KR20080072006A

KR20080072006A - 세포배양용 진탕장치 및 세포배양방법으로서의진탕배양방법

Info

Publication number: KR20080072006A
Application number: KR1020087012709A
Authority: KR
Inventors: 노리히코 하타; 히데마사 진구지; 나오코 아리요시
Original assignee: 가부시키가이샤 메디넷
Priority date: 2005-11-01
Filing date: 2006-11-01
Publication date: 2008-08-05
Also published as: US9175253B2; US20090111179A1; JPWO2007052718A1; EP1944359A4; EP1944359A1; JP5197013B2; AU2006309684A1; EP1944359B1; CN101300339A; WO2007052718A1

Abstract

세포에 대한 손상을 방지하면서 세포의 배양효율을 향상시킬 수가 있는 세포배양용 진탕장치를 제공한다. 세포가 접종된 배양액을 수용하는 가요성 배양백(18, 242)내에서 세포를 배양하는 세포배양장치(10, 100, 200)에 사용되는 진탕장치(80, 290)로서, 배양백(18, 242)을 반복해서 압박하는 작동판(85, 291a)을 구비한 진탕기구(91, 291)를 가지며, 상기 작동판(85, 291a)에 돌출 형성된 복수의 돌출부(86, 291b)의 압박에 의하여, 상기 배양백(18, 242)내의 배양액을 교반하는 것을 특징으로 한다.

배양백, 진탕장치, 배지백

Description

세포배양용 진탕장치 및 세포배양방법으로서의 진탕배양방법{SHAKER FOR CELL CULTURE AND SHAKEN CULTURE SYSTEM IN CELL CULTURE METHOD}

본 발명은, 배양용기내에서의 세포의 배양을 촉진시키기 위한 세포배양용 진탕장치 및 세포배양방법으로서의 진탕배양방법에 관한 것이다.

세포배양, 특히 면역세포요법에 사용되는 부유계 세포의 세포배양은, 종래, 거의 대부분이 사람의 조작에 의하여 실시되고 있다. 예를 들면, 환자로부터 채취한 세포를, 항체(유도인자)가 부착된 플라스크에 배지와 함께 접종하여 항온조(恒溫槽)에 수납하고, 이 플라스크를 매일 항온조로부터 꺼내어, 현미경 등을 사용하여 배양상황(예를 들면 증식상황)을 관찰하고, 증식 등이 인정되었을 때, 또는 세포접종으로부터 소정의 기간이 경과한 후에, 상기 플라스크에 배지를 첨가하여 세포를 배양(예를 들면 증식)하고 있다. 또, 대량의 세포를 얻고자 할 경우에는 플라스크에서 배양용 포대로 옮겨서 배양하는 경우도 있다.

이 플라스크나 포대에서 배양할 경우, 배양용기를 그대로 정치시키는 정치배양과, 이 배양용기를 예를 들면 올려놓는 재치대 등을 흔들어서 배양하는 진탕배양이 있다.

특허문헌 1 : 일본국 특개 2001-275659호 공보

그런데, 세포의 정치배양에 있어서는, 세포의 분포 및 배지의 성분농도가 균일하지 못하기 때문에, 배양환경의 제어가 어려워지며, 또 진탕배양에 비하여 산소공급능도 낮기 때문에, 세포의 증식을 최대한 끌어내기에는 문제점이 있다. 한편, 진탕배양에 있어서는, 배양용기내의 세포는 배양용기의 요동에 의하여, 배양면에 있어서 세포를 굴리게 되어, 세포의 물리적 손상이 심대하게 돼버린다는 문제가 있다.

본 발명의 목적은, 상술한 바와 같은 사정을 고려하여 이루어진 것으로서, 세포에로의 물리적 손상을 방지하면서 세포의 배양성을 향상시킬 수가 있는, 즉, 세포의 분포 및 배지의 성분농도가 균일한 상태로 되게 하여 배양환경의 제어가 용이하게 되며, 또 산소공급능도 높아지게 됨으로써, 세포의 증식이 촉진되는 세포배양용 진탕장치 및 세포배양방법으로서의 진탕배양방법을 제공하는 것에 있다.

청구항 1에 기재된 발명에 있어서의 세포배양용 진탕장치는, 세포가 접종된 배양액을 수용하는 가요성(可撓性) 배양용기내에서 세포를 배양하는데 있어서, 상기 배양용기를 반복해서 압박하는 압박수단을 구비하며, 이 압박수단의 압박에 의하여 상기 배양용기내의 배양액을 교반하도록 구성되는 것을 특징으로 한다.

청구항 2에 기재된 발명에 있어서의 세포배양용 진탕장치는, 청구항 1에 기재된 발명에 있어서, 상기 압박수단은 복수의 돌출부를 구비하며, 이들 돌출부가 배양용기를 압박하도록 구성되는 것을 특징으로 한다.

청구항 3에 기재된 발명에 있어서의 세포배양용 진탕장치는, 청구항 1 또는 2에 기재된 발명에 있어서, 상기 세포는, 부유계 세포인 것을 특징으로 하는 것이다.

청구항 4에 기재된 발명에 있어서의 세포배양용 진탕장치는, 청구항 1 내지 3의 어느 한 항에 기재된 발명에 있어서, 상기 세포는, 면역세포요법에 사용되는 것을 특징으로 하는 것이다.

청구항 5에 기재된 발명에 있어서의 세포배양방법으로서의 진탕배양방법은, 세포가 접종된 배양액을 수용하는 가요성 배양용기내에서 세포를 배양하는 세포배양방법에 있어서, 상기 배양용기를 압박수단에 의하여 반복해서 압박하고, 해당 배양용기내에서 배양액을 교반하여 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 것이다.

청구항 6에 기재된 발명에 있어서의 세포배양방법으로서의 진탕배양방법은, 청구항 4에 기재된 발명에 있어서, 상기 세포는, 부유계 세포인 것을 특징으로 한다.

청구항 7에 기재된 발명에 있어서의 세포배양방법으로서의 진탕배양방법은, 청구항 5 또는 6에 기재된 발명에 있어서, 상기 세포는, 면역세포요법에 사용되는 것을 특징으로 한다.

도1은, 본 발명에 관련되는 세포배양용 진탕장치에 있어서의 제1의 실시형태가 적용된 세포배양장치를 나타내는 구성도면.

도2는, 도1의 항온조를 나타내는 사시도면.

도3은, 도1의 항온조에 있어서의 캐니스터내에 수납되는 배양카세트를 나타 내는 사시도면.

도4는, 도3의 배양백트레이, 배지카세트 및 세포접종카세트를 각각 나타내는 사시도면.

도5는, 도2의 항온조에 있어서의 하나의 캐니스터와, 이 캐니스터내에 수납되는 배양카세트로 이루어지는 배양유니트의 구성을 나타내는 레이아웃도면.

도6은, 도5의 배양유니트의 제어계통을 나타내는 블록도면.

도7은, 도5의 진탕장치의 진탕기구를 나타내며, (A)는 사시도면, (B)는 측면도면.

도8은, 도5의 배양유니트에 있어서의 배양순서를 나타내는 공정도면.

도9는, 도5의 배양유니트에 있어서의 배양순서를 나타내며, 도8에 이어지는 공정도면.

도10은, 도5의 배양유니트에 있어서의 배양순서를 나타내며, 도9에 이어지는 공정도면.

도11은, 도5의 배양유니트에 있어서의 배양순서를 나타내며, 도10에 이어지는 공정도면.

도12는, 도5의 배양유니트에 있어서의 유도인자 자극간헐식 관류배양공정의 처리동작을 나타내는 플로우챠트.

도13은, 도12의 처리동작의 계속을 나타내는 플로우챠트.

도14는, 도5의 배양유니트에 있어서의 유도인자 자극간헐식 관류배양공정(세포회수백에 의한 세포회수처리를 포함한다)의 처리동작을 나타내는 플로우챠트.

도15는, 도14의 처리동작의 계속을 나타내는 플로우챠트.

도16은, 도5의 배양유니트에 있어서의 유도인자 자극연속식 관류배양공정의 처리동작을 나타내는 플로우챠트.

도17은, 도16의 처리동작의 계속을 나타내는 플로우챠트.

도18은, 본 발명에 관련되는 세포배양용 진탕장치에 있어서의 제2의 실시형태가 적용된 배양유니트 및 세포배양장치의 구성(분화유도상태)을 나타내는 레이아웃도면.

도19는, 도18의 배양유니트의 분화유도 전(前) 상태의 구성을 나타내는 레이아웃도면.

