステップの概要が示されている。まず、骨格筋生検を、骨格筋機能障害を処置される患者から採取する。次に、生検を処理し、自己ｈＭＰＣを単離し、本発明の細胞成長培地を使用して細胞培養で増殖させる。回収した後、ｈＭＰＣを、薬剤として使用するための組成物の調製に使用し、薬剤を次いで患者に注射し、その後、ＮＭＥＳを行う（図面には描かれていない）。

ｈＭＰＣの増殖及び組織工学で得られた収縮筋の効率的な形成をもたらす、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の代替物を同定する目的で、ｈＭＰＣの培養／成長培地中のＦＢＳを、ヒト血清（ＨＳ）又はプールされたヒト血小板溶解物（ｐｈＰＬ）で代替した。

腹直筋由来のヒト生検を、腹部手術の間に収集した。全てのサンプルを、確立されたプロトコルに従って、又はこの方法に変更を加えることによって、処理した（Ｅｂｅｒｌｉら、Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｙｏｆｉｂｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ４７、９８、２００９）。簡潔に述べると、各サンプルを細かく刻み、０．２％Ｉ型コラーゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）及び０．４％ディスパーゼ（Ｇｉｂｃｏ）に富むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１時間（３７℃、５％ＣＯ_２）消化した。消化は、ＦＢＳ（ＦＢＳ－ＧＭ）、ＨＳ（ＨＳ－ＧＭ）、又はｐｈＰＬ（ｐｈＰＬ－ＧＭ）のいずれかを添加した成長培地で停止させた。

遠心分離した後、サンプルをそれぞれの成長培地中で再懸濁し、コラーゲンコーティングした６ウェルディッシュに播種した。速く接着する線維芽細胞の数を減らすために、ｈＭＰＣを含有する懸濁液を、２４時間後に、コラーゲンコーティングした新たな６ウェルディッシュに再び播種した。ｈＭＰＣを、３７℃で、５％ＣＯ_２中で、ＦＢＳ、ＨＳ、又はｐｈＰＬのいずれかを添加した成長培地で増殖させた。実験目的のために、５％、１０％、及び２０％のｐｈＰＬ濃度を試験した。

以下の成長培地組成を使用した：１８％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ＨＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、又は５／１０／２０％ｐｈＰＬのいずれかを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｓｃｈａｌｌｍｏｓｅｒら、２００７におけるプロトコルに従う、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｓｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓｍｅｄｉｚｉｎ、Ｓａｌｚｂｕｒｇｅｒ Ｌａｎｄｅｓｋｌｉｎｉｋｅｎ ｕｎｄ Ｐａｒａｃｅｌｓｕｓ Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｐｒｉｖａｔｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ、Ｓａｌｚｂｕｒｇ、Ａｕｓｔｒｉａから得られる）。さらなる添加物は、全ての成長培地バリエーションで類似していた：１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（継代０でのみ）、１０μｇ／ｍｌのヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）（Ｓｉｇｍａ）、１μｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ）（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌのヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ）、及び０．４μｇ／ｍｌのデキサメタゾン（０．５μＭ、Ｓｉｇｍａ）。

全ての実験は、継代１から３までの各サンプルにつき、３回ずつ行った。

増殖期の後、細胞をヌードマウスに皮下移植し、４週間後、形成された組織を回収した。ｈＭＰＣを、同一性、純度、及び機能についてのいくつかの基準を適用して、異なる時点で特徴付けした。インビトロ分析を、成長分析、フローサイトメトリー分析、免疫蛍光染色、及び線維形成アッセイによって行った。インビボでの試験は、免疫組織化学、ウェスタンブロット、及びミオグラフィーによって行った。インビトロでの試験では、実験は、患者の少なくとも４つの生検で、３回ずつ行った。

ＨＳは軟骨細胞、間葉系幹細胞、角膜上皮細胞、及び歯髄幹細胞などの他の細胞型とうまく利用できるため、これを、ｈＭＰＣを培養するためのＦＢＳの代替物として選択した。しかし、ＨＳを添加した成長培地はｈＭＰＣの増殖を維持することができず、細胞は、２週間後でも、また４人の異なる患者に由来する生検の細胞培養物においても、培養ディッシュに接着しなかった（データは示していない）。推測とは異なり、２０％以上の、より高いＨＳ濃度でも、有望な結果は得られなかった。

