JP2016515379A - 単離された椎間板細胞、その使用方法、および哺乳動物組織からそれを調製する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、椎間板細胞集団、それを誘導する方法、およびその使用方法に関する。本明細書の椎間板細胞集団を用いて、対象の損傷、障害または欠損のある椎間板を回復または再生することができる。本発明の椎間板細胞集団を、対象から誘導し、対象に投与または移植する、または関連のないドナーから誘導することができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に準拠して、全体が参照により本明細書に組込まれる２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９４，６９１号の優先権の利益を主張する。

発明の分野
本開示は、変性椎間板疾患の処置における、椎間板細胞（intervertebral disc cell）の単離およびその使用方法に関する。

哺乳動物の脊椎は、２つの基本的な機能：（１）上半身の耐荷重支援および（２）脊柱を含む神経の保護を果たす。脊椎は、椎間板により隔てられた、連結する椎骨からなる。椎間板は衝撃吸収体として作用し、これによって脊椎は、曲がる、圧縮する、およびねじることができる。椎間板は、２つの基本的な部分：外側の線維構造（線維輪）、およびゲル状の内部構造（髄核）を有する。若い哺乳動物における健康な髄核は、約８０％が水である。時間と共に、髄核はその高い水分含量を失い、かくして、衝撃を吸収するその能力を失う。さらに、椎間板は、脱水、疾患、酷使、傷害または外傷により損なわれ、断裂、膨張、ヘルニア形成などをもたらし得る。椎間板はまた、変性椎間板疾患などの他の疾患の影響も受けやすい。

健康な椎間板においては、細胞は全体積のほんの一部である。椎間板体積の多くは、細胞により生成される細胞外マトリックス（ＥＣＭ；大量の水の保持に役立つコラーゲンおよびプロテオグリカン）であり、髄核と線維輪との違いは主に、水分含量およびＥＣＭの組成にある。

変性椎間板疾患の結果生じる背部痛は、病的状態、身体障害、および生産性低下の主な原因である。背部痛は、４５歳までの人々の活動を制約するものとしてしばしば報告され、医師への受診、入院、および外科的処置の理由である。慢性的な背部症状は、毎年、人口の１５％〜４５％により報告され、一生のある時点で人口の７０％〜８５％において報告される。医療費および労働時間損失の観点から、財政的影響は大きい。米国では毎年、１００万を超える脊椎の外科的処置が実施されている。さらに、脊椎手術市場の腰椎固定分は、歳入で１０億ドルをはるかに超えると見積もられている。

背部痛および脊椎疾患に罹患する対象のための手術的および非手術的治療選択肢の両方における継続的改善にも拘らず、この状態を解消する、または確実に改善するための解決法は存在しない。脊椎疾患のための現在の治療としては、ステロイド注射、理学療法、椎間板切除術および脊椎固定術が挙げられる。人工脊椎が、いくつかの会社によって導入されている。しかしながら、これらの人工器官は、その設計、例えば、ベアリング面、骨への固定、関節数、材料、制約、回転の可動性がまちまちで、実際のところはほとんど成功していないように見える。

核関節形成または核置換もまた、変性椎間板疾患を治療するための選択肢である。いくつかの場合、これらのデバイスは、ヒドロゲルコア中心がポリエチレンスリーブ中に包み込まれたものからなり、通常の荷重および非荷重下に収縮および膨張することができる。これは、椎間板腔の高さの回復に部分的に役立ち、健康なヒトの椎間板を模倣するのに役立ち得る。

椎間板置換術には、合併症がないわけではない。最も一般的な合併症としては、隣接レベル脊椎疾患、沈下、および椎間関節症が挙げられる。さらに、臨床試験に基づく最近の研究により、感染、椎体骨折、インプラントの位置異常、沈下、器質的な機能不全、および傍脊椎異所性骨化の発生が示された。インプラントの前方脱臼などの、より重篤な合併症も報告されている。また、全椎間板置換術に由来する摩耗粒子の問題および脊髄に対する潜在的な影響はまだわかっていない。

対象の椎間板の修復または置換に役立ち得る、椎間板のための生物学的処置が必要である。

単離された椎間板細胞（discogenic cell）集団、その使用方法、および調製方法が、本明細書に開示される。椎間板細胞集団は、損傷、傷害または障害のある椎間板の、修復、再生および置換において用いられる。いくつかの実施形態においては、椎間板細胞集団は、哺乳動物椎間板組織から誘導され、足場非依存的条件下、インビトロで増殖させる。いくつかの実施形態においては、細胞培養は、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、血清、線維芽細胞条件培地、および粘性の非反応性物質からなる群から選択される１または複数の添加物を含む培地を含む。いくつかの場合、細胞を、低接着コーティングを有する容器中で増殖させる。開示される椎間板細胞集団を、それを必要とする対象において、椎間板の自家および／または非自家処置のために用いることができる。

開示される椎間板細胞を、非吸収性材料または吸収性材料を用いるインビトロまたはインビボの人工椎間板置換物の形成のために用いることができる。前記材料は、椎間板細胞集団を収容するよう機能する人工輪を形成することができ、以下の少なくとも１つ−足場材料、マトリックス材料、担体材料、増殖因子、および／または他の生物活性物質、と組み合わせるか、または組み合わせなくてよい。この人工外輪は、それを１または複数の椎体に固定することができるように装着手段を含み得る。例えば、人工輪は、１または複数の椎体へのネジ固定を可能にするための、スルーホール、カフ、タブ、ループ、またはワッシャを含み得る。人工椎間板を、対象に外科的に移植して、椎間板を全置換することができる。

また、自己および非自己ドナーから椎間板細胞を取得および調製するための様々な方法も開示される。組織から１または複数の細胞を単離すること、足場依存的培養培地中で１または複数の細胞を継代すること、および足場非依存的培養培地に１または複数の細胞を移すことを含む、椎間板細胞集団を誘導する方法が開示される。処置量の椎間板細胞集団を対象に投与し、それによって対象を処置することを含む、それを必要とする対象中の少なくとも１つの椎間板を処置するために椎間板細胞を用いる方法も開示される。様々な実施形態において、組織は、哺乳動物椎間板組織であり、例えば提供された臓器または脊椎から得る。いくつかの態様において、開示される方法は、細胞集団を足場非依存的培養物中で少なくとも１回継代することを含み、その細胞集団は細胞外マトリックスを生成する。いくつかの態様において、細胞集団は、ＣＤ２４、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、Ｓｔｒｏ−１、ＨＩＦ１、ネスチン、ＣＫ８、およびＨＬＡタンパク質を含む群から選択される１または複数の細胞表面マーカーを生成し、細胞表面マーカーを発現する細胞の、集団中のパーセンテージは、７０％より高い、または４０％未満である。開示される方法のいくつかの態様において、細胞集団は、ＧＡＰＤＨ、ＳＤＨＡ、ＨＰＲＴ１、Ｂ２Ｍ、Ｓｏｘ９、アグリカン、Ｃｏｌ１、Ｃｏｌ２、ネスチン、ＣＫ８、Ｓｏｘ１、ＣＤ４４、ＡＬＰＩ、ＰＰＡＲＧ、ＡＤＡＭＴＳ、ＭＭＰ、ＦＭＯＤ、ＩＬを含む群から選択される１または複数の遺伝子または遺伝子産物を発現する。

別の態様において、記載される椎間板細胞集団において、４０％を超える細胞が細胞表面マーカーＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＨＬＡ−Ａ、ＢもしくはＣ、ＣＤ２４、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、またはそれらの組合せを生成し、細胞集団の約２０％未満がＣＤ３４、ＨＬＡ−ＤＲもしくは−ＤＱ、またはＳＴＲＯ−１を生成する。いくつかの実施形態においては、集団の約８０〜１００％が、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＨＬＡ ＡＢＣ、またはそれらの組合せを生成する。いくつかの実施形態においては、集団の約２０〜７５％がＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２４、またはそれらの組合せを生成する。

一態様によれば、本発明は、加齢、外傷、毒素曝露、薬物曝露、放射線曝露、酸化、免疫複合体沈着、または移植片拒絶により誘導される、椎間板損傷により引き起こされる障害または損傷を少なくとも１つの椎間板に有する対象を処置するための方法を提供する。

別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの椎間板に障害または損傷を有する対象を処置するためのキットであって、薬学的に許容される担体、該障害または損傷を処置するのに有効な量の椎間板細胞、脊柱組織を含み、前記細胞が培養物中で増殖することができ、分化する能力を有する、キットを提供する。いくつかの実施形態においては、キットは、少なくとも１つの薬剤を含む。

本特許のファイルは、少なくとも１つのカラー図面／写真を含む。カラー図面／写真を含む本特許の写しは、請求し必要な費用を支払えば米国特許商標庁により提供される。

発明と見なされる内容は、特に指摘され、本書の最後で明確に特許請求される。しかしながら、本発明は、構成および実施方法の両方に関して、発明の目的、特徴および利点と共に、下記の詳細な説明を添付の図面と併せて参照することによって、よく理解され得る。