도20은, 도18 및 도19의 배양유니트에 있어서의 분화유도 간헐식 관류배양공정의 처리동작을 나타내는 플로우챠트.

도21은, 도20의 처리동작의 계속을 나타내는 플로우챠트.

도22는, 본 발명에 관련되는 세포배양용 진탕장치에 있어서의 제3의 실시형태가 적용된 배양유니트 및 세포배양장치를 나타내는 구성도면.

도23은, 제3의 실시형태에 관련되는 세포배양용 진탕장치가 적용된 세포배양장치에 있어서의 하나의 공간적으로 독립한 배양실과 저온실, 이 배양실 내에 수납되는 배양백트레이와 저온실에 수납되는 배지백·폐액백트레이로 이루어지는 배양유니트의 구성을 나타내는 레이아웃도면.

도24는, 도23의 재치대의 구성을 나타내는 사시도면.

도25는, 도23의 배양유니트에 있어서의 항체자극 간헐식 관류배양공정에 있 어서, 배양백에 세포를 회수하는 처리가 포함되는 경우의 처리동작을 나타내는 플로우챠트.

도26은, 도25의 처리동작의 계속을 나타내는 플로우챠트.

도27은, 도23의 배양유니트에 있어서의 항체자극 간헐식 관류배양공정에 있어서, 세포회수백에 세포를 회수하는 처리가 포함되는 경우의 처리동작을 나타내는 플로우챠트.

도28은, 도27의 처리동작의 계속을 나타내는 플로우챠트.

도29는, 도23의 배양유니트에 있어서의 항체 자극연속식 관류배양공정의 처리동작을 나타내는 플로우챠트.

도30은, 도29의 처리동작의 계속을 나타내는 플로우챠트.

도31은, 도23의 배양유니트에 있어서의 항체 자극 단순 유가배양공정의 처리동작을 나타내는 플로우챠트.

도32는, 도31의 처리동작의 계속을 나타내는 플로우챠트.

도33은, 도23의 배양유니트에 있어서의 항체 자극 단순 유가배양공정에 있어서, 세포회수백에 의하여 세포를 회수하는 처리가 포함되는 경우의 처리동작을 나타내는 플로우챠트.

도34는, 도33의 처리동작의 계속을 나타내는 플로우챠트.

도35는, 도7의 세포배양용 진탕장치를 사용한 진탕방법에 의한 배양결과를, 종래의 진탕방법에 의한 배양결과 및 정치배양에 의한 배양결과와 대비하여 나타내는 그래프.

(부호의 설명)

10···세포배양장치

11···항온조

12···배양유니트

13···운전제어반

14···화상처리용 컴퓨터

15···감시용 컴퓨터

16···캐니스터

17···배양카세트

18···배양백(증식용 배양용기)

19···세포접종카세트(유도인자자극용 배양용기)

20···배지카세트(배지저류수단)

46···재치대

47···배양백트레이

48···제1 펌프

49···제2 펌프

65···유도인자 자극용기

67···배지백(배지저류용기)

68···사용이 끝난 배지백(사용이 끝난 배지저류용기)

72···세포회수백(세포회수용기)

80···진탕장치

85···작동판

86···돌출부

87···조명용LED

88···CCD카메라(화상취득수단)

89···화상 메모리 회로

91···진탕기구(압박수단)

100···세포배양장치

101···분화유도카세트(분화유도용 배양용기)

200···세포배양장치

212···배양유니트

221···화상처리용 유니트

230···저온실

231···배지백트레이

232···폐액백트레이

233···배지백(배지저류수단, 배지저류용기)

234···폐액백(폐액저류수단, 사용이 끝난 배지저류용기)

240···배양실

241···배양백트레이

242···배양백(항체자극용 배양용기, 증식용 배양용기)

252···재치대

252b···면적변화파트

252c···면적변화파트

261···공급펌프

271···배출펌프

290···진탕장치

291···진탕기구

291a···작동판(압박수단)

291b···돌출부

302···CCD카메라(화상취득수단)

이하, 본 발명을 실시하기 위한 최량의 형태를, 도면에 기초하여 설명한다.

[A] 제1의 실시형태(도1~도17)

도1은, 본 발명에 관련되는 세포배양용 진탕장치에 있어서의 제1의 실시형태가 적용된 세포배양장치를 나타내는 구성도이다. 도2는, 도1의 항온조를 나타내는 사시도이다. 도5는, 도2의 항온조에 있어서의 하나의 캐니스터와, 이 캐니스터 내에 수납되는 배양카세트로 이루어지는 배양유니트의 구성을 나타내는 레이아웃도면이다.

도1에 나타내는 세포배양장치(10)는, 특히, 면역세포요법에 사용되는 부유계 세포를 배양하는 것이며, 복수개(예를 들면 8개)의 배양유니트(12)를 구비한 항온 조(11)와, 이 항온조(11) 및 배양유니트(12)의 운전을 제어하는 운전제어반(13)과, 세포의 화상을 처리하기 위한 화상처리용 컴퓨터(14)와, 운전제어반(13) 및 화상처리용 컴퓨터(14)에 접속되며, 항온조(11) 및 배양유니트(12)를 감시하기 위한 감시용 컴퓨터(15)를 가지고 구성된다. 상기 운전제어반(13) 및 화상처리용 컴퓨터(14)가 제어수단으로서 기능한다.

여기서, 상기 부유계 세포로서는, 말초혈단핵구, LAK세포(Lymphokine Activated Killer 세포), 신경간세포, ES세포 등이 알려져 있다. 이들의 부유계 세포를 이하 간단히 세포라고 칭한다. 또한, 이들의 세포를 각각의 세포에 맞는 유도인자로 자극하여 배양한다. 각 유도인자는, 세포마다 다르며, 예를 들면 LAK세포에서는 항 인간 CD3 항체 등이며, 신경간세포의 유도인자에서는 EGF 등의 상피 성장인자이며, ES세포의 유도인자에서는 FGF-8b 등의 섬유아세포 증식인자이다. 또, 본 세포배양장치(10)는, 상기 부유계 세포 이외의 접착의존성 세포를 배양할 경우에도 적용이 가능하다.

상기 배양유니트(12)는, 항온조(11)내에서 서로 격리하여 분리된 복수개(예를 들면 8개)의 캐니스터(16)(도2 및 도5)와, 각 캐니스터(16)내에 수납되는 배양카세트(17)(도2 및 도3)를 가지고 이루어진다. 이 배양 카세트(17)는, 후에 설명하는 바와 같이, 증식용 배양용기로서의 배양백(18), 유도인자 자극용 배양용기로서의 세포접종카세트(19), 및 배지 저류(貯溜) 수단으로서의 배지카세트(20)를 구비한다. 이들의 배양용기(배양백(18), 세포접종카세트(19))내의 세포는, 캐니스터(16)마다 독립한, 배양환경하에서 배양된다.

상기 항온조(11)는, 도2에 나타낸 바와 같이, 개폐가능한 본체도어(21)를 구비한 항온조본체(22)내에 복수단의 선반(23)이 설치되고, 각 선반(23)에 캐니스터(16)가 1개씩 배치되어 이루어진다. 이 항온조(11)는, 본체도어(21)를 닫은 상태에서, 항온조본체(22)내의 환경(온도, 습도 및 CO2 농도)을, 세포를 배양하기 위한 필요한 환경으로 유지한다.

이 때문에, 항온조본체(22)내에는, 도5 및 도6에 나타낸 바와 같이, 온도센서(24), CO2센서(25), 도어센서(26) 및 히터(27)가 설치되며, 다시 이 항온조본체(22)에, 외부에 설치된 가스봄베(28)가 연결된다. 온도센서(24), CO2센서(25) 및 도어센서(26)로부터의 신호는, 운전제어반(13)으로 송신된다. 이 운전제어반(13)은, 온도센서(24)로부터의 온도신호에 기초하여 히터(27)를 제어하고, CO2센서(25)로부터의 CO2농도신호에 기초하여, 가스봄베(28)로부터 항온조본체(22)내로 공급되는 CO2가스의 양을 제어한다.

상기 캐니스터(16)는, 도5 및 도6에 나타낸 바와 같이, 캐니스터본체(30)에 개폐가능한 캐니스터도어(31)가 장착되고, 캐니스터본체(30)에 흡기필터(32) 및 배기필터(33)가 설치됨과 동시에, 캐니스터본체(30)의 흡기필터(32)측에 송풍팬(34)이 설치된 것이다.