成長している細胞の形態学的構造は、初期の継代及び後期の継代（１及び３）で、ＦＢＳを添加した成長培地（ＦＢＳ－ＧＭ）で成長した細胞及びｐｈＰＬを添加した成長培地（ｐｈＰＬ－ＧＭ）で成長した細胞の間で類似していたが、ゼノフリー培地ではあまりコンフルエントではなかった（図２）。異なる濃度のｐｈＰＬの間では、全ての継代において、違いは見られなかった。

生検後の初代培養の後の、異なる成長培地で培養されたｈＭＰＣの成長能力の分析のために、ｈＭＰＣを、各継代で５０００個細胞／ｃｍ^２で播種し、９０～９５％のコンフルエンシーまで培養し、計数した。ＦＢＳ－ＧＭ又はｐｈＰＬ－ＧＭのいずれかにおけるｈＭＰＣの増殖は効率的であり、同一の成長能力が、最初の３回の継代の間に観察された（図３）。しかし、１０％ｐｈＰＬ及び２０％ｐｈＰＬを含有する成長培地での条件が、ｈＭＰＣがインビトロで増殖するための最良の条件をもたらすと考えられ、継代３の最後に、より多くの細胞をもたらす。１０％ｐｈＰＬ－ＧＭで培養された細胞は、５％ｐｈＰＬ－ＧＭ及び２０％ｐｈＰＬ－ＧＭを添加した成長培地で培養された細胞よりも、小さいディッシュにおいてより良く成長した。さらに、継代３の後、２０％ｐｈＰＬ－ＧＭにおいて培養されたｈＭＰＣは成長しており、増殖の停止が見られた。１０％ｐｈＰＬ－ＧＭは、ＦＢＳを使用した標準的な成長培地よりもはるかにｈＭＰＣの増殖を促進すると思われた。

明らかに、培地の組成及び調節は細胞特異的であり、細胞増殖の成功及び筋分化に重要であり、Ｋｒａｍｅｒら（２００５）がＦＢＳをｐｈＰＬで最適に代替することができなかった理由を説明する。ｈＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びインスリンなどの増殖因子の添加がないこと、並びに、上述したように最適濃度ではない２０％のｐｈＰＬ濃度を使用したことが理由であると思われる。

ｈＭＰＣを、８０～９０％のコンフルエンスとなるまで培養し、その後、フローサイトメトリー分析を行った。

ｈＭＰＣの筋原性プロファイルに対するｐｈＰＬの効果を、免疫蛍光及びフローサイトメトリー分析によって研究した。ｐｈＰＬは、ｈＭＰＣの筋原性の細胞マーカー及び表現型並びにインビボで良く発現する分化能力を維持する。

異なる条件（ＦＢＳ又はｐｈＰＬ）で培養されたｈＭＰＣのフローサイトメトリー分析は、継代３（ｎ＝４の生検）で、筋特異的なマーカーの発現を示した。１０％ｐｈＰＬの培養条件は、標準的な条件（ＦＢＳ－ＧＭ）よりもはるかにｈＭＰＣ増殖を促進すると考えられる。しかし、ゼノフリー条件間の差も、ｐｈＰＬ－ＧＭとＦＢＳ－ＧＭとの間の差も、有意ではなかった。成長している細胞集団において、筋分化マーカーであるアルファ－アクチニン、デスミン、ＭｙＨＣ（ミオシン重鎖）、ＭｙｏＤ、及びＰａｘ７は、それぞれ、アルファ－アクチニンでは約８０％、デスミンでは約７８％、ＭｙＨＣでは約４０％、ＭｙｏＤでは約３５％、及びＰａｘ７では約６５％で発現した（図４）。１０％ｐｈＰＬ条件が、さらなる研究及びＦＢＳ－ＧＭ条件との比較に選択された。