図１は、幹細胞および軟骨形成細胞を同定するために知られる様々な表面マーカーの発現プロファイルを示す。８種類の細胞が調査されている：線維芽細胞、軟骨細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、単層（接着依存的）で増殖させた椎間板細胞、および懸濁液中（接着非依存的）で増殖させた椎間板細胞。 図２は、懸濁培養により増殖させた椎間板細胞の細胞形態を示す。 図３は、ＭＳＣと比較した椎間板細胞の軟骨形成能力を示す。 図４は、椎間板細胞の脂肪生成能力および骨形成能力を示す。 図５は、粘性１％ヒアルロン酸足場と組み合わせた後、および２７ゲージの１．５インチ外科用針を通して押し出された後の、細胞の生存能力を示す（緑色、またはモノクロの場合は明るい部分−生細胞；赤色、またはモノクロの場合は暗い部分−死細胞）。 図６は、様々な形態の椎間板疾患を処置するための椎間板細胞の治療的使用において使用し得る装置および方法を示す。処置は、注射（上図）または移植（下図）によるものであり得る。細胞と担体／足場とは、一緒にしておく、または使用直前に組み合わせることができる。 図７は、粘性足場担体と併用した椎間板細胞の、変性椎間板（動物モデル）を修復するインビボ効能を、ウサギにおいて示す。 図８は、椎間板細胞の調製および移植を示すフロー図である。工程ａには、椎間板の図を示す。工程ｂには、脊椎から単離された新鮮なヒト椎間板を示す。工程ｃには、切開および酵素消化後の髄核細胞を示す。接着する細胞を、ＥＧＦおよびＦＧＦ−２の存在下で増殖させる。スケールバー＝５０μｍ。工程ｄには、メチルセルロースを含有する接触阻害培養環境に移した細胞の顕微鏡写真を示す。約２週間でクラスターおよび球体が生じる。スケールバー＝２００μｍ。工程ｅには、メチルセルロース含む培地を洗浄により除去し、非架橋ヒアルロン酸足場と組み合わせた細胞を注入するためのシリンジを示す。工程ｆには、細胞と足場の混合物を変性ウサギ椎間板に注入するために用いられるシリンジを示す。その後、安全性および効能を約１ヶ月間にわたり調べた。 図９Ａ〜Ｆは、アグリカンおよびコラーゲンの生成を調べた椎間板細胞を示す。図９Ａは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色の位相画像である。図９Ｂは、ヌクレアファストレッドで対比染色されたアルシアンブルーの位相画像である。単一の細胞の周囲のマトリックスの存在に留意されたい（左図）。スケールバー＝１０μｍ。図９Ｃは、ピクロシリウスレッド染色の位相画像である。図９Ｄは、アクチン（赤色）および細胞核（青色）を含む共焦点画像である。図９Ｅは、さらに拡大された、アグリカン、コラーゲンおよびアクチン（核なし）の共焦点画像であり、ここで、黒色の矢印は細胞内アグリカンを示し、白色の矢印は細胞外アグリカンを示す。図９Ｆは、培養中の経時、１４日目の採取時点、および軟骨形成分化の後の、マトリックス分子（アグリカンおよびコラーゲン２Ａ）のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す棒グラフである。発現倍数は、ハウスキーピング遺伝子ＨＲＰＴおよび０日目でのベースライン遺伝子発現に対する正規化された交差閾値により算出した。 図１０Ａ〜Ｃは、椎間板細胞に対するフローサイトメトリー解析を示す。図１０Ａは、前方および側方散乱プロットであり、細胞集団の８９％を含む、その後の全ての解析に適用されたゲーティングを示す。図１０Ｂは、５人の異なるヒトドナーに由来する椎間板細胞の発現レベル（アイソタイプコントロールと比較）を示す棒グラフである。図１０Ｃは、表面マーカー発現の代表的なヒストグラムを示す。 図１１Ａ〜Ｅは、椎間板細胞の多能性を示す。図１１Ａは、アリザリンレッド染色により示される骨形成分化を示す。図１１Ｂは、オイルレッドＯ染色により示される脂肪生成分化を示す。図１１Ｃは、マイクロマス形成後の軟骨形成分化（アルシアンブルーおよびヌクレアファストレッド）を示す。スケールバー＝１００μｍ。図１１Ｄは、関節軟骨細胞（ＡＣ）、成人線維芽細胞（ＦＢ）、骨髄由来ＭＳＣ、および椎間板細胞（ＤＣ）について、軟骨形成分化後の可溶性（培地）および不溶性（マイクロマス）のＧＡＧの生成を定量的に評価する棒グラフである。図１１Ｅは、様々な種類の細胞について、ＤＮＡ量に対して正規化された総ＧＡＧ生成を示す棒グラフである。線は、有意差（ｐ＜０．０１、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉのポストホック検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡ）を示す。 図１２Ａは、変性椎間板疾患のウサギモデルにおける処置の安全性および効能評価を示す。図１２Ａは、示される１８の骨ランドマークに基づいて、２週間毎に撮影し、椎間板高指数（disk height index; ＤＨＩ）を計算するのに用いた、代表的なＸ線写真である。図１２Ｂは、試験期間にわたり（１４日目に注入処置）、ウサギの体重が正常範囲内にとどまったことを示す。図１２Ｃは、６週間の処置にわたるＤＨＩのグラフであり、４週間および６週間後において、コントロール条件と比較して処置がＤＨＩを改善し、高用量よりも低用量の方が効果が高いことを示す。足場コントロールまたは損傷コントロールにおいては改善は認められず、未損傷コントロールの椎間板高は週０時点から変化しなかった。 図１３Ａ〜Ｂは、６週間のパイロット試験後の、処置の組織学的評価を示す。図１３Ａは、健康な椎間板、損傷椎間板、および処置された椎間板の断面である（ヘマトキシリンおよびエオシン染色、スケールバー＝２ｍｍ）。図１３Ｂは、骨髄、線維輪（ＡＦ）、軟骨終板（ＣＥＰ）、および髄核（ＮＰ）を含む、処置後のＩＶＤの様々な領域の組織を示す；ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）またはアルシアンブルーで染色（スケールバー＝１００μｍ）。 図１４Ａ〜Ｃは、ブタにおける処置のパイロット試験（１２週）における安全性および効能を示す。図１４Ａは、ＩＤＣＴの用量が、１２週において持続的に、損傷コントロールと比較してＤＨＩを改善した（ｐ＜０．０５）ことを示すグラフである；足場コントロールまたは損傷コントロールにおいては改善はなく、未損傷コントロールの椎間板高は週０から変化することがなかった。図１４Ｂは、試験を受けているブタ脊椎の蛍光透視画像である（損傷を受けた椎間板において椎間板腔の崩壊が認められる）。図１４Ｃは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）ならびにアルシアンブルーで染色された、髄核（ＮＰ）、軟骨終板（ＣＥＰ）および線維輪（ＡＦ）を含む、ＩＤＣＴ処置された椎間板の組織学的評価である。

本明細書で記載される椎間板細胞は、椎間板組織から誘導され、椎間板の処置および／または修復のために用いることができる細胞である。いくつかの場合、椎間板細胞をインビトロで処理して、既存のまたは損傷のある髄核組織の修復、置換、または増強において他の細胞よりも強力である椎間板細胞を提供することができる。様々な実施形態において、椎間板細胞は、細胞外マトリックスを生成する。いくつかの実施形態においては、椎間板細胞は、プロテオグリカンを生成する。他の実施形態においては、椎間板細胞は、コラーゲンを生成する。他の実施形態においては、天然細胞に隣接して埋込まれた椎間板細胞は、化学的、機械的または他の力を介して天然細胞を刺激するのに役立ち得る。例えば、椎間板細胞は、増殖因子、サイトカインまたは他のタンパク質を放出することができる。

本明細書で用いられる「椎間板（の）」(または「椎間板形成性」）（discogenic）とは、インビボで椎間板組織を生成する能力を指す。いくつかの実施形態においては、椎間板細胞は、障害もしくは損傷のある椎間板組織、および／または１もしくは複数の椎間板組織特性を喪失した椎間板組織をインビボで再生させることができる。いくつかの場合、「椎間板」細胞はインビトロで椎間板組織を生成することができ、例えば、椎間板細胞を用いて移植のための人工椎間板を作成することができる。

インビトロで増殖させた細胞を言う場合に本明細書で用いられる「維持される」とは、細胞が２４時間を超えて培養物中で増殖することを包含する。いくつかの場合、維持される細胞は、細胞培養物中で分裂した細胞である。

「マイクロマス」は、接着を阻害する円錐容器中で約１０，０００〜１，０００，０００個の細胞を濃縮し、その結果、細胞が少なくとも１つの単一の塊を形成することによって形成される。マイクロマスは、細胞外マトリックスをさらに含有してもよい。それは、軟骨形成能力を決定するアッセイに基づくものであり、ペレットとも称される。

量、時間などの測定可能な値を言う場合に本明細書で用いられる「約」とは、±約２０％未満の変動を包含することを意味する。いくつかの場合、約は１０％もしくはそれ以下、または±５％もしくはそれ以下の変動を指し得る。いくつかの場合、約は±１％〜±０．１％の変動を指し得る。

「誘導される」は、ある細胞が、その天然の、または以前の生物学的状態または位置から取得または単離され、そして、培養物中で維持、成長もしくは増殖され、または不死化され、または他の処理がインビトロでなされたことを示すために用いられ得る。例えば、いくつかの本発明の実施形態においては、本発明の椎間板集団を、椎間板組織または軟骨性組織から誘導することができ、いくつかの実施形態においては、ディスコスフィア（ｄｉｓｃｏｓｐｈｅｒｅ）を、椎間板細胞集団から誘導することができる。

細胞または分子が「単離」される場合、それは、人間の介入によって、その天然の状態から取り出され、またはその天然の状態に関して変化させられている。

用語「発現する」、「発現した」または「発現」とは、核酸分子または遺伝子からの遺伝子産物の生合成、例えば、ポリペプチドの生合成を指す。ある細胞表面マーカーが細胞表面上に、何らかの事象、例えばインビトロ増殖の後に多少存在する場合、該細胞表面マーカーは細胞表面に発現すると言える。

「損傷」とは、加齢、外傷、または疾患に起因するものであろうとなかろうと、椎間板に対する任意の障害、損傷、変性、または外傷を指す。

「疾患」は、当分野で好適な任意の手段によって測定される、細胞、組織、臓器、系、または生体全体の、健康、状態、または機能からの、任意の逸脱、またはその障害である。

「治療する」、「治療すること」または「治療」とは、症状の軽減、寛解、減少、あるいは疾患、障害、または状態を対象にとってより忍容可能なものにすること（例えば痛みの軽減による）、変性または悪化の速度を減速させること、変性の終点の程度を軽くすること、対象の身体的または精神的健康状態を改善すること、または生存期間を延長することなどの、任意の客観的または主観的パラメータを含む、疾患、障害、または状態の任意の減衰または改善を指す。症状の治療または改善は、身体検査、放射線検査、神経学的検査、および／または精神鑑定の結果を含む、客観的および／または主観的パラメータに基づき得る。

「有効量」または「処置有効量」は本明細書では互換的に用いられ、特定の生物学的結果、例えば、これに限定されるものではないが本明細書に開示され、記載され、または例示される生物学的結果、を達成するのに有効な、本明細書に記載の化合物、材料、または組成物の量を指す。そのような結果としては、これに限定されるものではないが、当文献で好適な任意の手段により決定される、対象における椎間板疾患または障害の処置が挙げられる。

「薬学的に許容される」とは、組成物、製剤、安定性、対象の許容性およびバイオアベイラビリティに関して、薬学的／毒物学的観点から対象にとって、また、物理的／化学的観点から製薬化学者にとって許容可能である特性および／または物質を指す。

「薬学的に許容される担体」とは、活性成分の生物活性の有効性を妨害せず、投与を受ける宿主に対して毒性でない媒体を指す。薬学的に許容される担体の一例は、ヒアルロン酸である。

「ディスコスフィア（ｄｉｓｃｏｓｐｈｅｒｅ）」は、米国特許第８，２２７，２４６Ｂ２号およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２５０６６に記載されており、その全体が参照により本明細書に組込まれる。

椎間板組織からの椎間板細胞の取得
本明細書に記載される椎間板細胞は、椎間板組織から取得することができる。椎間板組織は、髄核組織、移行帯組織、および線維輪組織のいずれをも含み得る。いくつかの場合、椎間板細胞を、椎間板の軟骨終板から取得することができる。他の場合、椎間板細胞を、体内の他の軟骨性組織から取得することができる。

様々な実施形態において、椎間板組織を、生存しているまたは死亡したドナーから取得することができる。ドナーは、哺乳動物、例えば、ヒトであってよい。いくつかの場合、ドナーは組織ドナーであり、レシピエントに遺伝的に関連していなくてもよい。ドナーは、新生児、若年者、成人および高齢者などの、任意の年齢のものであってよい。

様々な実施形態において、椎間板組織は、健康な椎間板組織、または障害もしくは損傷のある椎間板組織であってよい。本明細書で開示される椎間板細胞および方法に用いることができる、障害または損傷のある椎間板組織としては、例えば、変性した組織、ヘルニア組織、痛みのある椎間板から取り出された組織、死亡ドナーから取り出された組織が挙げられる。

様々な実施形態において、組織は、細胞を取得するために直接用いられる。他の実施形態においては、組織は、例えば、凍結保存またはガラス化により、使用前に凍結され、後日用いられる。他の実施形態においては、組織は、細胞が抽出されるまで、特殊培地中で４℃で保持される。組織を、糖、凍結防止剤、安定剤、血清などを含有する培地中で維持することができる。

椎間板細胞の培養
椎間板細胞を、哺乳動物細胞培養において増殖させることができる。多くの場合、細胞培養は、基材を足場とさせる、または、基材を足場とさせないことができる。いくつかの場合、細胞培養は、培地を含み得る。細胞培養培地は、培養物中における哺乳動物細胞の増殖にとって好適な任意の培地、例えば、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＭＥＭ（改変イーグル培地）、ＲＰＭＩ、ＲＰＭＩ１６４０などであってよい。いくつかの場合、培地は、栄養培地、例えば、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｆ１２）などの添加物をさらに含んでもよい。いくつかの場合、細胞培養培地は、さらなる添加物を含んでも、または含まなくてもよい。

様々な実施形態においては、血清を培養培地に添加しても、または添加しなくてもよい。血清は、哺乳動物、例えば、ウシ、ニワトリ、ヤギ、ウマ、ヒト、ヒツジ、ブタ、ウサギなどから誘導される動物血清を指し得る。いくつかの場合、血清を、成体、新生児、または胎仔動物から誘導することができ、例えば、ウシ胎仔血清を、ウシまたはウシ胎仔から取得することができる。いくつかの場合、動物血小板溶解物（例えば、ヒト血小板溶解物）、血清変換された血小板溶解物、動物血清アルブミン（ウシ血清アルブミン）、または別の細胞培養に由来する条件培地（例えば、新生児包皮線維芽細胞条件培地）などの血清添加物を、血清と共に、または血清の代わりに添加してもよい。

