KR20210008009A

KR20210008009A - hMPC 집단의 제노-프리 생성 방법

Info

Publication number: KR20210008009A
Application number: KR1020207034490A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 에베르리; 디나 모르; 소우잔 살레미; 파드 아짜비 조우라크
Original assignee: 유니베르시태트 취리히
Priority date: 2018-05-08
Filing date: 2019-05-06
Publication date: 2021-01-20
Also published as: EP3790957A1; MX2020011884A; WO2019215090A1; US20210244770A1; AU2019266916A1; JP2021522805A; JP2024028920A; BR112020022667A2; IL287353A; CA3098775A1

Abstract

본 발명은 골격근 유래의 인간 근육 전구체 세포 집단의 생성 방법에 관한 것이다. 상기 목적을 위해, 전문적인 FBS 무함유(FBS-free) 세포 성장 배지가 사용된다. 본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한, 특히 골격근 기능장애의 치료용 의약으로서 사용하기 위한, 이러한 hMPC 집단을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

hMPC 집단의 제노-프리 생성 방법

본 발명은 인간 근육 전구체 세포 (human muscle precursor cell, hMPC) 집단의 제노-프리(xeno-free) 생성 방법, 이들 hMPC 를 포함하는 조성물, 및 골격근 기능장애, 특히 스트레스성 요실금(stress urinary incontinence) 치료용 조성물의 생산에 있어서의 이들 hMPC 의 용도에 관한 것이다.

요실금은, 불수의적인 요누출로, 45세 이상 여성 인구의 약 절반과 70세 이상 남성의 17%가 영향을 받는 주요 의료 현안이다. 요실금과 배뇨는 요도 폐쇄 및 배뇨근 활동 간의 균형과 관련된다. 요실금은 요도 괄약근, 방광 목 위치, 요도 평활근, 신경 완전성, 혈관총(vascular plexus) 및 주변 조직 지지(tissue support)의 복잡한 상호 작용에 의해 이루어진다.

스트레스성 및 절박성 요실금과 같은 다양한 종류의 요실금이 있다. 스트레스성 요실금 (Stress urinary incontinence, SUI)은 기침, 웃음, 재채기, 운동, 또는 그밖에 복강내 압력을 증가시켜 방광에 대한 압력을 증가시키는 움직임들과 관련된, 소량의 뇨 손실이다. 골격근으로 만들어져 체성 신경계의 자발적인 통제 하에 있는 외부 횡문요도괄약근(striated urethral sphincter) 이 보통 SUI를 예방하는 역할을 한다. 외부 요도 괄약근의 손상은 주로 출산, 외과적 치료 동안 또는 노화의 영향으로 발생한다. SUI는 전세계적으로 2억 명이 넘는 사람들에게 발생하는 질병으로 남성보다 여성에서 2배 더 흔하며, 제한된 일상 활동, 불쾌한 감각, 냄새, 및 젖은 기저귀로 인한 감염으로 인해 환자의 삶의 질이 저하된다. 발생하는 의료비용은 상당하다.

SUI의 현재 치료 옵션에는 주로 비수술적 치료 (방광 훈련, 식이 요법), 약물 치료 및 외과적 치료가 포함된다. 이러한 치료법은 단기적인 완화만을 제공하며, 이들의 전반적인 성공은 보통 합병증 (요로 감염률 증가로 이어지는, 수술의 침습성, 주변 조직 손상) 또는 부작용 (약물, 분해 불가능한 생체물질에 의한 조직 손상 등)에 의해 제한된다. 요실금을 치료하기 위한 세포치료 접근법의 발전은 환자 자신의 세포를 사용하여 근본적인 병인을 교정하는데 있어 유망한 결과를 보여준다. 최근 세포-기반 치료법의 발전으로 SUI 환자의 손상된 괄약근 기능을 복원할 수 있는 다양한 해결책들이 제공되었다.

US 5,130,141은 생쥐의 근육 약화 치료를 위한 근아세포(myoblast)의 용도를 개시한다. 근육 재생에 대한 보다 진보된 접근 방식은, 외인성 성장인자의 유무에 관계없이, 근아세포를 재구성된 기저막의 3차원 겔에 통합하는 것이다 (Barbero et al., Growth factor supplemented matrigel improves ectopic skeletal muscle formation - a cell therapy approach, J Cell Physiol. 2001 Feb; 186(2): 183-92) 이 프로토콜에서는, 쥐의 육종 세포 (Matrigel®)에서 분비되는, 상업적으로 이용가능한 젤라틴 단백질 혼합물이 사용되었는데, 여기에는 근원세포의 증식과 분화를 촉진하는 다양한 성장인자가 고농도로 함유되어 있다.

US 2014/0227233 A1은 상업적으로 이용가능한 재료 (생체적합성 글루, (인간 피브리노겐 및 인간 트롬빈의) 피브린 글루, 또는 생체적합성 겔을 포함함)와 골수 또는 지방 조직 유래의 중간엽 줄기세포의 조합을 포함하는 "재생성 글루(regenerative glue)"를 주입하여 SUI를 치료하는 방법을 개시한다. 이 글루는 대체 목적으로 손상되거나 없거나 또는 상처입은 치골-요도 인대 부위에 주입되었다.

WO 2016/138289 A1은 평활근 기능장애의 치료를 위한 평활근 전구체 세포의 잠재적인 용도를 개시한다.

테플론(Teflon), 소 콜라겐, 실리콘 입자 및 탄소 비드와 같은 주입 가능한 증량제의 사용은 단기적인 성공을 가져 왔다. 그러나 이러한 증량제는 만성염증, 이물질 거대세포 반응(foreign body giant cell response), 요도 주위 농양(periurethral abscess), 요도 침식, 하부 요로 폐쇄 및 이에 따른 요정체(urinary retention), 내부 장기로의 이동 및 폐색전증(pulmonary embolism)을 유발할 수 있음이 보고되었다 (Kiilholma P. et al., Complications of Teflon injections for stress urinary incontinence, Neurourol. Urodyn 12:131-137 (1993)).

MPC의 이식은 유전성 및 후천성 근육 장애의 치료법으로 연구되었다. MPC는 위성 세포로서 정지되고 비활성인 단계에서 근섬유를 둘러싼 기저판(basal lamina) 아래에 있다. 이 세포는 외상이나 손상시 활성화되고 손상된 부위로 이동하고 증식하며 서로 융합하여, 근섬유로 성숙되는 근관(myotube)을 형성함으로써, 조직 재생에 참여한다. MPC의 대부분은 근원세포(myogenic cell) 계통으로 분화되므로 골격근 생물공학에 가장 적합한다. MPC는 큰 성장능을 가지고 있으며 배양으로 쉽게 확장된다. 근관 형성 후, 이들 세포는 체세포 분열이 종료되고(post-mitotic) 성숙한 섬유로 분화되기 시작하여 생체 내에서 통제되지 않은 조직 성장을 억제한다. SUI 치료를 위한 주입가능한 배양된 MPC의 잠재적인 용도가 설치류 및 개 모델에서 조사되었으며, 괄약근 기능을 복원하는 1차 치료가 될 가능성이 있다 (Yokohama et al., Autologous Primary Muscle-Derived Cells Transfer into the Lower Urinary Tract; Tissue Engineering, 2001, 7(4), p. 395-404; Yiou et al., Restoration of Functional Motor Units in a Rat Model of Sphincter Injury by Muscle Precursor Cell Autografts, Transplantation, 2003, 76(7): p.1053-60; Eberli et al., A canine model of irreversible urethral sphincter insufficiency. BJU Int, 2009, 103(2): p. 248-53). 그러나 이러한 동물 모델은 인간 환자에서 볼 수 있는 병태들을 충분히 반영하지 않는다.

근육 유래 줄기 세포와 자가(autologous) 근아세포 주입는 지금까지 인간에서 가장 많이 조사된 옵션이었다. 그러나, 요도 괄약근의 재생 요법은 과거에 여러 번의 시도에도 불구하고 아직 임상에 도달하지 못하였고 아직 일상적인 비뇨기과 진료의 일부가 아니다.

소태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)에 대한 우려로 인해, 이 치료법을 임상 환경으로 쉽게 옮기려면 대체물이 필요한다. 지금까지 FBS는 세포 배양 및 조직 공학을 위한 표준 배지 보충제이자 성장인자의 공급원이었다. 전구 세포의 시험관 내 배양 확장 중에 FBS를 사용하면 단백질과 거대 분자들로 인해 잠재적 위험이 발생할 수 있다. 줄기 세포에서 이러한 거대 분자들의 내재화는 바이러스/프리온 질병을 전파할 수 있다. 또한, 거대 분자들은 이식된 세포에서 항원성 기질 역할을 하여 면역 반응을 일으 킨다. 이종-면역화(xeno-immunization)의 위험, 병원체의 전파, 및 FBS 수집과 관련된 윤리적 문제로 인해, 임상 세포 치료제 제조를 위한 적절한 인간 대체물이 시급히 필요하다. 따라서 FBS는 임상 적용에 대한 안전성 및 기타 문제들로 인해 바람직하지 않다. 일부 연구에서, FBS가 보충된 세포가 이식된 환자에서 아나필락시스 및 기타 알레르기 반응이 나타났다.