骨格筋マーカーの発現は、ＭｙＨＣを除いて、全ての継代にわたりＦＢＳ条件及びｐｈＰＬ条件の間で同等であった（図５ａ～ｃ）。ＭｙＨＣは、継代１においてｐｈＰＬ代替物が２倍高く、継代２においては２．５倍高かったが、継代３においては差はなかった。両条件は理想的な設定に相当し、ｈＭＰＣの増殖に好都合であった（線維芽細胞よりも）。ＣＤ３４の検出は低いまま留まり、全ての継代にわたり安定であった。注目すべきは、ＦＢＳ－ＧＭ及びｐｈＰＬ－ＧＭの両方において、継代１から３まででＭＰＣによって発現される筋マーカーのパーセンテージがわずかに低下したことである。このことは、両環境において、細胞の融合又は筋管の形成を防止しなかった（図６）。骨格細胞の分化が引き起こされると、ｈＭＰＣの線維形成はギムザ染色によって観察することができた。しかし、線維の計数は、筋様構造の構築における、ＦＢＳ－ＧＭ又はｐｈＰＬ－ＧＭにおいて成長したｈＭＰＣの異なる能力を説明した。ＦＢＳ－ＧＭにおいて２週間培養されたｈＭＰＣが、ｐｈＰＬで増殖したｈＭＰＣ（７．５６線維／スライド（±１．９））よりも容易に融合し、線維を形成した（１１．４線維／スライド（±２．４））ことが分かる（図７）。両細胞培養条件における骨格筋マーカーの発現を、免疫細胞蛍光法によって確認した（示されていない）。ＦＢＳ－ＧＭ又は１０％ｐｈＰＬ－ＧＭでインビトロで培養されたｈＭＰＣの継代３の培養されたｈＭＰＣの染色は、特異的な骨格筋マーカーであるアルファ－アクチニン、デスミン、ＭｙＨＣ、及びＭｙｏＤの発現を示した。線維形成アッセイに使用した成長培地、すなわち分化培地は、増殖因子（ＥＧＦ、ＦＧＦなど）を含有していなかった。

インビトロでの実験の後、ＦＢＳ－ＧＭ及び１０％ｐｈＰＬ－ＧＭにおいて培養されたｈＭＰＣを、ヌードマウスの背中に皮下注射した。４週間後、動物を屠殺し、工学で得られた筋組織を抽出した。工学で得られた組織は、全条件の移植区域において見ることができた。さらに、Ｈ＆Ｅ染色は、工学で得られた筋組織における筋様構造を実証した（図８ａ、ｂ）。４０倍の倍率で、筋管構造での筋形成が詳細になり、強調されている。注射の４週間後にサンプルに対して行われたウェスタンブロットによって、両培養条件において、筋特異的マーカーであるアルファ－アクチニン、デスミン、ＭｙＨＣ、及びＭｙｏＤの発現が確認された（示されていない）。免疫組織化学分析によって、インビボでのサンプルの筋肉の特徴付けが確認された。移植されたｈＭＰＣを、注射の前に、ＰＫＨ６７で標識した。両条件の工学で得られた組織は、この標識で検出された。筋特異的マーカーであるアルファ－アクチニン、デスミン、ＭｙＨＣ、及びＰａｘ７は、ＦＢＳ－ＧＭにおいて培養されたｈＭＰＣと１０％ｐｈＰＬ－ＧＭにおいて培養されたｈＭＰＣとの両方に由来する、工学で得られた組織において発現した（示されていない）。最後に、これらの組織工学で得られた回収物は、４０Ｖ／４０Ｈｚ及び８０Ｖ／８０Ｈｚで刺激すると収縮した（図９）。ｐｈＰＬ－ＧＭ条件は標準的条件と比較して良好な収縮性をもたらすと考えられたが、観察された違いは、統計的に有意ではなかった。

要約すると、ｈＭＰＣは、ＦＢＳベースの成長培地、及び全ての試験濃度のｐｈＰＬ（５～２０％）を添加した成長培地において増殖することができた。ｐｈＰＬは、融合及び組織工学で得られた収縮筋の形成が可能なｈＭＰＣのインビボでの増殖を、ＦＢＳに類似の様式で維持することが示されている。したがって、ｐｈＰＬは、細胞培養におけるＦＢＳのための基質として使用することができ、ｈＭＰＣの増殖する特徴及び筋原細胞表面マーカーの発現を保存する。ＦＢＳで増殖したｈＭＰＣとｐｈＰＬで増殖したｈＭＰＣとの間のわずかな差が同定されているが、インビボで筋管を形成するための細胞の分化能力は一定のままである。この所見は、ＳＵＩに罹患している患者を処置するための、筋生検から単離されたｈＭＰＣでの細胞療法の臨床適用を促進し得る。

