BR112020022667A2 - método para gerar uma população de células precursoras do músculo humano derivadas do músculo esquelético, população de células precursoras do músculo humano derivado do músculo esquelético, meio de crescimento celular para produção de uma população de células precursoras do músculo humano, método para a produção de um meio de crescimento celular, método para a produção de uma composição e composição - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um método para gerar uma população de células precursoras do músculo humano derivadas do músculo esquelético. Para este propósito, um meio de crescimento livre de FBAS especializado é usado.

Description

“MÉTODO PARA GERAR UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS PRECURSORAS DO MÚSCULO HUMANO DERIVADAS DO MÚSCULO ESQUELÉTICO, POPULAÇÃO DE

CÉLULAS PRECURSORAS DO MÚSCULO HUMANO DERIVADO DO MÚSCULO ESQUELÉTICO, MEIO DE CRESCIMENTO CELULAR PARA PRODUÇÃO DE UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS PRECURSORAS DO MÚSCULO HUMANO, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM MEIO DE CRESCIMENTO CELULAR, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO E COMPOSIÇÃO” Campo técnico

[0001] A presente invenção refere-se a um método para a geração livre de xeno de uma população das células precursores do músculo humano (hMPC), uma composição compreendendo estas hMPCs, e o uso destes hMPCs na produção de uma composição para o tratamento da disfunção do músculo esquelético, especialmente da incontinência urinária por stress. Estado da técnica

[0002] A incontinência urinária, a perda involuntária de urina, é uma questão médica principal com aproximadamente metade da população feminina afetada acima dos 45 anos e 17% dos homens acima dos 70 anos de idade. A continência e a micturição envolvem um balanço entre o fechamento uretral e atividade do músculo detrusor. A continência é conseguida por uma interação complexa do esfíncter uretral, posição do pescoço da bexiga, músculo liso uretral, integridade do nervo, plexo vascular e o suporte do tecido envolvente.

[0003] Existem diferentes tipos de incontinência urinária, tais como stress e incontinência de urgência. A incontinência urinária por stress (SUI) é a perda de pequenas quantidades de urina associada com tosse, riso, espirro, exercícios ou outros movimentos que aumentam a pressão intra-abdominal e assim, aumentam a pressão sobre a bexiga. O esfíncter uretral estriado externo, que é feito do músculo esquelético e, portanto, está sob controle voluntário do sistema nervoso somático é, na sua maioria, responsável para prevenção de SUI. Os danos para o esfíncter uretral externo ocorrem principalmente durante o parto, tratamentos cirúrgicos ou como um efeito da idade, SUI é uma doença que afeta acima de 200 milhões de pessoas no mundo e é duas vezes mais comum em mulheres do que em homens, diminuindo a qualidade de vida de pacientes devido às atividades diárias limitadas, sensação desconfortável, odor e infecções causados por fraldas úmidas. Os custos ocorridos nos cuidados de saúde são significantes.

[0004] As opções de tratamento atuais de SUI incluem principalmente a terapia não-cirúrgica (treinamento de bexiga, modificações na dieta), terapia com fármacos e terapia cirúrgica. Estas terapias oferecem apenas alívio por pequenos períodos e seu sucesso completo é frequentemente limitado por complicações (cirurgias invasivas, danos nos tecidos ao redor, conduzindo as taxas de infecção urinárias aumentadas) ou efeitos colaterais (fármacos, danos nos tecidos por biomateriais não-degradáveis, etc.). Os avanços nas abordagens das terapias celulares para o tratamento de incontinência urinária mostram resultados promissores em relação a correção da etiologia de base usando células próprias do paciente. Os avanços recentes em terapias a base de células tem provido uma variedade de soluções para restaurar a função do esfíncter danificado em pacientes com SUI.

[0005] A US 5,130,141 descreve o uso de mioblastos para o tratamento de fraqueza muscular em camundongos. Uma abordagem mais avançada para regeneração muscular é por incorporação de mioblastos, com ou sem o fator de crescimento exógeno dentro dos géis tridimensional de membrana mínima reconstituída (Barbero et al., “Growth fator suplemented matrigel improves ectopic skeletal muscle formation – a cell therapy approach, J. Cell Physiol. 2001 Feb; 186(2): 183-92). Nestes protocolos, uma mistura de proteína gelatinosa comercialmente disponível secretada pelas células de sarcoma de murinho (Matrigel®) foi usado, que contém uma concentração alta de vários fatores de crescimento para promover a proliferação e diferenciação de mioblastos.

[0006] O documento US 2014/0227233 A1 descreve um método para o tratamento de SUI pela injeção de uma “cola regenerativa” compreendendo uma combinação de material comercialmente disponível (incluindo colas biocompatíveis, cola fibrina (de fibrinogênio humano e trombina humana) ou géis biocompatíveis) com células tronco mesenquimal a partir de medula óssea ou tecido adiposo. Esta cola foi injetada no sítio de um dano, ausência ou ligamento pubo-uretral danificado para o propósito de substituição.

[0007] WO 2016/138289 A1 descreve o uso potencial de células precursores do músculo liso para o tratamento da disfunção do músculo liso.

[0008] O uso de agentes de intumescimento injetável tais como Teflon, colágeno bovino, partículas de silicone e contas de carbono tem sucesso em resultados a curto prazo. Entretanto, foi reportado que estes agentes de intumescimento podem causar inflamação crônica, resposta de célula gigante do corpo exógeno, abcesso periuretral, erosão da uretra, obstrução do trato urinário inferior com a retenção urinária resultante, e migração para órgãos internos e embolia pulmonar (Kiilholma P. et. Al., Complications of Teflon injections for stress urinary incontinence, Neurourol. Urodyn 12:131-137 (1993)).

[0009] O transplante de MPCs foi investigado como um tratamento para distúrbio muscular genético ou adquirido. MPCs, em sua aquiescência, estágio inativo como células satélite, reside debaixo da lâmina basal em torno das fibras musculares. Estas células tornam-se ativadas durante trauma ou danos e participam em regeneração do tecido por migração em direção a área danificada, proliferação, e fusão uma com a outra para formar miotubos, que finalmente maturam em miofibras. A maioria das MPCs é comprometida para a linhagem celular miogênica e são, portanto, mais adequados para a bioengenharia do músculo esquelético. MPCs tem grande potencial de crescimento e são facilmente expandidas em cultura. Após a formação de miotubo, estas células tornam-se pós-mitótica e iniciam para diferenciar em fibras maturas, inibindo o crescimento de tecido não controlado in vivo. O potencial uso de MPCs cultivados injetáveis par ao tratamento de SUI foi investigado em modelos de roedores e cães e tem o potencial de tornar-se o primeiro tratamento para restaurar a função do músculo esfíncter (Yokohama et al., Autologous Primary Muscle-Derived Cells Transfer into the Lower Urinary Tract; Tissue Engineering, 2001, 7(4), p. 395-404; Yiou et. Al., Restoration of Functional Motor Units in a Rat Modelo f Sphincter Injury by Muscle Precursor Cell Autografts, Transplantation. 2003, 76(7): p.1053-60; Eberli et al., A canine model of irreversible urethral sphincter insuficiency. BJU Int., 2009, 103(2): p. 2488-53). Entretanto, estes modelos animais não refletem suficientemente as condições vistas em pacientes humanos.

[0010] As células-tronco derivadas dos músculos e injeções de mioblasto autólogas foram as opções mais investigadas em humanos até agora. Entretanto, apesar das várias tentativas no passado, as terapias regenerativas do esfíncter uretral não foram alcançadas na clínica e não são ainda parte da prática urológica diária.

[0011] Devido às preocupações em relação ao soro bovino fetal (FBS), sua substituição é requerida para facilitar a transferência desta terapia dentro de uma configuração clínica. Até agora, FBS foi o meio padrão suplementado e a fonte de fatores de crescimento para a cultura celular e engenharia de tecido. O uso de FBS durante a expansão da cultura in vitro das células progenitoras podem representar um risco potencial devido as proteínas e macromoléculas. A internalização destas macromoléculas nas células-tronco podem transmitir doenças viral-W-prion. Além disso, as macromoléculas servem como substratos antigênicos sobre as células transplantadas e causam reações imunológicas. Devido aos riscos de xeno-imunização, transmissão de patógenos, e questões éticas associadas com coleção de FBS, alternativas humanas apropriadas para a fabricação de produtos terapêuticos de células clínicas são urgentemente necessárias. O FBS não é, portanto desejável devido a segurança e outras questões para aplicação clínica. Em alguns estudos de busca, a anafilaxia e outras reações alérgicas foram definidas em pacientes transplantados com as células suplementadas com FBS.