いくつかの場合、培養培地中の血清または血清添加物濃度は、０体積％、１体積％、２体積％、３体積％、４体積％、５体積％、６体積％、７体積％、８体積％、９体積％、１０体積％、１１体積％、１２体積％、１３体積％、１４体積％、１５体積％、１６体積％、１７体積％、１８体積％、１９体積％、２０体積％、２５体積％、および３０体積％より高い、および／または約３５体積％、３０体積％、２５体積％、２０体積％、１９体積％、１８体積％、１７体積％、１６体積％、１５体積％、１４体積％、１３体積％、１２体積％、１１体積％、１０体積％、９体積％、８体積％、７体積％、６体積％、５体積％、４体積％、３体積％、２体積％、および１体積％未満であってよい。いくつかの場合、培地中の血清濃度は、０％であってよい。いくつかの実施形態においては、血清濃度は、０〜１７％、０〜５％。５〜１７％または０〜２．５％である。

いくつかの場合、さらなるサプリメントを、培養培地に添加する、または添加しなくてもよい。いくつかの場合、サプリメントは、ホルモンまたは増殖因子であってよい。いくつかの場合、ホルモンまたは増殖因子は、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンギオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２、またはＦＧＦ−β）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヘパトーマ由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）および他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、インスリン、プロゲステロン、プトレシン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウムであってよい。多くの場合、増殖因子は、ＥＧＦおよびｂＦＧＦであってよい。多くの場合、細胞培養培地中のサプリメントの濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、および１ｍｇ／ｍｌより高い、および／または約１．１ｍｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、および１ｎｇ／ｍｌ未満であってよい。いくつかの場合、サプリメントの濃度は、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、１１ｎＭ、１２ｎＭ、１３ｎＭ、１４ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、および１ｍＭより高い、および／または約１．１ｍＭ、１ｍＭ、９００μＭ、８００μＭ、７００μＭ、６００μＭ、５００μＭ、４００μＭ、３００μＭ、２００μＭ、１００μＭ、９０μＭ、８０μＭ、７０μＭ、６０μＭ、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、９μＭ、８μＭ、７μＭ、６μＭ、５μＭ、４μＭ、３μＭ、２μＭ、１μＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１６ｎＭ、１５ｎＭ、１４ｎＭ、１３ｎＭ、１２ｎＭ、１１ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、および１ｎＭ未満であってよい。いくつかの実施形態においては、濃度は、約５〜１１０ｎｇ／ｍｌ、５〜１５ｎｇ／ｍｌ、または９０〜１１０ｎｇ／ｍｌである。

いくつかの場合、細胞培養培地は、神経サプリメントを含んでも、または含まなくてもよい。いくつかの場合、神経サプリメントは、市販の神経サプリメント、例えば、Ｂ２７、Ｎ２、またはＮ１０であってよい。神経培地サプリメントを添加する場合、細胞培養培地中のサプリメントの濃度は、約０Ｘ、１Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、および５Ｘより高い、および／または約１０Ｘ、６Ｘ、５Ｘ、４Ｘ、３Ｘ、２Ｘおよび１Ｘ未満であってよい。他の市販製品としては、ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ、ＡＮＳ Ｎｅｕｒａｌ Ｍｅｄｉａサプリメント、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌサプリメント、Ｂ２８、ＮＳ２１、Ｇ５、Ｎ２１、ＮＳ２１などが挙げられる。

いくつかの場合、細胞培養培地は、哺乳動物細胞培養分野で公知の他の化学物質、分子、サプリメント、または添加物、例えば、アミノ酸、ペプチド、塩、ビタミン、抗生物質、抗かび剤、抗真菌剤、ミネラル、ｐＨ緩衝剤、ｐＨ指示剤、および糖を含んでもよい。多くの場合、細胞培養培地のｐＨは、約６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８および７．９より高い、および／または約８．０、７．９、７．８、７．７、７．６、７．５、７．４、７．３、７．２、７．１、７．０、６．９、６．８、６．７、６．５、６．６、６．４、６．３、６．２、６．１、および６．０未満であってよい。様々な実施形態において、ｐＨは、約６．９〜７．７、７．０〜７．４、または７．３〜７．７である。

椎間板細胞を、単層中で、または懸濁液中で増殖させることができる。いくつかの場合、細胞を、必要に応じてガスおよび培地の交換を可能にする、哺乳動物細胞培養のためのプレート、皿、フラスコ、ローラーフラスコ、およびリアクターなどの細胞無菌容器中で増殖させることができる。様々な実施形態において、容器を静置する、または、容器を例えば回転もしくはローリングにより動かしながら、細胞を増殖させることができる。いくつかの場合、細胞培養培地を、例えば、容器の回転、震とう、またはローリングにより撹拌することができる。また、細胞培養培地を、他の方法で撹拌することもでき、例えば、静置容器中の細胞培養培地を、例えばその中の撹拌棒、撹拌子または他の機械的撹拌機構で物理的に動かすことにより撹拌することができる。いくつかの場合、容器は、培地の撹拌を補助するためのバッフルを含んでもよい。

いくつかの場合、容器を、例えば、細胞の接着を補助する、または阻害するために処理することができる。様々な培養方法を用いて、足場非依存的条件下で細胞を増殖させることができる。一般に、懸濁液中で増殖することができる細胞を、足場非依存的条件で増殖させることができる。例えば、基材への接着なしに増殖および分裂することができる細胞は、足場非依存的であり得る。いくつかの場合、接着を補助するように、例えばゼラチンまたはコラーゲンで、容器をコーティングし得る。いくつかの場合、細胞接着または付着を阻害するように、例えば超低接着表面改変により、容器をコーティングし得る。いくつかの場合、容器は、市販のもの、例えば、超低接着容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ）であってよい。さらに、細胞の自由浮遊懸濁を維持するように、メチルセルロース、ポロキサマー、または寒天／アガロースなどの粘性の非反応性培地添加物を用いる、または用いなくてよい。

いくつかの場合、細胞接着を防止または阻害するよう細胞培養培地に添加物を加える場合、例えば、粘性の非反応性物質を添加する場合、細胞培養培地中の該添加物の濃度は、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％および１５％より高い、および／または約２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％および０．１％未満であってよい。粘性添加物の最終濃度は、用いられる添加物に依存し得、例えば、メチルセルロースを用いる場合、その濃度は約０．６〜０．９％、０．７〜０．８％、または０．７５％であってよい。アガロースを用いる場合、その濃度は、約１〜５％、２〜４％、または３％であってよい。

いくつかの場合、椎間板細胞を、周囲レベルの酸素またはより高レベルもしくは低レベルの酸素を有する雰囲気中で増殖させることができる。多くの場合、周囲レベルの酸素は、２２〜１９％の酸素であり得る。いくつかの場合、細胞を増殖させる雰囲気は、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、および５％未満である、および／または約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％を超える。低酸素状態が望ましいいくつかの実施形態においては、酸素の濃度は約３〜７％、４〜６％、５％または６％であり得る。

表面マーカー
いくつかの場合、椎間板細胞集団は、細胞表面マーカーの発現により特徴付けられ得る。いくつかの場合、椎間板細胞集団は、１または複数の特異的細胞表面マーカーおよび／または分化タンパク質群を発現しても、またはしなくてもよい。様々な実施形態において、椎間板細胞集団は、ゲーティングにより選択される特定マーカーを有する細胞の割合が、参照細胞、例えば、軟骨細胞または脂肪細胞のそれよりも高い、または低くてよい。他の場合、椎間板細胞集団は、ゲーティングにより選択される、ある特定の細胞表面マーカーを有する細胞を、ある割合で含み得る。いくつかの場合、ゲーティングにより選択される、ある特定の細胞表面マーカーを有する細胞の割合は、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％および９０％を超える、および／または約１００％、９０％、８０％、７０％、６０％および５０％未満である。

椎間板細胞集団を特徴付けるのに役立ち得る細胞表面マーカーとしては、これらに限定されるものではないが、ＣＤ２４、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、Ｓｔｒｏ−１、ＨＩＦ１、ネスチン、ＣＫ８、およびＨＬＡタンパク質（ヒト白血球抗原、例えば、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲ）が挙げられる。いくつかの場合、ＣＤ２４は、細胞表面（例えば、リンパ球、顆粒球、および神経芽細胞）にグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合により固定される、細胞表面に発現する糖タンパク質であり得る。ＣＤ２４は、熱安定抗原（ＨＳＡ）とも称される。ＣＤ４４は、細胞間相互作用、細胞接着および移動に関与する細胞表面糖タンパク質を指し得る。ＣＤ７３は、５’−リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼとも称され、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、周皮細胞、濾胞樹状細胞、線維芽細胞、上皮細胞、心筋細胞、ニューロン、骨芽細胞、トロホブラストおよび間葉系幹細胞（ＭＳＣ）上に発現する。ＣＤ９０は、糖タンパク質Ｔｈｙ−１胸腺細胞抗原を指し得る。ＣＤ１０５は、ＴＧＦ−β受容体複合体の糖タンパク質成分であるエンドグリンを指し得る。ＣＤ１６６は、活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）を指し得る。Ｓｔｒｏ−１は、未熟な間葉系幹細胞のマーカーを指し得る。ＨＩＦ−１は、低酸素誘導因子を指し得る。ネスチンは、神経マーカーを指し得る。ＣＫ８は、サイトケラチンマーカーを指し得る。

いくつかの場合、椎間板細胞上の細胞表面タンパク質／マーカーの発現を測定し得る。様々な実施形態において、細胞表面タンパク質発現を、測定される細胞表面タンパク質のエピトープを認識する蛍光抗体を用いることにより測定する。いくつかの場合、測定は、標準的な技術を用いる蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーを用いて行われる。ＦＡＣＳにより測定される場合、発現は、ゲーティングにより選択される、特定の範囲内にある細胞の割合として測定され、ここでゲーティングはＩｇＧコントロールを用いて設定される。いくつかの場合、発現は、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ４４、ＣＤ７３およびＣＤ９０については約７０％よりも高く、ＣＤ２４、ＣＤ１０５およびＣＤ１０６については４０％より低い。

さらに、いくつかの場合、表面マーカーを用いて、特定のサブ集団または細胞を選別、単離、または濃縮することができる。例えば、磁気ビーズ、蛍光マーカーまたは他の技術を用いる細胞選別を用いて、集団内のサブ集団を選択することができる。

遺伝子発現
表面マーカーに加えて、いくつかの場合、ゲノムおよび遺伝子解析を用いて、椎間板細胞を同定する。技術としては、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、マイクロアレイ分析、ウェスタンブロットなどが挙げられる。ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはタンパク質の測定により、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ−グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＳＤＨＡ−コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体、サブユニットＡ、ＨＰＲＴ１−ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、Ｂ２Ｍ−ベータ２ミクログロブリンなど）に対する増加または減少として測定される遺伝子（例えば、転写因子Ｓｏｘ９、細胞外マトリックス成分アグリカン、細胞外マトリックス成分コラーゲン１および２、神経マーカーネスチン、サイトケラチン８、転写因子Ｓｏｘ１、ＣＤ４４（ヒアルロン酸の受容体）、ＡＬＰＩ（アルカリホスファターゼ）、ＰＰＡＲＧ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ）、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテイナーゼ）、ＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）、ＦＭＯＤ（フィブロモジュリン）、インターロイキンなど）の発現を用いて、椎間板細胞を同定することができる。

凍結保存
いくつかの場合、細胞を凍結保存することができる。細胞を、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ、ＨｙＣｒｙｏ、ＵｌｔｒａＣｒｕｚ、Ｃｙａｇｅｎなどの、予め製剤化された凍結保存媒体と混合することができる。あるいは、細胞を、血清、アルブミン、ジメチルスルホキシド、トレハロース、スクロース、他の糖、エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール、ヒアルロン酸、コラーゲン、マトリゲル、他の天然細胞外マトリックス分子などを含有しても、またはしなくてもよい、製剤化された凍結保存媒体と混合することができる。細胞を急速に（ガラス化）、またはゆっくりと（様々な温度で定められた時間経過で、または速度制御された凍結装置により）凍結することができる。細胞を、１０万〜１０００万個の細胞／ｍＬで凍結することができる。