치료적 접근법에 적용되는 모든 약물과 마찬가지로 세포 제품도 규제 요건을 충족해야한다. 이들의 생산 공정은 환자에게 안전한 적용을 위해 우수의약품제조관리기준 (Good Manufacturing Practice: GMP)를 따라야한다. 따라서 세포 배양 배지에서 임의의 동물 보충제를 제거하는 것은, SUI를 앓고있는 환자에게 근육 줄기 세포 치료법을 임상적으로 전달하기 위한 중요한 단계를 나타내며, 이에 의해 이종 단백질(xenogenic protein)에 대한 부작용을 피할 수 있다. 세포 배양 방법론의 이러한 변화는 hMPC의 주요 특성, 즉 수축 근육 조직을 형성하는 능력에 영향을주지 않고 구현되어야한다.

FBS에 대한 가능한 대안은, 인간 혈청, 인간 혈소판 유도체, 동종 제대혈 혈청, 또는 화학적으로 정의된 배지로 보완된 배지이다.

인간 혈소판 용해물 (Human platelet lysate, hPL)을 각각 함유하는 세포 배양 배지 또는 성장 배지는 중간엽 기질 세포의 임상적 규모 확장을 위한 FBS-함유 배지의 잠재적인 대체물로 설명되거나 치료 용도로 인간 중간엽 줄기 세포를 확장하는 것으로 설명되었다 (Schallmoser et al., Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion 2007, 47: 1436-1446; Castegnaro et al., Effect of Platelet Lysate on the Functional and Molecular Characteristics of Mesenchymal Stem Cells Isolated from Adipose Tissue. Curr Stem Cell Res Ther. 2011; 6(2):105-14). 그러나, 이러한 혈청 변화는 모든 세포 유형에서 용인되지는 않거나 또는 일부 배양된 세포의 기능성에 영향을 미칠 수 있다. 이전 연구에 따르면 hPL은 인간 골격근 세포를 배양하고 세포를 근관로 분화하기 위한 FBS의 대체물로 적합하지 않은 것으로 나타났다 (Kramer et al., Effect of serum replacement with plysate on cell growth and metabolism in primary cultures of human skeletal muscle. Cytotechnology 48, 89, 2005).

세포 증식(proliferation)은 배지-의존적이며 성장인자의 단순한 첨가만으로는 세포 확장(expansion)을 지속하기에 충분하지 않다.

따라서 본 발명의 목적은 hMPC의 증식을 허용하고 이식 후 생체 내에서 수축 조직 조작된 근육(contracting tissue engineered muscles)의 효율적인 형성을 가능하게 하는, 세포 배양 배지내 FBS에 대한 대안을 제공하는 것이다. 따라서 윤리적 및 안전 목적에서 본 발명의 목적은, 새로운 제노-프리(또는 동물성-성분-프리)를 개발함으로써 hMPC의 배양 및 확장을 위한, 즉 치료적 적용, 특히 인간 여성 환자에서 SUI의 재생 치료에 사용하기 위한 hMPC 집단을 포함하는 조성물의 제조를 위한, GMP-준수 프로토콜을 개발하는 것이다.

마지막으로, 본 발명은 골격근 기능장애에 대한 개선된 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

신경조절 및 운동 훈련은 결핍된 골격근의 잠재적인 치료법으로 제안되었다. 인간의 경우, 대퇴사두근을 감싼 자기 코일(magnetic coil)이 근육 피로와 훈련을 쉽게 유도하는 것으로 입증되었다. 골반저 운동을 위한 유사한 장치는 자기 펄스가 의자 의자 내부에 위치한 코일로 수렴되는 방식으로 설계되었다 (Chandi et al., Functional extracorporeal magnetic stimulation as a treatment for female urinary incontinence: "the chair". BJU Int, 2004. 93(4): p. 539-42).

근육 경련을 유도하는, 신경-근육 전자기 자극 (Neuro-muscular electromagnetic stimulation, NMES)이, 골격근 질환의 치료 방법으로 제안되었다. 2012 년 Blaganje 등은 외부 요도 괄약근에 초음파-유도 자가 근아세포 주입(ultrasound-guided autologous myoblast injection)을 전기 자극에 선행하여 실시하거나 상기 주입 후 전기 자극을 실시함으로써 SUI의 성공적인 치료를 공개하였다. 따라서 본 발명의 추가적인 목적은 세포 및 자극을 사용하여 인간 여성 환자에서 SUI의 최적화된 치료 방법을 제공하는 것이다.

조직 공학에서 인간 근육 전구체 세포 (hMPC)의 적용은 수축성 근육을 재생하여 스트레스성 요실금 (SUI)을 치료하기 위한 유망한 접근 방식이다. 이를 위해, 이러한 치료적 적용에서 의약으로 사용하기 위한 조성물을 생성하는 방법이 제안된다. 상기 조성물은 골격근 유래 hMPC (또는 근육 재생 세포)의 집단을 포함하며, 이들 조성물의 생성 또한 본 발명의 방법으로 제공된다.

따라서, 제1 측면에 따른 본 발명은 골격근 유래의 인간 근육 전구체 세포 집단의 생성 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 적어도 하기의 단계들을 포함한다:

첫째, 인간 환자의 골격근 생검을 통해 인간 조직 샘플을 수득한다. 바람직하게는, 골격근 생검시료는 인간 여성 환자로부터 수득되지만, 예를 들어, 전립선 절제술 후 잠재적인 SUI를 치료하기 위하여, 남성 환자의 골격근 생검시료 또한 유용할 수 있다. 바람직하게는, 골격근 생검시료는 가자미근(musculus soleus), 복직근(rectus abdominis), 대퇴사두근(quadriceps femoris) 및 외측광근(vastus lateralis)으로 구성된 군으로부터 선택된 조직으로부터 얻어진다.

(왼쪽 또는 오른쪽 다리의) 가자미근은 괄약근과 구성이 유사하고 접근성이 용이하기 때문에 생검시료로 선택된다. 대안으로, 예를 들어, 외측광근을 사용할 수 있다. 외과적 제거 후 생검시료의 운반이 필요한 경우, 생검시료는 항생제와 PBS를 함유하는 운반 매체 내에서 운반될 수 있다.

세척 및 소독 후, 근육 생검시료에서 지방- 및/또는 힘줄- 및/또는 결합 조직의 잔해를 외과적으로 제거한 다음, 분쇄(mincing)하고 분해하며, 바람직하게는 콜라게나제 및 디스파제를 함유하는 혼합물에 의해 분해한다. 바람직하게는, I형 콜라게나제 0.2% (w/v) 및 디스파제 0.4% (w/v)의 혼합물을 사용한다. 효소 반응은, 바람직하게는 세포 배양 배지, 즉 10% 인간 혈소판 용해물 (hPL), 바람직하게는 10% 풀링된 인간 혈소판 용해물 (phPL)을 함유하는 성장 배지를 이용하여 종결된다. 그후, 개별 섬유는 엄격한 피펫팅(rigorous pipetting)에 의해 해방시키고(liberate), 스트레이너, 바람직하게는 공극 크기가 100 ㎛ 인 스트레이너를 통해 여과된다. 원심분리 후, 펠렛은 1% 페니실린/스트렙토마이신 (이러한 계대 0 단계에서만 보충 됨)이 보충된 성장 배지에 재현탁하고, 세포외 기질 단백질, 예를 들어, 콜라겐 또는 피브로넥틴, 바람직하게는 I형 콜라겐 (바람직하게는 1 mg/ml)으로 코팅된 35mm-디쉬 (6-웰)로 옮긴다.

분해 후, 24 시간 후, 부착되지 않은 hMPC를 포함하는 상층액을 I형 콜라겐로 코팅된 디쉬에 재-플레이팅하여 오염성 섬유아세포(contaminating fibroblast)의 수를 줄임으로써 인간 근육 전구체 세포의 집단을 생성한다. 이들 인간 근육 전구체 세포는 콜라겐 코팅된 접시에 정착되도록 방치한 다음, 적어도 한 계대, 바람직하게는 적어도 2 계대, 더욱 바람직하게는 총 3 또는 4 계대 동안 성장 배지에서 확장시킨다.

바람직한 세포 배양 배지, 즉 성장 배지는 소태아혈청 (FBS)을 함유하지 않는다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 성장 배지는 다음과 같이 구성된다.

바람직하게는, hMPC는 hPL, 바람직하게는 phPL, 바람직하게는 여과된 phPL을 포함하는 성장 배지를 사용하여 확장된다. 바람직한 phPL 유형은 BGO (혈소판)/AB (혈장)이다. 바람직하게는, 성장 배지에서 phPL의 최종 농도는 5-20%,보다 바람직하게는 7-12%, 가장 바람직하게는 약 10% (부피%)이다.

