KR20240022018A - 생산성이 향상된 세포 유래 세포외 소포체 제조방법 및 그에 의해 제조된 세포외 소포체 - Google Patents
생산성이 향상된 세포 유래 세포외 소포체 제조방법 및 그에 의해 제조된 세포외 소포체 Download PDFInfo
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Abstract
세포 유래 세포외 소포체 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 첨가제에 포함된 첨가제 유래 세포외 소포체를 제거함과 동시에 세포에 배양액을 주입함으로써 추가 공정을 없애 세포 유래 세포외 소포체의 생산성을 양적 질적으로 향상시키고 자원소모를 크게 줄여 생산효율을 극대화시킬 수 있는 효과가 있어, 치료제 등의 원료로서 대량 생산 시스템에 유용하게 사용될 것이다.
Description
세포 유래 세포외 소포체 제조방법 및 그에 의해 제조된 세포외 소포체에 관한 것이다.
최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)' 또는 '세포외 소포체(extracellular vesicles, EV)'가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 마이크로베지클(microvesicles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
세포외 소포체는 노폐물 또는 약물의 축적으로부터 세포를 보호하고, 생리 기능 및 병리에 기여할 수 있으므로, 바이오마커에서 항암 요법에까지 무수한 잠재적인 임상 응용을 가진다. 이들은 또한 혈액뇌관문(Blood-Brain-Barrier, BBB)을 통과할 수 있다. 세포외 소포체는 이들이 유래하는 세포의 대부분의 효과를 재현하고 치료 목적으로 세포 대체물로서 사용될 수 있다.
세포의 체외배양시에는 일반적으로 기본배양배지에 세포의 부착, 성장에 필요한 첨가제를 첨가하여 배양한다. 세포배양배지에 일반적으로 사용되는 첨가제인 소태아 혈청 (Fetal bovine serum, FBS), 사람 혈소판 용해물 (human platelet lysate, hPL), 사람 혈청 알부민 (human serum albumin, HSA) 등에도 세포외 소포체가 다량 함유되어 있기 때문에, 세포 유래 세포외 소포체 생산시 purity 확보를 위해 해당 첨가제를 사용하지 않고 기본배지로만 생산하는 것이 일반적이다. 그러나, 첨가제를 사용하지 않고 기본배지만으로 배양할 경우 세포의 정상적 대사와 세포신호전달체계에 영향을 미칠 수 있고, 성장과 활성이 감소됨으로써 세포외 소포체의 질적 양적 생산성 확보에 한계가 있다.
위의 문제를 극복하기 위한 방법으로, 첨가제가 포함된 배지(Media with supplement, M-S)를 접선유동여과기(Tangential flow filtration, TFF)를 통해 세포외 소포체를 선 제거하여 세포외 소포체를 제거한 배지(M-S-EV free, M-S-EVF)로 제작 후 사용함으로써 세포 활성을 유지시키고 세포외 소포체의 생산성을 향상시키는 방법이 사용되고 있으나, M-S에서 세포외 소포체를 제거하는 공정이 추가됨에 따라 비용, 시간, 시설, 품질시험 등의 자원 소모가 크게 증가하는 문제점이 있다.
이에, 본 발명에서는 첨가제에 포함된 세포외 소포체를 제거함과 동시에 세포에 배양액을 주입하는 공정기술을 완성하였고, 이를 통해 추가 공정을 없애 세포외 소포체의 생산성을 양적 질적으로 향상시키고 자원소모를 크게 줄여 생산효율을 극대화시킬 수 있도록 하였다.
본 발명의 목적은, 세포의 집단에서 세포 유래 세포외 소포체를 제조하는 과정에서 생산효율이 극대화된 방법을 제공하는 데에 있다.
다른 목적은 상기 세포 유래 세포외 소포체를 제조하기 위한 방법으로 제조된 세포외 소포체를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 일 양상은 세포의 집단에서 세포 유래 세포외 소포체를 제조하기 위한 방법으로서,
i) 첨가제를 포함하는 배지를 생물반응기에 제공하는 단계;
ii) 생물반응기에서 세포의 집단을 배양하는 단계; 및
iii) 세포의 집단의 배양액으로부터 세포 유래 세포외 소포체를 분리 및 정제하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "생물반응기(Bioreactor)"는 폐쇄된 멸균 시스템 중에서 세포에 영양분을 제공하고 대사물질을 제거할 뿐만 아니라 세포 성장에 도움이 되는 물리화학적 환경을 제공하는 대규모 세포 배양 시스템을 의미한다. 일 구체예에 있어서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 생물반응기의 종류로는 중공사(Hollow fiber) 생물반응기를 포함한다.