生検：
患者が除外基準のいずれも満たさず、また全ての組み入れ基準を満たした限りにおいて、生検は、全身又は脊椎の麻酔下で採取した。生検は、左脚又は右脚のヒラメ筋（括約筋に組成が非常に類似している骨格筋）から採取した。この目的のために、下肢の背側の膝窩の数センチメートル下での切開（およそ２～４ｃｍ）を行った。ヒラメ筋を次いで同定し、筋肉の破片（約１ｃｍ^３）を外科的に取り出した。無菌の筋肉生検を、回収した直後に、輸送培地（１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＰＢＳ）を含有する閉じた５０ｍｌの試験管に移し、２４時間以内、好ましくは６時間以内に、さらに好ましくは生検の直後に、ＧＭＰ実験室において処理した。筋膜、皮下組織、及び皮膚を通常の方式で縫合した。創傷の管理及び皮膚縫合糸の除去を、生検の１週間後に行った。

ｈＭＰＣ集団及び細胞培養物の調製：
実験室において、脂肪組織及び腱組織を層流下で外科的に取り出し、その後、ＰＢＳ中ですすぎ、殺菌剤及びＰＢＳを含有する１：１溶液中で殺菌した。残っている組織を、はさみ及び鉗子を使用して、約１×１ｍｍの小さい組織片に切断し、次いで、０．２％コラーゲナーゼ及び０．４％ディスパーゼからなる５ｍｌの溶液中に置き、そして、少なくとも１時間、３７℃で、酵素消化のためにインキュベートした。インキュベーションの後、組織片を２５ｍｌのピペットで吸引し、５０ｍｌの試験管内に置き、この試験管内で、組織片を以下に列挙する成長培地で洗浄して、酵素反応をブロックした。その後、サンプルを５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離し、その後、上清を除去した。以下に列挙するレシピに従って組成された１５ｍｌの成長培地を細胞ペレットに添加し、混合物を上下に少なくとも１０回ピペッティングすることによってホモジナイズした。次いで、孔サイズが１００μｍのセルストレーナーを試験管上に置き、サンプルを濾過した。

その間に、６ウェルディッシュをコラーゲン溶液でプレコーティングした。１時間後に、コラーゲン溶液を吸引し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄して、酸性環境を除去した。

コラーゲンコーティングしたウェルからＰＢＳを除去した後、成長培地中に懸濁した細胞を、コラーゲンコーティングした６ウェルディッシュの最初の２つのウェルに分けた。２つの他のウェルにはＰＢＳを満たし、このＰＢＳは、その後のステップで細胞を添加する前に除去した。

単線維の存在を位相差顕微鏡によって確認し、全てのディッシュを、一晩、３７℃で、及び５％ＣＯ_２を含有する加湿雰囲気下でインキュベートした。

ｈＭＰＣの純度を増大させるために、細胞を線維芽細胞低減ステップにかけた：線維芽細胞はプレートに最初に接着する傾向があるため、接着していないｈＭＰＣを含有する上清を、２０～２８時間後に、ＰＢＳを除去した後の同一プレート上の次のＩ型コラーゲンコーティングしたウェルに移した。成長培地を４日目及び７日目に交換した。ｈＭＰＣがまだ接着性ではなかった場合には、培地は４日目には交換しなかった。その代わり、いくらかの新鮮な成長培地を最上部に慎重に添加した。培地の交換では、古い培地のおよそ８０％を慎重に除去し、新鮮な培地をゆっくりと添加した。初代培養された細胞は、６ウェルプレートに播種した後８～１０日間以内に８０％のコンフルエンシーに達した。最終濃度に関して３０００～７０００個細胞／ｃｍ^２、最適には約５０００個細胞／ｃｍ^２となるように分けた。６ウェルプレートから大きな培養プレートに移した後、抗生物質を全く添加していない成長培地を使用した。

細胞の形態学、細胞数、及び線維形成を、全ての継代で評価した。

以下のプロトコルを、ｈＭＰＣの増殖のためのｈＭＰＣ成長培地の生産に使用した。

以下の材料を使用した：
－ ４℃で保管した、ＤＭＥＭ／Ｆ１２栄養ミックス（１：１、Ｇｉｂｃｏ）の５００ｍｌのボトル、
－ ５００μｌのｈｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ、－８０℃で５００μｌ中に５００ｎｇ）（最終濃度１ｎｇ／ｍｌ）、
－ １ｍｌのｈＥＧＦ（－８０℃で５μｇ／ｍｌ）（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、
－ ５００μｌのヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ、－２０℃で５００μｌ中に５ｍｇ）（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）、
－ １．２ｍｌのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ、－２０℃で１．２ｍｌ中に２００μｇ）（最終濃度０．４μｇ／ｍｌ）、
－ ５０ｍｌの濾過されたヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）（ＢＧ ０（血小板）／ＡＢ（血漿））（最終濃度１０％）、
－ ＤＭＥＭに添加される前に、濾過されたｈＰＬに添加される、６００μｌのヘパリン－Ｎａ（Ｂｒａｕｎ、３５１１０１４）（２５０００ＩＵ／５ｍｌ）（成長培地１ｍｌ当たり６ＩＵのヘパリン－Ｎａ最終濃度）、
－ 継代０に使用する培地のためだけのペニシリン／ストレプトマイシン（－２０℃で６ｍｌの１００００単位／ｍｌのペニシリン及び１００００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）（最終濃度１％）。