[0012] Como qualquer fármaco aplicado em uma abordagem terapêutica, os produtos celulares também necessitam atender os requerimentos regulatórios. Seus processos de produção necessitam seguir boa prática de fabricação (GMP) de modo a permitir uma aplicação segura em pacientes. Portanto, a remoção de qualquer suplemento animal a partir do meio de cultura celular representa uma etapa importante em relação a transferência clínica de uma terapia de célula tronco do músculo em pacientes sofrendo de SUI, evitando assim, as reações colaterais para proteínas xenogênicas. Esta mudança em metodologia de cultura celular devem ser implementada sem afetar a característica principal de hMPCs, ou seja, sua capacidade para formar o tecido do musculo contratante.

[0013] As alternativas possíveis para FBS são meios complementados com soro humano, derivados de plaqueta humana, soro do sangue do cordão umbilical alogênico ou meio quimicamente definido.

[0014] O lisado de plaqueta humana (hPL) – contendo médio de cultura celular, ou meio de crescimento, respectivamente, foi descrito como um possível substituto para o meio contendo FBS para expansão em escala clínica das células do estroma mesenquimal ou para expandir células tronco mesenquimal humana para aplicações terapêuticas (Schallmoser et al., Human platelet lysate can replace fetal bovine sérum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion 2007, 47: 1436-1446; Castegnaro et. Al. Effect of Platelet Lysate on the Functional and Molecular Characteristics of Mesenchymal Stem Cells Isolated from Adipose Tissue. Curr. Stem Cell Res. Ther. 201 1; 6(2):105- 14). Entretanto, esta mudança no soro pode não ser tolerada por todos os tipos de célula ou pode afetar a funcionalidade de algumas células cultivadas. Um estudo prévio obtido hPL pode não ser uma substituição adequada para FBS no cultivo de células do músculo esquelético humano e para diferenciar as células dentro dos miotubos (Kramer et al., Effect of serum replacement with plysate on cell growth and metabolismo in primary cultures of human muscle skeletal. Cytotechnology 48, 89, 2005).

[0015] A proliferação celular é dependente do meio e a mera adição de fatores de crescimento não é suficiente para sustentar a expansão de células.

[0016] É portanto um objetivo da invenção prover uma alternativa para FBS em meio de cultura celular que garanta a proliferação de hMPCs e capacite a formação eficiente de músculos construídos de tecido de contração in vivo, após implante. É portanto um objeto da presente invenção, para o propósito ético e de segurança, desenvolver um novo protocolo compatível de GMP compatível livre de xeno (ou livre de componente animal) e, portanto seguro para cultivo e expansão de hMPCs, ou seja, para a produção de uma composição compreendendo uma população de hMPCs para uso em aplicações terapêuticas, especialmente para o tratamento regenerativo de SUI em pacientes fêmeas humanas.

[0017] Finalmente, a presente invenção tem por objetivo prover um método melhorado de tratamento para disfunção do músculo esquelético.

[0018] Neuromodulação e exercício: treinamento foi proposto como um possível tratamento de músculo esquelético deficiente. Em humanos, uma mola magnética enrolada ao redor do: quadríceps foi demonstrado para induzir o esforço do músculo, fatiga e treinamento. Um dispositivo similar para exercitar o assoalho pélvico foi designado, no qual pulsos magnéticos convergiram em uma mola colocada dentro de um assento de cadeira (Chandi, et al., Functional extracorporeal magnética stimulation as a treatment for female urinary incontinence: “the chair”. BJU INt. 2004, 93(4): p. 539-42).

[0019] O estimulo eletromagnético neuromuscular (NMES), que induz a contração do músculo foi proposto como uma modalidade terapêutica para as doenças do músculo esquelético. Blaganje et al., descreveu em 2012 o sucesso do tratamento de SUI por injeções de mioblasto autólogo guiado por ultrassom dentro do esfíncter uretral externo, precedido e seguido por estímulo elétrico. É, portanto, um objetivo adicional da invenção prover um método otimizado de tratamento de SUI em pacientes fêmeas humanas, usando células e estímulos. Sumário da invenção

[0020] A aplicação de células precursoras de músculo humano (hMPC) em construção de tecido é uma abordagem promissora para o tratamento de incontinência urinária por stress (SUI) através da regeneração do músculo contráctil. Para este propósito, um método para geração de uma composição par auso como um medicamento na referida aplicação terapêutica foi sugerida. A composição compreende uma população de hMPCs derivada do músculo esquelético (ou células de regeneração celular), a geração das quais também é provida como um método inventivo.

[0021] A invenção, de acordo com um primeiro aspecto, refere-se portanto a um método para geração de uma população autóloga de células precursoras do músculo humano derivado do músculo esquelético, o método compreendendo pelo menos as etapas as seguir:

[0022] Primeiro, uma amostra de tecido humano é obtida através de uma biopsia do músculo esquelético de um paciente humano. Preferivelmente, uma biópsia do músculo esquelético é obtida a partir de uma paciente fêmea humana, entretanto, também biopsias de músculos esqueléticos de pacientes machos, por exemplo, para tratar possíveis SUI após prostatectomia, podem ser úteis. Preferivelmente, a biópsia do músculo esquelético é tomada de um tecido selecionado a partir do grupo consistindo de: músculo solear, músculo reto do abdome, quadríceps femoral, vasto lateral.

[0023] O músculo solear (da perna esquerda ou direita) é escolhido para biópsia devido a sua similaridade em composição com o músculo do esfíncter e sua fácil acessibilidade. Como uma alternativa, por exemplo, o músculo vasto lateral pode ser usado. No caso de transporte da biópsia é necessário após a remoção cirúrgica, que a biópsia possa ser transportada em um meio de transporte contendo um agente antibiótico e PBS.

[0024] Após lavagem e desinfecção, a biópsia do músculo é cirurgicamente limpa de remanescentes de gordura, e/ou tendão e/ou tecido conjuntivo/conectivo, então cortada e digerida, preferivelmente, por uma mistura contendo colagenase de dispase. Preferivelmente, uma mistura de colagenase tipo I 0,2% (p/v) e dispase 0,4% (p/v) é usada. A reação enzimática é terminada, preferivelmente, com um meio de cultura celular, ou seja, meio de crescimento contendo 10% de lisado de plaqueta humana (hPL), preferivelmente 10% de lisado de plaqueta humana agrupada (phPL). Subsequentemente, fibras individuais são liberadas por pipetagem rigorosa e filtradas através de um filtro, preferivelmente, com um tamanho de poro de 10 pm. Após centrifugação, a pelota é ressuspensa em meio de crescimento suplementado com 1% de Penicilina/Estreptomicina (suplementada apenas para essa passagem na etapa 0) e transferidas dentro de discos de 35 mm (6-poços) revestidos com uma proteína de matriz extracelular, tal como colágeno ou fibronectina, preferivelmente, colágeno do tipo I (preferivelmente, 1 mg/ml).

[0025] Após digestão, após 24 horas, o hMPCs não-aderidos contido no sobrenadante é re-plaqueado em discos revestidos com colágeno do tipo I, de modo a reduzir o número de contaminantes de fibroblastos, resultando assim, em uma população de células precursoras do músculo humano. Estas células precursoras do músculo humano são deixadas assentar em um disco revestido com colágeno, e então expandidas em meio de crescimento por pelo menos uma passagem, preferivelmente, pelo menos duas passagens, mais preferivelmente, por um total de 3 ou4 passagens.

[0026] Um meio de cultura celular preferido, ou seja, meio de crescimento é livre de soro bovino fetal (FBS). De acordo com uma concretização preferida da invenção, o meio de crescimento é composto como descrito abaixo.

[0027] Preferivelmente, os hMPCs são expandidos usando um meio de crescimento compreendendo hPL, preferivelmente, phPL, que foram preferivelmente filtrados. Um tipo preferido de phPL é BG O(plaquetas)/AB(plasma). Preferivelmente, a concentração final de phPL no meio de crescimento é de 5-20%, mais preferivelmente, 7-12%, mais preferivelmente cerca de 10% (porcentagem em volume).