일 구체예에 있어서, 상기 생물반응기는 내부가 비어있는 튜브 형태의 분리막의 다발을 포함하는 필터를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 분리막은 중공사일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "중공사"는 분자량 컷오프(molecular weight cut-off, MWCO)가 10 kDa과 100 kDa 사이일 수 있는 작은 튜브형 필터를 의미한다. 이러한 섬유는 통상적으로 카트리지 쉘(cartridge shell) 내로 밀봉되어 세포가 포어(pore)의 크기 또는 중공사 내 및 주위의 다양한 조건에 따라 섬유의 내부 또는 외부에서 성장하는 동안 카트리지의 말단을 통해 펌핑된 세포 배양액이 섬유의 내부 또는 외부를 통해 흐를 수 있도록 한다. 그런 다음, 이러한 섬유는 세포가 성장하고 배양액이 흐르는 컴파트먼트(compartment) 사이에 규정된 분자량 컷오프의 반-투과성 장벽을 생성한다. 세포가 비-다공성 플라스틱 접시보다는 다공성 지지체(중공사)에 부착되기 때문에 영양분은 세포로 쉽게 수송된다. 예를 들어, 중공사의 포어 크기는 중공사가 어떻게 사용될지에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 10 kDa 내지 100 kDa의 범위의 분자량 컷오프를 갖는 중공사가 특정 목적을 위해 사용될 수 있다. 또한, 중공사는 2 cm 내지 200 cm의 길이를 가질 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 중공사는 분자량 17 kDa 이하의 컷오프를 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "중공사 생물반응기"는 상업적 규모의 세포배양을 실시하기 위해 고성능의 영양분, 가스 및 폐기물 교환을 위한 장치를 갖춘 중공사를 포함하는 생물반응기를 의미한다. 일 측면에서, 본 발명의 생물반응기로부터 수득된 세포 유래 세포외 소포체의 양은 생물반응기의 반응조의 크기에 비례하여 대량일 수 있다. 영양분, 가스 및 폐기물의 교환은 세포 유래 세포외 소포체를 생산하는 세포를 지원하기 위해 빠른 속도로 실시될 수 있다.
생물반응기의 외부 면적은 소규모에서 중규모, 대규모, 초대규모를 포함할 수 있다. 소규모 생물반응기는 약 1cm x 7cm x 10cm (약 30 ml의 내부 생물반응기 반응 부피) 범위의 외부 면적을 가질 수 있다. 중규모 생물반응기는 약 3cm x 12cm x 22cm (약 400 ml의 내부 생물반응기 반응 부피) 범위의 외부 면적을 가질 수 있다. 중-대규모 생물반응기는 약 5cm x 22cm x 35cm (약 2L의 내부 생물반응기 부피) 범위의 외부 면적을 가질 수 있다. 대규모 생물반응기는 약 10cm x 60cm x 60cm (약 20 L의 내부 생물반응기 반응 부피) 범위의 외부 면적을 가질 수 있다. 초대규모 생물반응기는 약 20cm x 90cm x 120cm (약 100 L의 내부 생물반응기 반응 부피) 범위의 외부 면적을 가질 수 있다. 생물반응기의 형태는 생물반응기가 세포 유래 세포외 소포체를 생산하는 기능을 하는 한 변형될 수 있다. 예를 들어, 형태는 직사각형으로 제한되지 않을 수 있다. 물질이 안정하고 효과적으로 사용가능 하다면 어떤 형태든 사용될 수 있다. 생물반응기의 외부 면적은 적합한 셋팅 및 환경에 따라 달라질 수 있다. 또한, 생물반응기는 가스 영양 공급장치(gas nutrient supply)를 포함하며, 상기 가스 영양은 산소, 이산화탄소, 질소 또는 공기일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 생물반응기는 상기 분리막의 내부에서 세포가 배양되는 제1 영역 및 상기 분리막의 외부에서 세포가 배양되지 않는 제2 영역을 포함하는 것일 수 있다. 상기 세포가 배양되는 제1 영역은 필요에 따라 다양한 천연 혹은 합성 물질, 예를 들어, 콜라겐, 파이브로넥틴, 라미닌, 또는 메트리겔 등을 코팅하여 사용할 수도 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 세포가 배양되는 제1 영역은 파이브로넥틴을 사용하여 코팅할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포가 배양되는 제1 영역은 적합한 수의 세포가 접종될 수 있다. 예를 들어, 접종되는 세포의 수는 1.0Х106개 내지 1.0Х108개의 세포일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 첨가제를 포함하는 배지가 제2 영역을 통해 제1 영역으로 제공되면서 첨가제 유래 세포외 소포체가 제거되는 것일 수 있다.