인간 근육 전구체 세포의 확장(expansion)에 사용되는 특히 유리한 성장 배지는 항-응고인자, 바람직하게는 헤파린을 추가로 포함한다. 이를 위해, 예를 들어 헤파린-Na (헤파린-나트륨) (25'000 IU/5ml)를 사용할 수 있다. 헤파린은 바람직하게는 여과된 phPL에 첨가되어 혼합물을 형성하고, 상기 혼합물을 성장 배지 ml 당 1-10 IU, 더욱 바람직하게는 2-6 IU/ml, 가장 바람직하게는 약 2 IU/ml 의 바람직한 최종 농도로 성장 배지의 양액(nutrient solution)에 첨가한다. 대안으로, 응고를 방지하는 다른 물질 (예 : EDTA)을 사용할 수 있다. 피브리노겐-고갈된 phPL을 사용하는 경우, 활성 응고인자가 더 이상 존재하지 않으므로 항-응고제를 추가하지 않아야 한다.

바람직하게는, 각각 hPL 또는 phPL 및 항-응고인자 외에, 성장 배지는 추가로 하기 성분들을 포함한다:

- 양액(nutrient solution), 바람직하게 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), 더 바람직하게 1:1 DMEM/F12 영양혼합물(nutrient mixture)(DMEM과 Ham's F-12의 1:1 믹스);

- hEGF(human Epidermal Growth Factor)로서, 바람직하게는 최종 농도 2-20 ng/ml, 더 바람직하게는 약 10 ng/ml의 최종 농도가 되도록 양액에 첨가되는 hEGF;

- hbFGF (human basic Fibroblast Growth Factor) 로서, 바람직하게는 최종 농도 0.5-2 ng/ml, 더 바람직하게는 약 1 ng/ml의 최종 농도가 되도록 양액에 첨가되는 hbFGF;

- 인슐린으로서, 바람직하게는 최종 농도 5-20 ㎍/ml, 더 바람직하게는 약 10 ㎍/ml의 최종 농도가 되도록 양액에 첨가되는 인슐린;

- 덱사메타손으로서, 바람직하게는 최종 농도 0.2-0.8 ㎍/ml, 더 바람직하게는 약 0.4 ㎍/ml의 최종 농도가 되도록 양액에 첨가되는 덱사메타손.

최종 농도로 표시된 백분율(%)은 양액의 부피%로 계산되지만, 단순화를 위해 500ml의 최종/총 부피의 양액을 계산에 사용했고 (각 100ml 양액 당 x vol) 최종 세포 배양-/성장 배지 조성물을 사용하지는 않았다 (이 조성물은 phPL의 첨가로 인해 550ml를 약간 초과함). 또한 헤파린의 용량(dosis)은 그램이 아니라 국제 단위 (IU)로 표시된다. 하나의 유닛은 1 시간 동안 37℃에서 CaCl₂를 첨가 한 후 1ml 시트레이트-함유-혈장의 응고를 방지한다.

본 발명은 추가로 전술한 방법에 따른 방법에서 생성된 골격근 유래 인간 근육 전구체 세포 (human muscle precursor cell, hMPC)의 집단에 관한 것이다. 바람직하게는, 골격근 유래 hMPC 집단의 단백질 발현 패턴은 바람직하게 다음과 같다: Pax7 (바람직하게는 60% 이상), 데스민(Desmin) (바람직하게는 60% 이상), MyHC (바람직하게는 약 30-50%) 및 알파-액티닌 (바람직하게는 50% 이상, 더 바람직하게는 60% 이상). 세포는 바람직하게는 음성 대조군으로 작용하는 15% 미만의 CD34를 발현한다. 유세포 분석에서 일반적으로 사용되는 바와 같이, 백분율(%)은 형광성 세포 수의 계수-독립적 측정값인, 즉, 문제의 단백질을 발현하는 총 세포 수의 표시된%인, "% 양성 세포" 이다.

본 발명의 골격근 유래 hMPC 집단은 의약으로서, 특히 골격근 기능장애를 치료하기 위한, 예를 들어 스트레스성 요실금 (SUI)을 치료하기 위한 의약으로서 사용될 수있다.

또한, 본 발명은 골격근 기능장애의 치료를 위한 상기 hMPC 집단의 생성/제조를 위한 FBS-무함유 세포 배양 배지 또는 성장 배지의 유리한 조성물을 제공한다. 본 발명의 성장 배지는 바람직하게는 상기 기재된 조성물을 포함한다.

바람직한 구체예에 따르면, 세포 성장 배지, 그러나 계대 0에 대해서만, 세포 성장 배지는 항생제, 바람직하게는 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 용액을, 바람직하게는 최종 농도 약 1% 로 포함한다 (Pen/Strep: (pH 안정성을 위해) 10mM 시트레이트 완충액 중의 10000 units/ml 페니실린 및 10000 μg/ml의 스트렙토마이신).

본 발명에 따른 세포 성장 배지는, 전술한 바와 같이, 바람직하게는 하기 단계를 수행하여 제조된다:

- 양액(nutrient solution), 바람직하게 DMEM 용액, 더 바람직하게 1:1 DMEM/F12 영양혼합물(nutrient mix)을 제공하는 단계;

- hEGF 로서, 바람직하게는 양액내 약 10 ng/ml의 최종 농도에 도달하도록 hEGF를 첨가하는 단계;

- hbFGF 로서, 바람직하게는 약 1 ng/ml 의 최종 농도에 도달하도록 hbFGF를 첨가하는 단계;

- 인슐린으로서, 바람직하게는 약 10 ㎍/ml 의 최종 농도에 도달하도록 인슐린을 첨가하는 단계;

- 여과된 인간 혈소판 용해물과 항-응고인자의 혼합물을 제조하는 단계로서, 항-응고인자는 바람직하게는 헤파린, 보다 바람직하게는 헤파린-Na이고, 상기 혼합물은 상기 혼합물을 (DMEM) 양액에 첨가하기 전에 헤파린, 바람직하게는 헤파린-Na을 여과된 phPL 에 첨가하여 제조하되, 바람직하게는, phPL 의 최종농도 5-20%, 바람직하게는 phPL 의 최종농도 7-12%, 더 바람직하게는 phPL 의 최종농도 10%에 도달하고, 바람직하게는 헤파린이 최종 농도 1-10 IU/ml, 더 바람직하게는 2-6 IU/ml, 가장 바람직하게는 2 IU/ml의 헤파린에 도달하도록 제조하는, 단계, 및 그후 phPL 및 헤파린의 혼합물을 양액에 첨가하는 단계;

- 덱사메타손으로서, 바람직하게는 최종 농도 0.2-0.8 ㎍/ml, 더 바람직하게는 약 0.4 ㎍/ml 의 최종 농도에 도달하도록 덱사메타손을 첨가하는 단계.

본 발명은 또한 캐리어 매트릭스(carrier matrix)로서 콜라겐 용액에 현탁된 골격근 유래 hMPC의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 골격근 기능장애의 치료에 사용하기에 적합하다.

본 발명은 골격근 유래 hMPC 집단을 포함하는 이러한 조성물의 제조 방법을 추가로 제공하며, 상기 hMPC 집단은 바람직하게는 전술한 방법에 따라 제조된다. 골격근 기능장애의 치료에 사용될 수 있는 조성물의 제조를 위해, 인간 근육 전구체 세포의 집단은 바람직하게는 저-비율의 콜라겐 용액, 바람직하게는 0.5-4 mg/ml, 더 바람직하게는 1-2 mg/ml의 콜라겐 용액에, 바람직하게는 콜라겐 용액의 1천만 내지4천만 세포/ml의 농도로, 바람직하게는 콜라겐 용액 2천만 내지 3천만 세포/ml의 농도로 현탁된다. 유리하게는, 콜라겐 용액은 바람직하게는 돼지, 소 또는 인간 기원의 I형 콜라겐을 함유한다.

각 환자에게 주입하기 위한 표적 세포 수는 바람직하게는 총 6천만 내지 1억 세포 범위이다. 주입 전에 품질 및 순도 분석이 수행된다.

80% 이상의 생존력으로 최소한 8천만 hMPC를 전달하기 위해, 최종 농도 2천만 세포/ml에서, 배양된 세포 (8천만)를 4ml의 콜라겐 용액에 현탁한다. 최종 생성물은 바람직하게는 온도 측정 장치에 의해 제어되는 5℃ (+/- 3℃)에서 상자에 담긴 10ml 시린지로 운반된다. 수술실에서는, 최종 제품을 주입하기 전에 부드럽게 혼합하는 것이 바람직하다.