흡기필터(32) 및 배기필터(33)는, 세균을 제거하는 필터이며, 송풍팬(34)의 운전에 의하여 항온조본체(22)내의 공기 및 CO2가스가 캐니스터(16)내로 도입될 때에, 항온조본체(22)에서 캐니스터(16)내에로의 세균의 유입을 방지한다. 또, 송풍팬(34)의 운전은 운전제어반(13)에 의하여 제어되며, 항온조(11)의 본체도어(21)가 열렸다는 신호가 도어센서(26)에서 운전제어반(13)으로 송신되면, 송풍팬(34)의 운전이 정지되고, 캐니스터(16)의 밀폐상태가 확보된다.

흡기필터(32) 및 배기필터(33)에 의한 항온조본체(22)로부터 캐니스터(16)내로의 세균유입방지기능과, 송풍팬(34)의 운전정지에 의한 캐니스터(16)의 밀폐성 확보에 의하여, 각 캐니스터(16) 안이 각각 독립한 배양환경으로 된다. 이에 의하여, 항온조(11)에 있어서의 하나의 캐니스터(16)에 수납되는 배양카세트(17)내의 세포가 다른 캐니스터(16)내의 세포에 대하여 격리됨과 동시에, 이 캐니스터(16)에 수납되는 배양카세트(17)내의 세포가 잡균에 의하여 오염되는 콘타미네이션이 방지된다. 또, 다른 환자의 세포에 의하여 오염되는 이른바 크로스 콘타미네이션도 방지된다.

캐니스터본체(30)에는, 다시 도어센서(35), 도어록센서(36), 온도센서(37), 습도센서(38), 도어록기구(39), 히터(40) 및 순환팬(41)이 설치되어 있다. 운전제어반(13)은, 온도센서(37)로부터의 온도신호에 기초하여 히터(40)를 제어한다. 또, 운전제어반(13)은, 순환팬(41)의 운전을 제어하고, 캐니스터(16)내에서 공기 및 CO2가스를 순환시킨다. 상기 습도센서(38)는, 캐니스터(16)내의 습도를 검출하여 운전제어반(13)으로 송신하고, 그 이상을 검출한다. 이와 같이 하여, 캐니스터(16)내는 세포를 배양하기 위한 최적의 환경으로 유지된다.

또, 운전제어반(13)은, 하나의 항온조(11)에 있어서 2이상의 캐니스터도어(31)가 동시에 열림동작을 실시하는 경우가 없도록 도어록기구(39)의 동작을 제어한다. 이에 의하여, 다른 캐니스터(16)사이에서 세포나 배지 등이 바뀌어서 반입 되는 것이 방지된다. 이 도어록기구(39)의 잠금동작은 도어록센서(36)에 의하여 검출되고, 운전제어반(13)으로 송신된다. 또, 캐니스터도어(31)의 개폐상태는 도어센서(35)에 의하여 검출되며, 운전제어반(13)으로 송신된다.

도5에 나타내는 캐니스터본체(30)내의 하부에는, 캐니스터(16)내에 수납되는 배양카세트(17)를 지지하는 스테이지(42)가 설치되고, 이 스테이지(42)에 중량계(43)가 설치된다. 이 중량계(43)는, 캐니스터(16)내에 수납된 배양카세트(17)의 배양백(18)의 중량을 계측하는 것이며, 실제로는, 배지카세트(20)에서 배양백(18)으로 공급되는 배지량을 계측한다. 이 중량계(43)의 계측값도 운전제어반(13)으로 송신된다. 또, 캐니스터본체(30)에는, 표시등(44)이 설치되어 있다. 캐니스터(16)내에서 자동배양을 실시하고 있을 때에, 이 캐니스터(16)의 표시등(44)을 예를 들면 적색 점등시키고, 조작지령이 출력된 캐니스터(16)와, 내부에 배양카세트(17)가 수납되어 있지 않은 캐니스터(16)의 표시등(44)을 녹색 점등시킨다. 이에 의하여, 자동배양을 실시하고 있는 캐니스터(16)에 대해서는 다른 캐니스터(16)와는 독립한 배양환경이 확보되고, 다른 캐니스터(16)에 수납되어 있는 검체(세포)와의 크로스 콘타미네이션이나 착오로 바뀌는 것을 방지하는 것이 가능하게 된다.

여기서 상기 배양카세트(17)에 대해서 설명한다.

이 배양카세트(17)는, 도3 및 도5에 나타낸 바와 같이, 라지트레이(45)에 배양백(18), 세포접종카세트(19) 및 배지카세트(20)가 장착된 것이며, 배양백(18) 및 세포접종카세트(19)가 세포를 배양하는 배양용기이다. 이 중, 세포접종카세트(19)는, 세포에 기능을 발현시키기(예를 들면 세포를 증식시키는, 세포를 분화(후술)시 키는 등) 위한 기능발현용 배양용기이며, 본 실시형태에서는, 증식을 위하여 유도인자에 의해 세포를 자극하는 유도인자자극용 배양용기이다. 또, 배양백(18)은, 세포접종카세트(19)에 있어서 유도인자에 의해 자극된 세포를 증식시키기 위한 증식용 배양용기이다.

배양백(18)은, 세포가 접종된 배양액을 수용하는 가요성의 디스포서블 용기이며, 재치대(46)(도5)를 통하여, 도4(A)에 나타내는 배양백트레이(47)에 재치되며, 이 배양백트레이(47)가 도3 및 도5에 나타내는 라지트레이(45)에 착탈가능하게 장착된다. 상기 배양백(18)은, 예를 들면 산소투과성 재질로 이루어지는 백이다. 상기 라지트레이(45)에는, 도5에 나타낸 바와 같이, 제1 펌프(48), 제2 펌프(49) 및 제3 펌프(50)가 배치된다. 배양백(18)의 일단측은, 튜브(63)를 사용하여 제2 펌프(49)를 거쳐 제7 커넥터(57)에 접속된다. 또, 배양백(18)의 타단측은, 튜브(60)를 사용하여 제1 커넥터(51)에 접속된다. 상기 제1 펌프(48), 제2 펌프(49), 제3 펌프(50)는, 멸균튜브교환의 편리성때문에, 연동형(peristaltic type)펌프가 바람직하다.

상기 라지트레이(45)에서는, 튜브(61)의 일단은 제3 커넥터(53)에 접속되며, 타단은 제5 커넥터(55)에 접속된다. 이 튜브(61)는, 제1 펌프(48)의 도시하지 않은 회전구동부에 배치되어 있다. 튜브(63)의 일단은, 상술한 바와 같이 제7 커넥터(57)에 접속되며, 타단은 배양백(18)에 접속된다. 이 튜브(63)는, 제2 펌프(49)의 도시하지 않은 회전구동부에 배치되어 있다. 튜브(62)는, 일단이 커넥터X에 의하여 튜브(61)에 접속되고, 타단이 커넥터Y에 의하여 튜브(63)에 접속된다. 이 튜 브(62)는, 제3 펌프(50)의 도시하지 않은 회전구동부에 배치되어 있다.

상기 세포접종카세트(19)는, 도4(C)에 나타낸 바와 같이, 유도인자 자극용기(65)의 바닥면 내측에 유도인자를 고층화(固層化)하고, 이 유도인자 자극용기(65) 내에 배지를 투입하고, 이 배지에 세포를 접종하여, 이 유도인자 자극용기(65)를 카세트프레임(66)에 설치하여, 카세트구조로 구성된 것이다. 상기 유도인자 자극용기(65)에 유도인자, 배지 및 세포를 넣는 작업은, 클린벤치 또는 안전캐비넷(본 실시형태에 있어서 이하, 클린벤치 등이라고 한다)내에서 무균상태로 실시된다. 또, 배지 및 세포의 혼합액을 배양액이라고 칭한다.

상기 세포접종카세트(19)는, 도3에 나타낸 바와 같이, 라지트레이(45)에 착탈가능하게 장착된다. 이때에는, 도5에 나타낸 바와 같이, 세포접종카세트(19)의 제2 커넥터(52) 및 제4 커넥터(54)가 라지트레이(45)의 제1 커넥터(51), 제3 커넥터(53)의 각각에 무균적으로 결합된다. 즉, 제1 커넥터(51)와 제2 커넥터(52)는, 예를 들면, 일방의 고무형상 결합부에 타방의 침상결합부가 삽입되는 것으로서 무균적으로 결합된다. 제3 커넥터(53)와 제4 커넥터(54)의 결합에 있어서도 마찬가지이다.