상기 "배지"는 시험관 내(in vitro)에서 세포의 성장과 생존 및 증식에 필요한 필수성분을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium), Knockout DMEM, E8 (Essential 8 Medium), SF-DMEM (serum free-Dulbecco Modified Eagle Medium) 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어, "첨가제"는 세포의 배양시 세포의 성장에 필요한 성분을 포함하고 있는 물질을 의미하며, 시판되고 있는 첨가제 또는 제조하여 사용할 수 있는 첨가제 모두 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 상기 첨가제는 동물 또는 식물 유래 첨가제일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 첨가제는 소태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS), 사람 혈소판 용해물(human platelet lysate, hPL), 사람 혈청 알부민(human serum albumin, HSA), 사람 혈청(human Serum, HS), 혈소판 혈장(Platelet-Rich Plasma, PRP), 혈소판 부족 혈장(platelet poor plasma, PPP) 송아지 혈청(Calf serum), 말 혈청(hourse serum), 돼지 혈청(porcine serum) 및 양 혈청(sheep serum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 첨가제는 5 % 내지 10 %의 농도로 배지에 첨가될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포는 줄기세포 또는 면역세포일 수 있다. 상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 상기 면역세포는 T 세포, B 세포, NK 세포(Natural killer cell), 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), 수지상 세포(Dendritic cell) 또는 대식 세포(Macrophage)일 수 있다.
본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 상기 세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 유도만능 줄기세포, 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포, 유도만능 줄기세포 유래 전구세포, 섬유아세포, 암세포, 면역세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다. 상기 세포는 인간 또는 동물 조직 유래의 성체 줄기세포이거나 인간 또는 동물 조직 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 와튼젤리(Wharton jelly; Umbilical cord, 탯줄) 및 태반으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 인간 또는 동물 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다. 바람직하게는 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간 유래 세포일 수 있다.
그러나 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 유전자 변형세포나 다양한 동물세포를 사용할 수 있음은 물론이다. 예를 들어, HEK 293 세포나 HEK 293T 세포의 사용도 가능하다. 따라서, 후술하는 실시예들에서 사용된 줄기세포는 본 발명에서 사용될 수 있는 동물세포의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 명세서에서 용어, "세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)"는 통상 세포막 유래 소포체(membrane vesicles), 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 마이크로베지클(microvesicles) 또는 이의 등가물을 포괄하는 의미로 사용된다. 분리 환경, 조건 및 방법 등에 따라 세포외 소포체는 엑소좀과 동일한 의미를 가질 수도 있고 엑소좀과 크기는 동일 내지는 유사하지만 엑소좀의 조성을 갖지 않는 나노베지클까지 포함하는 의미를 가질 수도 있다. 한편, 본 명세서에서 생산 촉진 또는 생산성과 관련하여 사용되는 엑소좀이라는 용어는 상기 세포외 소포체를 포괄하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(DNA, mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포를 배양하는 단계는 3 내지 6일 동안 수행되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포의 집단의 배양액은 제1 영역으로부터 수득되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포 유래 세포외 소포체를 분리 및 정제하는 단계는 접선유동여과, 초고속원심 분리 또는 분리 키트에 의해 수행되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 접선유동여과는 100,000 내지 750,000 Da의 필터를 사용하여 수행되는 것일 수 있다.