환자, 바람직하게는 인간 환자, 바람직하게는 여성 환자, 보다 바람직하게는 근육 생검시료를 취한 동일한 여성 인간 환자에게 상기 기재된 조성물을 주입함으로써, 환자에서 골격근 조직을 재생하는 것이 가능하다. 즉, 본 발명에 따른 hMPC 집단은 인간 환자의 골격근 기능장애를 치료하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명의 추가적인 목적은 전술한 바와 같은 본 발명에 따른 조성물을 사용하여, 인간 환자에서 골격근 기능장애, 특히 외부 요도 괄약근의 결함을 치료, 및/또는 골격근 조직의 재생을 치료하는 방법이다. 상기 치료 방법은 적어도 하기 단계를 포함한다:

- 콜라겐 용액에 현탁된 골격근 유래 인간 근육 전구체 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 조성물은 바람직하게는 전술한 방법에 따라 제조되는, 단계;

- 상기 조성물을 인간 환자, 바람직하게는 인간 여성 환자의 요도 괄약근에, 바람직하게는 초음파 유도 하에 주입하는 단계;

- 조성물의 주입 후, 인간 환자의 골반저는 바람직하게는 신경-근육 전자기 자극 (neuro-muscular electromagnetic stimulation, NMES)을 받는다.

따라서, 전술한 치료 방법은 스트레스성 요실금, 특히 외부 요도 괄약근의 결함으로 인해 발생할 수 있는 스트레스성 요실금을 치료하는 데 사용될 수 있다.

인간 환자, 바람직하게는 여성 환자의 골반저에 표준화된 주입을 허용하기 위해, 세포는 초음파 유도하에 주입된다. 바람직하게는 8-12 분취량을 골반저에 주입하고, 바람직하게는 총 4ml를 초과하지 않는다.

세포 현탁액 주입 후 NMES-치료는 근육-신경 크로스 토크(cross talk)를 활성화하여 근육과 신경 재생을 지원하고 신경근 접합부의 성숙을 유도한다. 좌석에 큰 전자기 코일을 포함하는 의자 (예를 들어, 특수 자석 의자 "BioCon-2000")를 사용하여 골반저에 적용할 수 있는 이 비-침습적 치료가, 기능성 근육 조직의 지속적인 형성을 지원할 수 있다.

골반저 전자기 자극은 제어 된 근육 재생, 인접 신경의 탈분극 및 근육 수축을 유도한다. 펄스 자기장의 생리적 자극은 고도로 집중된 자기장과 자기장의 가장자리(advancing edge)에서 매우 가파른 변화 구배를 가능하게 하는 몇 가지 특수 설계 특징에 의존한다. 이러한 특성은 주파수와 강도를 쉽게 조정할 수 있는 빠른 펄스 자기장을 생성한다. 임상적 효과의 경우 환자의 외부 의복(external clothing)을 제거하는데 이점이 없다. 최대 출력에서 유도 전기장의 강도는 자극 코일 표면에서 120V/m이며 이는 자극 코일과의 거리에 따라 기하급수적으로 감소한다. 자극 코일 위 5cm에서, 전장(field)은 22V/m이다.

자기장이 펄스함에 따라, 플럭스는 펄스를 포함하는 자기장을 생성하여 작은 와전류(eddy current)가 조직 안에 흐르도록 유도한다. 이러한 전류는 신경 축삭의 탈분극을 유도하고, 근위 및 원위 방향으로 모두 이동하는 신경충동(nerve impulse)의 전파가 있을 것이다. 그것이 말단 운동 신경 축삭인 경우, 전파하는 충동은 운동 종판(motor end plate)으로 이동하여 아세틸콜린의 의무적 방출을 유발하고, 해당 근섬유의 탈분극 및 해당 섬유의 수축이 발생할 것이다. 자속(magnetic flux)이 조절됨에 따라, 근섬유의 수축률은 일반적인 생리학적 범위 내에서 조절될 수 있다. 근섬유 수축 속도를 50Hz 의 오더(order)의 최대 생리적 속도로 유도할 수 있다.

이 체외 자기 치료의 임상적 효능은 골반 근육의 활성을 변화시키는 것이며, 말단 운동 신경 섬유가 반복적으로 활성화되면 운동 종판이 힘과 지구력 측면에서 강화되는 경향이 있다.

전자기 자극은 염증성 침윤의 존재와 외상후 흉터 형성을 크게 최소화하여 근육 재생을 개선한다. 외상후 근육 위축을 방지하고 근육 비대를 유도하며 근육의 대사와 회전율을 증가시켜 근육 마커의 발현을 3 배로 늘리고 외상후 근육 기능의 회복을 크게 향상시킨다.

제안된 SUI 치료는 NMES와 조합된 자가 hMPC 이식을 기반으로 하는 치료 전략이다. 미래에 구상되는 최적화된 방법에서, SUI 치료를 위한 세포-기반 의약품의 구성요소로서 hMPC 집단의 생산을 위한 생물반응기를 사용하면 생산 비용이 낮아지고 그에 따라 더 광범위한 영향을 받은 개인들이 치료법을 이용할 수 있게 될 것이다.

추가 개발에는 동물 성분을 생략하기 위해 GMP를 준수한 방법에 따라 생산된 인간 콜라겐 제형을 사용하여 본원의 공정을 최적화하는 것을 포함한다. 또한, 괄약근에 본원의 조성물의 전달은 향후 정밀도 측면에서 최적화될 것이다.

본 발명의 추가적인 구현예는 종속항에 기재되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예들이 도면을 참조하여 이하에서 설명되며, 이는 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위한 것이지 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 도면에서,본 발명의 바람직한 구현예들이 도면을 참조하여 이하에서 설명되며, 이는 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위한 것이지 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 도면에서,
도 1은 배양에서 hMPC의 분화를 개략적으로 보여준다.
도 2는 상이한 성장 배지에서 배양된 hMPC의 형태의 비교를 나타낸다.
도 3은 상이한 성장 배지에서 배양된 hMPC의 성장능의 비교를 나타낸다.
도 4는 상이한 성장 배지에서 배양된 hMPC의 유세포 분석의 비교를 나타낸다.
도 5는 근원성 특성화를 위한 두 가지 상이한 조건에서 배양된 hMPC의 비교를 나타내며, 도 5a에서, 계대 1에 대한 hMPC의 유세포 분석 결과를 보여주고, 도 5b 에서 계대 2, 도 5c에서 계대 3에 대한 유세포 분석 결과를 보여준다.
도 6은 FBS 또는 10% phPL을 함유하는 분화 배지에서 배양된 hMPC에 대한 섬유 형성 분석 결과를 보여준다.
도 7은 FBS를 포함하는 분화 배지에서 배양된 hMPC와 10% phPL을 포함하는 분화 배지에서 배양된 hMPC를 비교한 섬유 형성 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 FBS (도 8a) 또는 10% phPL (도 8b)을 포함하는 분화 배지로 배양된, 피하 주입된 hMPC로부터 생성된, 조직 공학 근육(tissue-engineered muscle)의 섬유 형성을 보여준다.
도 9는 두 가지 수준의 자극에서 수행된 오르간 배스(organ bath) 분석 결과를 나타낸다.
도 10은 H&E 염색에 의해 누드 마우스에 hMPC를 피하 주입한 후 조직 공학 골격근(tissue engineered skeletal muscle)에서의 섬유 형성의 특성을 보여준다.
도 11은 이식된 hMPC의 MRI에 의한 추적을 보여준다.
도 12는 이식된 hMPC의 T2*MRI에 의한 추적을 위한 신호 감쇠 곡선을 보여준다 (MRI 이미지는 도시되지 않음).
도 13은 개 모델에서 괄약근 기능의 기능적 평가를 보여주며, A는 대표적인 요도 프로파일을 나타내고, B는 시간에 따른 괄약근 압력을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 14는 6개월째의 개 괄약근 부위의 방사선 사진으로, A는 정상 동물 괄약근에 대한 영상을 나타내고, B는 손상된 괄약근에 대한 영상을 나타내고, C는 MPC로 처리된 손상된 괄약근에 대한 영상을 나타낸다.
도 15는 세포 배양에 대한 생검에서 치료까지의 일련의 단계를 보여준다.

도 15에는 본 발명에 기여하는 단계가 요약되어 있다. 첫째, 골격근 기능장애 치료 대상 환자로부터 골격근 생검시료를 수득한다. 다음으로, 생검시료를 처리하고 자가 hMPC를 분리하며 본 발명의 세포 성장 배지를 사용하여 세포 배양물에서 확장시킨다. 수확 후, hMPC는 의약으로 사용하기 위한 조성물의 제조에 사용된 후, 환자에게 주입되고, 그후 NMES 를 실시한다 (도면에는 도시되지 않음).

실시예 1 :

hMPC의 증식과 수축하는 조직 공학 근육(contracting tissue engineered muscle)의 효율적인 형성을 가능하게 하는 소태아혈청 (FBS)의 대안을 확인하기 위해, hMPC의 배양/성장 배지 중의 FBS를 인간 혈청(HS) 또는 풀링된 인간 혈소판 용해물 (phPL)로 대체했다.