[0028] Um meio de crescimento especialmente vantajoso usado para expansão de células precursoras do músculo humano compreende, adicionalmente, um fator anti-coagulação, preferivelmente heparina. Para esse propósito, por exemplo, Hparina-Na (heparina-sódio) (25’000 IU/5 ml) pode ser usado. A heparina é, preferivelmente, adicionada ao phPL filtrado formando, assim, uma mistura, antes da adição da referida mistura à solução de nutriente do meio de crescimento para uma concentração final preferida de 1-10 IU por mol do meio de crescimento, mais preferivelmente, 2-6 IU/ml, mais preferivelmente, cerca de 2 IU/ml. Como uma alternativa, outras substâncias de prevenção de coagulação (por exemplo, EDTA) podem ser usadas. No caso de uso de phPL reduzido de fibrinogênio, nenhum anticoagulante deve ser adicionado, uma vez que nenhum fator de coagulação ativo estão presentes de forma alguma.

[0029] O meio de crescimento adicionalmente preferido, além de hPL ou phPL, respectivamente, e o fator anti-coagulação, compreende os ingredientes a seguir: - uma solução nutriente, preferivelmente, meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), mais preferivelmente, uma mistura de nutrientes 1:1 de DMEM/F12 (mistura de 1:1 de DMEM e F-12 de Flam); - um fator de crescimento epidérmico (hEGF), preferivelmente adicionado à solução nutriente para resultar em uma concentração final de 2-20 ng/ml, mais preferivelmente de cerca de 10 ng/ml; - ftor de crescimento de fibroblasto básico humano, (hbFGF), preferivelmente adicionado à solução nutriente para resultar em uma concentração final de 0,5-2 ng/ml, mais preferivelmente, de cerca de 1 ng/ml; - insulina, preferivelmente insulina humana, preferivelmente,

adicionada à solução nutriente para resultar em uma concentração final de 5-20 pg/ml, mais preferivelmente, de cerca de 10 µg/ml; - dexametasona, preferivelmente adicionada à solução nutriente para resultar em uma concentração final de 0,2-0,8 pg/ml, mais preferivelmente de cerca de 0,4 pg/ml.

[0030] As porcentagens indicadas para a concentração final são calculadas em porcentagem em volume da solução nutriente, entretanto, para o propósito de simplificação, um volume final/total de 500 ml da solução nutriente foi usado para o cálculo (x volume por cada 100 ml da solução nutriente), e não a composição do meio de crescimento/cultura (que excede levemente 550 ml devido à adição do phPL). Além disso, as doses de heparina não indicada em grama, mas em unidades internacionais (IU). Uma unidade previne a coagulação de 1 ml de plasma compreendendo citrato após a adição de CaCl2 a 37°C, durante o intervalo de tempo de uma hora.

[0031] A presente invenção refere-se ainda a uma população de células precursoras do músculo humano derivadas do músculo esquelético (hMPC) geradas em um método de acordo com o método descrito acima. Preferivelmente, o padrão de expressão da proteína da população de hMPC derivada do músculo esquelético é, preferivelmente, como a seguir: Pax7 (preferivelmente, pelo menos 60%), Desmin (preferivelmente pelo menos 60%), MyHC (preferivelmente cerca de 30-50%), e alfa-actinina (preferivelmente, pelo menos 50%, mais preferivelmente, pelo menos 60%). As células expressam preferivelmente menos que 15% de CD34, servindo como um controle negativo. Como tipicamente usado nem análise de citometria de fluxo, as porcentagens são “percentual de célula positiva” que é uma medida independente da contagem do número de células que são fluorescentes, ou seja, a porcentagem indicada do número total de células que expressam a proteína em questão.

[0032] A população inventiva de hMPC derivada do músculo esquelético pode ser usada como um medicamento, especialmente para tratamento da disfunção do músculo esquelético, tal como, por exemplo, incontinência urinária por stress (SUI).

[0033] Além disso, a invenção provê uma composição vantajosa de um meio de cultura de célula livre de FBS ou meio de crescimento para a geração/produção da referida população de hMPCs para o tratamento de disfunção do músculo esquelético. O meio de crescimento inventivo compreende, preferivelmente, a composição descrita acima.

[0034] De acordo com a concretização preferida, o meio de crescimento celular, entretanto, apenas para a passagem 0, compreende ainda uma solução contendo um agente antibiótico, preferivelmente, contendo penicilina e estreptomicina, preferivelmente, em uma concentração final de cerca de 1% (Pen/Estrep: 10000 unidades/ml de penicilina e 10000 mg/ml de estreptomicina em um tampão citrato 1QmM (para estabilidade pFI) a 20°C).

[0035] O meio de crescimento celular de acordo com a invenção, como mencionado acima, preferivelmente é preparada pelo transporte de etapas a seguir: - prover uma solução de nutriente, preferivelmente, solução DMEM, mais preferivelmente uma mistura de nutriente 1:1 de DMEM/F12; - adicionar hEGF, preferivelmente, de modo que alcance uma concentração final de cerca de 10 ng/ml na solução nutriente;

- adição de hbFGF, preferivelmente de modo que ela alcance uma concentração final de cerca de 1 ng/ml; - adição de insulina, preferivelmente de insulina humana, preferivelmente de modo que ela alcance uma concentração final de 5-20 pg/ml, mais preferivelmente de cerca de 10 pg/ml; - preparação de uma mistura de lisado de plaqueta humana com um fator de anti-coagulação, preferivelmente heparina, mais preferivelmente Heparina-Na, preferivelmente pela adição de heparina, preferivelmente Heparina-Na para o hPL filtrado antes da adição da mistura para a solução de nutriente (DMEM), preferivelmente de modo que ela alcance uma concentração final de 5-20% de phPL, preferivelmente uma concentração final de 7-12% de phPL, mais preferivelmente, uma concentração final de cerca de 10% de phPL, sendo que preferivelmente a heparina alcança uma concentração final de 1-10 IU/ml, mais preferivelmente de 2-6 IU/ml, mais preferivelmente 2 IU/ml de heparina, seguido pela adição da mistura de phPL e heparina para solução de nutriente; - adição de dexametasona, preferivelmente de modo que ela alcance uma concentração final de 0,2-0,8 µg/ml, mais preferivelmente cerca de 0,4 pg/ml.

[0036] A presente invenção provê ainda uma composição compreendendo uma população de hMPCs derivada do músculo esquelético suspenso em uma solução de colágeno como uma matriz de transporte. A referida composição é apropriada para uso no tratamento da disfunção do músculo esquelético.

[0037] A invenção atual provê ainda um método para a produção de tal composição compreendendo uma população de hMPCs derivadas do músculo esquelético, sendo que a população de hMPCs é, preferivelmente, preparada de acordo com o método descrito acima. Para a produção de uma composição que pode ser usado no tratamento da disfunção do músculo esquelético, a população das células dos precursores do músculo humano é suspenso em uma solução de colágeno de baixa percentagem, preferivelmente, de um 0,5-4 mg/ml, mais preferivelmente, 1-2 mg/ml, preferivelmente, em uma concentração de 10-40 milhões de células/ml da solução de colágeno, preferivelmente de 20- 30 milhões de células/ml da solução de colágeno. Vantajosamente, a solução de colágeno contém, preferivelmente, colágeno do tipo I, preferivelmente de porcos, bovinos ou de origem humana.

[0038] A contagem da célula alvo para injeção dentro de cada paciente é, preferivelmente, na faixa de 60-100 milhões de células totais. Antes da injeção, a análise da qualidade e pureza são realizadas.

[0039] Para liberar um mínimo preferido de 80 milhões de hMPCs com pelo menos 80% de viabilidade, em uma concentração final de 20 milhões de células/ml, as células cultivadas (80 milhões) são suspensas em 4 ml de uma solução de colágeno. O produto final é, preferivelmente, transportada em uma seringa de 10 ml em uma caixa a 5°C (+/- 3°C) controlado por uma temperatura do dispositivo de medida. Em uma temperatura de cirurgia, o produto final é, preferivelmente, gentilmente misturado antes da injeção.

[0040] Por injeção da composição descrita acima dentro de um paciente, preferivelmente, um paciente humano, preferivelmente um paciente fêmea, mais preferivelmente, dentro do mesmo paciente humano fêmea a partir de quem a biópsia do músculo foi tomada, é possível regenerar o tecido do músculo esquelético no paciente. Em outras palavras, a população de hMPC de acordo com a presente invenção pode ser usada na fabricação de um medicamento para a disfunção do músculo esquelético em um paciente humano.