다른 일 양상은 상기 세포 유래 세포외 소포체를 제조하기 위한 방법으로 제조된 세포외 소포체를 제공한다.
본 발명의 일 양상에 따라 세포의 집단에서 세포 유래 세포외 소포체를 제조하기 위한 방법으로, 첨가제에 포함된 첨가제 유래 세포외 소포체를 제거함과 동시에 세포에 배양액을 주입함으로써 첨가제 없이 세포외 소포체를 생산하는 기존 방법 대비 세포 유래 세포외 소포체의 생산성을 양적 질적으로 크게 향상시켜 생산효율을 극대화한 양질의 세포외 소포체를 생산할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 다른 양상에 따라 첨가제에 포함된 첨가제 유래 세포외 소포체를 제거함과 동시에 세포에 배양액을 주입함으로써, 첨가제의 세포외 소포체를 제거한 후 생물반응기에 첨가하는 전처리 추가 공정을 없애 세포 유래 세포외 소포체의 생산시의 자원소모를 크게 줄여 효율을 증대시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 M-S의 첨가제 유래 세포외 소포체를 제거함과 동시에 세포에 배양액을 제공하여 세포 유래 세포외 소포체를 생산하는 본 발명에 따른 기술의 모식도이다.
도 2는 첨가제를 포함하지 않는 배지를 사용하여 세포 유래 세포외 소포체를 생산하는 종래 기술 및 M-S에서 첨가제 유래 세포외 소포체를 먼저 제거하고 세포에 배양액을 제공하여 세포 유래 세포외 소포체를 생산하는 종래 기술의 모식도이다.
도 3는 중공사 생물반응기의 중공사 막을 통과하지 못한 제2 영역(outlet)에 남은 농축액과 중공사 막을 통과한 제1 영역(inlet)의 농축액에서의 미세입자 분석(NTA) 결과이다.
도 4은 M-S에 포함된 세포외 소포체 특이적인 표면 마커 단백질인 CD9, CD63의 분석 결과이다.
도 5는 M-S-EVF 및 M-SF에서 배양된 총세포수를 비교한 결과이다.
도 6은 실시예 1 및 비교예 1 내지 3에 따라 생산된 세포 유래 세포외 소포체의 입자수를 비교한 결과이다.
도 2는 첨가제를 포함하지 않는 배지를 사용하여 세포 유래 세포외 소포체를 생산하는 종래 기술 및 M-S에서 첨가제 유래 세포외 소포체를 먼저 제거하고 세포에 배양액을 제공하여 세포 유래 세포외 소포체를 생산하는 종래 기술의 모식도이다.
도 3는 중공사 생물반응기의 중공사 막을 통과하지 못한 제2 영역(outlet)에 남은 농축액과 중공사 막을 통과한 제1 영역(inlet)의 농축액에서의 미세입자 분석(NTA) 결과이다.
도 4은 M-S에 포함된 세포외 소포체 특이적인 표면 마커 단백질인 CD9, CD63의 분석 결과이다.
도 5는 M-S-EVF 및 M-SF에서 배양된 총세포수를 비교한 결과이다.
도 6은 실시예 1 및 비교예 1 내지 3에 따라 생산된 세포 유래 세포외 소포체의 입자수를 비교한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 및 청구범위에 사용된 용어 또는 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 아니하며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석 되어야만 한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, "A 및/또는 B"는, A 또는 B, 또는 A 및 B를 의미한다.
본 발명의 명세서에서 M-S(Medium with Supplement)는 첨가제가 포함된 배지를 의미한다.
본 발명의 명세서에서 M-SF(Medium-Supplement Free)는 첨가제를 포함하지 않는 배지를 의미한다.
본 발명의 명세서에서 M-S-EVF(Medium with Supplement EV-Free)는 첨가제 유래 세포외 소포체를 제거한 M-S를 의미한다.
실시예 1. 중공사 생물반응기를 이용한 세포 유래 세포외 소포체의 제조
본 발명의 일 실시양태에 따른 중공사 생물반응기를 이용하여 세포 유래 세포외 소포체를 제조하였다.