복부 수술 중에 복직근의 인간 생검시료를 수집했다. 모든 샘플은 확립된 프로토콜에 따라 또는 이 방법에 변형을 적용하여 처리하였다 (Eberli et al., Optimization of human skeletal muscle precursor cell culture and myofiber formation in vitro, Methods 47, 98, 2009). 간략히 설명하면, 각 샘플을 0.2% I형 콜라게나제 (Worthington Biochemical) 및 0.4% 디스파제 (Gibco)가 농축된 DMEM/F12 (Gibco, Invitrogen)에서 1시간 (37℃, 5% CO₂) 동안 분쇄하고 분해했다. 분해는 FBS (FBS-GM), HS (HS-GM) 또는 phPL (phPL-GM)이 보충된 성장 배지를 이용하여 중단하였다.

원심분리 후, 샘플을 각각의 성장 배지에 재현탁하고 콜라겐-코팅된 6웰 디쉬에 플레이팅하였다. 빠르게 부착되는 섬유아세포의 수를 감소시키기 위해, hMPC를 함유하는 현탁액을 새로운 콜라겐-코팅된 6-웰 디쉬에 24 시간 후에 재-플레이팅하였다. hMPC는 FBS, HS 또는 phPL로 보충된 성장 배지로 5% CO₂에서 37℃에서 확장하였다. 실험 목적으로 5%, 10% 및 20%의 phPL 농도를 테스트했다.

다음의 성장 배지 조성물을 사용하였다: 18% FBS (Gibco, Invitrogen), 10% HS (Invitrogen) 또는 5/10/20% phPL (invitrogen)이 보충 된 DMEM/F12 (Gibco, Invitrogen) (Schallmoser 등, 2017 문헌의 프로토콜에 따랐으며, 오스트리아 찰츠부르크의 수혈의료 대학연구소, 찰츠부르크 시립병원 및 파라셀수스 의과대학에서 수득함). 추가 보충제는 모든 성장 배지 변형물에 대해 유사했다: 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco, Invitrogen) (계대 0에만 해당), 10μg/ml 인간 상피세포 성장인자 (hEGF) (Sigma), 1μg/ml 인간 염기성 섬유아세포 성장인자 (hbFGF) (Sigma), 10 μg/ml 인간 인슐린 (Sigma) 및 0.4 μg/ml 덱사메타손 (0.5 μM, Sigma).

모든 실험은 계대 1에서 3까지 각 샘플에 대해 세 번 수행하였다.

확장기 후, 세포를 누드 마우스에 피하 이식하고 4주 후에 형성된 조직을 수확하였다. hMPC는 동일성, 순도 및 기능에 대한 여러 기준을 적용하여 서로 다른 시점에서 특성화하였다. 시험관내 분석은 성장 분석, 유세포 분석, 면역형광염색 및 섬유 형성 분석에 의해 수행하였다. 생체내 시험은 면역조직화학, 웨스턴 블롯 및 근운동기록법(myography) 에 의해 수행하였다. 시험관내 시험을 위해, 실험은 4 이상의 환자 생검시료로 3회에 걸쳐(triplicate) 수행하였다.

HS는, 연골세포, 중간엽 줄기세포, 각막 상피세포, 및 치수 줄기세포와 같은 다른 세포 유형에 성공적으로 적용되었기 때문에, hMPC 배양을 위한 FBS의 대안으로 선택하였다. 그러나 HS가 보충된 성장 배지는 hMPC의 증식을 지속할 수 없었고, 2주 후에도 세포가 배양 접시에 부착되지 않았고, 4명의 서로 다른 환자에서 유래한 생검시료의 세포 배양에서도 세포가 부착되지 않았다 (데이터는 표시되지 않음). 예상과는 달리 20% 또는 그 이상의 고농도의 HS 역시 유망한 결과를 산출하지 못했다.

성장하는 세포의 형태학적 구조는 초기 및 후기 계대 (1 및 3)에서 FBS-보충된 성장 배지 (FBS-GM)에서 성장한 세포와 phPL-보충된 성장 배지 (phPL-GM) 에서 성장한 세포간에 유사했고, 제노-프리 배지에서 덜 컨플루언트하였다 (도 2). 모든 계대에서 phPL 의 다양한 농도 간에 차이는 관찰되지 않았다.

상이한 성장 배지에서 배양된 hMPC의 성장능을 분석하기 위해, 생검 후 1 차 배양 후, hMPC를 각 계대에서 5000세포/cm²로 시딩하고 90-95% 컨플루언시까지 배양하고 계수하였다. FBS-GM 또는 phPL-GM에서 hMPC의 증식은 효율적이었으며 처음 3 계대 동안 동일한 성장능이 관찰되었다 (도 3). 그러나, 10% 및 20% phPL을 포함하는 성장 배지를 사용하는 조건은 hMPC가 시험관 내에서 증식할 수 있는 최상의 조건을 제공하는 것으로 나타났으며, 그 결과 계대 3이 종료될 때 더 많은 세포가 생성되었다. 10% phPL-GM에서 배양된 세포는 5% 및 20% phPL-GM이 보충된 성장 배지보다 작은 디쉬에서 더 잘 성장했다. 또한, 계대 3 이후, 20% phPL-GM에서 배양된 hMPC가 성장하였고 증식 정지가 관찰되었다. 10% phPL-GM은 FBS를 사용하는 표준 성장 배지보다 hMPC의 증식을 더욱 촉진하는 것으로 보인다.

분명히, 배지 구성 및 배지 조정은 세포 특이적이고, 성공적인 세포 확장 및 근원성 분화에 중요하며, Kramer 등(2005)이 FBS를 phPL로 최적으로 대체할 수 없었던 이유를 설명한다. hEGF, bFGF 및 인슐린과 같은 성장인자의 보충제가 누락되고, 전술한 바와 같이 최적 농도가 아닌 20% 농도의 phPL을 사용한 것이 그 이유일 수 있다.

hMPC는 유세포 분석 전에 80-90% 컨플루언시에 이를 때까지 배양하였다.

hMPC의 근원성 프로파일에 대한 phPL의 효과는 면역형광 및 유세포 분석에 의해 연구하였다. phPL은 hMPC의 근원성 마커와 표현형 및 생체내 잘 발현되는 분화능을 유지한다.

상이한 조건 (FBS 또는 phPL)에서 배양된 hMPC의 유세포 분석은 계대 3에서 근육 특이적 마커의 발현을 보여주었다 (n = 4 생검시료). 10% phPL 배양 조건은 표준 조건 (FBS-GM)보다 hMPC의 증식을 더욱 촉진하는 것으로 보인다. 그러나 제노-프리 조건들 간의 차이와 phPL-GM과 FBS-GM 간의 차이는 크지 않았다. 성장하는 세포 집단에서, 근원성 분화 마커 알파-액티닌, 데스민, MyHC (myosin heavy chain), MyoD 및 Pax7은 각각 알파-액티닌의 경우 약 80%, 데스민의 경우 약 78%, MyHC의 경우 약 40%, 약 MyoD의 경우 약 35%, Pax 7의 경우 약 65%로 발현하였다 (도 4). 추가 연구 및 FBS-GM 조건과의 비교를 위해 10% phPL 조건을 선택하였다.

골격근 마커의 발현은, MyHC를 제외하고는, 모든 계대에 걸쳐 FBS 및 phPL 조건 간에 유사했다 (도 5a-c). MyHC는 계대 1에서 phPL 대체물에서 2배 더 높았고 계대 2에서는 2.5배 더 높았지만, 계대 3 에서는 차이가 없었다. 두 조건 모두 이상적인 설정을 나타내었고 (섬유아세포보다는) hMPC 의 증식을 촉진했다. CD34 검출은 모든 계대에서 낮고 안정적인 상태를 유지했다. 주목할 점은 FBS- 및 phPL-GM 모두에서 MPC에 의해 표현되는 근육 마커의 비율(%)이 계대 1에서 3까지 약간 감소한 것이다. 이것은 두 환경에서 세포의 융합 또는 근관(myotube)의 형성을 방지하지 못했다 (도 6). 골격 세포의 분화를 촉발하여, hMPC의 섬유 형성은 Giemsa 염색으로 관찰할 수 있었다. 그러나 근육과 유사한 구조를 구성하는 데 있어서 섬유 계수는 FBS-GM 또는 phPL-GM에서 성장한 hMPC의 다른 능력을 보여주었다. FBS-GM에서 2주 동안 배양된 hMPC(11.4 섬유/슬라이드 (±2.4))는 phPL 에서 확장된 hMPC(7.56 섬유/슬라이드 (±1.9))보다 더 쉽게 융합되고 섬유를 형성하는 것으로 나타났다 (도 7). 두 세포배양 조건에서 골격근 마커의 발현은 면역세포형광에 의해 확인하였다 (데이터는 표시하지 않음). 시험관내에서 FBS-GM 또는 10% phPL-GM으로 배양된 hMPC의 계대 3에서, 배양된 hMPC의 염색은 특정 골격근 마커인 알파-액티닌, 데스민, MyHC 및 MyoD의 발현을 보여주었다. 섬유 형성 분석에 사용된 성장 배지, 즉 분화 배지에는 성장인자 (예를 들어, EGF, FGF 등)가 포함되지 않았다.