제1 커넥터(51)와 제2 커넥터(52)와의 결합에 의해 튜브(60)를 사용하여, 상이한 배양환경의 세포접종카세트(19)와 배양백(18), 즉 세포를 유도인자에 의하여 자극하여 해당 세포에 증식기능을 발현시키기 위한 배양환경을 갖는 세포접종카세트(19)와, 세포를 증식시키기 위한 배양환경을 갖는 배양백(18)이 접종되게 된다. 따라서, 세포접종카세트(19)에 있어서 유도인자에 의하여 자극되어, 증식을 개시하 기 시작한 세포를 배양백(18)으로 이행시키고, 이 배양백(18)에 있어서 증식만을 실시하게 하는 것이 가능하게 된다.

상기 배지카세트(20)는, 도4(B)에 나타낸 바와 같이, 배지저류용기로서의 배지백(67), 및 사용이 끝난 배지저류용기로서의 사용이 끝난 배지백(68)이 배지백트레이(69)에 재치되어, 카세트구조로 구성된 것이다. 상기 배지백(67)은, 배양백(18), 세포접종카세트(19)로 공급되는 배지를 저류하는 것이다. 또, 상기 사용이 끝난 배지백(68)은, 배양백(18)으로부터 배출되는 사용이 끝난 배지(상청)를 저류하는 것이다. 배지카세트(20)가 카세트구조로 구성된 것에 의하여, 배양백(18)을 캐니스터(16)내에 유지한 상태로, 해당 캐니스터(16)내의 배양카세트(17)에 배지카세트(20)를 장착하는 것만으로 배지의 교환, 공급이 가능해진다.

상기 배지카세트(20)는, 라지트레이(45)(도3)에 착탈가능하게 장착된다. 이때, 도5에 나타낸 바와 같이, 배지카세트(20)의 제6 커넥터(56), 제8 커넥터(58)가 라지트레이(45)의 제5 커넥터(55), 제7 커넥터(57)의 각각에, 제1 커넥터(51) 및 제2 커넥터(52)의 경우와 동일하게 하여 무균적으로 결합된다. 제6 커넥터(56)와 제5 커넥터(55)와의 결합에 의하여, 배지백(67)과 세포접종카세트(19)가 접속된다. 또, 제7 커넥터(57)와 제8 커넥터(58)의 결합에 의하여, 사용이 끝난 배지백(68)과 배양백(18)이 접속된다.

배양백(18), 세포접종카세트(19) 및 배지카세트(20)가 상술한 바와 같이 접속되는 것에 의하여, 배지카세트(20)에 있어서의 배지백(67)내의 배지가, 제1 펌프(48)의 기동에 의하여 세포접종카세트(19)를 통하여 배양백(18)으로 공급되며, 이 배양백(18)내의 사용이 끝난 배지가, 제2 펌프(49)의 기동에 의하여 배지카세트(20)의 사용이 끝난 배지백(68)으로 배출되는 폐쇄계가 구성된다. 이 폐쇄계의 구성에 의하여, 해당 계통(배양백(18), 세포접종카세트(19) 및 배지카세트(20))이 무균상태로 유지된다.

또한, 상기 세포접종카세트(19)는, 내부에 세포가 없어진 단계에서 더미카세트(70)로 환치된다. 이에 의하여, 세포접종카세트(19)내의 유도인자가 배양백(18)내로 이행하는 것이 방지된다. 또, 배지카세트(20)는, 배지백(67)이 비워진 단계에서, 배지가 차 있는 배지백(67)과 비어 있는 사용이 끝난 배지백(68)을 구비하는 새로운 배지카세트(20)로 교환된다. 이 교환은 조작자에 의하여 실시된다. 상기 더미카세트(70)는, 단순히, 배지를 유동시키는 유로로서 기능하는 것이다.

배양백(18)내에서의 배양(세포증식)에는, 제1 펌프(48)를 기동시켜서, 배지카세트(20)의 배지백(67)내의 배지를 배양백(18)으로 공급(유가(流加))하는 것으로 세포를 증식시키는 유가배양(fed-batch culture)과, 제1 펌프(48) 및 제2 펌프(49)를 기동시켜서, 배양백(18)내의 사용이 끝난 배지를 배지카세트(20)의 사용이 끝난 배지백(68)으로 배출하고, 또한 배지백(67)내의 배지를 배양백(18)으로 공급하는 것으로 세포를 증식시키는 관류(灌流)배양과, 후술하는 진탕장치(80)를 사용한 진탕배양과, 진탕을 실시하지 않는 정치배양이 있다. 이 중 관류배양에는, 사용이 끝난 배지의 배출과 배지의 공급을 교대로 실시하는 간헐식 관류배양과, 사용이 끝난 배지의 배출과 배지의 공급을 동시에 실시하는 연속식 관류배양이 있다. 이 연속식 관류배양에서는, 통상, 튜브(63) 중 배양백(18)과 제2 펌프(49)와의 사이에, 세포 의 이동을 저지하는 필터(71)가 배치되어, 배양백(18)내의 세포가 사용이 끝난 배지백(68)으로 배출되는 것이 방지된다.

상기 제3 펌프(50)는, 배양백(18)내에서 증식된 세포를 화상에 의하여 관찰하는 경우 등에 기동된다. 즉, 배양백(18)내의 세포는, 튜브(63)에 필터(71)가 배치되어 있지 않은 경우에는, 배양백(18)으로부터 튜브(63), 튜브(62) 및 튜브(61)를 통하여, 세포접종카세트(19) 또는 더미카세트(70)로 유도되고, 후술하는 CCD카메라(88)에 의하여 촬영되어, 증식된 세포수 등이 관찰된다. 상기 튜브(63)에 필터(71)가 배치되어 있는 경우에는, 제3 펌프(50)의 상류측이 바이패스튜브(73)를 통하여 배양백(18)에 접속되며, 배양백(18)내의 세포는, 상기 바이패스튜브(73) 및 튜브(62)를 통하여, 세포접종카세트(19) 또는 더미카세트(70)내로 유도되고, CCD카메라(88)를 사용하여 관찰된다.

상기 배지카세트(20)의 사용이 끝난 배지백(68)으로는, 배양백(18)에 있어서의 세포의 증식종료후에, 배양백(18)내의 사용이 끝난 배지가 배출되어, 이 배양백(18)내의 세포가 농축된다. 이 사용이 끝난 배지의 배출은 제2 펌프(49)의 기동에 의하여 실시되며, 중량계(43)의 계측값에 기초하여 운전제어반(13)의 제어에 의하여, 배양백(18)내의 배양액의 용량이 약 1/2~1/3 정도가 되기까지 실시된다. 이 배양백(18)내에서의 세포의 농축에 의하여, 그 후에 실시되는 세포세정·농축을 목적으로 한 원심분리기에 의한 원심분리의 횟수가 저감된다.

또, 배지카세트(20)에서는, 배양백(18)에 있어서의 세포가 상술한 바와 같이 농축된 후에, 사용이 끝난 배지백(68)을, 원심분리기에 장착가능한 세포회수용기로 서의 세포회수백(72)으로 환치하고, 이 세포회수백(72)내로, 배양백(18)내에서 세포가 농축된 배양액을, 제2 펌프(49)의 기동에 의하여 제공하여도 좋다. 이 경우에는, 튜브(63)에 필터(71)가 배치되어 있지 않는 것을 조건으로 한다. 이에 의하여, 원심분리기에 장착가능한 백에서의 세포의 회수를, 폐쇄계 공간인 캐니스터(16)내에서 실시할 수가 있으며, 세포의 회수작업이 간이화된다.

캐니스터(16)내에 수납되는 배양카세트(17)의 라지트레이(45)에는, 도5 및 도6에 나타낸 바와 같이, 세포접종카세트(19) 또는 더미카세트(70)가 라지트레이(45)에 장착된 것을 검출하는 세포접종카세트센서(74)와, 배지카세트(20)가 라지트레이(45)에 장착된 것을 검출하는 배지카세트센서(75)가 설치되어 있다. 이들 센서(74 및 75)의 신호는 운전제어반(13)으로 송신된다. 이 운전제어반(13)은, 배양카세트(17)의 라지트레이(45)에 세포접종카세트(19) 또는 더미카세트(70)가 장착되며, 또한 배지카세트(20)가 장착된 것을 확인하여, 제1 펌프(48), 제2 펌프(49) 및 제3 펌프(50)를 기동시킨다.