도 1을 참조하여 설명하면, 중공사의 Inlet에 세포가 접종된 중공사 생물반응기에 첨가제를 포함하는 배지를 제공하여, 중공사의 Outlet으로부터 Inlet으로 배지가 제공되면서 첨가제 유래 세포외 소포체가 제거되도록 하였다. 그 후, 생물반응기에서 세포를 배양하고, 배양액으로부터 접선유동여과를 이용하여 세포 유래 세포외 소포체를 분리 및 정제하였다.
구체적으로, 중공사 생물반응기에 필요한 접종 세포수를 얻기 위해 해동한 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 5% CO2, 37℃ 조건에서 5% hPL 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 MEM-α 배지로 T-flask에서 배양하였다. 세포가 약 80% 이상 밀집도에 도달하면 Trypsin을 처리하여 세포를 수확하였다.
중공사 생물반응기에 세포를 접종하기 하루 전 5mg 파이브로넥틴을 사용하여 중공사 내부(제1 영역, Inlet)를 코팅하였다. 수확된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 중공사 생물반응기에 접종하고 5% hPL이 첨가된 MEM-α 배지를 중공사 막 Inlet으로 직접 흘려주는 방법으로 3 내지 6일 동안 배양하였다. 이 때 락테이트 및 글루코스 모니터링을 통해 유동속도 설정과 세포증식을 확인하였다. 세포수가 5 X 108 내지 10 X 108 개에 도달하면 PBS로 중공사 Inlet 내부를 세척한 후 5% hPL이 첨가된 MEM-α 배지를 중공사 막 Outlet에서 Inlet으로 흘려주는 방법으로 3 내지 6일 동안 배양하면서 배양액을 수거하였다. 수거된 배양액은 세포 및 세포 잔해물을 제거하기 위해 0.2 μm 필터로 여과하였다.
0.2 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 세포외 소포체를 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 접선유동여과 방법을 사용하였다. 접선유동여과 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터 또는 카세트 필터를 사용하였고, 이는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff, MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 세포외 소포체를 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
1 내지 4리터의 배양액으로부터 세포외 소포체를 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 접선유동여과 필터를 사용하였다. 배양액을 접선유동여과 방법을 이용하여 1/50 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들을 제거하여 세포외 소포체를 분리하였다. 세포외 소포체가 분리된 농축액은 -80℃에 동결 보관하고 모든 배양액 생산이 완료되면 해동하여 접선유동여과 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환을 수행하였다. 이때, 시작 부피 대비 12배 이상의 완충용액을 이용하여 수행하였다.
비교예 1. 첨가제를 포함하지 않는 배지를 이용한 세포 유래 세포외 소포체 제조
종래의 기술인 첨가제를 포함하지 않는 배지를 이용하는 방식으로 세포 유래 세포외 소포체를 제조하였다.
실시예 1에서 세포수가 5 X 108 내지 10 X 108 개에 도달하면 PBS로 중공사 Inlet 내부를 세척한 후 5% hPL이 첨가되지 않은 MEM-α 배지를 중공사 막 Outlet에서 Inlet으로 흘려주는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 세포 유래 세포외 소포체를 제조하였다.
비교예 2 및 3. 플라스크를 이용한 세포 유래 세포외 소포체 제조
종래의 기술인 플라스크에서 세포를 배양하는 방식으로 세포 유래 세포외 소포체를 제조하였다.
비교예 2의 제조: 도 2를 참조하여 설명하면, 첨가제가 포함된 배지를 접선유동여과 및 제균여과를 수행하여 먼저 배지로부터 첨가제 유래 세포외 소포체를 제거하였다. 첨가제 유래 세포외 소포체가 제거된 배지를 세포가 접종된 T-25 flask에 제공하고, 세포를 배양하고, 배양액으로부터 접선유동여과를 이용하여 세포 유래 세포외 소포체를 분리 및 정제하였다.
비교예 3의 제조: 비교예 2에서 첨가제가 포함되지 않은 배지를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 세포 유래 세포외 소포체를 제조하였다.