これによって、ｈＭＰＣの増殖及び分化のためにコラーゲンコーティングしたディッシュ及び規定培地のみを使用する培養技術が確立された。細胞の特徴付けによって、ｈＭＰＣの表現型がこれらの条件下で維持され得ること、並びに細胞がインビトロ及びインビボで筋線維を形成する能力を有することが実証された。組織工学利用のための十分な数の細胞を、この方法を使用して３～４週間成長させることができる。

細胞組成物の調製：
注射の前に、細胞のサンプルをフローサイトメトリーによって分析し、生存能力試験を行って、質及び純度を調べる。最少で８０００万個のｍＭＰＣを少なくとも８０％の生存能力で、すなわち、約６４００万個の生存細胞を、最終濃度２０００万個細胞／ｍｌで送達するために、培養された細胞（約８０００万個）を、４ｍｌの低パーセンテージコラーゲン溶液、すなわち３～４ｍｇ／ｍｌ中に懸濁して、最終生成物中で約２ｍｇ／ｍｌのコラーゲン最終濃度とする。担体マトリクスには、低濃度のコラーゲンのみが必要である。これを、より高いコラーゲン濃度を使用する以前の研究と比較すると、以前の研究は、良好な短期の結果をもたらすにすぎない。

コラーゲン溶液の調製に関しては、コラーゲンを０．０１ＭのＨＣｌ中で混合した。次いで、ＭＥＭを、ｐＨ指示薬として、溶液が黄色に変化するまで添加した。次いで、ＮａＨＣＯ_３を、溶液がピンク色に変化するまで、すなわちｐＨ６～８の生理学的ｐＨ値に達するまで、滴下で添加した。コラーゲン溶液を次いで、最終細胞ペレット（継代２の後に回収された）に移し、上下にピペッティングすることによってホモジナイズし、５０ｍｌの試験管に移し、そして冷却装置内で冷却した。

コラーゲン溶液中の完成したｈＭＰＣ組成物の最適最長保存期間は、限定されている。最終組成物の安定性は、２～８℃で最大２４時間である。したがって、完成した組成物は、少なくとも８０％の細胞生存能力を維持するためには、可能な限りすぐに、好ましくは調製後４時間以内、遅くとも２４時間以内に投与されるべきである。

１０ｍｌのシリンジ中の最終生成物を、温度測定装置によって制御された５℃（＋／－３℃）の箱に入れて、研究場所に移す。外科手術室において、最終生成物は、注射の前に、穏やかに混合される。

ｈＭＰＣ組成物の注射：
ｈＭＰＣでのＳＵＩの処置は、ＳＵＩ歴がある、低リスクの成人女性患者（具体的な除外基準に従う）の損傷した括約筋に限定されている。

女性患者の骨盤底への標準化された注射を可能にするために、細胞は超音波誘導下で注射される。

超音波プローブは経膣的に置かれ、試験管及び一方向シリンジを含むガイダンスツールが尿道内に置かれる。ｈＭＰＣ－コラーゲン組成物の８～１２個のアリコートを、組成物の総量が４ｍｌを超えないようにして、骨盤底に注射する。

注射するための細胞サンプルを、線維の形成及び筋原性のマーカーの発現におけるそれらの能力をチェックするための線維形成アッセイ及びフローサイトメトリーアッセイのために培養することができる。

比較の目的で、異なる注射選択肢（経尿道及び経膣）、並びにシール法で固定されたヒト死体の泌尿器括約筋への流体ポリマー化合物（塗布後に固まる液体ポリマー）の経膣超音波（ＢＫ ８８４８、ＢＫ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｄｅｎｍａｒｋ）誘導注射を評価した。括約筋を次いで、ＭＲＩ及びホールマウント切片の組織学によって分析した。両方法は、横紋筋性括約筋をヒットすることにおいて、良好且つ同等の正確性を示した。