[0041] Um objetivo adicional da invenção é método para a disfunção do músculo esquelético, especialmente um defeito do músculo do esfíncter uretral externo, e/ou de regeneração do tecido do músculo esquelético em um paciente humano, usando a composição de acordo com a invenção como descrito acima. Dito método de tratamento compreende pelo menos as etapas a seguir: - prover uma composição compreendendo uma população de células do precursor do músculo humano derivado do músculo esquelético suspenso em uma solução de colágeno, sendo que a composição é, preferivelmente, de acordo com o método descrito acima; - injetar a composição dentro do músculo esfíncter urinário de um paciente humano, preferivelmente, um paciente fêmea humano, preferivelmente, sob guia de ultrassom; - sendo que após a injeção da composição, a piso pélvico do paciente humano, preferivelmente, é submetido ao estímulo eletromagnético neuromuscular (NMES).

[0042] Portanto, o método acima mencionado de tratamento pode ser usado para tratar a incontinência urinária por stress, o que entre outras coisas, podem ser causada por um defeito do músculo de esfíncter uretral externo.

[0043] Para permitir as injeções padronizadas dentro do piso pélvico dos pacientes humanos, preferivelmente pacientes humanos, as células são injetadas sob guia de ultrassom. Preferivelmente, de 8-12 alíquotas são injetadas dentro do peso pélvico, sendo que preferivelmente, uma quantidade total de 4 ml não é excedido.

[0044] O tratamento NMES após a injeção da suspensão celular suporta a regeneração dos músculos e nervos por ativação transversal do músculo-nervo e induz a maturação das junções neuromusculares. Este tratamento não-invasivo, que pode ser aplicado ao assoalho pélvico por uma cadeira contendo uma mola eletromagnético largo em seu assento (tal como a cadeira magnética especializada “BioCon-2000”), pode suportar uma formação sustentada de tecido do músculo funcional.

[0045] O estímulo eletromagnético do assoalho pélvico induz regeneração controlada do músculo, despolarização de nervos adjacentes e contração dos músculos. O estímulo fisiológico do campo magnético pulsado depende de algumas características de desenho especial que permite um campo altamente focado e um gradiente muito acentuado de mudança na borda avançada do campo. Estas características produzem um campo magnético de pulso rápido que é rapidamente ajustável na frequência e resistência. Para efeitos clínicos, não existe vantagem na remoção do coágulo externo do paciente. A resistência do campo elétrico induzido em saída máxima é 120 V/m na superfície da mola de estímulo e esta diminuição exponencial com distância da mola de estímulo. Em 5 cm acima da mola de estímulo, as medidas de campo de 22 V/m.

[0046] Como os pulsos de campo magnéticos, o fluxo induz pequenas correntes em turbilhão para fluir nos tecidos por geração do campo magnético contendo o pulso. Estas correntes irão induzir despolarização dos nervos axônicos, e existirá uma propagação do impulso nervoso que irá viajar em ambas as direções, proximal e distal. Se ele é um nervo axon motor terminal, o impulso de propagação viajará para as placas finais motoras e causam a liberação obrigatória de acetilcolina, e existirá a despolarização das fibras do músculo correspondente e contração daquelas fibras. Como o fluxo magnético é regulado, a taxa de contração das fibras do músculo pode ser modulada dentro das faixas fisiológicas usuais. É possível dirigir a taxa de contração da fibra muscular para a taxa fisiológica máxima, sobre a ordem de 50 Hz. A eficácia clínica deste tratamento magnético extracorporal é para mudar a atividade dos músculos pélvicos, e se a fibra do nervo motor terminal é repetidamente ativada, as placas extremas do motor tendem a ser reforçadas em termos de força e resistência.

[0047] O estimulo eletromagnético melhora a regeneração do músculo por minimizar significativamente a presença de infiltrado inflamatório e formação de cicatrizes após trauma. Isto evita atrofia muscular pós-trauma, induz hipertrofia do músculo e aumenta o metabolismo e movimento do músculo, triplica a expressão dos marcadores do músculo e melhora significativamente a recuperação da função muscular após o trauma.

[0048] O tratamento proposto de SUI é uma estratégia terapêutica com base na implantação de hMPCs autólogos em combinação com NMES. Em um método otimizado previsto, o uso de um biorreator para a produção de uma população de hMPCs como um componente de um produto medicinal baseado em célula para o tratamento de SUI diminuiria os custos de produção e, assim faz a terapia acessível para uma faixa mais ampla dos indivíduos afetados.

[0049] Desenvolvimentos adicionais incluem uma otimização do processo inventivo pelo uso de uma formulação de colágeno humano produzido de acordo com um método compatível com GMP para omitir o componente animal. Em adição, a liberação da composição inventiva no músculo do esfíncter seja otimizada em termos de precisão no futuro.

[0050] Concretização adicional da invenção é estabelecido nas reivindicações dependente. Breve descrição dos desenhos

[0051] As concretizações preferidas da invenção são descritas a seguir com referência aos desenhos, que tem proposito ilustrativo da concretização preferida da invenção e não para o propósito de limitação do mesmo. Nos desenhos:

[0052] A figura 1 mostra, em uma vista esquemática, a diferenciação de hMPC em cultura;

[0053] A figura 2 mostra uma comparação da morfologia de hMPC cultivado em diferentes meios de crescimento;

[0054] A figura 3 mostra uma comparação do potencial de crescimento de hMPCs cultivados em diferentes meios de cultura;

[0055] A figura 4 mostra uma comparação da análise de citometria de fluxo de hMPCs cultivados em diferentes meios de cultura;

[0056] A figura 5 mostra uma comparação de hMPCs cultivados em duas diferentes condições para caracterização miogênica, sendo que na Figura 5a, a análise de citometria de fluxo é mostrada em hMPCs para passagem 1, na figura 5b para a passagem 2, e na figura 5c para a passagem 3;

[0057] A figura 5 mostra um ensaio de formação de fibra para hMPCs cultivadas em meios de diferenciação contendo tanto FBS quanto 10% de phPL;

[0058] A figura 7 mostra uma análise de formação de fibra comparando hMPCs cultivados em meio de diferenciação contendo FBS com hMPCs cultivado em meio de diferenciação contendo 10% de phPL;

[0059] A figura 8 mostra formação de fibra em músculo de construção de tecido gerado a partir de hMPCs injetados simultaneamente, cultivado com meio de diferenciação contendo tanto FBS (figura 8a) quanto 10% de phPL (figura 8b);

[0060] A figura 9 mostra uma análise de banho orgânico realizado em dois níveis de estimulação;

[0061] A figura 10 mostra uma caracterização da formação de fibra no músculo esquelético de construção de tecido após injeção subcutânea de hMPCs em camundongo pelado por coloração FI&E;

[0062] A figura 11 mostra o rastreamento de hMPCs transplantado por MRI;

[0063] A figura 12 mostra as curvas de decaimento do sinal para o rastreamento/monitoramento de hMPCs transplantados por T2*MRI (imagem-MRI não representada);

[0064] A figura 13 mostra uma avaliação funcional da função do esfíncter em um modelo canino; sendo que em A, os perfis de uretra representativos são mostrados, e em B, um gráfico mostrando as pressões do esfíncter em função do tempo são mostrados;

[0065] A figura 14 mostra uma radiografia da área do esfíncter canino em 6 meses, sendo que em A, a imagem para um esfíncter animal normal, em B para um esfíncter danificado, e em C para um esfíncter danificado tratado com MPC é mostrado;

[0066] A figura 15 mostra uma sequência de etapas a partir da biópsia em relação ao cultivo celular para tratamento. Descrição das concretizações preferidas

[0067] Na figura 15, um resumo é mostrado das etapas contribuindo para a presente invenção. Primeiro, uma biópsia do músculo esquelético é tomada a partir do paciente a ser tratado para a disfunção do músculo esquelético. Em seguida, a biópsia é processada e hMPCs autólogos são isolados e expandidos em cultura celular, usando um meio de crescimento celular inventivo. Em seguida à coleta, os hMPCs são usados para a preparação de uma composição para uso como um medicamento, que é então injetado dentro do paciente seguido por NMES (não ilustrado). Exemplo 1:

[0068] Para o propósito de identificação, uma alternativa para o soro bovino fetal (FBS) que garante a proliferação de hMPCs e a formação eficiente de contração dos músculos construídos do tecido, FBS em meio de cultura/crescimento de hMPCs foi substituído tanto por soro humano (FIS) quanto lisado de plaqueta humana agrupado (phPL).

