CN111117962A - 一种有效去除支原体污染的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开一种有效去除支原体污染的方法，包括如下步骤：(1)取小鼠腹腔内巨噬细胞均匀的分布在带有支原体去除剂的完全培养基中，然后平铺在孔板中；(2)取支原体污染细胞平铺在孔板中，观察7天；(3)取小鼠腹腔内巨噬细胞均匀的分布在带有支原体去除剂的完全培养基中，然后平铺在孔板中，挑选步骤(2)中1‑3孔状态好的支原体污染细胞平铺在孔板中；(4)等待7天，将步骤(3)孔板拿出来观察，每板挑选状态好的细胞株进行检测；(5)将步骤(4)挑选的细胞株继续用带有支原体去除剂的完全培养基扩大培养5‑10天，最后挑选无支原体污染的细胞进行冻存。本发明方法可以有效去除支原体细胞污染。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种有效去除支原体污染的方法。
背景技术
支原体污染一直是细胞培养中令人头疼的大问题，它可能来自培养基，血清或者实验操作者以及实验环境，大部分细胞被支原体感染以后会严重影响细胞的状态，导致细胞活性变差甚至死亡。细胞感染支原体后大部分研究人员会放弃细胞，重新引种新的细胞，因为支原体非常难得根除。常规的支原体去除剂并不能完全有效去除支原体。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述缺陷，提供一种有效去除支原体污染的方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
一种有效去除支原体污染的方法，包括如下步骤：
(1)取小鼠腹腔内巨噬细胞均匀的分布在带有支原体去除剂的完全培养基中，然后平铺在孔板中；
(2)取支原体污染细胞平铺在孔板中，观察7天；
(3)取小鼠腹腔内巨噬细胞均匀的分布在带有支原体去除剂的完全培养基中，然后平铺在孔板中，挑选步骤(2)中1-3孔状态好的支原体污染细胞平铺在孔板中；
(4)等待7天，将步骤(3)孔板拿出来观察，每板挑选状态好的细胞株进行检测；
(5)将步骤(4)挑选的细胞株继续用带有支原体去除剂的完全培养基扩大培养5-10天，最后挑选无支原体污染的细胞进行冻存。
优选的，步骤(1)所述完全培养基为高糖培养基或MEM培养基，所述完全培养基中添加10％胎牛血清和1％双抗。
优选的，步骤(1)所述完全培养基添加1％的支原体去除剂，所述支原体去除剂为上海易色生物支原体去除剂和上海瑟欧生物支原体去除剂。
优选的，步骤(1)所述孔板为48孔板或96孔板。
优选的，步骤(2)每孔不超过10个支原体污染细胞。
优选的，步骤(4)所述细胞株为5-10株。
与现有技术相比本发明的有益效果是：
本发明去除支原体污染的方法，在48或96孔板中培养比在T75中有明显优势，可以有效去除支原体细胞污染，同时添加巨噬细胞，可以清除支原体并且有利于细胞生长，清除效果强。
具体实施方式
以下是对本发明专利的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明专利，并非用于限定本发明专利的范围。
实施例1
一种有效去除支原体污染的方法，包括如下步骤：
(1)取小鼠腹腔内巨噬细胞均匀的分布在带有1％支原体去除剂的高糖培养基中，其中培养基中添加10％胎牛血清和1％双抗，然后平铺在孔板中；
(2)取支原体污染细胞平铺在48孔板中，每孔不超过10个支原体污染细胞，观察7天；
(3)取小鼠腹腔内巨噬细胞均匀的分布在带有支原体去除剂的完全培养基中，然后平铺在48孔板中，挑选步骤(2)中13孔状态好的支原体污染细胞平铺在48孔板中；
(4)等待7天，将步骤(3)48孔板拿出来观察，每板挑选状态好的细胞株5株进行检测；
(5)将步骤(4)挑选的细胞株继续用带有支原体去除剂的完全培养基扩大培养5天，最后挑选无支原体污染的细胞进行冻存。
实施例2
一种有效去除支原体污染的方法，包括如下步骤：
(1)取小鼠腹腔内巨噬细胞均匀的分布在带有1％支原体去除剂的MEM 培养基中，其中培养基中添加10％胎牛血清和1％双抗，然后平铺在孔板中；