椎間板細胞集団の単離
椎間板組織から椎間板細胞を誘導、取得、または単離する方法を説明する。いくつかの場合、単離された椎間板細胞集団は、自己または非自己ドナーから誘導される。自己ドナーは、椎間板細胞集団が、その細胞を用いて処置される対象から誘導される場合であり得る。同種異系ドナーとも称される非自己ドナーは、異なる対象であり得る。また、生存および／または死亡ドナーから椎間板細胞を取得および調製するための様々な方法も開示する。

多くの場合、椎間板組織から椎間板細胞を単離する方法は、細胞外マトリックスから椎間板細胞を分離することを含む。いくつかの場合、椎間板組織を、機械的、化学的、および／または酵素的に破壊することができる。いくつかの場合、椎間板組織を、切り刻む、スライスする、またはミンチ状にすることができる。いくつかの場合、椎間板組織を、酵素、例えば、コラゲナーゼを用いて処理する。椎間板組織の処理は、細胞外マトリックスの除去に役立ち得る。いくつかの場合、組織を、組織培養処理された皿に、皿の表面に直接接触するよう、培地と共に入れると、組織からプレート上に細胞が移動する。他の場合、細胞を、フィルターを用いて組織から分離する。

細胞外マトリックスは、コラーゲン、プロテオグリカン、および他の分子を含み得る。いくつかの場合、コラーゲンは、動物、例えば哺乳動物中に見出される、天然に存在するタンパク質群を指し得る。天然コラーゲンは、三重らせんを含む長い線維を形成し得る。多くの場合、コラーゲンの３本のらせんは、２つの同一のアルファ１鎖（α１）および１つのアルファ２鎖（α２）を含む。多くの場合、コラーゲンは、転写後に、ヒドロキシル化、架橋、グリコシル化、切断などにより修飾される。コラーゲンを、動物または動物細胞から取得することができる。コラーゲンを、当業者には周知の技術を用いて、哺乳動物細胞および細菌などの非哺乳動物細胞を含む様々な細胞から合成することができる。プロテオグリカンは、グリコシル化されたタンパク質を指し得る。プロテオグリカンは、Ｓｅｒ残基で結合し得る１または複数の硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）鎖（一般に、配列−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−、ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基であり得る）を有し得る。プロテオグリカン鎖は、一般に、生理的条件下で、長く、線状であり、負に荷電している。グリコサミノグリカンを、例えばジメチルメチレンブルー比色アッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイを用いて、細胞からのプロテオグリカン生成を決定する方法としてアッセイすることができる。多くの場合、マイクロマス中のグリコサミノグリカンおよび交換された培地（培地変更による）の両方をアッセイする。いくつかの場合、例えば、ＴＧＦ−Ｂ（トランスフォーミング増殖因子ベータ）または軟骨細胞表現型を生成することが知られる他の増殖因子を含有する軟骨形成促進（prochondrogenic）培地においてマイクロマス培養で増殖させた椎間板細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０μｇより多い、および約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１μｇより少ないｓＧＡＧを生成し得る。多くの場合、これらの結果を、細胞あたりのプロテオグリカン生成を決定するために、細胞数、ＤＮＡ含量またはタンパク質含量に対して正規化し得る。細胞数に対して正規化する場合、その値は、約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６ｎｇ ｓＧＡＧ／細胞より大きい、および１、０．０９、０．０８、０．０７ｎｇ ｓＧＡＧ／細胞より小さいものであり得る。ｓＧＡＧをそのタンパク質含量に対して正規化する場合、その値は、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００ｎｇ ｓＧＡＧ／μｇタンパク質より大きい、および約１０００、９００、８００、７００、６００、５００ｎｇ ｓＧＡＧ／μｇタンパク質より小さいものであり得る。多くの場合、椎間板細胞は、同様の時間にわたって接着非依存的条件で増殖され、またはされていない他の細胞（例えば、線維芽細胞、間葉系幹細胞、または椎間板細胞）よりも多く、または少なく、可溶性プロテオグリカンを生成する。

分化した接着単層細胞培養物に対して特殊培地を用いるＬｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＳｔｅｍＰｒｏ多能性キットを使用するなどの、当業者に公知の技術により、細胞を、脂肪細胞、骨細胞、および神経細胞系列に沿って分化させることができる。骨細胞分化の後、アリザリンレッド染料を用いて石灰化された骨の存在を確認する。脂肪細胞分化の後、オイルレッドＯ染料を用いて脂肪の存在を確認する。神経細胞分化の後に、神経形態の存在を観察する。さらに、遺伝子マーカーを試験して、関連する表現型変化を確認することができる。

細胞は、自己再生を行うことができるものであり得、自己再生は、細胞表現型を変化することなく複製する能力と定義される。この特性を、多くの継代にわたって増殖特性評価によりインビトロで、または連続的な移植および抽出によりインビボで確認することができる。

いくつかの実施形態において、椎間板細胞は、細胞外マトリックス分子を生成し得る。他の実施形態においては、椎間板細胞は、タンパク質を生成し得る。他の実施形態においては、椎間板細胞は、増殖因子を生成し得る。他の実施形態においては、椎間板細胞は、サイトカインを生成し得る。他の実施形態においては、椎間板細胞は、ホルモンを生成し得る。他の実施形態においては、椎間板細胞は、糖を生成し得る。

細胞外マトリックスの除去、減少、または分解の後、椎間板組織に由来する細胞を、接着依存的または接着非依存的培養系に移すことができる。多くの場合、椎間板組織を接着依存的系に付す場合、容器をゼラチンおよび／またはコラーゲンで処理することができる。椎間板組織細胞を接着非依存的培養系に付す場合、培地は、メチルセルロースなどの、ゲルを形成する粘性の非反応性材料を含有し得る。

一旦接着したら、細胞を最大で約１０回継代する（容器から剥離し、より低密度で再懸濁し、再度容器に接着させる）。いくつかの場合、細胞は容器中で決して集密に達しない。他の場合、細胞は容器中で集密に達する。細胞は、標準的な細胞培養技術を用いて継代する。十分な量の細胞が得られたら（ただし、増殖「低下」（すなわち、細胞が有意により低い速度で分裂すること）の前）、細胞を、所望の期間にわたって、粘性の非反応性培地を用いる懸濁培養に移行させる。完了後、細胞を単離し、他の物質を洗い落とし、さらに必要に応じて凍結保存または直接的な治療的使用のために処理する。

ゼラチンまたはコラーゲンでコーティングされた容器上における椎間板組織由来細胞の増殖は、椎間板細胞の成長、増殖、および／または分化を可能にし得る。椎間板細胞を、１，０００〜５０，０００細胞／ｃｍ^２で加えることができる。このような場合、細胞を、血清、ＥＧＦ、およびｂＦＧＦの存在下で増殖させることができる。いくつかの場合、血清添加物を細胞培地に添加することができ、例えば、線維芽細胞培養に由来する条件培地を添加してもよい。これらの場合、非椎間板形成性および低椎間板形成性の細胞を、椎間板細胞と共に成長、増殖、および／または分化することもできる。

足場非依存的条件での椎間板組織由来細胞の増殖は、椎間板細胞の成長、増殖、および／または選抜に役立ち得る。椎間板細胞を、１０，０００細胞／ｍＬで、または８０，０００細胞／ｍＬまで加えることができる。いくつかの場合、神経サプリメント、ｂＦＧＦ、およびＥＧＦを、接着非依存的細胞培養培地に添加してもよい。いくつかの場合、血清を培地に添加しても、または添加しなくてもよい。多くの場合、接着依存的条件で増殖させた椎間板細胞培養物に由来する椎間板細胞は、接着非依存的条件で増殖させた細胞よりも少なく細胞外マトリックスを生成する。

多くの場合、細胞から、細胞培養培地を洗い落とすことができる。いくつかの場合、細胞をＰＢＳ、さらなる培地、凍結保護培地などで洗浄する。いくつかの場合、洗浄前に容器を４℃に冷却して、粘性成分の溶解を補助する。時には、繰り返し遠心分離して、望ましくない成分を除去する。時には、細胞を新しい容器に接着させて、望ましくない成分の除去を可能にする。時には、細胞を担体に接着させて、望ましくない成分の除去を可能にする。時には、化学物質を用いて、望ましくない成分を除去する。

標準的な技術に従って、細胞を、トリプシン、組換えトリプシン、アキュターゼ、ＨｙＱＴａｓｅ、ＴｒｙｐＬＥなどの酵素を用いて、容器または他の細胞から剥離または分離してもよく、またはしなくてもよい。細胞を、さらなる培地と混合して、様々な速度で、例えば、異なる細胞密度（単一の細胞とクラスター）の分離を可能にする低速、底部に細胞濃縮物を形成させるための標準的速度、密な細胞ペレットを形成させるための高速などで、遠心分離することができる。

多くの実施形態において、椎間板細胞集団は、インビボで椎間板組織を回復させる、再生する、および／または増殖させる能力を特徴とする。例えば、椎間板細胞集団は、損傷または障害のある椎間板を有する対象において、損傷または障害のある椎間板を回復させることができる。多くの実施形態においては、対象の損傷椎間板への椎間板細胞集団の導入は、椎間板高を、ほぼ損傷前の高さまで回復させる。

細胞形態
椎間板細胞は、単核であり得る。椎間板細胞は、多核であり得る。椎間板細胞は、ミトコンドリア、ゴルジ体、およびリボソームなどの細胞小器官を有し得る。椎間板細胞の生存能力を、トリパンブルー、アラマーブルー、live/deadアッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、または他のアッセイにより示すことができる。椎間板細胞は、増殖可能であり得る。椎間板細胞は、細胞外マトリックス生成可能であり得る。

接着非依存的条件下で増殖させた椎間板細胞は、単層として増殖させた椎間板細胞とは異なる形態を有し得る。例えば、接着非依存的細胞培養に由来する椎間板細胞は、単離された丸い細胞であってよい。あるいは、それらは他の細胞および／または丸い細胞の集合体と緩く結合した細胞クラスターを形成してよい。あるいは、それらは、ディスコスフィアとして知られる密な細胞クラスターを形成してもよい。椎間板細胞クラスターは、十分な増殖後、約５０μｍを超える少なくとも１つの寸法を有し得る。椎間板細胞は、単離された丸い細胞として始まり、時間と共に、いくつかの細胞が増殖してクラスターまたはディスコスフィアを形成してもよい。その時間は、１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、１４、２１、または２８日間であり得る。椎間板細胞は、結合した細胞外マトリックス、例えばプロテオグリカンおよびコラーゲンを有してもよい。

細胞集団
椎間板細胞集団の一実施形態においては、細胞は、これらに限定されるものではないが、以下の細胞：軟骨細胞、線維芽細胞、髄核細胞、線維輪細胞、間葉系幹細胞、幹細胞、前駆細胞、軟骨性細胞のうちの１または複数を含んでよい。椎間板細胞団の別の実施形態においては、細胞は、これらに限定されるものではないが、エクスビボで改変された以下の細胞：軟骨細胞、線維芽細胞、髄核細胞、線維輪細胞、間葉系幹細胞、幹細胞、前駆細胞、軟骨性細胞のうちの１または複数を含んでよい。椎間板細胞集団の別の実施形態においては、集団は、以下のもの：単離された細胞、または集合した細胞のクラスター、またはディスコスフィアのうちの１または複数を含んでよい。椎間板細胞集団の別の実施形態においては、細胞を分離して、単離された細胞の集団を形成させることができる。椎間板細胞集団の別の実施形態においては、細胞を凝集させて、少なくとも１つのマイクロマスを形成させることができる。別の実施形態においては、椎間板細胞は、細胞を分離する前に、より処置有効性であり得る。

椎間板細胞集団の治療的使用
椎間板細胞を、損傷組織に直接送達することができる。有効量の椎間板細胞を、移植を補助するための薬学的に許容される生体材料足場と混合しても、またはしなくてもよい。例えば、ヒアルロン酸、コラーゲンまたは他の細胞外マトリックス分子を含有する、粘性の天然材料を用いることができる。あるいは、固形の天然材料を用いることができる。いくつかの場合、安定性のために添加物を含有させることができる。いくつかの場合、添加物を、凍結保存を補助するために含有させることができる。