그런데, 도5에 나타낸 바와 같이, 캐니스터(16)내에는 배양카세트(17)가 수납되며, 이 배양카세트(17)가 캐니스터(16)의 스테이지(42)에 지지되는바, 이 스테이지(42)에는, 배양카세트(17)의 배양백트레이(47)가 배치되는 하방위치에 경사모터(76), 캠기구(79) 및 위치결정센서(77)가 설치된다. 배양백트레이(47) 상에서 배양백(18)을 직접 재치하는 재치대(46)는, 그 일부(도시하지 않은 승강부)가 승강가능하도록 구성된다. 상기 경사모터(76)는 캠기구(79)를 회동시켜서, 재치대(46)의 상기 승강부를 승강시킨다. 이 승강부의 위치가 위치결정센서(77)에 의하여 검출되 고, 운전제어반(13)으로 송신된다. 경사모터(76)는 운전제어반(13)에 의하여 제어되며, 배양백(18)에 있어서의 배양초기단계에서, 재치대(46)의 승강부를 하강시키도록 제어된다. 이에 의하여, 배양백(18)에 액체체류부(78)(도8 및 도9)가 형성된다.

배양백(18)에 있어서의 배양초기단계에서, 세포접종카세트(19)로부터의 배양액이 액체체류부(78)에 저류되는 것에 의하여, 배양백(18)내의 면적당 세포밀도가 증식하기에 적당한 밀도로 유지되고, 배양 초기에 세포가 효율적으로 증식된다. 배양백(18)내에 배양액이 소정량 a(후술) 이상이 되는 배양 중기 및 후기에는, 경사모터(76)가 캠기구(79)를 통하여 재치대(46)의 승강부를 상승시켜, 배양백(18)을 수평상태로 하여 상기의 액체체류부(78)를 해소한다.

또한, 캐니스터(16)내에는, 도5에 나타낸 바와 같이, 배양카세트(17)의 배양백트레이(47)가 배치되는 상방의 위치에, 진탕장치(80)의 진탕기구(91)가 압박수단으로서 설치된다.

이 진탕장치(80)는, 상기 진탕기구(91), 작동모터(81), 캠기구(90) 및 위치결정센서(82)를 갖는다. 진탕기구(91)는, 도7에 나타낸 바와 같이, 장치프레임(83)에, 가이드로드(84)를 통하여, 압박수단으로서의 작동판(85)이 상하이동이 자유롭게 배치되며, 이 작동판(85)의 바닥면에 복수의 돌출부(86)가 돌출·형성된 것이다. 작동판(85)이 작동모터(81)에 의하여, 캠 기구(90)(도5)의 작용으로 상방 또는 하방으로 교대로 이동되는 것에 의하여, 이 작동판(85)의 돌출부(86)가, 진탕기구(91)의 하방에 위치하는 배양백(18)을 반복적으로 압박, 즉 배양백(18)에 대하여 압박과 해제를 반복한다.

여기서, 배양백(18)의 용량을 500~1500ml, 작업판(85)의 크기를 30×40㎝로 한 경우에 있어서는, 도7(A)에 나타내는, 진탕기구(91)에 돌출·형성하는 돌출부는, 예를 들면 5~25개로 하는 것이 바람직하다. 또, 도7(B)에 나타낸 바와 같이, 이 돌출부(86)의 직경(r)은, 예를 들면 0.5~7㎝, 보다 바람직하게는 1~3㎝이며, 돌출부(86)의 높이(h)는, 예를 들면 0.5~7㎝, 보다 바람직하게는 1~3㎝이다. 돌출부(86)의 소재는, 예를 들면, 플라스틱, 알루미늄, 고무 등으로 형성되어 있다. 이와 같은 소재로 작성하는 것에 의하여, 배양백(18) 및 배양백(18)내의 세포를 상처없이 압박하는 것이 가능해진다. 돌출부(86)의 형상은, 예를 들면 반구형이나 원통형 등, 배양백을 손상시키지 않는 형상이라면 어떤 형상이라도 상관없다. 또한, 돌출부(86)의 압박은, 예를 들면, 1분간에 10~180회의 스피드로, 압박폭 1~15mm으로 압박하고 있다. 또한, 이들의 수치는 한 예이며, 상기의 수치에 한정되는 것은 아니다.

이와 같은 구성의 진탕기구(91)에 의하여, 배양백(18)내의 배양액이 교반되며, 배양백(18)내의 세포가 배양액 내에서 부유하여 이동하고, 이 배양백(18)내에서의 세포의 분포 및 배지의 성분농도가 균일화되며, 또 산소공급능도 높아지게 되어 세포의 증식이 촉진된다.

도6에 나타낸 바와 같이, 상기 위치결정센서(82)에 의하여 작동판(85)의 위치가 검출되어 운전제어반(13)으로 송신되고, 이 운전제어반(13)에 의하여 작동모터(81)가 제어된다. 상기 진탕장치(80)를 사용한 배양백(18)내에서의 세포배양(진 탕배양)은, 배양백(18)내에 배양액이 가득찰 정도로 채워지기 전에 실시되어도 좋으며, 또는 가득찰 정도로 채워진 후에 실시되어도 좋다.

또, 캐니스터(16)내에는, 도5에 나타낸 바와 같이, 배양카세트(17)의 세포접종카세트(19) 또는 더미카세트(70)가 배치되는 위치의 상방에 조명용LED(87)가, 하방에는 화상취득수단으로서의 CCD카메라(88)가 설치된다. 조명용LED(87)는, 세포접종카세트(19) 또는 더미카세트(70)를 상방으로부터 조명하는 것이다. CCD카메라(88)는, 세포접종카세트(19) 또는 더미카세트(70)내의 세포를 하방으로부터 촬영하고, 그 화상을 취득하는 것이다. 이들의 조명용LED(87)의 조명동작과 CCD카메라(88)의 촬영동작은 운전제어반(13)(도6)에 의하여 제어되며, 소정시간(예를 들면 6시간)마다 세포접종카세트(19) 또는 더미카세트(70)내의 세포의 화상을 얻게 된다. 각 시간마다의 세포화상은, 화상처리용 컴퓨터(14)의 화상메모리회로(89)에 기억된다.

상기 화상처리용 컴퓨터(14)는, 화상메모리회로(89)내에 기억된 각 시간마다의 세포화상을 화상처리, 예를 들면 2치화처리나 다(多)치화처리하여, 단일세포의 투영면적의 평균값과, 단일세포가 응집한 세포응집덩어리인 비단일세포의 증가속도를 세포배양의 평가파라미터로서 산출한다. 단일세포의 투영면적의 평균값(단일세포의 평균투영면적)은, 세포접종카세트(19)를 배양카세트(17)에 장착하고, 이 배양카세트(17)를 캐니스터(16)내에 수납하여 배양을 개시했을 때로부터 예를 들면 24시간 경과후의 세포화상으로부터 산출한다.

또, 상술한 비단일세포인지에 대한 여부는, 배양초기의 단일세포의 투영면적 이 100μ㎡미만이기 때문에, 투영면적이 100μ㎡이상의 경우를 비단일세포로 판단한다. 세포의 경시적인 화상(예를 들면, 배양개시로부터 24시간, 48시간, 72시간 경과후의 화상)으로부터, 모든 세포에 대한 비단일세포의 비율의 변화를 연산하고, 비단일세포의 증가속도를 산출한다.

화상처리용 컴퓨터(14)는, 단일세포의 평균투영면적으로부터 래그타임을 산출하고, 해당 세포의 증식개시시기를 추정한다. 여기서, 상기 래그타임이란, 세포접종카세트(19)의 유도인자 자극용기(65)에 세포를 접종하고나서부터 증식개시까지의 필요한 유도기의 시간이다. 화상처리용 컴퓨터(14)는, 세포의 증식개시시기로부터 해당 세포의 배양상황, 즉 해당 세포가 유도인자의 자극에 의하여 증식의 가능성이 있는지에 대한 여부를 판단한다. 그리고, 화상처리용 컴퓨터(14)는, 해당 세포의 판정결과(예를 들면, 해당 세포가 증식할 가능성이 있는 경우에는 「YES」, 그렇지 않은 경우에는 「NO」등의 신호)를 운전제어반(13)에 대하여 송신한다. 운전제어반(13)은, 세포접종카세트(19)의 유도인자자극용기(65)내의 세포에 대하여 증식의 가능성이 현저하게 낮다고 판단한 내용의 신호를 받았을 때에는, 해당 세포에 대하여, 그 상태를 표시한다. 또, 래그타임이 너무 긴 세포는, 유도인자에 의한 자극이 현저하게 작용하기 어려운 세포이며, 증식의 가능성이 낮다고 판단된다.