[0069] As biópsias humanas a partir do músculo reto abdominal foram colhidas durante as cirurgias abdominais. Todas as amostras foram processados de acordo com os protocolos estabelecidos ou por aplicação de variações a este método (Eberli et al., otimização da cultura de células precursoras do músculo esquelético humano e formação de miofibras in vitro, Methods 47, 98, 2009). Resumidamente, cada amostra foi picada e digerida por 1 hora (37°C, 5% de CO2) em DMEM/F12 (Gibco, Invitrogen) enriquecido com 0,2% de colágeno tipo I (Worthington Biochemical) e 0,4% de dispase (Gibco). A digestão foi interrompida com meio de crescimento suplementado tanto com FBS (FBS-GM), HS (FIS-GM) ou phPL (phPL-GM).

[0070] Após centrifugação, as amostras foram ressuspensa no meio de crescimento respectivo e plaqueada sobre discos com 6 poços revestidos com colágeno. De modo a reduzir o número de fibroblastos aderindo rápido, a suspensão contendo hMPCs foi re-plaqueada após 24 horas em novos discos com 6 poços revestidos com colágeno. hMPCs foram expandido em 37°C em 5% de CO2 com meio de crescimento suplementado tanto com FBS, com FIS ou com phPL. Para o propósito experimental, as concentrações de phPL de 5%, 10% e 20% foram testados.

[0071] A composição a seguir do meio de crescimento foi usado: DMEM/F12 (Gibco, Invitrogen) suplementado tanto com 18% de FBS (Gibco, Invitrogen), 10% de HS (Invitrogen), ou 5/10/20% phPL (seguindo o protocolo na Schallmoser et ah, 2007, obtido a partir da Universitatsinstitu fur Trnasfusionsmedizin, Salzburger Landeskliniken und Paracelsus Medizinische Privatuniversitat, Salzburg, Austria). Suplementos adicionais foram similares para todas as variações de meios de crescimento: 1% penicilina/estreptomicina (Gibco, Invitrogen) (para passagem 0 apenas), 10 µg/ml de fator de crescimento epidérmico humano (hEGF) (Sigma), 10 pg/ml de insulina human (Sigma) e 0,4 pg/ml de dexametasona (0,5 pM, Sigma).

[0072] Todos os experimentos foram feitos em triplicatas para cada amostra a partir de passagens 1 a 3.

[0073] Após a fase de expansão, as células foram transplantadas subcutaneamente dentro do camundongo pelado e após 4 semanas de tecido formado foi colhida. As hMPCs foram caracterizadas em pontos do tempo diferentes aplicando vários critérios para identificação, pureza, e função. A análise in vitro foi feita por análise de crescimento, análise de citometria de fluxo, coloração de imunofluorescência e ensaio de formação de fibra. Os testes in vivo foram feitos por imunohistoquímica, Western blot e miografia. Para os testes in vitro, os experimentos foram realizados com pelo menos 4 biópsias de pacientes em triplicatas.

[0074] HS foram escolhidas como uma alternativa para FBS para cultivo de hMPCs devido ao seu sucesso de aplicação com outros tipos de célula, tal como condrocitos, células tronco mesenquimal, células epiteliais corneal, e células tronco da polpa dental. Entretanto, o meio de crescimento suplementado com HS não foi capaz de sustentar a proliferação de hMPCs, as células não aderiram aos discos de cultura, mesmo após 2 semanas e em culturas celulares de biópsias originando de 4 pacientes diferentes (dados não mostrados). Mesmo em concentrações maiores de 20% ou superiores de HS não alcançaram em resultados promissores apesar da especulação.

[0075] As estruturas morfológicas de células de crescimento foram similares entre o crescimento celular em FBS- suplementado com meio de crescimento (FBS-GM) e crescimento celualr em phPL-suplementado com meio de crescimento (phPL- GM) em passagens anteriores ou posteriores (1 e 3). Embora menos confluente para o meio livre de xono (Figura 2). Nenhuma diferença foi observada entre as diferentes concentrações de phPL em todas as passagens.

[0076] Para a análise do potencial de crescimento do hMPC cultivado em meio de crescimento diferente, depois da cultura primária após biópsia, hMPCs foram semeadas em 5000 células/cm2 em cada passagem, cultivada até 90-95% de confluência e contadas. A proliferação de hMPCs tanto FBS-GM quanto phPL-GM foi eficienet e o mesmo potencial de crescimento foi observado durante as tr~es primeira passagens (Figura 3). Entretanto, as condições com o meio de crescimento contendo 10% e 20% phPL apareceu oferecer as melhores condições para hMPCs para expandir in vitro, resultante em amis células no final da passagem 3. As células cultivadas em 10% de phPL-GM foram crescidos melhores em pequenos discos do que no meio de crescimento suplementado com 5% e 20% de phPL-GM. Além disso, depois da passagem 3, as hMPCs cultivadas em 20% de phPL-GM foram crescidas e uma proliferação de captura foi testemunhada. Os 10% de phPL-GM semeados para promover a proliferação de hMPC ainda mais do que o meio de crescimento padrão usando FBS.

[0077] Obviamente, a composição do meio e ajustes foram específicos para célula e críticos para expansão celular de sucesso e diferenciação miogênica e explica o porque Kramer et al. (2005) não foram capazes de otimizar a substituição FBS por phPL. A perda do suplemento dos fatores de crescimento tal como hEGF, bFGF e insulina, e o uso de uma concentração de 20% de phPL que não é concentrações ótimas como discutido acima, pode ser a razão.

[0078] O hMPCs foram cultivados até elas terem 80-90% de confluência antes da análise de citometria de fluxo.

[0079] O efeito de phPL, sobre o perfil miogênico de hMPCs foi estudado por imunofluorescência e análise de citometria de fluxo. O phPL manteve os marcadores celulares miogênicos e fenótipos de hMPCs e o potencial de diferenciação que foi bem expresso in vivo.

[0080] A análise de citometria de fluxo de hMPCs cultivado em condições diferentes (FBS ou phPL) mostrando a expressão dos marcadores específicos de músculo em passagem 3 (n=4 biópsias). A condição de cultura a 10% de phPL parece promover a proliferação de hMPC ainda mais do que as condições padrão (FBS-GM). Entretanto, as diferenças entre as condições livre de xono, bem como entre phPL-GM e FBS-GM não foram significantes. Nas populações da célula de crescimento, marcadores de diferenciação miogênica Alfa-actinina, Desmin, MyHC (miosina de cadeia pesada), MyoD e Pax7 foram expressos em cerca de 80% para alfa-actinina, cerca de 78% para Desmin, cerca de 40% para MyHC, cerca de 35% para MyoD, e cerca de 65% para Pax 7, respectivamente (Figura 4). A condição de 10% de phPL foi escolhida para estudos adicionais e comparação com condição FBS-GM.

[0081] A expressão dos marcadores do músculo esquelético foi comparável entre as condições FBS e phPL sobre todas as passagens, exceto para MyHC (Figuras 5a-c). o último foi 2- vezes maior na alternativa phPL na passagem 1 e 2,5 vezes maior na passagem 2, enquanto não houve diferença na passagem

3. Ambas as condições representaram um ajuste ideal e favorável da proliferação de hMPCs (ao invés de fibroblastos). A detecção de CD34 permaneceu baixa e estável durante todas as passagens. Notável foi a leve diminuição na porcentagem dos marcadores do músculo expressos por MPCs a partir da passagem 1 a 3, em ambos FBS- e phPL-GM. Isto não previne a fusão das células ou a formação de miotubos em ambos os meios (Figura 6). O acionamento da diferenciação das células esqueléticas, formação de fibra de hMPCs poderia ser observada por coloração de Giemsa. Entretanto, a contagem de fibra ilustrou uma capacidade diferente de crescimento hMPCs,

em FBS-GM ou phPL-GM na construção das estruturas do tipo músculo. Parece que hMPCs cultivado para duas semanas em FBS- GM fundido e as fibras formadas mais facilmente (11,4 fibras/lâmina (+ 2,4)) do que hMPCs expandiu em phPL (7,56 fibras/lâmina (+ 1,9)) (Figura 7). A expressão dos marcadores do músculo esquelético em ambas as condições de cultura celular foi confirmada por imunocitofluorescência (não ilustrada).

[0082] A coloração do hMPCs cultivado na passagem 3 de hMPCs cultivado com FBS-GM ou 10% de phPL-GM in vitro mostrou expressão dos marcadores do músculo esquelético específico de alfa-actinina, Desmin, MyHC e MyoD. O meio de crescimento usado para os ensaios de formação de fibra, ou seja, meio de diferenciação, não contendo fatores de crescimento (tal como EGF, FGF, etc..).