椎間板細胞の投与により、障害のある椎間板を修復でき、および／または椎間板の構造を再生させることができ、それによって、変性椎間板疾患および他の椎間板損傷を回復または安定化できることが、本発明に従って見出された。また、そのような細胞を損傷椎間板を有する対象に投与すると、損傷前の椎間板高が部分的に回復することも見出された。従って、本発明は、少なくとも１つの椎間板に障害または損傷を有する対象を処置するのに使用するために、椎間板細胞を単離する、および増殖させるための方法を特徴とする。この方法は通例、損なわれた椎間板の修復および／または再生が起こるように、処置有効量の椎間板細胞を対象に投与することを含む。

非常に好ましい態様において、前記方法は、脊柱または他の軟骨性組織から取得または単離された細胞を、少なくとも１つの障害または障害椎間板の処置を必要とする対象に投与することを含み、ここで、前記細胞は、培養物中で自己再生および／または増殖することができる。脊柱および軟骨性組織から単離された細胞を、投与前に培養物中で増殖または維持することができる。

本明細書に開示される方法において、椎間板細胞を、生物活性物質と組み合わせて投与することができる。椎間板細胞を、生物活性物質と逐次または同時に投与することができる。溶解物、可溶性細胞画分、膜に富む細胞画分、タンパク質、増殖因子、ホルモン、細胞培養培地（例えば、条件培地）、または、脊髄、椎間板もしくは軟骨性組織または椎間板細胞から誘導される細胞外マトリックスも、必要に応じて対象に投与することができ、例えば、椎間板細胞および他の細胞または物質を併用することができる。選択した特定の物質を、提供者からのキットの一部として送達することができる。あるいは、特定の物質は、対象の処置に当たる医療専門家の裁量にあってよく、対象の特定の必要性または状態に応じて異なり得る。選択される物質は、これらに限定されるものではないが、細胞投与の促進、椎間板の修復および／または再生の改善、対象の全体的な健康の改善、疼痛の軽減、および／または移植細胞の生存性の強化などの、様々な目的のために用いることができる。

細胞を、注射により対象に投与することができる。例えば、細胞を、対象の１または複数の椎間板に直接注射することができる。多くの場合、細胞を、椎間板の髄核、移行帯、または線維輪に注射することができる。椎間板細胞を、単独で、または生物活性物質もしくは処置活性物質、および／または足場もしくはマトリックス剤と組み合わせて投与することができる。

いくつかの実施形態においては、椎間板細胞集団を、対象に移植することができる。例えば、椎間板細胞集団を、損傷または障害のある椎間板に外科的に移植することができる。いくつかの実施形態においては、椎間板細胞集団を、椎間板の全部または一部が除去された椎間板腔に外科的に移植することができる。いくつかの実施形態においては、椎間板細胞集団を、人工椎間板または椎間板置換物の一部として、椎間板腔に移植することができる。

細胞を、足場−またはマトリックス−細胞複合体として投与することもできる。足場およびマトリックス構成物としては、これらに限定されるものではないが、タンパク質、ヒドロゲル、合成ポリマー、およびそれらの組合せが挙げられる。足場およびマトリックス構成物は、生分解性であっても、またはなくてもよい。そのような材料は、治療的処置、外科的修復、組織工学、および創傷治癒の分野において公知である。足場−およびマトリックス−細胞組成物を、これらに限定されるものではないが、移植、注射、外科的付着、他の組織を伴う移植などの、当分野で公知の任意の方法で対象の体内に導入することができる。いくつかの実施形態においては、インビボ、またはさらにより好ましくは、インサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）でのマトリックス形態、例えば、インサイチューで重合可能なゲルを、本発明に従って用いることができる。そのようなゲルの例は、当分野で公知である。

椎間板細胞を、移植前に足場およびマトリックスと混合する、またはインビトロでそのような組成物上に播種することができ、それにより細胞を増殖させ、および／または細胞外マトリックスを確立することができる。いくつかの場合、マトリックスは、哺乳動物椎間板構造と類似し、マトリックスは対象中において１つの椎間板全体を置換することができる。いくつかの場合、マトリックスは、治療剤を含んでもよい。

椎間板細胞を用いて、インビトロまたはインビボで人工椎間板置換デバイスを作製することができる。一例においては、ポリウレタンなどの適当な非吸収性材料を用いて、人工外輪を作製する。別の例においては、ポリグリコール酸またはポリ乳酸などの吸収性材料を用いる。この人工輪は、足場材料、マトリックス材料、担体材料、増殖因子、および／または他の生物活性物質のうちの少なくとも１つと組み合わせても、または組み合わせなくてもよい椎間板細胞のための容器として機能する。多くの実施形態において、人工輪構造は多孔性および／または線維性であり得る。人工外輪は、それを１または複数の椎体に固定することができるように、アタッチメント手段を含み得る。例えば、人工輪は、１または複数の椎体へのネジ固定を可能にするための、スルーホール、カフ、タブ、ループ、またはワッシャを含み得る。人工椎間板を対象に外科的に移植して、椎間板を全置換することができる。

人工椎間板置換デバイスは、本発明の椎間板細胞を含み得る。様々な実施形態において、椎間板細胞を、人工輪構造中に挿入することができる。人工輪構造は、椎間板細胞のための格納構造を提供するように設計することができ、また、１または複数の椎体に椎間板置換デバイスをしっかりと取り付けるためのアタッチメント構造をさらに含んでよい。

椎間板細胞は、椎間板置換デバイスを挿入する時点、またはほぼその時点で、人工椎間板置換デバイスに加える。他の実施形態においては、椎間板細胞を、該細胞が増殖し、分裂し、マトリックスまたは足場材料を提供することができるように、挿入よりかなり前に椎間板置換デバイスに加える。多くの実施形態において、足場材料、マトリックス材料、担体材料、増殖因子、および／または他の生物活性物質を、椎間板置換デバイスに、椎間板細胞を加える前、その後、またはそれと共に添加することができる。

人工椎間板置換デバイスは、吸収性または非吸収性の人工輪を含んでよい。いくつかの実施形態において、人工輪は、椎間板細胞の増殖を支援するのに役立つマトリックス材料、足場、増殖因子、または他の生物活性物質を含んでよい。一実施形態においては、人工輪は、線維輪細胞の増殖および／または分化を、例えば、線維輪細胞への椎間板細胞分化を促進し得る局部の増殖因子源および／またはサイトカイン源を提供することにより、支援する。多くの実施形態において、椎間板細胞を含む人工椎間板置換デバイスは、非人工椎間板の、例えば、線維輪、髄核、および終板組織を含むセル状構造と同様の、セル状構造を有し得る。

いくつかの場合、椎間板細胞および足場を、液体窒素中で凍結保存し得る。あるいは、それらを−８０℃、−２０℃、または−１℃などの、様々な氷点下温度で保存することができる。さらに、椎間板細胞を、４℃または３７℃で保存することができる。椎間板細胞を、保存前に足場と組み合わせることができる。あるいは、椎間板細胞を、移植直前に足場と組み合わせる、または組み合わせなくてもよい。

かくして、有効な処置は、処置剤、マトリックス、または足場の存在下または不存在下に椎間板細胞を含む処置用細胞組成物を用いて、椎間板に障害、異常、または外傷を有する対象を処置することを含む。該細胞は、例えば、直接のプロテオグリカン生成、または天然細胞再生の刺激を促進するのに有効な量で存在する。その結果は、ウサギモデルにおいて示されるように、天然組織構造の再生、修復、または再構築であり得る。これを、医学的画像化（Ｘ線、ＭＲＩ）または疼痛の軽減により決定することができる。ヒト椎間板中への移植の場合、細胞量は、椎間板細胞集団または椎間板細胞から抽出されたサブ集団を含み、１，０００〜１０，０００，０００であり得る。また、足場体積は、対象の空間的必要性に応じて、１０μＬ〜１０００μＬ、または１０ｍｇ〜１０ｇの範囲であり得る。

いくつかの実施形態において、椎間板細胞中の１または複数の細胞サブ集団を移植することができる。このサブ集団は、選別のための磁気ビーズ、選別のための蛍光マーカー、密度勾配、選別のための蛍光遺伝子タグ付け、物理的分離、濾過などを用いて単離することができる。このサブ集団は、全集団と比較して、より処置有効性であり得る。

対象の処置において、椎間板細胞は、接着依存的椎間板細胞、または髄核細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、幹細胞、前駆細胞などの他の細胞集団と比較して、優れた処置効果を提供することができる。この効果を、足場、担体または他の生体材料の使用により改善しても、またはしなくてもよい。

本発明は、本発明の方法を実施するためのキットをも特徴とする。一態様において、少なくとも１つの椎間板に障害または損傷を有する対象を処置するためのキットが提供される。キットは、薬学的に許容される担体；前記障害または損傷を処置するのに有効な量の椎間板細胞；および、少なくとも１つの椎間板に障害または損傷を有する対象を処置する方法においてキットを用いるための説明書を含み得る。キットは、少なくとも１つの作用物質および細胞を培養するための説明書をさらに含んでもよい。キットは、少なくとも１つの生物活性物質または処置活性物質をさらに含んでもよい。キットは、バイアルおよびシリンジをさらに含んでもよい。キットは、椎間板への直接的進入のためのディスコグラフィ用針をさらに含んでもよい。キットは、施術中の画像化を補助するためのＸ線不透過性物質をさらに含んでもよい。

実験の詳細
材料および方法
供給者／薬剤：
いくつかの場合、接着依存的細胞培養を、増殖条件と称し得る。増殖培地を、増殖条件での細胞の増殖のために用いることができる。増殖培地は、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を含有した。この培地の３０％を、場合により、新生児包皮線維芽細胞の存在下に３日間、予め馴化してもよい。この予め馴化した分を、使用前に濾過した。増殖培地を細胞に加える前に、ｂＦＧＦおよびＥＧＦを添加して、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦの最終濃度で培地を「完全」にする（保存された１０００Ｘストック溶液から得る）。

いくつかの場合、接着非依存的細胞培養を、懸濁条件と称し得る。懸濁培地を、懸濁条件での細胞の増殖のために用いることができる。懸濁培地は、１Ｘ Ｂ２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５％ウシ胎仔血清、１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、および１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中に１％Ａ４Ｍ Ｐｒｅｍｉｕｍメチルセルロース（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含有した。懸濁流加培地は、メチルセルロースを含まない、同じものである。

増殖のために、コラーゲン、ゼラチンまたは他の同様のマトリックスタンパク質でコーティングしたプレートまたはフラスコを用いた。そのような既製の容器を購入した。あるいは、１ＬのｄｄＨ２Ｏ（再蒸溜水）に１ｇの粉末ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）を溶解することにより、手作業でプレートをコーティングする、または既製の溶液（Ｓｉｇｍａ）を１％の最終濃度に希釈して用いることによりプレートを調製することができる。実験室においてコーティングした場合は、容器を室温で１５分以上インキュベートする。懸濁のためには、Ｃｏｒｎｉｎｇの超低接着容器を用いた。

いくつかの場合、インビボで細胞を移植するのに、粘性足場担体を使用した。特に、ＰＢＳ中の１．７％ヒアルロン酸（０．８〜１．２ＭＤａ）から成る既製の滅菌ゲルを、ヒト血清アルブミンおよび３０，０００個の椎間板細胞で希釈して、２．５％ヒト血清アルブミンを含む１％ヒアルロン酸ゲルを得た。これを、滅菌した５０μｌのガラス製Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジに入れた。動物への移植のために、２７ゲージのＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｇｌｉｄｅ針をＨａｍｉｌｔｏｎシリンジにルアーロックにより取り付けた。