しかし、経尿道アプローチが、取り扱い性及びより短い学習曲線に主に起因する簡易性の意味で優れていると思われる。

電磁刺激：
骨盤底運動のための理学療法を、電磁椅子刺激（ＢｉｏＣｏｎ－２０００）によって行った。最大アウトプットでの誘導された電界の強さは、刺激コイルの表面で１２０Ｖ／ｍであった。刺激コイルの５ｃｍ上で、電界の測定値は２２Ｖ／ｍであった。

動物モデルにおける筋肉の分化及び機能の分析：
骨格筋再生に対するＭＰＣの効果を研究するために、いくつかの動物モデルを使用した：マウス（異所性の筋形成のための皮下細胞注射（図１０）、並びに四頭筋及び後脚脛骨筋の圧挫損傷モデル（示されていない））；ラット（膀胱出口部閉塞モデル）；イヌ（外括約筋の顕微外科切開による尿道括約筋不全のモデル）（図１３及び１４）。

ヌードマウスにおいてｈＭＰＣを注射した後の、組織工学で得られた骨格筋における線維形成を特徴付けするために、培養された一次ｈＭＰＣをヌードマウスに皮下注射した。注射の３日後、７日後、１４日後、及び２８日後、形成された組織を回収し、Ｈ＆Ｅ染色によって分析した。図１０に示すように、注射されたｈＭＰＣによる線維形成能力の増大が４週間以内に観察され、組織学的に成熟した筋組織が１４日目に観察された。免疫組織蛍光染色によって、骨格筋マーカーであるアルファ－アクチニン、ＭｙＨＣ、及びデスミンの発現を確認した（示されていない）。

ＭＲＩによる細胞分化の非侵襲的な可視化の例として、ｈＭＰＣをＭＲＩによって追跡し、成長中の筋組織をＴ２^＊ＭＲＩによって追跡した（図１１及び１２）。図１１は、ＭＲＩによる、移植されたＭＰＣの追跡を示す。標識されていないＭＰＣ（コントロール）及び４００μｇ／ｍｌの超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）で標識されたＭＰＣを、ヌードマウスの背中に皮下注射した。マウスを、ＭＲＩによって、注射の４日後、１週間後、２週間後、及び４週間後にスキャンした。目的の区域のＴ２強調ＭＲＩ画像が示されている。注射された細胞には、矢印で印がつけられている。図１２において、全ての測定時点についてのＴ２^＊シグナル減衰曲線が示されている。筋前駆細胞の、骨格筋線維への成熟が観察され、これは、弛緩パラメータ及び拡散パラメータの減少（ＭＲＩによって測定される）と相関している。重要なことに、分化の間、弛緩パラメータ及び拡散パラメータは減少して、成熟骨格筋組織の値に近づき、このことは、ＭＲＩによる弛緩及び拡散の測定値が筋肉の分化及び機能のインビボモニタリングのための適切なバイオマーカーを提供することを示唆する。

図１３は、イヌモデルにおける括約筋機能の機能的評価を示す。イヌの筋前駆細胞は、成功裏に且つ再現可能に単離され、成長し、そして増殖した。Ａにおいて、代表的な尿道プロファイルは、細胞処置の後の括約筋区域における括約筋圧の増大を示す。Ｎは正常なコントロールを示し、Ｄ６は６カ月目の「損傷のみ」のコントロールを示し、そして、Ｍ６は、６カ月目の、ＭＰＣで処置された動物を示す。Ｂにおいて、グラフは、経時的な括約筋圧を示す。細胞を注射された動物は、その括約筋機能の著しい機能回復を示し、括約筋圧は正常のおよそ８０％であったが、コントロール動物（「損傷のみ」）における圧力は低下し、２０％のままであった（ｐ＜０．０２５）。組織学的に、移植された細胞は生存し、括約筋の注射領域内で組織を形成し、新たな神経支配された筋線維を形成した（Ｅｂｅｒｌｉ，Ｄ．ら、Ｍｕｓｃｌｅ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ Ｄａｍａｇｅｄ Ｓｐｈｉｎｃｔｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２０１２も参照されたい）。