실험예 1. 중공사 생물반응기 내 중공사 막의 분자량 컷오프에 따른 배양배지 제조 및 나노입자 추적을 이용한 첨가제 유래 세포외 소포체 제거 확인
상기 실시예 1에서 첨가제 유래 세포외 소포체가 제거되는지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
구체적으로, 5%의 사람 혈소판 용해물(human platelet lysate, hPL)을 포함하는 MEM-α(Minimum Essential Medium alpha) 배지에 존재하는 세포외 소포체를 제거하기 위하여 분자량 17 kDa 이하의 컷오프 중공사 막을 가진 중공사 생물반응기를 이용, 중공사 막 제2 영역(Outlet)에서 제1 영역(Inlet)으로 배지를 통과시켰다. 중공사막을 통과하여 Inlet에서 회수한 여과액과 중공사막을 통과하지 않는 Outlet에 남은 농축액을 수확하였다.
여과액의 미세입자분석은 중공사 막을 통과하지 못한 Outlet에 남은 농축액을 대조군으로 하여 나노입자 추적 분석법(nanoparticle tracking analysis, NTA; Zetaview)을 통해 수행하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, Outlet의 배양액에는 다량의 미세입자가 확인되고 Inlet의 배양액에서는 확인되지 않은 바, 배지 내의 미세입자는 분자량 17 kDa 컷오프 이하의 중공사 막을 통과하지 못하고 배지로부터 미세입자들이 효과적으로 제거되었음을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 웨스턴블랏(Western Blot)을 이용한 첨가제 유래 세포외 소포체 제거의 분자생물학적 확인
상기 실시예 1에서 첨가제 유래 세포외 소포체가 제거되는지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
중공사막을 통한 세포외 소포체의 제거 여부를 확인하기 위하여, 세포외 소포체에 특이적 표적인자인 CD9, CD63, CD81을 웨스턴 블랏(Western Blot) 분석법을 통해 확인하였다.
실시예 1과 같이 중공사막을 통과하여 Inlet에서 회수한 여과액과 중공사막을 통과하지 않는 Outlet에 남은 농축액을 수확하였다. 그 후, Outlet과 Inlet에서 수득한 배양액을 원심분리하여 펠릿을 수득하였다.
단백질 용해액인 RIPA buffer를 사용하여 총 단백질을 펠릿에서 추출하고, Micro BCA 분석법을 사용하여 단백질 농도를 정량하였다. 단백질 추출물을 4-20%의 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)을 통해 전기영동 한 후, 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 멤브레인에 트랜스퍼 하여, 멤브레인을 0.1% Tween-20을 함유하는 트리스-완충 식염수(Tris-buffered saline, TBS)인 TBST에서 5% 탈지분유로 블로킹(blocking) 시켰다. 멤브레인을 CD9(1 : 200의 희석액), CD63(1 : 500의 희석액), CD81(1 : 200의 희석액)에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 이후, 멤브레인을 상온에서 2시간 동안 horseradish peroxidase가 결합된 anti-mouse 2차 항체(1 : 2,000의 희석액)에 반응시킨 후 ECL 반응을 통해 blot을 도출하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이 Outlet에서 수득한 배양액에서는 CD9, CD63, CD81 발현이 확인되고, Inlet에서 수득한 배양액에서는 확인이 되지 않는 것으로 나타났다. 상기 결과로부터, hPL 내의 첨가제 유래 세포외 소포체가 중공사막에 의해 효과적으로 제거되었음을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 중간엽 줄기세포의 배양 및 배양액의 생산 및 총세포수 분석
M-S-EVF 및 M-SF 배지에서 세포를 배양할 경우, 세포의 수에 차이가 나타나는지 알아보기 위하여, 각 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양한 후 세포의 수를 비교하였다.
실시예 1 및 비교예 1에서 배양이 완료되면 Trypsin을 중공사 생물반응기에 로딩하여 세포를 수확하고 생물안전작업대로 옮겨 총세포수를 측정한 후 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸바와 같이, cell counting을 통해 총세포수를 비교한 결과 M-S-EVF 배지에서 배양한 경우의 총세포수가 M-SF 배지에서 배양한 경우보다 높은 것을 확인할 수 있다. 따라서 동일기간 M-S-EVF 배지를 이용하여 세포를 키워 세포외 소포체를 생산하면, 세포의 성장과 활성을 유지하면서 세포외 소포체를 생산할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실험예 4. 나노입자 추적 분석법을 이용한 중간엽 줄기세포 유래 세포외 소포체 분리 검증
M-S-EVF 및 M-SF 배지에서 세포를 배양할 경우, 생산된 세포외 소포체의 양에 차이가 나타나는지 알아보기 위하여, 실시예 1 및 비교예 1에 의해 세포당 생산된 세포외 소포체 입자수를 측정하여 비교하였다.