또, 화상처리용 컴퓨터(14)는, 비단일세포의 증가속도로부터 해당 세포의 최소배화시간을 산출한다. 여기서, 배화시간이란, 어떤 시간에 있어서의 세포의 세포수가 배의 세포수가 되기까지에 필요한 시간을 말한다. 화상처리용 컴퓨터(14)는, 이 최소배화시간으로부터 해당 세포의 배양상황, 즉 해당 세포의 증식능력을 판단 하여 운전제어반(13)으로 송신한다. 그리고, 화상처리용 컴퓨터(14)로부터 신호를 받은 운전제어반(13)은, 상기 세포의 증식능력에 기초하여, 세포접종카세트(19)에서 배양백(18)으로 세포를 이동시키는 타이밍이나, 배양백(18)으로 배지를 유가시키는 유가속도 등을 결정한다. 또한, 최소배화시간이 너무 긴 세포는, 증식능력이 현저하게 낮은 세포라고 판단된다.

제어수단으로서 기능하는 운전제어반(13) 및 화상처리용 컴퓨터(14)는, 도시하지 않으나, 연산이나 제어를 실행하는 CPU와, 처리프로그램이나 데이터를 기억하는 기억장치(메모리)와, 데이터나 지령 등을 입력하기 위한 키보드, 마우스 또는 터치패널 등의 입력장치나 모니터 등의 출력장치와의 접속을 실행하는 입출력회로를 가지고 구성된다. 또한, 화상처리용 컴퓨터(14)에 있어서는, CCD카메라(88)로부터의 화상데이터를 기억하는 화상메모리회로(89)를 구비한다.

화상처리용 컴퓨터(14)의 기억장치에는, CCD카메라(88)가 소정시간마다 촬영한 세포접종카세트(19)내의 세포의 화상을 화상처리(예를 들면 2치화처리나 다치화처리)하여, 세포배양의 평가파라미터(단일세포의 평균투영면적, 비단일세포의 증가속도) 등을 산출하고, 이 세포배양의 평가파라미터로부터 세포의 배양상황(세포의 증식가능성, 세포의 증식능력)을 판정하기 위한 프로그램이 기억되어 있다.

또, 운전제어반(13)의 기억장치에는, 세포의 배양상황에 따라서 항온조(11), 캐니스터(16) 및 배양카세트(17)에 관한 기기(예를 들면 제1 펌프(48), 제2 펌프(49) 등)을 제어하고, 배양조작을 실시하기 위한 프로그램이 기억되어 있다. 또한, 이 운전제어반(13)의 기억장치에는, CCD카메라(88)를 소정시간마다 제어하여 세포의 화상을 얻는 등, 항온조(11), 캐니스터(16) 및 배양카세트(17)의 각종 센서로부터의 신호에 기초하여, 이들의 항온조(11), 캐니스터(16) 및 배양카세트(17)에 관한 기기를 제어하는 기기제어용의 프로그램도 기억되어 있다.

이어서, 운전제어반(13) 및 화상처리용 컴퓨터(14)가 상기 프로그램을 실행하여 세포를 배양하는 공정을, 도8~도11의 공정도 및 도12~도17에 나타내는 플로우챠트를 사용하여 설명한다. 이 세포배양공정에 있어서, 운전제어반(13) 및 화상처리용 컴퓨터(14)는, 항온조(11)의 캐니스터(16) 마다 독립하여 배양환경을 설정하여 제어하고, 각 캐니스터(16)에 수납된 배양카세트(17)에 있어서의 세포를 배양한다.

도8 내지 도13은, 유도인자 자극간헐식 관류배양공정을 나타내며, 배양백(18)에 세포를 회수하는 경우이다. 먼저, 도8(A) 및 도12에 나타낸 바와 같이, 조작자는, 빈 배양백(18)을 재치대(46)를 통하여 배양백트레이(47)에 재치하고, 이 배양백트레이(47)를 라지트레이(45)에 장착하고, 배양백(18)을 제1 펌프(48), 제2 펌프(49) 및 제3 펌프(50)에 접속한다.

이어서, 조작자는, 이 라지트레이(45)를 항온조(11)의, 표시등(44)이 예를 들면 녹색으로 점등된 단일의 캐니스터(16)내로 반입하고, 그 스테이지(42)에 지지시킨다. 그리고, 조작자는, 클린벤치 등의 내에서 유도인자 자극용기(65)에 유도인자를 고층화하고, 배지를 투입하여, 세포를 접종시킨 세포접종카세트(19)를, 도8(B)에 나타낸 바와 같이, 상기 캐니스터(16)내의 상기 라지트레이(45)에 장착한다. 연이어서, 조작자는, 클린벤치 등의 내에서 배지백(67)에 배지를 투입한 배지 카세트(20)를, 상기 캐니스터(16)내의 상기 라지트레이(45)에 장착한다(도12의 S1).

이어서, 조작자는, 라지트레이(45)에 배양백(18), 세포접종카세트(19) 및 배지카세트(20)가 장착된 배양카세트(17)를 수납한 캐니스터(16)에 있어서의 CCD카메라(88)의 화상출력을 확인한다(도12의 S2). 이 화상출력확인의 전 또는 후에, 조작자는 해당 캐니스터(16)의 경사모터(76)를 기동시켜 재치대(46)의 승강부를 하강시켜, 배양백(18)에 액체체류부(78)를 형성해 둔다. 다시 조작자는, 해당 캐니스터(16)의 중량계(43)에 의하여, 빈 배양백(18)의 중량을 계측해 둔다.

그 후, 도9(A)에 나타낸 바와 같이, 조작자는, 캐니스터도어(31)를 닫고 해당 캐니스터(16)내에서 세포의 배양을 개시시킨다(도12의 S3). 이에 의하여, 세포접종카세트(19)의 유도인자 자극용기(65)에 있어서, 증식을 위한 유도인자에 의해 세포가 자극된다(도12의 S4). 해당 캐니스터(16)의 CCD카메라(88)는, 세포접종카세트(19)의 유도인자 자극용기(65)내의 세포를 소정시간(예를 들면 6시간)마다 촬영하고, 화상처리용 컴퓨터(14)는, 이 촬영화상으로부터 세포배양의 평가파라미터를 산출한다. 그리고 화상처리용 컴퓨터(14)는, 이 평가파라미터로부터 래그타임을 산출하고, 해당 세포가 유도인자에 의하여 자극을 받아서 증식할 가능성이 있는지에 대한 여부를 판정하고, 다시 최소배화시간을 산출하여, 해당 세포의 증식능력을 산출한다(도12의 S5).

운전제어반(13)은, 화상처리용 컴퓨터(14)로부터, 세포가 세포접종카세트(19)의 유도인자 자극용기(65)내에서 유도인자에 의하여 자극되고나서 소정시간 (예를 들면 72시간) 경과하여도 증식의 가능성이 인정되지 않는다고 판단한 신호를 받았을 때에는, 그 결과를 표시한다. 또, 운전제어반(13)은, 화상처리용 컴퓨터(14)로부터 세포접종카세트(19)의 유도인자 자극용기(65)내의 세포에 증식의 가능성이 있다고 판단한 신호를 받았을 때에는, 해당 세포의 증식능력에 기초하여, 해당 세포를 배양백(18)으로 이행시키는 타이밍이나, 배양백(18)내로의 배지의 유가속도 등을 결정한다. 운전제어반(13)은, 이 결정에 기초하여 제1 펌프(48)를 작동하고, 도9(B)에 나타낸 바와 같이, 배지카세트(20)의 배지백(67)내의 배지를 세포접종카세트(19)로 유가시키고, 이 세포접종카세트(19)의 유도인자 자극용기(65)내의 세포를 배양백(18)으로 이행시킴과 동시에, 배지백(67)내의 배지를 배양백(18)으로 유가시킨다(도12의 S6).

이 제1 펌프(48)의 작동에 의하여, 배양백(18)의 액체체류부(78)내에서의 세포의 정치배양이 개시된다(도12의 S7). 운전제어반(13)은, 프로그램에 따라, 배지를 유가시키면서 유가배양하고, 중량계(43)에 의하여 계측되는 배양백(18)내의 배양액의 중량이 소정값 a 이상이 되었는지에 대한 여부를 판단한다(도12의 S8). 운전제어반(13)은, 소정값 a 이상이 된 시점에서 경사모터(76)를 기동시키고, 캠기구(79)를 통하여 재치대(46)의 승강부를 승강시켜, 도10(A)에 나타내는 바와 같이, 배양백(18)을 수평상태로 하여 액체체류부(78)를 해소시킨다(도12의 S9).