図１４において、６カ月目のイヌ括約筋区域のレントゲン写真が示されている。ＭＰＣ注射で処置された動物は、正常な解剖学的括約筋構造（Ｃにおける矢印）及び膀胱頚領域を取り戻すことができたが、その一方で、処置されていない動物は括約筋区域の拡大を示し（Ｂにおける矢印）、このことは、解剖学的な完全性が喪失していることを示す。Ａは、正常な、損傷していない括約筋の代表を示し、Ｂは損傷した括約筋を示し、Ｃは、ＭＰＣで処置された損傷した括約筋を示す。

イヌにおける結果は、自己ＭＰＣが、これを使用しなければ不可逆的に損傷した括約筋の機能を、回復させ得ることを示した。注射された細胞は生存することができ、損傷した括約筋機能内で成熟組織を形成することができた。この大きな動物研究によって、括約筋不全の患者における泌尿器括約筋の機能的回復のために自己筋前駆細胞を使用することの実現可能性が実証された。

ヒトにおける筋細胞療法におけるＭＰＣの成功裏の適用のために、分化プロセスの、非侵襲性のインビボモニタリングツールが非常に重要である。ＭＲＩによる弛緩及び拡散の測定値は、筋前駆体の分化のインビボモニタリングのための適切なバイオマーカーを提供する。

Claims (20)