方法：
ＩＲＢに承認されたプロトコールを用いて、手術を受けたドナーから同意の下、ヒト成人髄核組織を得る。様々な実施形態において、組織を、様々な供給源および組織、例えば、生存および死亡非自己ドナー、自己ドナー、椎間板組織、または他の軟骨性組織から取得することができる。線維輪および軟骨終板を含む非髄核組織を、手作業で切除し、廃棄した。得られた組織２〜７ｇを、Ｔ７５フラスコ中、３００単位／ｍｌのコラゲナーゼＩＩを含有する１５ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２と混合し、標準的な組織培養条件（３７℃および５％ＣＯ_２）下で一晩インキュベートした。次に、遊離細胞を５０ｍｌチューブに移し、遠心により細胞を沈降させ（４分間、１２００ｒｐｍ）、上清を除去し、細胞を約１０，０００細胞／ｍｌの最終濃度にＤＭＥＭ／Ｆ１２中に再懸濁した。

別法として、細胞を凍結保存バイアル（液体窒素中で保存）から、３７℃の水浴中で解凍し、すぐに１０ｍＬの増殖培地を含有する１５ｍＬチューブに移すことにより取得した。次いで、細胞混合物を１２００ｒｐｍで４分間遠心した。上清を吸引し、細胞を増殖培地に再懸濁して、細胞を計数し、生存能力を確認した。

増殖のために、細胞を、完全増殖培地に１０，０００細胞／ｍＬで播種し、２〜３日毎に培地を交換した。集密となる前に、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシンと共に７分間インキュベートした後、増殖培地を用いてプレートから取り出し、５０ｍｌ円錐チューブに移した。チューブを前記のように遠心し、トリプシンを含有する上清を除去した。次いで、細胞の計数および生存能力のチェックを可能とするよう、細胞を増殖培地に再懸濁した。この時点で、５０万〜３００万個の細胞を９０％ＦＢＳ／１０％ＤＭＳＯと凍結バイアル中で混合することにより、細胞を凍結保存することができた。内容物を凍結するために、凍結バイアルを−８０で一晩保存した後、長期保存のために液体窒素の蒸気相に移した。

懸濁培養のために、細胞を１０，０００細胞／ｍｌで懸濁培地と混合し（合計１５ｍｌ）、超低接着１００ｍｍプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れた。２日毎に、３００μｌの懸濁流加培地をプレートに加えた。図２に記載のように、位相差光学顕微鏡を用いて４Ｘ、１０Ｘおよび２０Ｘで画像を撮影した。２週間後、プレートを４℃で２０分間インキュベートし、次いでゲル様培地を１５ｍＬのＰＢＳで希釈することにより、細胞を採取した。次いで、プレートの内容物を１５ｍＬチューブに移し、さらにＰＢＳを加えて体積を５０ｍＬに増加させ、１２００ｒｐｍで４分間遠心し、上清を除去した。次いで、この方法でさらに２回、細胞を洗浄して、確実にメチルセルロースを除去した。最後に、細胞の計数および生存能力のチェックを可能にするよう、椎間板細胞を増殖培地に再懸濁した。

表面マーカー発現を決定するために、椎間板細胞を０．２５％トリプシンで７分間処理して、単一細胞懸濁液とする。試験に用いたさらなる細胞集団は、増殖培養に由来する前椎間板細胞（ｐｒｅ−ｄｉｓｃｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ）、ヒト成人間葉系幹細胞（ＣＥＴ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ヒト新生児包皮線維芽細胞（ＡＡＴＣ）、およびヒト成人関節軟骨細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）を含んだ。Ｐａｒｔｅｃ ＣｙＦｌｏｗフローサイトメーターを用いて、標準的な技術により細胞を解析した。簡単に述べると、７０，０００個の細胞および抗体（チューブあたり１種類）を、０．５％ウシ血清アルブミンを含有する２００μｌのＰＢＳで希釈し、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。以下の抗体を用いた：ＣＤ７３−ＰＥ（ＢＤ）、ＣＤ９０−ＰＥ−Ｃｙ５（ＢＤ）、ＣＤ１０５−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＣＤ１６６−ＰＥ（ＢＤ）、ＨＬＡ−ＡＢＣ（ＢＤ）およびコントロール。この作業を２回実施し、１つの代表的なデータセットを示す。

軟骨形成促進環境におけるプロテオグリカン生成を決定するために、標準的な軟骨細胞ペレットアッセイを用いた。簡単に述べると、２００，０００個の細胞（椎間板細胞または間葉系幹細胞）を、２００μｌの軟骨形成促進培地（ＳｔｅｍＰｒｏ培地、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む９６穴プレートの個々の円錐ウェルに入れ、短時間遠心した。３日毎に、形成された中央のマイクロマスを吸引しないように注意しながら、培地を除去し、回収し、交換した。２週間後（図３を参照されたい）、細胞ペレットを採り、乾燥し、バッファー中、６０℃で、２５０μｌのパパイン（Ｓｉｇｍａ）により一晩消化した。消化物、また、回収した培地を、標準的なＤＭＭＢアッセイを用いて、プロテオグリカンの成分であるｓＧＡＧ含量についてアッセイした。特に、ＤＭＭＢ作用溶液を作製するために、１ｇのギ酸ナトリウムを、４９０ｍＬの脱イオン水に溶解し、１ｍＬのギ酸を加えた。別のチューブにおいて、８ｍｇのジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）粉末（Ｓｉｇｍａ）を、２．５ｍＬのエタノールと混合して溶解し、２つの溶液を混合した。次いで、水を加えて体積を５００ｍＬにした。コンドロイチン−６−硫酸標準を作製するために、４０ｍｇのコンドロイチン−６−硫酸（Ｃ６Ｓ）を、４０ｍＬの水と混合して、１ｍｇ／ｍＬの標準溶液（ストック）を作製した。次いで、ストックを希釈して、０、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０μｇ／ｍＬとした。プロテオグリカン量をアッセイするために、１００μｌの標準または試料を１００μｌのＤＭＭＢ作用溶液と９６穴透明プレート中で混合し、５分以内に５２５ｎｍで測定した。標準を用いて試料の濃度を決定した後、その濃度を元の体積に対して正規化して量を決定した。さらに、消化物を、Ｐｉｅｒｃｅタンパク質アッセイを製造者の説明書に従って用いてタンパク質量について、またはＱｕａｎｔｉ−ＩＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の説明書に従って用いてＤＮＡ量についてアッセイした。

骨形成能力および脂肪生成能力を決定するために（図４）、製造者の説明書に従ってＳｔｅｍＰｒｏ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ Ｋｉｔｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、椎間板細胞を増殖させた。

インビボでの効能を評価するために、３０，０００個の椎間板細胞を、２．５％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ中の１％ヒアルロン酸（０．８〜１．２ＭＤａ）２５μｌと混合した。細胞および粘性足場を、５０μｌのガラス製Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジに入れた。予め内部検証した変性椎間板疾患モデルを用いて、３匹のＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄウサギの腰部椎間板に外科的にアクセスし、針で穿刺して変性を誘導した（ｎ＝４つの椎間板／動物、地元ＩＡＣＵＣにより承認）。２週間後、損傷椎間板に、細胞または無細胞足場コントロールを注射した。さらに、損傷および未損傷コントロール腰部椎間板を、それぞれの動物中で維持した。６週間にわたって２週間毎に、椎間板高を単純Ｘ線撮影により測定し、週０での値に対して正規化し、椎間板高指数（ＤＨＩ）を得た。６週間後、ウサギを安楽死させた。椎間板を採り、組織学的分析のために処理した。切片をＨ＆Ｅまたはアルシアンブルーで染色し、異常を盲検的にスコア化した；ＡＦ／ＮＰ境界、ＡＦ構成、ＮＰ細胞外マトリックス、およびＮＰ細胞性（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）（ＡＦ−線維輪；ＮＰ−髄核）について０〜２のスコアを割り当てた。４つの結果を合計した（０＝正常、８＝異常）。

以下の実施例は、本開示の微環境の実施形態の調製および特性を詳細に説明するものである。構成、材料、および方法のいずれに対しても多くの改変を、本開示の範囲から逸脱することなく実施できることが、当業者には明らかである。

ＦＡＣＳ分析による、様々な種類の細胞の表面マーカー発現
椎間板細胞を含む様々な細胞について、細胞表面マーカー発現を分析した。図１に示すように、試験したヒト細胞の種類は、成人間葉系幹細胞、新生児包皮線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏ．）、関節軟骨細胞（Ｃｈｏｎｄｒｏ．）、足場依存的椎間板細胞（ＡＤ−ＤＣ）、足場非依存的椎間板細胞（ＡＩ−ＤＣ）を含んだ。図１Ａは、標準的なＩｇＧゲーティングに基づき、所与のマーカーを発現する細胞のパーセントを示す。ＤＣ細胞は、他の種類の細胞と比較して低いＣＤ１０５およびＣＤ１６６発現を示す。他の表面マーカーは、ＤＣに独特な表現型フィンガープリントを特定するために調べられている。図１Ｂは、椎間板細胞が独特のパターンを示した、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６に関する、ＭＳＣ、前椎間板細胞および椎間板細胞の代表的な細胞マーカーフローサイトメトリー分析を示す。

懸濁培養における椎間板細胞の形態
椎間板細胞の形態を調査した。図２Ａは、ディスコスフィアとして知られる密な球体（*）、緩い細胞凝集体（**）、および単一の細胞（***）からなる椎間板細胞を示す顕微鏡写真である。図２Ｂは、ディスコスフィアおよび凝集体の直径は様々で、典型的には５０μｍより大きいことを示す。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および椎間板細胞（ＤＣ）の軟骨形成能力
図３は、間葉系幹細胞および椎間板細胞の軟骨形成能力の分析を示す。図３Ａは、軟骨形成促進環境で２週間増殖後の細胞の形態を示す。示されるように、ＤＣはＭＳＣより大きいマイクロマスを生成する。図３Ｂは、ＭＳＣおよびＤＣによるタンパク質およびＧＡＧの生成を比較するグラフである。示されるように、ＤＣが、ＭＳＣと比較して、より多くのｓＧＡＧ（プロテオグリカンの成分）を生成したことが、培地および消化したマイクロマスのいずれからの回収においても示された。一方、各マイクロマスのタンパク質量は同程度であった。

椎間板細胞集団の脂肪生成能力および骨形成能力
図４Ａは、脂肪生成培地において製造者（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の説明書に従って分化させた後、ヘマトキシリンで対比染色したオイルレッドＯ染色により、脂質生成が確認されたことを示す。図４Ｂは、骨形成培地において製造者（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の説明書に従って分化させた後、アリザリンレッド染色により、骨形成が確認されたことを示す（スケール＝５０μｍ）。

live/deadアッセイによる、治療的使用前の様々な段階での椎間板細胞の生存能力（緑色は生存を、赤色は死を示す）
図５Ａは、粘性ヒアルロン酸足場中で２４時間後に生存能力が確認されることを示す。ここで、大部分の細胞が生存している（明るい細胞；いくつかの死細胞が矢印で示される）。図５Ｂは、ウサギへの外科的移植のために用いられた２７ゲージ外科用針から押し出された後にも、生存能力（明るい細胞）が確認されることを示す。

粘性足場担体を用いる椎間板細胞の治療的使用
図６は、ＤＤＤを処置するために椎間板細胞を使用する実施形態および工程を示す略図である。図６（Ａ）は、注射による椎間板細胞の使用を示す。細胞と足場とを混合し、シリンジまたはバイアルに予め充填し得る。細胞と足場とは別々であってよく、注射の直前に混合し得る。調製物をシリンジまたはフォルスボトムバイアルから送達することができる。調製物を、変性椎間板に直接注射する。図６（Ｂ）は、椎間板細胞の移植を示す。細胞と足場とを混合する、または別々に送達することができる。移植に先立ち、材料を、意図される移植領域を満たすように切断または調整する。次いで、材料を欠陥部に移植する。細胞は、移植後に加えてもよい（図示せず）。記載するインビボ動物試験においては、細胞と足場とを混合し、バイアル中で４℃で輸送し、内容物を注射直前にシリンジに入れた。