(2)取支原体污染细胞平铺在96孔板中，每孔不超过10个支原体污染细胞，观察7天；
(3)取小鼠腹腔内巨噬细胞均匀的分布在带有支原体去除剂的完全培养基中，然后平铺在96孔板中，挑选步骤(2)中2孔状态好的支原体污染细胞平铺在96孔板中；
(4)等待7天，将步骤(3)48孔板拿出来观察，每板挑选状态好的细胞株8株进行检测；
(5)将步骤(4)挑选的细胞株继续用带有支原体去除剂的完全培养基扩大培养8天，最后挑选无支原体污染的细胞进行冻存。
实施例3
一种有效去除支原体污染的方法，包括如下步骤：
(1)取小鼠腹腔内巨噬细胞均匀的分布在带有1％支原体去除剂的高糖培养基中，其中培养基中添加10％胎牛血清和1％双抗，然后平铺在孔板中；
(2)取支原体污染细胞平铺在48孔板中，每孔不超过10个支原体污染细胞，观察7天；
(3)取小鼠腹腔内巨噬细胞均匀的分布在带有支原体去除剂的完全培养基中，然后平铺在48孔板中，挑选步骤(2)中3孔状态好的支原体污染细胞平铺在48孔板中；
(4)等待7天，将步骤(3)48孔板拿出来观察，每板挑选状态好的细胞株10株进行检测；
(5)将步骤(4)挑选的细胞株继续用带有支原体去除剂的完全培养基扩大培养10天，最后挑选无支原体污染的细胞进行冻存。
试验例
1试验试剂与器材：
带有支原体污染的hepal-6、hep-2、neuro-2a细胞，高糖培养基，MEM培养基，胎牛血清，上海易色生物支原体去除剂，上海瑟欧生物支原体去除剂，健康的昆明小鼠，96孔板，上海易色生物一步法支原体检测试剂盒，T75细胞培养瓶。
2试验方法
2.1T75支原体污染去除方法
2.1.1配置好3种细胞需要的完全培养基高糖与MEM，加入10％胎牛血清， 1％的双抗，2种支原体去除剂共四瓶，分别是带有易色支原体去除剂的完全培养基高糖(代称为易色高糖1)，带有瑟欧支原体去除剂的完全培养基高糖(代称为瑟欧高糖2)，带有易色支原体去除剂的完全培养基MEM(代称为易色 MEM1)，带有瑟欧支原体去除剂的完全培养基MEM(代称为瑟欧MEM2)；
2.1.2取三种带有支原体污染的细胞各六瓶(已用支原体检测试剂盒测试过)，编号分别为1号细胞(hepal-6)，2号细胞(hepal-6)，3号细胞(hep-2)， 4号细胞(hep-2)，5号细胞(neuro-2a)，6号细胞(neuro-2a)，细胞的量控制在T75瓶的15％；
2.1.3添加对应的培养基：1号为易色高糖1，2号为瑟欧高糖2，3号为易色高糖1，4号为瑟欧高糖2，5号为易色MEM1，6号为瑟欧MEM2；放置于37 度培养箱中静养；
2.1.4培养3天后，察细胞状态，1号、4号细胞进行吹打重新换液控制细胞的量，其余2、3、5、6号细胞进行换液，收集上清；之后每隔2天对细胞进行整体吹打换液，换液均为3种对应的完全培养基并收集上清；循环3次后收集上清并进行换液处理；
2.1.5将收集到的6种细胞上清用易色支原体检测试剂盒进行检测，前三次收集的上清还有支原体污染，后面两次的上清已经检测不出支原体污染；
2.1.6继续收集上清并进行换液处理；每隔2-3天收集上清并进行换液处理； 30天后换液培养基为不含有支原体去除剂的高糖与MEM完全培养基；
2.1.7收集上述细胞上清用易色支原体检测，11天后3号、4号细胞检测发现支原体污染，其余细胞正常；30天后的所有细胞都有支原体污染。
2.2本发明支原体污染去除方法
2.2.1配置好3种细胞需要的完全培养基高糖与MEM，加入10％胎牛血清， 1％的双抗，2种支原体去除剂共四瓶，分别是带有易色支原体去除剂的完全培养基高糖(代称为易色高糖1)，带有瑟欧支原体去除剂的完全培养基高糖(代称为瑟欧高糖2)，带有易色支原体去除剂的完全培养基MEM(代称为易色 MEM1)，带有瑟欧支原体去除剂的完全培养基MEM(代称为瑟欧MEM2)；
2.2.2取健康昆明小鼠腹腔内巨噬细胞均匀的分布板用在带有支原体去除剂的完全培养基中，然后平铺在96孔板中，分别铺6板，依次为A板(高糖1)、 B板(高糖2)、C板(高糖1)、D板(高糖2)、E板(MEM1)、F板 (MEM2)。
2.1.3将支原体污染细胞计数取少量细胞平铺在96孔板中，每孔不超过2个支原体污染细胞，1、2、3、4、5、6号细胞分别对应平铺在ABCDEF板中；