시험관내 실험 후, FBS-GM 및 10% phPL-GM에서 배양된 hMPC를 누드 마우스의 등에 피하 주입하였다. 4주 후, 동물을 희생시키고 조작된 근육 조직을 추출했다. 조작된 조직은 모든 조건의 이식 영역에서 볼 수 있었다. 또한, H&E 염색은 조작된 근육 조직에서 근육-유사 구조를 입증하였다 (도 8a, b). 40X 배율은 근관 구조로 근육 형성을 자세히 보여준다. 주입 4주 후 샘플에 대해 수행된 웨스턴 블롯은 두 배양 조건에서 근육 특이적 마커인 알파-액티닌, 데스민, MyHC 및 MyoD의 발현을 확인했다 (데이터로 표시되지 않음). 면역조직화학 분석은 생체내 샘플의 근육 특성을 확인했다. 이식된 hMPC는 주입 전에 PKH67로 표지하였다. 두 조건의 조작된 조직을 이 표지로 검출하였다. 근육 특이적 마커인 알파-액티닌, 데스민, MyHC 및 Pax7은, FBS-GM 및 10% phPL-GM 에서 배양된 hMPC 둘 다에서 유래한 조작된 조직에서 발현되었다(데이터로 표시되지 않음). 마지막으로, 이러한 조직 공학 수확물은 40V/40Hz 및 80V/80Hz에서 자극되었을 때 수축했다 (도 9). phPL-GM 조건은 표준 조건에 비해 더 나은 수축성을 제공하는 것처럼 보였지만, 관찰된 차이는 통계적으로 유의하지 않았다.

요약하면, hMPC는 FBS-기반 성장 배지 및 모든 테스트 농도의 phPL (5-20%)이 보충된 성장 배지에서 증식할 수 있었다. phPL은 FBS와 유사한 방식으로 생체 내에서 융합하고 수축하는 조직공학 근육을 형성할 수 있는 hMPC의 확장을 유지하는 것으로 나타났다. 따라서, phPL은 근원성 세포 표면 마커의 발현과 증식하는 hMPC 의 특성을 보존하면서, 세포 배양에서 FBS 의 대체물로 사용될 수 있다. FBS와 phPL 확장된 hMPC 간의 미묘한 차이가 확인되긴 하였으나, 생체 내에서 근관을 형성하는 세포의 분화능은 일정하게 유지된다. 이러한 발견은 SUI로 고통받는 환자를 치료하기 위해 근육 생검시료에서 분리된 hMPC를 사용한 세포 요법의 임상 적용을 촉진할 수 있다.

실시예 2 :

생검:

환자가 제외 기준 중 어느 하나에라도 해당하지 않고 모든 포함 기준을 충족하는 경우 전신 또는 척추 마취하에 생검을 실시했다. 생검시료는 왼쪽 또는 오른쪽 다리의 가자미근 (괄약근과 구성이 매우 유사한 골격근)에서 채취하였다. 이를 위해, 하지 뒤쪽의 슬와의 몇 센티미터 아래를 절개했다 (약 2-4cm). 그런 다음 가자미근을 확인하고 근육 조각 (약 1cm³)을 외과적으로 제거했다. 멸균한 근육 생검조직은 수확 후 즉시 수송 배지 (1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 PBS)를 포함하는 폐쇄된 50ml 튜브로 옮겨 24 시간 이내에, 바람직하게는 6 시간 이내에, 더 바람직하게는 생검 직후에 GMP 실험실에서 처리되었다. 근막, 피하 조직 및 피부는 일상적인 방식으로 봉합하였다. 상처 조절 및 피부 봉합사 제거는 생검 1 주 후 수행하였다.

hMPC 집단의 제조 및 세포 배양:

실험실에서, 지방과 힘줄 조직을 층류(laminar flow) 하에서 외과적으로 제거한 후 PBS로 헹구고 소독제와 PBS가 1:1 포함된 용액으로 소독하였다. 나머지 조직은 가위와 집게를 사용하여 약 1x1 mm의 작은 조직 조각으로 자른 다음, 0.2% 콜라게나제와 0.4% 디스파제 용액 5ml에 넣고 효소적 분해를 위해 37℃에서 1 시간 이상 인큐베이션했다. 인큐베이션 후 조직 조각을 25ml 피펫으로 흡인하고 50ml 튜브에 넣은 다음, 효소 반응을 차단하기 위해 하기 열거된 성장 배지로 세척했다. 그 후, 샘플을 1500rpm에서 5 분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다. 하기 열거된 제조법에 따라 구성된 15ml의 성장 배지를 세포 펠렛에 첨가하고 혼합물을 10 회 이상 위아래로 피펫팅하여 균질화했다. 다음으로, 공극 크기가 100 μm 인 세포 스트레이너를 튜브 위에 놓고 샘플을 여과하였다.

한편, 6-웰 디쉬는 콜라겐 용액으로 미리 코팅하였다. 1시간 후 콜라겐 용액을 흡인하고 웰을 PBS로 3 회 세척하여 산성 환경을 제거하였다.

콜라겐-코팅된 웰에서 PBS를 제거한 후, 성장 배지에 현탁된 세포를 콜라겐-코팅된 6-웰 디쉬의 처음 두 웰로 분할하였다. 두 개의 다른 웰은 PBS로 채웠고, 이는 후속 단계에서 세포를 추가하기 전에 제거하였다.

단일 섬유의 존재를 위상 현미경으로 확인하고 모든 디쉬를 37℃ 및 5% CO₂를 포함하는 가습 분위기에서 밤새 인큐베이션하였다.

hMPC의 순도를 높이기 위해 세포들에 대해 섬유아세포 감소 단계를 실시했다: 섬유아세포가 먼저 플레이트에 부착되는 경향이 있으므로, 부착되지 않은 hMPC를 포함하는 상층액을 PBS 제거 후 동일 플레이트 상의 I형 콜라겐이 코팅된 웰로 20-28 시간 후에 옮겼다. 성장 배지는 4일째와 7일째에 변경하였다. hMPC가 아직 부착되지 않은 경우, 4일째에 배지를 변경하지 않았다. 대신, 일부 신선한 성장 배지를 위부분에 조심스럽게 추가하였다. 배지 교체를 위해, 약 80%의 오래된 배지를 조심스럽게 제거하고 신선한 배지를 천천히 첨가했다. 1차 배양된 세포를 6-웰 플레이트에 플레이팅한 후 8-10 일 이내에 80% 컨플루언시에 도달하였다. 분할은 3000-7000 세포/cm², 최적으로는 약 5000 세포/cm²의 최종 농도에 대해 수행하였다. 6-웰 플레이트에서 대형 배양 플레이트로 옮긴 후, 더 이상 항생제가 보충되지 않은 성장 배지를 사용했다.

세포 형태, 세포 수 및 섬유 형성은 모든 계대에서 평가하였다.

다음 프로토콜을 hMPC의 확장을 위한 hMPC-성장 배지의 제조에 사용하였다:

다음 물질들을 사용하였다:

- 4℃에서 보관된, 500ml 병의 DMEM/F12 양액 혼합물 (1:1, Gibco);

- 500μl의 hbFGF (Sigma, -80℃에서 500 μl 중의 500ng) (최종 농도 1ng/ml);

- 1 ml 의 hEGF (-80℃에서 5 μg/ml) (최종 농도 10 ng/ml);

- 500 μl의 인간 인슐린 (Sigma, -20℃에서 500 μl 중의 5mg) (최종 농도 10 μg/ml);

- 1.2 ml 의 덱사메타손(Sigma, -20℃에서 200 μl 중의 1.2 ml) (최종농도 0.4 μg/ml);

- 50 ml 여과된 인간 혈소판 용해물 (hPL) (BG 0 (혈소판) /AB (혈장)) (최종농도 10%);

- DMEM 에 첨가하기 전에, 여과된 hPL에 첨가된, 600 μl 헤파린-Na (Braun, 3511014) (25'000 IU/5 ml) (성장 배지 ml 당 헤파린-Na의 최종농도 6 IU);

- Pen/Strep (-20℃에서 10'000 units/ml 페니실린 및 10'000 μg/ml 스트렙토마이신, 6 ml), 계대 0 에 사용된 배지에서만 첨가됨 (최종농도 1%)

그 결과, hMPC의 확장 및 분화를 위해 콜라겐-코팅된 디쉬와 정의된 배지만을 사용하는 배양 기술을 확립하였다. 세포 특성화는 hMPC 표현형이 이들 조건 하에서 유지될 수 있고 세포가 시험관 내 및 생체 내에서 근섬유를 형성하는 능력을 가지고 있음을 입증했다. 이 방법을 사용하면 조직 공학 응용을 위한 충분한 수의 세포를 3-4 주 내에 성장시킬 수 있다.