그 후, 운전제어반(13)은, 중량계(43)에 의하여 계측되는 배양백(18)내의 배양액의 중량이 소정값 b 이상이 되었는지에 대한 여부를 판단하고(도12의 S10), 소정값 b 이상이 된 시점에서 작동모터(81)를 기동시킨다. 이에 의하여, 도10(B)에 나타낸 바와 같이 진탕장치(80)가 작동하고, 진탕장치(80)의 진탕기구(91)에 있어서의 작동판(85)이 배양백(18)을 반복해서 압박하는 진탕배양을 개시한다(도12의 S11). 운전제어반(13)은, 계속하여, 중량계(43)에 의하여 계측되는 배양백(18)내의 배양액의 중량이 소정값 c 이상이 되었는지에 대한 여부를 판단하고(도12의 S12), 소정값 c 이상이 된 시점에서, 제1 펌프(48)를 정지하고 배양카세트(20)의 배지백(67)에서 배양백(18)으로의 배지의 유가를 정지하고, 작동모터(81)를 정지하여, 배양백(18)내에서의 진탕배양을 정지한다(도13의 S13).

운전제어반(13)은, 배양백(18)내에서 세포가 침강한 후에, 제2 펌프(49)를 작동시켜, 도11(A)에 나타낸 바와 같이, 배양백(18)내의 사용이 끝난 배지(배양백(18)내의 상청)를 배지카세트(20)의 사용이 끝난 배지백(68)으로 배출한다(도13의 S14). 그 후, 운전제어반(13)은, 제1 펌프(48)를 기동하여 배지카세트(20)의 배지백(67)에서 배양백(18)으로 배지를 유가시키고, 작동모터(81)를 기동하여, 진탕장치(80)에 의하여 배양백(18)내에서 진탕배양을 실시한다(도13의 S15). 소정 시간 경과후, 운전제어반(13)은, 제1 펌프(48)를 정지하고 배지카세트(20)의 배지백(67)에서 배양백(18)으로의 배지유가를 정지하고, 작동모터(81)를 정지하여 배양백(18)내에서의 진탕배양을 정지한다(도13의 S16).

운전제어반(13)이, 증식되는 세포의 사용일시에 따른 소망하는 배양기간에 이르렀는지에 대한 여부를 판단하고, 또는, 화상처리용 컴퓨터(14)가, 배양백(18)내에서의 세포가 소망하는 세포수에 이르렀는지에 대한 여부를 판단한다(도13의 S17). 배양백(18)내에서 세포가 소망하는 세포수에 이르렀는지에 대한 여부를 판단 할 때에는, 운전제어반(13)은, 제3 펌프(50)(도11(A))를 기동시키고, 배양백(18)내의 세포의 일부를 세포접종카세트(19) 또는 더미카세트(70)(대부분의 경우에는 더미카세트(70))로 이행시키고, 이 세포를 CCD카메라(88)로 촬영한다. 이 세포의 화상을 화상처리용 컴퓨터(14)가 화상처리하고, 세포수가 규정값 이상인지에 대한 여부를 판단하여 운전제어반(13)으로 송신한다. 그리고, 운전제어반(13)은, 이들의 배양기간 또는 세포수에 이르지 않았을 경우에는, 스텝 S14~S17의 처리동작을 반복한다.

상기 스텝 S13~S17은, 배양백(18)내에서 사용이 끝난 배지의 배출과, 배양백(18)내로의 새로운 배지의 공급(유가)을 교대로 실시하는 간헐식 관류배양이다.

또, 스텝 S9~S17에 있어서, 세포접종카세트(19)의 유도인자 자극용기(65)내에서의 세포의 유무는 CCD카메라(88)로 확인되며, 운전제어반(13)은, 유도인자 자극용기(65)내에 세포가 존재하지 않을 경우에는, 이 유도인자 자극용기(65)로부터 배양백(18)내로 유도인자가 유입하지 않도록, 세포접종카세트(19)를 더미카세트(70)로 환치하도록 조작자에게 촉구한다. 이 더미카세트(70)로 환치할 때에는, 운전제어반(13)은, 배지카세트(20)에서 배양백(18)으로의 배지의 유가와, 진탕장치(80)에 의한 진탕배양을, 더미카세트(70)에로의 환치가 완료되기까지 일시 중단시킨다.

다시, 스텝 S9~S17에 있어서, 운전제어반(13)은, 중량계(43)의 계측값으로부터 배지카세트(20)의 배지백(67)에 배지가 없어졌다고 판단하였을 경우에는, 배지카세트(20)를 새로운 배지카세트(20)로 교환하도록 조작자에게 촉구한다. 이 새로 운 배지카세트(20)로 교환할 때에도, 운전제어반(13)은, 배지카세트(20)에서 배양백(18)으로의 배지의 유가와, 진탕장치(80)에 의한 진탕배양을 배지카세트(20)에로의 교환이 완료될 때까지 일시중단시킨다.

운전제어반(13)은, 스텝 S17에 있어서 소망하는 배양기간에 이르거나, 또는 소망하는 세포수에 이르렀을 시점에서, 진탕을 정지하고, 세포침강 후, 도11(B)에 나타낸 바와 같이 제2 펌프(49)를 기동시키고, 배양백(18)내의 사용이 끝난 배지를 배지카세트(20)의 사용이 끝난 배지백(68)으로 배출하고, 중량계(43)의 계측값에 기초하여, 배양백(18)내의 배양액이 약 1/2~1/3 정도가 되기까지 세포를 농축시킨다(도12의 S18).

운전제어반(13)은, 그 후 제2 펌프(49)를 정지하고 세포배양을 종료한다(도12의 S19). 이 배양종료후에, 조작자에 의하여 배양백(18)내의 세포가 클린벤치 등 내부에서 원심분리기용의 용기로 옮겨지고, 그 후, 원심분리에 의하여 세포가 회수된다(도12의 S20).

이어서, 동일한 유도인자 자극간헐식 관류배양공정에 있어서, 세포회수백(72)(도5)에 의하여 세포를 회수하는 처리가 포함되는 경우를 도14 및 도15에 나타낸다. 따라서, 이 도14 및 도15에 나타내는 공정의 스텝 S21~S38은, 도12 및 도13의 스텝 S1~S18과 동일하기 때문에 설명을 생략한다.

도15에 나타내는 스텝 S38에 있어서, 제2 펌프(49)의 기동에 의하여 배양백(18)내의 세포가 농축된 후, 운전제어반(13)은, 제2 펌프(49)를 정지하고, 배지카세트(20)의 사용이 끝난 배지백(68)을 세포회수백(72)(도5)으로 교환하도록 조작 자에게 촉구한다(도13의 S39). 이 세포회수백(72)은, 원심분리기에 장착되어 원심분리에 사용될 수 있는 백이다.

배지카세트(20)의 사용이 끝난 배지백(68)이 세포회수백(72)으로 교환된 후, 운전제어반(13)은, 제2 펌프(49) 및 작동모터(81)를 기동시켜서, 진탕장치(80)에 의하여 배양백(18)내를 진탕시키면서, 이 배양백(18)내의 세포를 배지와 함께, 배지카세트(20)에 장착된 세포회수백(72)으로 이행시킨다(도15의 S40). 운전제어반(13)은, 그 후 제2 펌프(49) 및 작동모터(81)를 정지하고 세포배양을 정지한다(도15의 S41). 이 배양종료후에, 조작자에 의하여 세포회수백(72)이 원심분리기에 장착되고, 원심분리에 의하여 세포가 회수된다(도15의 S42).

이어서, 유도인자 자극연속식 관류배양공정을, 도16 및 도17에 기초하여 설명한다. 이 도16 및 도17에 나타내는 유도인자 자극연속식 관류배양공정에 있어서의 스텝 S51~S62는, 도12 및 도13의 유도인자 자극간헐식 관류배양공정에 있어서의 스텝 S1~S12와 동일하기 때문에 설명을 생략한다. 이 유도인자 자극연속식 관류배양공정에서는, 배양백(18)과 제2 펌프(49)와의 사이에 필터(71)가 배치되어 있다.