[0083] A seguir os experimentos in vitro, hMPCs no FBS-GM e em 10% phPL-GM foram injetados subcutaneamente dentro das costas do camundongo pelados. Após quatro semanas, os animais foram sacrificados e os tecidos musculares construídos foram extraídos. Os tecidos construídos foram visíveis na área transplantada de todas as condições. Em adição, a coloração de H&E demonstrou as estruturas do tipo músculo em tecidos do músculo construído (Figuras 8a, b). A amplificação 40x em detalhes e destacadas na formação do músculo com estruturas de miotubo. O Western blot realizados sobre as amostras 4 semanas após a injeção confirmou a expressão dos marcadores específicos do músculo alfa-actinina, Desmin, MyHC e MyoD em ambas as condições de cultura (não ilustrado). A análise imunohistoquímica confirmou a caracterização muscular das amostras in vivo. Os hMPCs transplantados foram marcados com

PKH67 antes da injeção. Os tecidos construídos de ambas as condições foram detectados com este marcador. Os marcadores específicos do músculo da alfa-actinina, Desmin, MyHC e Pax7 foram expressos nos tecidos construídos originando ambos, hMPCs cultivado em FBS-GM e 10% de phPL-GM (não ilustrado). Finalmente, estes tecidos construídos colhidos foram contraídos quando estimulados em 40V/40 Hz e 80V/80Flz (Figura 9). Apesar da condição phPL-GM mostrou para prover uma contração melhor comparado à condição padrão, a diferença observada foi não estatisticamente significante.

[0084] Para resumir, hMPCs forma capaz de proliferar no meio de crescimento a base de FBS e meio de crescimento suplementado com todas as concentrações testadas de phPLC (5- 20%). phPL foi mostrado para sustentar a expansão de hMPCs capaz de fundir e formar a contração de músculo de construção de tecido in vivo de uma maneira similar ao FBS. Portanto, phPL pode ser usado como um substrato para FBS em cultura celular, preservando as características de hMPCs para proliferar e expressar os marcadores da superfície celular miogênica. Apesar das diferenças sutis entre FS e phPL expandido em hMPCs foram identificados, a diferenciação potencial das células para formar miotubes in vivo permanecem constantes. Estas descobertas podem promover a aplicação clínica de uma terapia celular com hMPCs isolado a partir de biopsias de músculo para tratar pacientes sofrendo de SUL> Exemplo 2: Biópsias:

[0085] São providos que o paciente não pertença a qualquer um dos critérios de exclusão e atenda todos os critérios de inclusão, a biópsia foi tomada sob anestesia geral ou espinhal. A biópsia foi tomada a partir do musculo solear (um músculo esquelético que é muito similar na composição ao músculo do esfíncter) da perna direita e esquerda. Para este propósito, uma incisão (aproximadamente 2-4 cm) de poucos centímetros abaixo da fossa popliteal sobre o lado de traz do membro inferior foi realizada. O músculo selar foi então identificado e uma peça do músculo (cerca de 1 cm3) foi cirurgicamente removida. A biópsia do músculo estéril foi transferida imediatamente depois da coleta para um médio de transporte contido no tubo de 50 ml fechado (PBS com 1% de Penicilina/estreptomicina) e processado dentro de 24 horas, preferivelmente dentro de 6 horas, mais preferivelmente imediatamente após biópsia em um laboratório GMP. A fascia, do tecido subcutâneo e a pele foram suturadas de forma rotineira. O controle do ferimento e da remoção de suturas de pele foi realizado uma semana após a biópsia. Preparação de uma população hMPC e cultura celular:

[0086] No laboratório, o tecido de tendão e gordura foram cirurgicamente removidos sob fluxo laminar, após lavagem em PBS e desinfecção em uma solução 1:1 contendo um desinfetante e PBS. O tecido remanescente foi cortado dentro de peças de tecidos pequenas de cerca de 1 x 1 mm usando tesouras e um fórceps, então plaqueadas dentro de 5 ml de uma solução de 0,2% de colagenase e 0,4% de dispase e incubadas por pelo menos 1 hora a 37°C para digestão enzimática. Após incubação, as peças de tecidos foram aspiradas com uma pipeta de 25 ml e plaqueadas em um tubo de 50 ml, onde elas foram lavadas com meio de crescimento como listado abaixo para bloquear a reação enzimática. Subsequentemente, a mostra foi centrifugada por 5 minutos a 1500 rpm, depois que o sobrenadante foi removido. 15 ml de meio de crescimento composto de acordo com a receita listada abaixo foram adicionados às pelotas celulares e a mistura foi homogeneizada por pipetagem até e abaixo de pelo menos 10 vezes. Então, o filtro celular com um tamanho de poro de 100 pm foi colocado sobre o tubo e a amostra foi filtrada.

[0087] Enquanto isso, um disco de 6 poços foi pré-revestido com uma solução de colágeno. Depois de 1 hora, a solução de colágeno foi aspirada e os poços foram lavados 3 vezes com PBS para remover o meio ácido.

[0088] Depois da remoção de PBS dos poços revestidos com colágeno, as células suspensas em meio de crescimento foram dividas nos primeiros dois poços de um disco de 6 poços revestidos com colágeno. Dois outros poços foram preenchidos com PBS, que foi removido antes da adição de células em uma etapa subsequente.

[0089] A presença de fibras únicas foi confirmada pela microscopia de fase e todos os discos foram incubados durante a noite a 37°C e atmosfera umidificada contendo 5% de CO2.

[0090] De modo a aumentar a pureza do hMPCs, as células foram submetidas em uma etapa de redução de fibroblatos: como os fibroblastos tendem a aderir as placas primeiro, o sobrenadante não contendo hMPCs aderido foi transferido após 20-28 horas para o poço seguinte revestido com colágeno do tipo 1 na mesma placa após remoção do PBS. O meio de crescimento foi alterado nos dias 4 e 7. Se os hMPCs não estavam ainda aderidos, o meio não foi alterado no dia 4. Ao invés, algum meio de crescimento fresco foi cuidadosamente adicionado no topo. Para a mudança de meio, em torno de 80% do meio velho foi cuidadosamente removido e o meio fresco foi adicionado lentamente. As células primárias cultivadas alcançaram 80% de confluência dentro de 8-10 dias pós plaqueamento na placa de 6 poços. A divisão foi feita com reação à concentração de 3000-7000 células/cm2, otimamente cerca de 5000 células/cm2. Depois de transferir da placa de 6 poços para placas de cultura maior, um meio de crescimento foi usado, o qual não foi suplementado com antibióticos de qualquer tipo. A morfologia celular, número de células e formação de fibra foram avalizadas em cada passagem.

[0091] O protocolo a seguir foi usado para a produção do meio de crescimento hMPC para a expansão de hMPCs:

[0092] Os materiais a seguir foram usados: - uma garrafa de 500 ml da mistura de nutrientes de DMEM/F12 (1:1, Gibco) armazenado a 4°C; - 500 µl de hbFGF (Sigma, 500 ng em 500 µl a -80°C) (concentração final de 1 ng/ml); - 1 µl de hEGF (5 mg/ml a -80°C) (concentração final de 10 ng/ml); - 500 µl de insulina humana (Sigma, 5 mg em 500 µl em -20°C) (concentração final de 10 pg/ml); - 1,2 ml de dexametasona (Sigma, 200 µg em 1,2 ml a -20°C) (concentração final de 0,4 Pg/ml); - 50 ml de lisado de plaquetas humana filtrado (hPL) (BG 0 (plaquetas)/AB (plasma)) (concentração final de 10%); - 600 µl de heparina-Na (Braun, 351 1014) (25000 IU/5 ml), adicionado ao hPL filtrado antes da adição de DMEM (concentração final de Heparina-Na de 6 IU por ml de meio de crescimento); - Penicilina/Estreptomicina (6 ml de 10000 unidades/ml de penicilina e 10000 pg/ml de estreptomicina em -20°C) apenas para o meio usado para a passagem 0 (concentração final de 1%).