또한, 중공사 생물반응기에서 세포를 배양하는 경우, 일반적인 T-flask에서 세포를 배양하는 경우보다 세포외 소포체의 생산성에 차이가 나타나는지 알아보기 위하여, 비교예 2 및 3에 의해 생산된 세포외 소포체 입자수를 측정하여 실시예 1과 비교하였다.
구체적으로, 분리 및 정제한 세포외 소포체를 Zetaview 나노입자 추적 분석(NTA 분석)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였으며, 세포당 생산된 세포외 소포체를 계산하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이 M-S-EVF 배지를 이용하여 생산한 경우의 세포당 생산된 세포외 소포체 입자수가 M-SF로 생산한 경우 보다 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 중공사 생물반응기를 이용하여 생산한 경우의 세포당 생산된 세포외 소포체 입자수가 T-25 flask를 이용하여 생산한 경우 보다 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, M-S-EVF를 이용하여 줄기세포를 배양하고 이 배양액으로부터 세포외 소포체를 분리함으로써 세포외 소포체 생산성을 현저히 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 본 발명에 따른 중공사 생물반응기를 이용하여 세포외 소포체를 생산하는 경우 T-25 flask를 이용한 경우보다 세포외 소포체 생산성을 현저히 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
Claims (14)
- 세포의 집단에서 세포 유래 세포외 소포체를 제조하기 위한 방법으로서,
i) 첨가제를 포함하는 배지를 생물반응기에 제공하는 단계;
ii) 생물반응기에서 세포의 집단을 배양하는 단계; 및
iii) 세포의 집단의 배양액으로부터 세포 유래 세포외 소포체를 분리 및 정제하는 단계
를 포함하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 생물반응기는 내부가 비어있는 튜브 형태의 분리막의 다발을 포함하는 필터를 포함하는 것인 방법. - 청구항 2에 있어서,
상기 생물반응기는 상기 분리막의 내부에서 세포가 배양되는 제1 영역 및 상기 분리막의 외부에서 세포가 배양되지 않는 제2 영역을 포함하는 것인 방법. - 청구항 3에 있어서,
상기 첨가제를 포함하는 배지가 제2 영역을 통해 제1 영역으로 제공되면서 첨가제 유래 세포외 소포체가 제거되는 것인 방법. - 청구항 2에 있어서,
상기 분리막은 중공사인 것인 방법. - 청구항 5에 있어서,
상기 중공사는 분자량 17kDa 이하의 컷오프를 갖는 것인 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 첨가제는 동물 또는 식물 유래 첨가제인 것인 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 첨가제는 소태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS), 사람 혈소판 용해물(human platelet lysate, hPL), 사람 혈청 알부민(human serum albumin, HSA), 사람 혈청(human Serum, HS), 혈소판 혈장(Platelet-Rich Plasma, PRP), 혈소판 부족 혈장(platelet poor plasma, PPP) 송아지 혈청(Calf serum), 말 혈청(hourse serum), 돼지 혈청(porcine serum) 및 양 혈청(sheep serum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 유도만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC), 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포, 유도만능 줄기세포 유래 전구세포, 섬유아세포, 암세포, 면역세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 와튼젤리(Wharton jelly; Umbilical cord, 탯줄) 및 태반으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 인간 또는 동물 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것인 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 세포를 배양하는 단계는 3 내지 6일 동안 수행되는 것인 방법. - 청구항 3에 있어서,
상기 세포의 집단의 배양액은 제1 영역으로부터 수득되는 것인 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 세포 유래 세포외 소포체를 분리 및 정제하는 단계는 접선유동여과, 초고속원심 분리 또는 분리 키트에 의해 수행되는 것인 방법. - 청구항 13에 있어서,
상기 접선유동여과는 100,000 내지 750,000 Da의 필터를 사용하여 수행되는 것인 방법.
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| KR102159915B1 (ko) | 2019-09-18 | 2020-09-24 | 주식회사 엑소코바이오 | 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성 촉진 방법 |
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