1. 少なくとも以下のステップ：
   － ヒト患者の骨格筋生検によってヒト組織サンプルを得るステップ、
   － ヒト組織サンプルから脂肪組織及び／又は腱組織及び／又は結合組織を外科的に取り除くステップ、
   － ヒト組織サンプルを細かく刻み、酵素消化するステップ、
   － 線維芽細胞の数を減らし、これによってヒト筋前駆細胞の集団を得るステップ、
   － ヒト筋前駆細胞を、コラーゲンコーティングしたディッシュに定着させるステップ、
   － 少なくとも１回の継代のために、ヒト筋前駆細胞を細胞成長培地中で増殖させるステップ
   を含む、骨格筋由来のヒト筋前駆細胞の集団を生成する方法。
2. 骨格筋生検が、ヒラメ筋、腹直筋、大腿四頭筋、外側広筋からなる群から選択される組織から採取され、骨格筋生検がヒラメ筋組織から好ましくは採取される、請求項１に記載の方法。
3. ヒト筋前駆細胞が、少なくとも２回の継代、好ましくは３回又は４回の継代にわたり培養される、請求項１に記載の方法。
4. ヒト筋前駆細胞が、ウシ胎児血清を含まない細胞成長培地を使用して増殖される、請求項１に記載の方法。
5. ヒト筋前駆細胞が、ヒト血小板溶解物、好ましくはプールされた、濾過されたヒト血小板溶解物を含む細胞成長培地を使用して増殖され、ヒト血小板溶解物が、細胞成長培地中で５～２０％、さらに好ましくは７～１２％、最も好ましくは約１０％の最終濃度で好ましくは存在する、請求項４に記載の方法。
6. ヒト筋前駆細胞を増殖させるために使用される細胞成長培地が、抗凝固因子、好ましくはヘパリン、さらに好ましくはヘパリン－Ｎａを、好ましくは１～１０ＩＵ／ｍｌ、さらに好ましくは２～６ＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは約２ＩＵ／ｍｌの最終濃度でさらに含み、細胞成長培地が、以下の成分：
   － 栄養溶液、好ましくはＤＭＥＭ、さらに好ましくは１：１のＤＭＥＭ／Ｆ１２栄養ミックス；
   － 好ましくは５～２０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度の、ｈＥＧＦ、
   － 好ましくは０．５～２ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１ｎｇ／ｍｌの最終濃度の、ｈｂＦＧＦ、
   － 好ましくは５～２０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１０μｇ／ｍｌの最終濃度の、インスリン、好ましくはヒトインスリン、
   － 好ましくは０．２～０．８μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約０．４μｇ／ｍｌの最終濃度の、デキサメタゾン
   を好ましくはさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の方法で生成された、Ｐａｘ７、デスミン、及びアルファ－アクチニンを好ましくは発現し、ＭｙＨＣも好ましくは発現する、骨格筋由来のヒト筋前駆細胞の集団。
8. 薬剤として使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法で生成された、骨格筋由来のヒト筋前駆細胞の集団。
9. 骨格筋機能障害の処置において使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法で好ましくは生成された、骨格筋由来のヒト筋前駆細胞の集団。
10. 緊張性尿失禁の処置において使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法で好ましくは生成された、骨格筋由来のヒト筋前駆細胞の集団。
11. ウシ胎児血清を含まない、骨格筋機能障害を処置するためのヒト筋前駆細胞の集団を生産するための細胞成長培地。
12. ヒト血小板溶解物、好ましくはプールされたヒト血小板溶解物を含有する、請求項１１に記載の細胞成長培地。
13. 以下の組成物：
    － 栄養溶液、好ましくはＤＭＥＭ、さらに好ましくは１：１のＤＭＥＭ／Ｆ１２栄養ミックス、
    － 好ましくは５～２０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度の、ｈＥＧＦ、
    － 好ましくは０．５～２ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１ｎｇ／ｍｌの最終濃度の、ｈｂＦＧＦ、
    － 好ましくは５～２０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１０μｇ／ｍｌの最終濃度の、インスリン、好ましくはヒトインスリン、
    － 好ましくは０．２～０．８μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約０．４μｇ／ｍｌの最終濃度の、デキサメタゾン、
    － 好ましくは１～１０ＩＵ／ｍｌ、さらに好ましくは２～６ＩＵ／ｍｌの最終濃度の、ヘパリン、好ましくはヘパリン－Ｎａ、
    － 好ましくは５～２０％、さらに好ましくは７～１２％、最も好ましくは約１０％の最終濃度の、濾過されたヒト血小板溶解物
    を含む、請求項１２に記載の細胞成長培地。
14. 少なくとも１回の継代で使用するために、好ましくは継代０で使用するために、抗生物質を含有する溶液、好ましくはペニシリン及びストレプトマイシンを含有する溶液を、好ましくは約１％の最終濃度でさらに含む、請求項１１に記載の細胞成長培地。
15. 以下のステップ：
    － 栄養溶液、好ましくはＤＭＥＭ溶液、さらに好ましくはＤＭＥＭ／Ｆ１２の１：１栄養ミックスを用意するステップ、
    － 好ましくは５～２０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで、ｈＥＧＦを添加するステップ、
    － 好ましくは０．５～２ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで、ｈｂＦＧＦを添加するステップ、
    － 好ましくは５～２０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１０μｇ／ｍｌの最終濃度まで、インスリン、好ましくはヒトインスリンを添加するステップ、
    － ヘパリン、さらに好ましくはヘパリン－Ｎａを、濾過されたｈＰＬに好ましくは添加することによって、ヒト血小板溶解物と抗凝固因子との混合物を、混合物を栄養溶液に添加する前に、好ましくは５～２０％のｈＰＬ最終濃度、さらに好ましくは約１０％のｈＰＬ最終濃度となるように、及び好ましくは１～１０ＩＵ／ｍｌ、さらに好ましくは２～６ＩＵ／ｍｌのヘパリン最終濃度となるように、調製し、そして、ヒト血小板溶解物とヘパリンとの混合物を栄養溶液に添加するステップ、
    － 好ましくは０．２～０．８μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約０．４μｇ／ｍｌの最終濃度まで、デキサメタゾンを添加するステップ
    を含む、請求項１３に記載の細胞成長培地を生産するための方法。
16. 請求項１～６のいずれか一項に従って好ましくは調製された、骨格筋由来のヒト筋前駆細胞の集団を含む組成物を生産するための方法であって、骨格筋起源由来のヒト筋前駆細胞の集団が、コラーゲン溶液中に、少なくとも８０％の生存能力で好ましくは１０００万～３０００万個細胞／ｍｌの濃度で懸濁され、コラーゲンが、好ましくはＩ型コラーゲンであり、コラーゲンの濃度が、好ましくは１～４ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約２ｍｇ／ｍｌである、方法。
17. 請求項１６に記載の方法によって生産された、コラーゲン溶液中に懸濁した骨格筋由来のヒト筋前駆細胞の集団を含む、組成物。
18. 少なくとも８０％の生存能力で、好ましくは１０００万～３０００万個細胞／ｍｌの濃度の、コラーゲン溶液中に懸濁した骨格筋由来のヒト筋前駆細胞の集団を含む組成物であって、コラーゲン溶液が、好ましくはブタ、ウシ、又はヒト由来のＩ型コラーゲンを好ましくは含有し、組成物中のコラーゲン濃度が、好ましくは１～４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約２ｍｇ／ｍｌである、組成物。
19. 薬剤として使用するための、請求項１８に記載の組成物。
20. 骨格筋機能障害の処置、特に、外尿道括約筋の欠陥の処置において薬剤として使用するための、請求項１８に記載の組成物。
    
    

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