[0093] Assim, uma técnica de cultura foi estabelecida que usa apenas discos revestidos de colágeno e meio definido para expansão e diferenciação de hMPCs. A caracterização celular demonstrou que o fenótipo hMPC pode ser mantido sob estas condições e que as células tem a capacidade de formar miofibras in vitro e in vivo. Os números suficientes de células para aplicações de construções de tecido podem ser crescidos em 3-4 semanas usando este método. Preparação da composição celular:

[0094] Antes da injeção, uma mostra de células é analisada por citometria de fluxo, e os testes de viabilidade são realizados para investigar a qualidade e a pureza. Para liberar um mínimo de 80 milhões de mMPCs com pelo menos 80% de viabilidade, ou seja, cerca de 64 milhões de células viáveis, em uma concentração final de 20 milhões de células/ml, as células cultivadas (cerca de 80 milhões) são suspensas em 4 ml de uma porcentagem baixa de solução de colágeno, ou seja, 3-4 mg/ml, conduzindo a uma concentração final de cerca de 2 mg/ml de colágeno no produto final. Para a matriz do veículo, apenas uma concentração baixa de colágeno é necessária. Isto compara com os estudos prévios usando concentrações maiores de colágeno, o que apenas leva a bons resultados em curtos períodos.

[0095] Como para a preparação da solução de colágeno, o colágeno foi misturado em 0,01 M de HCl. Então MEM foi adicionado como um indicador de pH, até a solução se tornar amarela. Então NaHCCfi foi adicionado gota a gota até a solução se tornar rosa, ou seja, alcançar um valor de pH fisiológico de 6-8. A solução de colágeno foi então transferida dentro de pelotas celulares finais (colhidas depois da passagem 2), homogeneizadas por pipetagem e deixadas, transferidas para dentro de um tubo de 50 ml e resfriadas em um dispositivo de resfriamento.

[0096] A meia fica máxima ótima da composição finalizada de hMPCs em uma solução de colágeno foi limitada. A estabilidade da composição final é de até 24 horas após preparação, para manter pelo menos 80% da viabilidade celular.

[0097] O produto final em uma seringa de 10 ml é transportado em uma caixa a 5°C (+/- 3°C) controlada por um dispositivo de medida de temperatura para estudo de sítio. Na sala de cirurgia, o produto final é misturado gentilmente antes da injeção. Injeção da composição hMPC:

[0098] O tratamento de SUI com hMPCs é restrito a um músculo de esfíncter danificado de pacientes fêmeas adultas com baixo risco (de acordo com o critério de exclusão específico) com um histórico de SUI.

[0099] Para permitir a injeção padronizada dentro do assoalho pélvico dos pacientes fêmea, as células são injetadas sob um guia de ultrassom.

[0100] Uma sonda de ultrassom é posicionada transvaginalmente e uma ferramenta de guia compreendendo um tubo e uma seringa de uma via é colocada dentro da uretra. 8- 12 alíquotas da composição de colágeno-hMPC são injetado dentro do assoalho pélvico, não excedente uma quantidade total de 4 ml da composição.

[0101] Uma amostra de c´lulas a ser injetada pode ser cultivada para o ensaio de formação de fibra e os ensaios de citometria de fluxo para checar a capacidade deles na formação de fibras e na expressão dos marcadores miogênicos.

[0102] Para o propósito comparativo, diferentes opções de injeção (transuretral e transvaginal) foram avaliados, tanto quanto o ultrassom transvaginal (BK 884, BK Medical, Denmark) injeções guiadas dos compostos polimérico fluido (polímero líquido que endurece após aplicação) em músculos de esfíncter urinário dos cadáveres humanos fixados com Thiel. O esfíncter foi então analisado por MRI e histologia de todas as seções montadas. Ambos os métodos mostraram boa e apurada comparável atingir o rabdosesfincter.

[0103] Entretanto, a abordagem transuretral mostra ser superior em meios simples primários devido ao manuseio e curva de aprendizado mais curto. Estimulação eletromagnética:

[0104] A fisioterapia para os exercícios do assoalho pélvico foi realizada por estímulo de cadeira eletromagnética (BioCon-2000). O comprimento do campo elétrico induzido na saída máxima 12 V/m na superfície da mola de estímulo. Em 5 cm acima da mola de estímulo, o campo medido de 22 V/m. Análise da diferenciação muscular e função nos modelos animais:

[0105] Para estudo do efeito de MPCs sobre a regeneração do músculo esquelético, vários modelos animais foram usados: camundongo (injeção de célula subcutânea para formação do músculo ectópico (Figura 10) e modelos de danos de esmagamento de quadríceps e músculos do membro dianteiro tibial (não ilustrado)); ratos (modelo de obstrução da saída da bexiga); cachorro (insuficiência do esfíncter uretral por incisão microcirúrgica do esfíncter externo) (Figura 13 e

14).

[0106] Para a caracterização da formação de fibra no tecido construído do músculo esquelético após injeção de hMPCs no camundongo pelado, hMPCs primário cultivado foram injetados subcutaneamente em camundongo pelado. 3, 7, 14 e 28 dias após injeção, o tecido formado foi colhido e analisador por coloração H&E. o aumento na capacidade de formação de fibra por hMPCs injetado foi observado dentro de quatro semanas com tecido muscular maduro histologicamente no dia 14, como mostrado na Figura 10. A coloração himunohisto-fluorescente confirmou a expressão dos marcadores do músculo esquelético alfa-actinina, MyHC, e Desmin (não ilustrado).

[0107] Como um exemplo para visualização não-invasiva da diferenciação celular por MRI, hMPCs foram monitoradas por MRI e o desenvolvimento do tecido muscular por T2*MRI (Figura 11 e 12). A figura 11 mostra o monitoramento de MPCs transplantados por MRI. Os MPCs não marcados (controle) e marcados com 400 µg/ml do óxido de íon super-paramagnético (SPIO) foram injetados subcutaneamente sobre as costas do camundongo pelado. Os camundongos foram escaneados por MIR 4 dias, e 1, 2 e 4 semanas após a injeção. As imagens de MRI T2-pesados da área de interesse são mostradas. As células injetadas foram marcadas com uma seta. Na Figura 12, as curvas de decaimento do sinal T2* para todas as medidas do ponto de tempo são mostrados. A maturação das células precursoras do músculo dentro das fibras do músculo esquelético foi observada, correlacionada com uma diminuição nos parâmetros de relaxamento e difusão diminuíram, a abordagem dos valores para tecido do músculo esquelético maduro, sugerindo que o relaxamento MRI e a medida de difusão proveem biomarcadores adequado para o monitoramento in vivo da diferenciação muscular e função.

[0108] A figura 13 mostra uma avaliação funcional da função do esfíncter em um modelo canino. As células progenitoras do músculo canino foram isoladas com sucesso e reproducibilidade, o crescimento e expansão. Em A, o perfil de uretra representativo mostra o aumento da pressão do esfíncter na área de esfíncter após o tratamento celular. N mostra o controle normal, D6 mostra o “dano apenas” do controle em 6 meses, e M6 mostra o animal tratado com MPC em 6 meses. Em B, o gráfico mostra a pressão do esfíncter sobre o tempo. Os animais injetados com as células mostraram uma recuperação funcional significante de sua função de esfíncter com a pressão de esfíncter aproximadamente 80% do normal, enquanto a pressão no animal controle (“danos apenas”0 caiu e permaneceu em 20% (p<0,025). Histologicamente, as células implantadas sobreviveram e formaram tecido dentro da região injetada do esfíncter e formaram novas fibras musculares inervadas (ver também Eberli, D., et al., Muscle Precursor Cells for the REstoration of Irreversibly Damaged Sphincter Function. Cell Transplant, 2012).

[0109] Na figura 14, um radiograma da área do esfíncter de cachorro em 6 meses é mostrado. Os animais tratados com injeção MPC foram capazes de recuperar um estrutura de esfíncter anatômico normal (setas em C) e região do pescoço da bexiga enquanto os animais sem tratamento mostraram uma amplitude da área de esfíncter (setas em B), indicando uma perda da integridade anatômica. A mostra uma representação de um normal, esfíncter não danificado, B de um esfíncter danificado, e C de um esfíncter danificado tratado com MPC.

[0110] Os resultados em cachorros mostraram que os MPCs autólogos são capazes de restaurar de forma irreversivelmente a função do esfíncter danificado. As células injetadas foram capazes de sobreviver e formar o tecido maduro dentro da função de esfíncter danificado. Este estudo amplo em animais demonstrou a viabilidade de uso de células precursoras do músculo autólogo para a restauração funcional do músculo do esfíncter urinário em pacientes com insuficiência de esfíncter.