変性椎間板疾患のウサギモデルにおける、粘性足場担体中の椎間板細胞の効能
図７Ａは、足場担体内の椎間板細胞療法が、４週および６週の時点で、コントロール群と比較して椎間板高指数（ＤＨＩ）を回復させたことを示すグラフである。コントロール群はいずれも、２週、４週および６週の時点の間で一貫性を示した。Ｎ＝３、*は、二元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙのポストホック検定により、足場コントロールおよび損傷コントロールいずれとの比較においてもｐ＜０．００１であることを示す。図７Ｂは、組織学的スコアを示すグラフである。６週時点での椎間板の盲検スコア（０〜８、０＝正常）。細胞療法は、損傷コントロールおよび足場コントロールと比較して有意な改善を示した。**は、足場コントロールとの比較においてｐ＜０．０５であることを示し、*は損傷コントロールとの比較においてｐ＜０．０５であることを示す（ｔ検定による）。

椎間板細胞の生成および評価
材料および方法
椎間板細胞の生成
説明する手順を、図８のフロー図に示す。まず、椎間板切除術に由来する廃棄物であるヒト成人髄核組織を、ＩＲＢの承認の下、同意したドナーから入手した（Ｂａｐｔｉｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ＴＮ）。線維輪および他の組織夾雑物を、切除により取り除いた。次いで、残存する材料を、ＰＢＳ中の２Ｘ抗生物質−抗真菌剤（ＡＢＡＭ、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＨｙＣｌｏｎｅ）を用いて３回洗浄し、１Ｘ ＡＢＡＭを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３００単位の組換え２型コラゲナーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により一晩消化した。単離された細胞を、ゼラチンコーティングしたフラスコにおいて増殖培地（１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）に播種し、時間と共に、幹細胞／前駆細胞から構成される細胞サブ集団がプレートに接着した。これらの細胞を、最大で４回まで継代して増殖させた。

次に、超低接着容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）において、細胞を、１％メチルセルロース（Ａ４Ｍ Ｐｒｅｍｉｕｍ，Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の存在下で懸濁培地と組み合わせた（５％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ−２を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中、１０，０００細胞／ｃｍ^２）（１ｃｍ^２あたり１．５ｍＬの培地を加えた）。２週間後、細胞を、さらなる使用のために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＧｒｏ；Ｍａｎａｎｎａｓ ＶＡ）で３回洗浄してメチルセルロースを除去することにより採取した。椎間板細胞を、５人の異なるヒトドナーから生成した。椎間板細胞の懸濁液を、１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｒｄｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で１５分間固定した。

椎間板細胞の組織学
次に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、細胞を３７℃のアガロース中に再懸濁した（Ｓｉｇｍａによる１％ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔ低ゲル化温度アガロースにおいて、０．５ｍＬあたり約１ｘ１０^７個の細胞）。アガロースが凝固したら、そのペレットを、凍結させるまではＰＢＳ中に保持し、Ｌｅｉｃａ ＣｒｙｏｓｔａｔにおいてＯＣＴ培地（Ｓａｋｕｒａ Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ；Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）中で凍結させ、荷電スライド上で６μｍの厚さに切片化した。次いで、試料を、標準的なプロトコールに従って、ヘマトキシリンおよびエオシン、アルシアンブルーおよびヌクレアファストレッド対比染色、またはピクロシリウスレッドのいずれかで染色した。１人の代表的なドナーに由来する組織を示す。

共焦点顕微鏡観察
椎間板細胞の懸濁液を、１０％ホルマリン中で１５分間固定し、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ １００Ｘ、Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）で３回洗浄した。続いて、固定された細胞を用いて、ＰＢＳＴＡ（ＰＢＳＴ＋０．５％ヒトアルブミン、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｗｅｓｔｌａｋｅ Ｖｉｌｌａｇｅ ＣＡ）中の一次抗体を、抗ヒトアグリカン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｄａｌｌａｓ ＴＸ）については１：１００に、抗コラーゲンＩＩ抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ；Ｉｏｗａ Ｃｉｔｙ，Ｉｏｗａ）については１：２０に希釈し、室温で２時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、細胞に、アグリカンについてはＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ ４８８を、コラーゲンＩＩについてはＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ ６３３を（いずれもＰＢＳＴＡ中で）室温で１時間にわたり結合させ、ＰＢＳＴで３回洗浄した。最後に、細胞核およびアクチンについては、細胞をそれぞれ、ＤＡＰＩおよびＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で対比染色し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点顕微鏡を用いて画像化した。１人の代表的なドナーに由来する組織を示す。

フローサイトメトリー
椎間板細胞の細胞表面抗原発現を、以下の蛍光標識マウス抗ヒトモノクローナル抗体：ＣＤ１０５−フィコエリトリン（ＰＥ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）；Ｓｔｒｏ−１−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）；ＣＤ１６６−ＰＥ、ＣＤ７３−ＡＰＣ、およびＣＤ９０−ＦＩＴＣ、ＣＤ４４−ＦＩＴＣ、ＣＤ−２４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ３４−ＰＥ、ＨＬＡ−ＤＲＤＰ−ＦＩＴＣ、ＨＬＡ−ＡＢＣ−ＦＩＴＣ（全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡから）を用いてフローサイトメトリーにより解析した。適切なアイソタイプコントロールのランも並行して行った。細胞を、５０％マウス血清を含有するＰＢＳ中、４℃で３０分間インキュベートした後、１．０％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ中で洗浄および再懸濁した。ＤＡＰＩジラクテート（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、生細胞量を測定した。データの取得および解析のために、ＦｌｏｗＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用い、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、最低２０，０００イベントを収集した。

多分化能
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）により提供されたキットを用いて、骨形成および脂肪生成を誘導した。簡単に述べると、ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１５分間にわたって椎間板細胞を解離させて、単一細胞懸濁液を形成し、２０，０００細胞／ｃｍ^２で組織培養処理皿上に播種した。骨形成および脂肪生成分化のための細胞の皿を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で３日間維持した後、適切な補充分化培地を３週間供給した。分化後、単層を、石灰化についてはアリザリンレッドで、または脂肪分についてはオイルレッドＯで、指示通りに染色した。位相画像を様々な倍率で捕捉した。試験を４人の異なるドナーに対して行った。

軟骨形成を、［Johnstone 1998］に記載のように誘導した。簡単に述べると、２５０，０００個の細胞を、２００μｌの軟骨形成培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に、９６穴プレートの個々の円錐ウェルに入れ、短時間遠心した。３日毎に、形成された中央のマイクロマスを吸引しないように注意しながら、培地を完全に除去し、回収し、交換した。２週間後、細胞マイクロマスを採り、乾燥し、６０℃で、２５０μｌのパパイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により一晩消化した。消化物、また、回収した培地を、［Farnesdale］に記載のようにＧＡＧ含量についてアッセイした。さらに、消化物を、Ｑｕａｎｔ−ＩＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡ含量についてアッセイし、その結果を正規化してＧＡＧ／ＤＮＡを評価した。

比較のために、椎間板細胞の軟骨形成能力を、他の周知のヒト成人細胞系と比較して評価した。関節軟骨細胞（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、骨髄由来間葉系幹細胞（ＣＥＴ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、および皮膚線維芽細胞（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）を購入し、提供された説明書に従って増殖させた。

結果
組織学、共焦点顕微鏡観察および遺伝子発現
椎間板細胞を、アグリカンおよびコラーゲン生成についてアッセイした。ノン-プラスチック（non-plastic）接着培養において、２週間後に、個々のＮＰ由来幹細胞／前駆細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に埋まった様々な大きさのクラスターに増殖した。マトリックスは、髄核組織の主成分であるプロテオグリカンおよび様々なコラーゲンから構成されていた（図９Ａ〜Ｃ）。共焦点画像化により、ＥＣＭ中のアグリカンおよびコラーゲン２を確認した（クラスターによりマトリックス内容が異なることがわかった）（図９Ｄ）。さらに、高倍率画像により、細胞内および細胞外両方のアグリカンが示され（図９Ｅ）、これは、画像化の時点における細胞外へのＥＣＭ分子の能動輸送を示唆する。

図９Ｆに示すように、アグリカンおよびコラーゲン２の発現を、培養中に経時的に（３日目および７日目）、細胞採取時に（１４日目）、および軟骨形成分化の後に、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴと比較して評価した。培養期間中に細胞外マトリックス分子の発現は有意に増加し、プラスチック（plastic）接着細胞と比較して、アグリカンの発現は約２０倍に、コラーゲン２の発現は約７０倍となった。遺伝子発現は、軟骨形成分化の際にさらに増加した。

フローサイトメトリー
椎間板細胞を解離させて、単一細胞懸濁液を形成し、様々な表面マーカーをフローサイトメトリーにより解析した。この集団は図１０Ａに示される前方／側方散乱プロットに見られるように、サイズおよび内部構造に関して均質であった。広範な表面マーカーを試験し、間葉系幹細胞（コントロールとして）と比較した。それらマーカーの発現は、５人の異なるヒトドナーにわたって全体的に均一であり（ｐ＞０．０５）、アイソタイプコントロールと比較して、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＨＬＡ−ＡＢＣの発現が８０％を超え、ＣＤ３４、ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＱおよびＳＴＲＯ−１の発現が１０％未満であった（図１０Ｂおよび図１０Ｃ）。ＣＤ２４、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６の発現は約４０％で、わずかにより高い変動を示した。

多能性
椎間板細胞を、標準的な分化プロトコールに従って、骨、脂肪および軟骨を形成するその能力について試験した。分化した細胞の単層を染色すると、明らかな脂質生成および骨形成が観察された（図１１Ａ〜Ｂ）。椎間板細胞は、分化により、大きく固い軟骨のマイクロマスを形成し、プロテオグリカンについて陽性に染色された（図１１Ｃ）。

３週間培養後、培地およびマイクロマスを、プロテオグリカン含量について定量的にアッセイした。椎間板細胞（ＤＣ）を、関節軟骨細胞（ＡＣ）、線維芽細胞（ＦＢ）および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と比較した。図１１Ｅに示されるように、プロテオグリカンの不溶性（マイクロマス）量は細胞の種類によって有意に異ならなかったが、可溶性プロテオグリカンの測定量はかなり異なった。これらの２つの種類のマトリックスを合わせてＤＮＡ含量に対し正規化したところ（図１１Ｄ）、椎間板細胞によるプロテオグリカン／ＤＮＡ生成は、線維芽細胞よりも多く（ｐ＜０．０１）、ＭＳＣおよび関節軟骨細胞と同等レベルであることがわかった。

ウサギにおけるインビボのパイロット試験
メスのＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅウサギ（３〜４ｋｇ）を、民間のＩＡＣＵＣの承認の下、試験に用いた。３匹のウサギを手術前に一晩、絶食させた。変性を誘導する１回目の手術のために、動物を静脈内投与により麻酔し、手術部位を無菌的手術のために準備した。左側腹部に、腸骨稜と最後の肋骨との間で、８〜１０ｃｍの縦切開を行った。鈍的切開により、後腹膜アプローチで腰部椎間板にアクセスした。次いで、対象とする腰部椎間板に１８ゲージ針を少なくとも５ｍｍ挿入して、椎間板を損傷した。椎間板Ｌ２−Ｌ３、Ｌ３−Ｌ４、Ｌ４−Ｌ５、Ｌ５−Ｌ６を、この方法で損傷した。Ｌ５−Ｌ６は損傷せずに置いた。次いで、筋肉および皮膚を、縫合糸を用いて２または３層で閉鎖し、動物を回復中にモニタリングした。この試験に先立ち、６匹のウサギに損傷を与え、８週間評価して、安定かつ適切な欠陥が作られることを確認した（データは示さず）。

２週間後、ウサギを手術のために再度準備し、麻酔し、前記のように椎間板にアクセスした。２７ゲージ針を用いて、３０，０００個の細胞を含有する細胞療法（Ｌ５−Ｌ６）または足場のみ（Ｌ４−Ｌ５）のいずれか２５μｌを注入した。高用量療法では、３００，０００個の細胞を注入した。１つの椎間板は、そのような手を加えず、損傷コントロールとした（Ｌ２−Ｌ３）。注射をその場で５秒間保持し、針を抜いた時、材料の漏出は観察されなかった。