세포 조성물의 제조:

주입 전에, 세포 샘플을 유세포 분석으로 분석하고 생존력 테스트를 수행하여 품질과 순도를 조사한다. 최소한 8천만 mMPC를 80% 이상의 생존율, 즉 약 6,400만 개의 생존 세포를 최종 농도 2천만 세포/ml로 전달하기 위해, 배양된 세포 (약 8천만 개)를 저비율 콜라겐 용액 4ml에, 즉 3-4mg/ml로 현탁시켜, 최종 산물 내 콜라겐의 최종 농도가 약 2mg/ml 가 되었다. 캐리어 매트릭스의 경우, 저농도의 콜라겐만 필요한다. 이것은 더 높은 콜라겐 농도를 사용한 이전 연구들과 비교하여 좋은 단기 결과로 이어진다.

콜라겐 용액의 제조를 위해 콜라겐을 0.01M HCl에 혼합하였다. 그후 용액이 노란색으로 변할 때까지 MEM을 pH 지시약으로 첨가했다. 그런 다음 용액이 분홍색으로 변할 때까지, 즉 pH 6-8의 생리적 pH 값에 도달할 때까지 NaHCO₃를 적가하였다. 그후 콜라겐 용액을 최종 세포 펠릿 (계대 2 후 수확)으로 옮기고, 위아래로 피펫 팅하여 균질화하고, 50ml 튜브 안으로 옮기고, 냉각 장치에서 냉각시켰다.

콜라겐 용액 내 hMPC의 최종 조성물의 최적의 최대 보관 수명(shelf-life)은 제한적이다. 최종 조성물의 안정성은 2-8℃에서 최대 24 시간이다. 따라서, 최종 조성물은 80% 이상의 세포 생존력을 유지하기 위해, 제조후 가능한 한 빨리, 바람직하게는 4 시간 이내에, 늦어도 24 시간 이내에 투여되어야 한다.

10ml 시린지에 담긴 최종 제품은 온도 측정 장치로 제어되는 5℃(+/- 3℃)의 상자에 넣어 연구 장소로 운반된다. 수술실에서, 최종 제품은 주입 전에 부드럽게 혼합된다.

hMPC-조성물의 주입:

hMPC를 사용한 SUI 치료는 SUI 병력이 있는 (특정 제외 기준에 따른) 저위험 성인 여성 환자의 손상된 괄약근 근육으로 제한된다.

여성 환자의 골반저에 표준화된 주입를 허용하기 위해, 초음파 유도(ultrasound guidance)하에 세포를 주입한다.

초음파 탐침은 질을 통과하여 배치되고 튜브와 단방향 시린지로 구성된 가이드 도구를 요도에 배치한다. hMPC-콜라겐 조성물의 8-12 분취량을 골반저에 주입하되 총 4ml의 조성물을 초과하지 않는다.

주입될 세포 샘플은, 섬유 형성 분석 및 유세포 분석을 위해 배양되어 섬유 형성 및 근원성 마커 발현 능력을 확인할 수 있다.

비교 목적으로, 티엘(Thiel) 고정된 인간 해부용 사체의 요도 괄약근으로의 유체 고분자 화합물 (적용후 경화되는 액체 고분자)의 질경유 초음파 (BK 8848, BK Medical, 덴마크)-유도 주입 및 다양한 주입 옵션 (요도 경유(transurethral) 및 질 경유(transvaginal))을 평가하였다. 그후 괄약근을 MRI 및 전체 마운트 섹션의 조직학으로 분석했다. 두 방법 모두 횡문괄약근(rhabdosphincter)을 히팅하는(hitting) 데 있어서 우수하고 비슷한 정확도를 보여 주었다.

그러나 요도경유 접근법은 주로 핸들링과 짧은 학습 곡선으로 인해 단순성 측면에서 우수한 것으로 보인다.

전자기 자극:

골반저 운동을 위한 물리치료는 전자기 의자 자극 (BioCon-2000)에 의해 수행하였다. 최대 출력에서 유도 전기장의 강도는 자극 코일 표면에서 120V/m였다. 자극 코일 위 5cm에서 전장(field)은 22V/m로 측정되었다.

동물 모델의 근육 분화 및 기능 분석:

골격근 재생에 대한 MPC의 효과를 연구하기 위해, 여러 동물 모델을 사용하였다: 마우스 (이소성(ectopic) 근육 형성을 위한 피하 세포 주입 (도 10) 및 대퇴사두근 및 경골 뒷다리 근육의 압궤 손상 모델 (데이터로 표시되지 않음)); 렛트 (방광 출구 폐쇄 모델); 개 (외부 괄약근의 미세외과수술 절개에 의한 요도 괄약근 기능부전 모델) (도 13 및 14).

누드 마우스에 hMPC를 주입한 후 조직 공학 골격근에서 섬유 형성을 특성화하기 위해, 배양된 1차 hMPC를 누드 마우스에 피하 주입했다. 주입 후 3, 7, 14 및 28 일 후에 형성된 조직을 수확하고 H&E 염색으로 분석하였다. 도 10에서 나타난 바와 같이, 주입된 hMPC에 의한 섬유 형성 능력의 증가가, 14 일째에 조직학적으로 성숙한 근육 조직에서 4주 이내에 관찰되었다. 면역조직형광 염색으로 골격근 마커 알파-액티닌, MyHC 및 데스민의 발현을 확인하였다 (데이터로 표시되지 않음).

MRI에 의한 세포 분화의 비-침습적 시각화의 예로서, hMPC를 MRI로 추적되고 T2*MRI로 발달중인 근육 조직을 추적했다 (도 11 및 12). 도 11은 MRI에 의한 이식된 MPC의 추적을 보여준다. 비표지 (대조군) 및 400 ㎍/ml의 초상자성 산화철 (SPIO)로 표지된 MPC를 누드 마우스의 등에 피하 주입하였다. 마우스는 주입 후 4일째 및 1, 2, 및 4주 후에 MRI로 스캔하였다. 관심 영역의 T2-가중된 MRI 영상을 표시하였다. 주입된 세포는 화살표로 표시하였다. 도 12에서, 모든 측정 시점에 대한 T2*신호 감쇠 곡선을 나타내었다. 근육 전구체 세포의 골격근 섬유로의 성숙이 관찰되었으며, 이는 이완 및 확산 파라미터들의 감소 (MRI로 측정됨)와 관련이 있다. 중요한 것은, 분화 중에 이완 및 확산 파라미터들이 감소하여 성숙한 골격근 조직에 대한 값에 접근한 것으로, 이는 MRI 이완 및 확산 측정이 근육 분화 및 기능의 생체내 모니터링을 위한 적절한 바이오마커를 제공함을 시사한다.

도 13은 개 모델에서 괄약근 기능의 기능적 평가를 보여준다. 개 근육 전구 세포는 성공적이고 재현 가능하게 분리, 성장 및 확장되었다. A에서, 대표적인 요도 프로파일이 세포 처리 후 괄약근 부위의 괄약근 압력 증가를 나타낸다. N은 정상 대조군을 나타내고, D6은 6개월 시점에서 "손상만(damage only)" 대조군을 나타내고, M6은 6개월 시점에서 MPC 처리된 동물을 나타낸다. B에서, 그래프는 시간 경과에 따른 괄약근 압력을 보여준다. 세포가 주입된 동물은 괄약근 압력이 정상의 약 80%로 괄약근 기능의 상당한 기능 회복을 보인 반면, 대조군 동물 ("손상만")에서는 압력이 떨어지고 20%로 유지되었다 (p<0.025). 조직학적으로 이식된 세포는 생존하여 괄약근의 주입된 부위 내에 조직을 형성하고 새로운, 신경지배를 받는 근섬유(innervated muscle fiber)를 형성했다 (Eberli, D., et al., Muscle Precursor Cells for the Restoration of Irreversibly Damaged Sphincter Function. Cell Transplant, 2012 참조).

도 14는 6개월 시점의 개 괄약근 부위의 방사선 사진을 나타낸다. MPC 주입으로 치료 받은 동물은 정상적인 해부학적 괄약근 구조 (C의 화살표)와 방광 목 부위를 회복할 수 있었지만, 치료하지 않은 동물은 괄약근 부위 (B의 화살표)가 넓어져 해부학적 완전성의 손실을 나타 냈다. A는 손상되지 않은 정상 괄약근을 나타내고, B는 손상된 괄약근을 나타내고, C는 MPC로 치료한 손상된 괄약근을 나타낸다.

개에서의 결과는 자가 MPC가 비가역적으로 손상된 괄약근 기능을 회복할 수 있음을 보여주었다. 주입된 세포는 손상된 괄약근 기능 내에서 생존할 수 있고 성숙한 조직을 형성할 수 있었다. 이번 대규모 동물 연구는 괄약근 기능이 부족한 환자의 요도 괄약근 기능 회복을 위해 자가 근육 전구체 세포를 사용할 수 있음을 입증했다.

인간의 근육 세포 치료에 MPC를 성공적으로 적용하려면 분화 과정의 비침습적인 생체 내 모니터링 도구가 중요하다. MRI 이완 및 확산 측정은 근육 전구체 분화의 생체 내 모니터링을 위한 적절한 바이오마커를 제공한다.