[0111] Para aplicação de sucesso de MPCs em terapia celular de músculo em humanos, uma ferramenta de monitoramento in vivo não-invasiva do processo de diferenciação é crucial. O relaxamento MRI e a medida de difusão provê biomarcadores adequados para o monitoramento in vivo da diferenciação do precursor muscular.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para gerar uma população de células precursoras do músculo humano derivadas do músculo esquelético, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos as etapas a seguir: - obter uma amostra de tecido humano por uma biópsia do músculo esquelético de um paciente humano; - remover cirurgicamente gordura, e/ou tendão, e/ou tecido conectivo a partir da amostra de tecido humano; - picar e digerir enzimaticamente a amostra de tecido humano; - reduzir um número de células de fibroblasto, resultando assim, em uma população de células precursoras do músculo humano; - permitir que as células precursoras do músculo humano assentem em um disco revestido de colágeno; - expandir as células precursoras do músculo humano em um meio de crescimento celular por pelo menos uma passagem.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a biopsia do músculo esquelético ser tomada a partir de um tecido selecionado a partir do grupo consistindo de: músculo sóleo, reto abdominal, quadríceps femoral, músculo vasto lateral, sendo que a biopsia do músculo esquelético é, preferivelmente, tomada a partir do tecido do músculo sóleo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as células precursores do músculo humano serem cultivadas por pelo menos 2 passagens, preferivelmente 3 a 4 passagens.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as células precursoras do músculo humano serem expandidas usando um meio de crescimento celular que é livre de soro bovino fetal.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de as células precursoras do músculo humano serem expandidas usando um meio de crescimento celular compreendendo lisado da plaqueta humana, preferivelmente, um lisado de plaqueta humana filtrada agrupada, e sendo que o lisado de plaqueta humana está, preferivelmente, no meio de crescimento celular em uma concentração final de 5-20%, mais preferivelmente, de 7-12%, mais preferivelmente de cerca de 10%.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de o meio de crescimento celular utilizado para expansão das células precursores do músculo humano compreender ainda um fator anti-coagulação, preferivelmente, heparina, mais preferivelmente, heparina-Na, preferivelmente, em uma concentração final de 1-10 IU/ml, mais preferivelmente 2-6 IU/ml, mais preferivelmente, de cerca de 2 IU/ml, e sendo que o meio de crescimento celular compreende, adicional e preferivelmente os ingredientes a seguir: - uma solução nutriente, preferivelmente, DMEM, mais preferivelmente, uma mistura de nutrientes 1:1 de DMEM/F12; - hEGF, preferivelmente em uma concentração final de 5-20 ng/ml, mais preferivelmente de cerca de 10 ng/ml; - hbFGF, preferivelmente em uma concentração final de 0,5-2 ng/ml, mais preferivelmente, de cerca de 1 ng/ml; - insulina, preferivelmente, insulina humana, preferivelmente, em uma concentração final de 5 a 20 µg/ml, mais preferivelmente, de cerca de 10 µg/ml; - dexametasona, preferivelmente, em uma concentração final de

0,2-0,8 pg/ml, mais preferivelmente, de cerca de 0,4 µg/ml.

7. População de células precursoras do músculo humano derivado do músculo esquelético, caracterizada pelo fato de expressar, preferivelmente, Pax7, Desmin, e alfa-actinina, preferivelmente, também MyHC, dita população sendo gerada em um método conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.

8. População de células precursoras do músculo humano derivado do músculo esquelético, caracterizada pelo fato de ser gerada em um método definido de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 para uso como um medicamento.

9. População de células precursoras do músculo humano derivado do músculo esquelético, caracterizada pelo fato de ser gerada preferivelmente pelo método definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, para uso no tratamento da disfunção do músculo esquelético.

10. População de células precursoras do músculo humano derivado do músculo esquelético, caracterizada pelo fato de ser gerada preferivelmente pelo método definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, para uso no tratamento de incontinência urinária por stress.

11. Meio de crescimento celular para produção de uma população de células precursoras do músculo humano, para o tratamento da disfunção do músculo esquelético, caracterizado pelo fato de o meio de crescimento celular ser livre de soro bovino fetal.

12. Meio de crescimento celular, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de o meio de crescimento celular conter lisado de plaqueta humana, preferivelmente um lisado de plaqueta humana agrupada.

13. Meio de crescimento celular, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de o meio de crescimento celular compreender a composição a seguir: - uma solução nutriente, preferivelmente, DMEM, mais preferivelmente, uma mistura de nutrientes 1:1 de DMEM/F12; - hEGF, preferivelmente em uma concentração final de 5-20 ng/ml, mais preferivelmente de cerca de 10 ng/ml; - hbFGF, preferivelmente em uma concentração final de 0,5-2 ng/ml, mais preferivelmente, de cerca de 1 ng/ml; - insulina, preferivelmente, insulina humana, preferivelmente, em uma concentração final de 5 a 20 µg/ml, mais preferivelmente de cerca de 10 pg/ml; - dexametasona, preferivelmente, em uma concentração final de 0,2-0,8 pg/ml, mais preferivelmente, de cerca de 0,4 pg/ml; - heparina, preferivelmente, heparina-Na, preferivelmente em uma concentração final de 1-10 IU/ml, mais preferivelmente de 2-6 IU/ml; - lisado de plaqueta humana filtrado, preferivelmente em uma concentração final de 5-20%, mais preferivelmente, de 7-12%, mais preferivelmente de cerca de 10%.

14. Meio de crescimento celular, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de ser para uso em pelo menos uma passagem, preferivelmente, para uso em passagem 0, o meio de crescimento celular compreender ainda uma solução contendo um agente antibiótico, preferivelmente, uma solução contendo penicilina e estreptomicina, preferivelmente, em uma concentração final de cerca de 1%.

15. Método para a produção de um meio de crescimento celular, conforme definido na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:

- prover de uma solução de nutriente, preferivelmente, solução DMEM, mais preferivelmente uma mistura de nutriente 1:1 de DMEM/F12; - adição de hEGF, preferivelmente, em uma concentração final de 5-20 ng/ml, mais preferivelmente, de cerca de 10 ng/ml; - adição de hbFGF, preferivelmente, em uma concentração final de 0,5-2 ng/ml, mais preferivelmente de cerca de 1 ng/ml; - adição de insulina, preferivelmente de insulina humana, preferivelmente em uma concentração final de 5-20 pg/ml, mais preferivelmente de cerca de 10 pg/ml; - preparação de uma mistura de lisado de plaqueta humana com um fator de anti-coagulação, preferivelmente por adição de heparina, mais preferivelmente Fleparina-Na para o hPL filtrado antes da adição da mistura para a solução de nutriente, preferivelmente, em uma concentração final de 5- 20% de hPL, mais preferivelmente de cerca de 10% de hPL e preferivelmente, em uma concentração final de 1-10 IU/ml, mais preferivelmente de 2-6 IU/ml de heparina, e adição da mistura de lisado de plaqueta humana e heparina para solução de nutriente; - adição de dexametasona, preferivelmente, em uma concentração final de 0,2-0,8 pg/ml, mais preferivelmente de cerca de 0,4 pg/ml.

16. Método para a produção de uma composição, compreendendo uma população do músculo esquelético derivado de células precursoras do músculo humano, preferivelmente preparadas de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de a população de células precursoras do músculo humano derivadas da origem do músculo esquelético ser suspensa em uma solução de colágeno, preferivelmente em uma concentração de 10-30 milhões de células/ml com pelo menos 80% de viabilidade, sendo que o colágeno preferivelmente é o colágeno do tipo I, e sendo que a concentração do colágeno tem preferivelmente de 1-4 mg/ml, mais preferivelmente de cerca de 2 mg/ml.

17. Composição, caracterizada pelo fato de compreender uma população de células precursoras do músculo humano derivado do músculo esquelético suspensas em uma solução de colágeno, dita composição sendo produzida pelo método definido de acordo com a reivindicação 16.

18. Composição, caracterizada pelo fato de compreender uma população de células precursoras de músculo humano derivado do músculo esquelético suspenso em uma solução de colágeno, preferivelmente, em uma concentração de 10-30 milhões de células/ml com pelo menos 80% de viabilidade, sendo que a solução de colágeno contém preferivelmente colágeno do tipo I, preferivelmente de porco, bovino ou de origem humana, e sendo que a concentração de colágeno na composição tem, preferivelmente, de 1-4 mg/ml, preferivelmente, cerca de 2 mg/ml.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de ser para uso como um medicamento.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de ser para uso como um medicamento no tratamento da disfunção do músculo esquelético, especialmente no tratamento de um defeito do músculo esfíncter uretral externo.