2.2.4一周后，用支原体检测试剂盒检测，每板挑选10个亚克隆细胞株进行检测，发现总共60个支原体污染细胞，其中污染的只剩下3个；
2.2.5从上述A、B、C、D、E、F板中每板挑选一个细胞株继续进行亚克隆，分别为A板F2，B板G7，C板F9，D板E12，E板C7，F板G5；
2.2.6取昆明小鼠腹腔内巨噬细胞均匀的分布在带有支原体去除剂的高糖和 MEM完全培养基中，然后对应平铺在96孔板中，将挑选好的细胞A板F2、B 板G7、C板F9、D板E12、E板C7、F板G5计数平铺在带有巨噬细胞96孔板中，一周后用支原体检测试剂盒，每板挑选10个亚克隆细胞株进行检测，未发现支原体污染，然后从中挑选了6个细胞分别是A板F2G9、B板G7D4、C板 F9D1、D板E12G2、E板、F板G5C7进行扩大培养至T75瓶中；
2.2.75天后，收集6种细胞的上清并换成不含有支原体去除剂的高糖和 MEM完全培养基，持续培养每隔5天6瓶在T75中培养的细胞上，收集6次进行检测，6瓶细胞的上清均未被支原体污染，将收集细胞进行细胞冻存；
2.2.8一年后将冻存的A板F2G9、B板G7D4、C板F9D1、D板E12G2、E 板C7A2、F板G5C7进行了复苏，培养一周后收集上清进行检测，未发现支原体污染。
3试验结果
通过2.2方法，添加支原体去除剂是有效果的，但是在去除7-15天后会复发，去除不够完善；而采用本发明方法可以完全去除支原体污染且不会复发，是由于 2.2方法中采用细胞T75中培养，去除的范围太广泛，去除剂要同时去除几万个细胞，如果有个别细胞去除不干净，就又会造成整体的大面积污染；本发明方法是同时进行100次去除1-2个细胞的支原体，而且结合了巨噬细胞的特性，可以清除支原体并且有利于细胞生长，清除效果更强。
以上为本发明较佳实施例，只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。对于本领域技术人员而言，显然本发明专利不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明专利的精神或基本特征的情况下，能够以其它的具体形式实现本发明专利。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明专利的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明专利内。
以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种有效去除支原体污染的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)取小鼠腹腔内巨噬细胞均匀的分布在带有支原体去除剂的完全培养基中，然后平铺在孔板中；
(2)取支原体污染细胞平铺在孔板中，观察7天；
(3)取小鼠腹腔内巨噬细胞均匀的分布在带有支原体去除剂的完全培养基中，然后平铺在孔板中，挑选步骤(2)中1-3孔状态好的支原体污染细胞平铺在孔板中；
(4)等待7天，将步骤(3)孔板拿出来观察，每板挑选状态好的细胞株进行检测；
(5)将步骤(4)挑选的细胞株继续用带有支原体去除剂的完全培养基扩大培养5-10天，最后挑选无支原体污染的细胞进行冻存。
2.根据权利要求1所述的有效去除支原体污染的方法，其特征在于：步骤(1)所述完全培养基为高糖培养基或MEM培养基，所述完全培养基中添加10％胎牛血清和1％双抗。
3.根据权利要求1所述的有效去除支原体污染的方法，其特征在于：步骤(1)所述完全培养基添加1％的支原体去除剂。
4.根据权利要求1所述的有效去除支原体污染的方法，其特征在于：步骤(1)所述孔板为48孔板或96孔板。
5.根据权利要求1所述的有效去除支原体污染的方法，其特征在于：步骤(2)每孔不超过10个支原体污染细胞。
6.根据权利要求1所述的有效去除支原体污染的方法，其特征在于：步骤(4)所述细胞株为5-10株。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20200508 |