Claims

골격근 유래의 인간 근육 전구체 세포 집단의 생성 방법으로서, 적어도 하기의 단계들을 포함하는 방법:
- 인간 환자의 골격근 생검에 의해 인간 조직 샘플을 수득하는 단계;
- 인간 조직 샘플에서 지방- 및/또는 힘줄- 및/또는 결합 조직을 외과적으로 제거하는 단계;
- 인간 조직 샘플을 분쇄(mincing)하고 효소로 분해하는 단계;
- 섬유아세포의 수를 감소시켜 인간 근육 전구체 세포 집단을 생성하는 단계;
- 인간 근육 전구체 세포를 콜라겐이 코팅된 디쉬에 정착시키는 단계;
- 적어도 하나의 계대 동안 세포 성장 배지에서 인간 근육 전구체 세포를 확장(expansion)시키는 단계.
제1항에 있어서, 골격근 생검시료가 가자미근(musculus soleus), 복직근(rectus abdominis), 대퇴사두근(quadriceps femoris) 및 외측광근(vastus lateralis)으로 이루어진 군에서 선택된 조직에서 얻어지며, 바람직하게는 가자미근(musculus soleus) 조직에서 얻어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
인간 근육 전구체 세포가 적어도 2 계대, 바람직하게는 3 또는 4 계대 동안 배양되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
인간 근육 전구체 세포를 소태아혈청이 없는 세포 성장 배지를 사용하여 확장시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
제4항에 있어서,
인간 근육 전구체 세포를 인간 혈소판 용해물, 바람직하게는 풀링되고 여과된 인간 혈소판 용해물을 포함하는 세포 성장 배지를 사용하여 확장시키고, 인간 혈소판 용해물은 바람직하게는 최종 농도 5-20%, 보다 바람직하게는 7-12%, 가장 바람직하게는 약 10%로 세포 성장 배지에 존재하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제5항에 있어서,
인간 근육 전구체 세포의 확장에 사용되는 세포 성장 배지가 항-응고인자, 바람직하게는 헤파린, 더욱 바람직하게는 헤파린-Na를, 바람직하게는 최종 농도 1-10 IU/m, 바람직하게는 2-6 IU/ml, 가장 바람직하게는 약 2 IU/ml로 포함하고, 상기 세포 성장 배지가 바람직하게는 하기의 성분들을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
- 양액(nutrient solution), 바람직하게 DMEM, 더 바람직하게 1:1 DMEM/F12 영양혼합물(nutrient mixture);
- hEGF 로서, 바람직하게는 최종 농도 5-20 ng/ml, 더 바람직하게는 약 10 ng/ml의 hEGF;
- hbFGF 로서, 바람직하게는 최종 농도 0.5-2 ng/ml, 더 바람직하게는 약 1 ng/ml의 hbFGF;
- 인슐린으로서, 바람직하게는 최종 농도 5-20 ㎍/ml, 더 바람직하게는 약 10 ㎍/ml의 인슐린;
- 덱사메타손으로서, 바람직하게는 최종 농도 0.2-0.8 ㎍/ml, 더 바람직하게는 약 0.4 ㎍/ml의 덱사메타손.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따라 생성된, 골격근 유래 인간 근육 전구체 세포 집단으로서,
바람직하게는 Pax7, 데스민(Desmin) 및 알파-액티닌을 발현하고, 바람직하게는 추가로 MyHC를 발현하는, 세포 집단.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 생성된, 의약으로 사용하기 위한 골격근 유래 인간 근육 전구체 세포 집단.
골격근 기능장애의 치료에 사용하기 위한 골격근 유래 인간 근육 전구체 세포 집단으로서,
바람직하게는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 생성된 것인, 세포 집단.
스트레스성 요실금의 치료에 사용하기 위한 골격근 유래 인간 근육 전구체 세포 집단으로서,
바람직하게는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 생성된 것인, 세포 집단.
골격근 기능장애의 치료에 사용하기 위한 골격근 유래 인간 근육 전구체 세포 집단의 생산을 위한 세포 성장 배지로서,
상기 세포 성장 배지는 소태아혈청을 포함하지 않는, 세포 성장 배지.
제11항에 있어서,
상기 세포 성장 배지가 인간 혈소판 용해물, 바람직하게는 풀링된 인간 혈소판 용해물을 함유하는, 세포 성장 배지.
제12항에 있어서,
상기 세포 성장 배지가 하기의 조성을 포함하는, 세포 성장 배지:
- 양액(nutrient solution), 바람직하게 DMEM, 더 바람직하게 1:1 DMEM/F12 영양혼합물(nutrient mixture);
- hEGF 로서, 바람직하게는 최종 농도5-20 ng/ml, 더 바람직하게는 약 10 ng/ml의 hEGF;
- hbFGF 로서, 바람직하게는 최종 농도 0.5-2 ng/ml, 더 바람직하게는 약 1 ng/ml의 hbFGF;
- 인슐린으로서, 바람직하게는 최종 농도 5-20 ㎍/ml, 더 바람직하게는 약 10 ㎍/ml의 인슐린;
- 덱사메타손으로서, 바람직하게는 최종 농도 0.2-0.8 ㎍/ml, 더 바람직하게는 약 0.4 ㎍/ml의 덱사메타손;
-헤파린으로서, 바람직하게는 최종 농도 1-10 IU/ml, 더 바람직하게는 2-6 IU/ml의 헤파린, 바람직하게는 헤파린-Na;
-여과된 인간 혈소판 용해물로서, 바람직하게는 최종 농도 5-20%, 더람직하게는 7-12%, 가장 바람직하게는 약 10%의 여과된 인간 혈소판 용해물.
제11항에 있어서,
적어도 하나의 계대에서 사용하기 위해, 바람직하게는 계대 0에서 사용하기 위해, 세포 성장 배지가 추가적으로 항생제를 함유하는 용액, 바람직하게는 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 용액을, 바람직하게는 약 1%의 최종 농도로 포함하는, 세포 성장 배지.
제13항에 있어서,
하기 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 성장 배지의 제조 방법:
- 양액(nutrient solution), 바람직하게 DMEM 용액, 더 바람직하게 1:1 DMEM/F12 영양혼합물(nutrient mixture)을 제공하는 단계;
- hEGF 로서, 바람직하게는 최종 농도5-20 ng/ml, 더 바람직하게는 약 10 ng/ml의 hEGF를 첨가하는 단계;
- hbFGF 로서, 바람직하게는 최종 농도 0.5-2 ng/ml, 더 바람직하게는 약 1 ng/ml의 hbFGF를 첨가하는 단계;
- 인슐린으로서, 바람직하게는 최종 농도 5-20 ㎍/ml, 더 바람직하게는 약 10 ㎍/ml의 인슐린, 바람직하게는 인간 인슐린을 첨가하는 단계;
- 인간 혈소판 용해물(hPL)과 항-응고인자의 혼합물을 제조하되, 바람직하게는, 혼합물을 양액에 첨가하기 전에 바람직하게는 최종 농도 5-20%의 hPL, 더 바람직하게는 약 10%의 hPL 및 최종 농도 1-10 IU/ml, 더 바람직하게는 2-6 IU/ml의 헤파린으로, 헤파린, 더 바람직하게는 헤파린-Na를 여과된 hPL에 첨가함으로써 제조하고, 인간 혈소판 용해물(hPL)과 헤파린의 혼합물을 양액에 첨가하는 단계;
- 덱사메타손으로서, 바람직하게는 최종 농도 0.2-0.8 ㎍/ml, 더 바람직하게는 약 0.4 ㎍/ml의 덱사메타손을 첨가하는 단계.
골격근 유래 인간 근육 전구체 세포 집단, 바람직하게는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따라 제조된 세포 집단을 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,
골격근 기원 유래 인간 근육 전구체 세포 집단을, 바람직하게는 적어도 80% 생존율을 갖는 1천만 내지 3천만 세포/ml의 농도로, 콜라겐 용액에 현탁하는 것을 특징으로 하고, 상기 콜라겐은 I형 콜라겐이고, 상기 콜라겐의 농도는 바람직하게는 1-4 mg/ml, 더 바람직하게는 약 2mg/ml인, 방법.
콜라겐 용액에 현탁된 골격근 유래 인간 근육 전구체 세포 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 제16항에 따른 방법에 의해 제조된 것인, 조성물.
콜라겐 용액에 현탁된 골격근 유래 인간 근육 전구체 세포 집단을 포함하는 조성물로서, 바람직하게는 적어도 80% 생존율을 갖는 1천만 내지 3천만 세포/ml의 농도로 현탁되고, 상기 콜라겐 용액은 바람직하게는 I형 콜라겐, 바람직하게는 돼지, 소 또는 인간 기원의 I형 콜라겐을 함유하고, 상기 조성물 내 콜라겐의 농도는 바람직하게는 1-4 mg/ml, 바람직하게는 약 2 mg/ml인, 조성물.
제18항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 조성물.
제18항에 있어서,
골격근 기능장애의 치료, 특히 외부 요도 괄약근의 결함을 치료하는 의약으로 사용하기 위한 조성물.