６週間にわたって、有害事象または健康状態について動物をモニタリングした。体重を毎週測定した。さらに、２週間毎に、動物を短時間麻酔して、腰部脊椎のＸ線撮影を行った（図１２Ａ）。単純Ｘ線写真において骨ランドマーク間の距離（椎間板腔の３つの測定値、左隣の椎骨の３つの測定値）を、同一人がマイクロメーターで測定し、週０での距離に対して正規化して、椎間板高指数（ＤＨＩ）パーセントを得た。

６週間後、ウサギを安楽死させた；椎間板を採り、パラフィンを用いて組織学的分析のために調製した。切片（４μｍ）を、ヘマトキシリンとエオシン、またはアルシアンブルーとエオシンの混合物を用いて染色した。

統計学的分析
全ての統計学的分析を、Ｔｕｋｅｙのポストホック検定を利用するＳｔａｔＰｌｕｓソフトウェア（ＡｎａｌｙｓｔＳｏｆｔ；Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて実施した。有意性に関するｐ値を、それぞれの試験において示した。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、インビトロでの椎間板細胞の表面マーカー発現およびプロテオグリカン生成を比較した。二元配置ＡＮＯＶＡを用いて、経時的に椎間板高データを解析し、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて、週６における組織学的スコアを比較した。グラフには、平均と共に、データセットの標準偏差を表すエラーバーを示す。

結果
上記のように、外科的穿刺により、３匹のＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅウサギ（ｎ＝３の条件）の椎間板に「変性」を誘導した。損傷の時点で、針を抜いた後の針通路から髄核物質が出てくるのが認められた。手術後、動物は、損傷に起因する苦痛のいかなる異常兆候も示さなかった。２週間後、低用量、高用量、または足場コントロールを椎間板に注入投与し、圧力を５秒間保持した後、針を抜いた。注入後、針を抜いた後に、いくらかの注入物が椎間板から出てくるのが認められた。

６週間の試験期間にわたって、安全性の問題は見られなかった。最初の損傷の後（図１２Ｂ；平均して、損傷前の３．４グラムから７日目の３．３グラムに変化）、または細胞療法注入の後（図１２Ｂ；平均で３．２グラム）に、大きな体重変化は観察されなかった。椎間板にヒト細胞の注入を受けたいずれの動物においても、動物ケアスタッフによる健康または行動の問題の報告はなかった。

６週間の期間にわたり、椎間板高の顕著な変化がＸ線により測定された（代表的なＸ線写真を図１２Ａに測定方法と共に示す）。損傷の２週間後、全ての椎間板は、その高さが平均で元の高さの５９％まで低下した。週４および週６において、低用量および高用量で処置した椎間板は、それぞれ、７０％および６４％のＤＨＩから９４％および７１％のＤＨＩへと、足場コントロールおよび損傷コントロールのいずれと比較しても有意な椎間板高改善を示した（ｐ＜０．００１）（図１２Ｃ）。足場コントロールの注入は、何ら注入を行わなかった場合（損傷コントロールにより示される）よりもわずかに良好な結果を示した（それぞれ、６４％のＤＨＩおよび５３％のＤＨＩ；ｐ＜０．０１）。

組織学的には、Ｈ＆Ｅ画像は、細胞療法処置により椎間板構造が正常化されることを示した。終板から終板までの髄核の高さは、損傷により減少し、細胞療法により増加した（図１３Ａ）。図１３Ｂに示されるように、処置後に骨髄、線維輪（ＡＦ）、軟骨終板（ＣＥＰ）または髄核（ＮＰ）において免疫反応または異常な組織形成は見られなかった。アルシアンブルー染色により示されるように、髄核は相変わらずプロテオグリカンが濃密であった（図１３Ｂ）。

ブタにおけるインビボのパイロット試験
メスのＧｏｔｔｉｎｇｅｎミニブタ（１０〜１５ｋｇ）を、民間ＩＡＣＵＣの承認の下、この研究に用いた。２匹のブタを手術前に一晩、絶食させた。損傷手術を実施例９に記載のように実施したが、本実施例では、蛍光透視画像による針の適切な配置の確認を追加で行った。椎間板Ｌ２−Ｌ３、Ｌ３−Ｌ４およびＬ３−Ｌ４を損傷した。Ｌ５−Ｌ６は損傷せずに置いた。次いで、筋肉および皮膚を、縫合糸を用いて２または３層で閉鎖し、動物を回復中にモニタリングした。この試験に先立ち、６匹のミニブタに損傷を与え、１２週間評価して、安定かつ適切な欠陥が作られることを確認した（データは示さず）。

２週間後、ブタを手術のために再度準備し、麻酔し、前記のように椎間板にアクセスした。２７ゲージ針を用いて、１００，０００個の細胞を含有する細胞療法（高用量；動物１：Ｌ３−Ｌ４、Ｌ４−Ｌ５）、５００，０００個の細胞を含有する細胞療法（低用量；動物２：Ｌ３−Ｌ４、Ｌ４−Ｌ５）または足場のみ（Ｌ２−Ｌ３）のいずれか１５０μｌを注入した。１つの椎間板は、そのような手を加えず、損傷コントロールとした（Ｌ２−Ｌ３）。注射をその場で５秒間保持し、針を抜いた時、材料の漏出は観察されなかった。

さらに１０週間にわたって、有害事象または健康状態について動物をモニタリングした。体重を毎週測定した。さらに、４、８および１２週間後に動物を短時間麻酔して、腰部脊椎のＸ線撮影を行い、前記のようにＤＨＩを決定した。１２週後、ブタを安楽死させた；椎間板を採り、前記のようにパラフィンを用いて組織学的分析のために調製した。

結果
ブタ椎間板の損傷は、椎間板高の２０〜３０％の低下をもたらした。低用量および高用量の処置はいずれも、直ちに椎間板高の改善をもたらし、これは週１２まで持続し、損傷コントロールよりも良好であった（ｐ＜０．０５）。足場コントロールおよび損傷コントロールは、経時的に改善を示さなかった（図１４Ａ）。蛍光透視画像により、正確な針の配置を補助し、また、損傷脊椎に沿った椎間板高の差を示す（図１４Ｂ）。上記のウサギパイロット試験と同様、髄核、軟骨終板、線維輪または骨髄において、免疫反応または異常な組織形成は見られず（図示せず）、プロテオグリカンに関する髄核染色は未処置の組織と同様であった（図１４Ｃ）。

本明細書に開示される実施形態を実施する代替的な方法が存在する。いくつかの例示的な態様および実施形態を説明したが、当業者であれば、ある一定の改変、置き換え、追加およびそのサブコンビネーションを認識できる。従って、本発明の実施形態は、例示的なものであり、限定的ではないと考えるべきである。さらに、特許請求の範囲は、本明細書に記載される詳細に限定されるものではなく、それらの完全な範囲およびその等価物に権利が与えられるべきである。

Claims (32)

1. 哺乳動物椎間板組織から誘導され、インビトロで足場非依存的培養により増殖させた、少なくとも１つの細胞
   を含む、椎間板細胞集団。
2. 軟骨性組織から誘導された１または複数の細胞であって、少なくとも１つの細胞が足場非依存的培養により維持されたものである細胞
   を含む、異種細胞集団。
3. 培養物が、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、血清、線維芽細胞条件培地、および粘性非反応性物質からなる群から選択される１または複数の添加物を含む培地を含む、請求項１または２に記載の細胞集団。
4. 低接着コーティングを有する培養容器中で継代される、請求項３に記載の細胞集団。
5. 足場非依存的培養により少なくとも１回継代される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞集団。
6. 細胞外マトリックスを生成する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞集団。
7. ＣＤ２４、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、Ｓｔｒｏ−１、ＨＩＦ１、ＦＩＴ−１、ネスチン、ＣＫ８、およびＨＬＡタンパク質を含む群から選択される１または複数の細胞表面マーカーを生成する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞集団。
8. 細胞表面マーカーを生成する細胞の割合が７０％を超える、または４０％未満である、請求項７に記載の細胞集団。
9. ＧＡＰＤＨ、ＳＤＨＡ、ＨＰＲＴ１、Ｂ２Ｍ、Ｓｏｘ９、アグリカン、Ｃｏｌ１、Ｃｏｌ２、ネスチン、ＣＫ８、Ｓｏｘ１、ＣＤ４４、ＡＬＰＩ、およびＰＰＡＲＧを含む群から選択される１または複数の遺伝子または遺伝子産物を発現する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞集団。
10. 椎間板組織から得られる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞集団。
11. 組織から１または複数の細胞を単離すること；
    該１または複数の細胞を足場依存的培養培地中で継代すること；
    該１または複数の細胞を足場非依存的培養培地に移すこと
    を含む、椎間板細胞集団を誘導する方法。
12. 少なくとも１つの椎間板の処置を、それを必要とする対象において行うために椎間板細胞を使用する方法であって、
    処置有効量の椎間板細胞集団を対象に投与し、それによって対象を処置することを含む方法。
13. 障害、損傷、または欠損のある少なくとも１つの椎間板を有する対象を処置する方法であって、
    対象に、該障害または損傷を処置するのに有効な量の椎間板細胞集団を投与することを含む方法。
14. 変性椎間板疾患、椎間板ヘルニア、椎間板損傷からなる群から選択される適応症を処置する方法であって、
    処置有効量の椎間板細胞集団を投与し、それによって適応症を処置することを含む方法。
15. 組織が哺乳動物椎間板組織である、請求項１１に記載の方法。
16. 組織が、提供された臓器組織である、請求項１５に記載の方法。
17. 細胞集団が足場非依存的培養により少なくとも１回継代される、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
18. 細胞集団が細胞外マトリックスを生成する、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
19. 細胞集団が、ＣＤ２４、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、Ｓｔｒｏ−１、ＨＩＦ１、ネスチン、ＣＫ８、およびＨＬＡタンパク質を含む群から選択される１または複数の細胞表面マーカーを生成する、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
20. 細胞表面マーカーを生成する集団中の細胞の割合が、７０％より高い、または４０％未満である、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
21. 集団が、ＧＡＰＤＨ、ＳＤＨＡ、ＨＰＲＴ１、Ｂ２Ｍ、Ｓｏｘ９、アグリカン、Ｃｏｌ１、Ｃｏｌ２、ネスチン、ＣＫ８、Ｓｏｘ１、ＣＤ４４、ＡＬＰＩ、ＰＰＡＲＧ、ＡＤＡＭＴＳ、ＭＭＰ、ＦＭＯＤ、ＩＬを含む群から選択される１または複数の遺伝子または遺伝子産物を発現する、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
22. 障害または損傷のある椎間板を処置するためのデバイスであって、
    軟骨性組織から誘導された椎間板細胞集団であって、少なくとも１つの細胞が足場非依存的培養により増殖させたものである細胞集団；および
    足場、マトリックス、または移植可能な構造体を含むデバイス。
23. 生物活性物質をさらに含む、請求項２２に記載のデバイス。
24. 人工外輪；
    椎間板細胞集団
    を含む、人工椎間板置換デバイス。
25. 外輪が非吸収性材料を含んで構成される、請求項２４に記載の人工椎間板置換デバイス。
26. 非吸収性材料がポリウレタンである、請求項２５に記載の人工椎間板置換デバイス。
27. 外輪が吸収性材料を含んで構成される、請求項２４に記載の人工椎間板置換デバイス。
28. 吸収性材料が、ポリグリコール酸もしくはポリ乳酸、またはその組合せである、請求項２７に記載の人工椎間板置換デバイス。
29. 椎間板細胞集団が、足場材料、マトリックス材料、担体材料、増殖因子、および他の生物活性物質のうちの１または複数をさらに含む、請求項２４に記載の人工椎間板置換デバイス。
30. デバイスを１または複数の椎体にしっかり固定するためのアタッチメント手段をさらに含む、請求項２４に記載の人工椎間板置換デバイス。
31. １また複数の椎体へのネジ固定を可能にするための、スルーホール、カフ、タブ、ループ、またはワッシャをさらに含む、請求項３０に記載の人工椎間板置換デバイス。
32. 椎間板を置換する方法であって、
    請求項２４に記載の人工椎間板をインビトロで製造すること；および
    該人工椎間板を対象に外科的に移植し、それによって椎間板を置換すること
    を含む方法。