운전제어반(13)은, 배양백(18)내로 배지카세트(20)의 배지백(67)으로부터 배지가 유가되고(도16의 S56), 배양백(18)내에서의 진탕장치(80)에 의한 진탕배양중에(도16의 S61), 배양백(18)내의 배양액의 중량이 소정값 c 이상이 되는 시점에서(도16의 S62) 제2 펌프(49)를 기동시키고, 배양백(18)내의 사용이 끝난 배지를 배지카세트(20)의 사용이 끝난 배지백(68)으로 배출시킨다. 이에 의하여, 배양백(18)으로의 배지의 유가와 배양백(18)으로부터의 사용이 끝난 배지의 배출을 동시에 실 시하는 연속식 관류배양이 배양백(18)내에서 개시된다(도17의 S63). 이때, 배양백(18)내의 세포는, 필터(71)에 의하여 유동이 저지되고 사용이 끝난 배지백(68)내로 유동할 수가 없다. 상기 연속식 관류배양중에는, 진탕장치(80)에 의한 진탕배양도 동시에 실시되고 있다.

운전제어반(13)이, 증식되는 세포의 사용일시에 따른 소망하는 배양기간에 이르렀는지에 대한 여부를 판단하고, 또는, 화상처리용 컴퓨터(14)가, 배양백(18)내에서의 세포가 소망하는 세포수에 이르렀는지에 대한 여부를 판단한다(도17의 S64). 배양백(18)내에서 세포가 소망하는 세포수에 이르렀는지에 대한 여부를 판단할 때에는, 운전제어반(13)은, 제3 펌프(50)를 기동시키고, 배양백(18)내의 세포의 일부를 세포접종카세트(19) 또는 더미카세트(70)(대부분의 경우에는 더미카세트(70))로 이행시키고, 이 세포를 CCD카메라(88)로 촬영한다. 이 세포의 화상을 화상처리용 컴퓨터(14)가 화상처리하고, 세포수가 규정값 이상인지에 대한 여부를 판단하여 운전제어반(13)으로 송신한다. 그리고, 운전제어반(13)은, 이들의 배양기간 또는 세포수에 이르지 않았을 경우에는, 스텝 S63의 연속식 관류배양을 반복한다.

여기서, 스텝 S59~S64에 있어서, 세포접종카세트(19)의 유도인자 자극용기(65)내에서의 세포의 유무는 CCD카메라(88)로 확인되며, 운전제어반(13)은, 유도인자 자극용기(65)내에 세포가 존재하지 않을 경우에는, 이 유도인자 자극용기(65)로부터 배양백(18)내로 유도인자가 유입하지 않도록, 세포접종카세트(19)를 더미카세트(70)로 환치하도록 조작자에게 촉구한다. 이 더미카세트(70)로 환치할 때에는, 운전제어반(13)은, 배지카세트(20)에서 배양백(18)으로의 배지의 유가와, 진탕장 치(80)에 의한 진탕배양을, 더미카세트(70)로의 환치가 완료하기까지 일시 중단시킨다.

또, 스텝 S59~S64에 있어서, 운전제어반(13)은, 중량계(43)의 계측값으로부터 배지카세트(20)의 배지백(67)에 배지가 없어졌다고 판단했을 경우에는, 배지카세트(20)를 새로운 배지카세트(20)로 교환하도록 조작자에게 촉구한다. 이 새로운 배지카세트(20)로 교환할 때에도, 운전제어반(13)은, 배지카세트(20)에서 배양백(18)으로의 배지의 유가와, 진탕장치(80)에 의한 진탕배양을, 배지카세트(20)로의 교환이 완료하기까지 일시 중단시킨다.

운전제어반(13)은, 스텝 S64에 있어서의 소망하는 배양기간에 이르거나, 또는 소망하는 세포수에 이르렀을 시점에서, 제1 펌프(48), 제2 펌프(49) 및 작동모터(81)를 정지시키고, 관류배양 및 진탕배양을 정지시킨다(도17의 S65).

운전제어반(13)은, 그 후 제2 펌프(49)를 기동시키고, 배양백(18)내의 사용이 끝난 배지를 배지카세트(20)의 사용이 끝난 배지백(68)으로 배출시키고, 중량계(43)의 계측값에 기초하여, 배양백(18)내의 배양액이 약 1/2~1/3 정도가 되기까지 세포를 농축시킨다(도17의 S66).

운전제어반(13)은, 그 후 제2 펌프(49)를 정지하고 세포배양을 종료한다(도17의 S67). 이 배양종료후에, 조작자에 의하여 배양백(18)내의 세포가 클린벤치 등 내부에서 원심분리기용의 용기로 옮겨지고, 그 후, 원심분리에 의하여 세포가 회수된다(도17의 S68).

이상과 같이 구성됨으로써, 상기 실시 형태에 의하면, 다음과 같은 효 과(1)~(8)를 나타낸다.

(1) CCD카메라(88)가 촬영한 세포접종카세트(19)내의 세포의 화상을, 화상처리용 컴퓨터(14)가 화상처리하여 세포배양의 평가파라미터(단일세포의 평균투영면적, 비단일세포의 증가속도)를 얻고, 해당 세포의 배양상황(세포의 증식가능성 및 증식능력)을 판정평가한다. 운전제어반(13)은 이 배양상황에 따른 배양조작(세포접종카세트(19)에서 배양백(18)으로의 세포이행의 타이밍이나, 배양카세트(20)에서 배양백(18)으로의 소정의 유가속도에서의 배지유가 등)을 실시한다. 이 결과, 세포의 배양상황을 비접촉·비침습상태에서 판정할 수가 있기 때문에, 해당 세포에 손상을 주는 일이 없으며, 샘플링에 의한 콘타미네이션의 위험성 및 세포의 손실을 회피할 수가 있다. 또, 배양조작을 조작자가 차례로 실시할 필요가 없기 때문에, 조작자의 노력을 경감할 수가 있다. 더욱이, 한 환자의 세포를 단일의 캐니스터(16)내에 수납되는 배양카세트(17)의 세포접종카세트(19)에 접종시키고, 이 세포마다, 세포의 배양상황에 따른 배양조작을 실시할 수가 있기 때문에, 환자마다 적절한 배양조작을 실현할 수가 있으며, 크로스콘타미네이션을 회피할 수가 있다. 이 세포의 배양상황에 따른 적절한 배양조작을 실현함으로써, 시간 단위에서의 배양조작이 가능하게 되며, 배양이 촉진되어 배양기간을 단축할 수가 있다.

(2) 배지카세트(20)가 카세트구조로 구성되고, 배양백(18), 및 동일하게 카세트구조로 구성된 세포접종카세트(19)에 접속되기 때문에, 특히 배양백(18)을 배양에 있어서 최적 환경의 캐니스터(16)내로 항상 유지할 수가 있다. 이 때문에, 환경변화에 따른 배양백(18)내의 세포에 대한 손상을 저감시킬 수 있으며, 동시에, 클린벤치 등 내부에서 배양백(18)에 배지를 공급하는 무균조작을 생략할 수가 있다.

(3) 배지카세트(20), 세포접종카세트(19) 및 배양백(18)이 접속되어 폐쇄계로 구성됨으로써, 이들의 배지카세트(20), 세포접종카세트(19) 및 배지카세트(20)를 무균상태로 유지할 수가 있다.

(4) 배양백(18)내에서의 배양초기단계에 있어서, 이 배양백(18)의 액체체류부(78)내에 배양액이 저류됨으로써, 면적 당 세포밀도를 증식에 적당한 밀도로 유지하는 것에 의하여, 배양초기단계에 세포를 효율적으로 증식시킬 수가 있다.

(5) 배양백(18)내에서 증식된 세포를 세포접종카세트(19) 또는 더미카세트(70)내로 유도하고, 이 세포의 화상이 CCD카메라(88)에 의하여 얻어지게 되는 경우에는, 배양백(18)내에서 증식된 세포를 화상으로 얻을 수가 있으므로 샘플링할 필요가 없이, 그 세포의 수나 세포의 형태를 관찰할 수가 있다.

(6) 배양백(18)내의 사용이 끝난 배지가 배지카세트(20)의 사용이 끝난 배지백(68)으로 배출되어 저류됨으로써, 배양백(18)내의 세포밀도를 높이고 농축할 수가 있기 때문에, 세포회수를 위한 원심분리 조작회수를 저감시킬 수가 있다. 이 결과, 세포회수작업의 간이화를 실현할 수 있는 것과 동시에, 원심분리에 따른 세포의 손상도 저감시킬 수가 있다.

(7) 배양백(18)내에서 농축된 세포를, 배지카세트(20)에 장착된 세포회수백(72)에 전량 회수시키는 경우에는, 이 세포회수백(72)을 원심분리기에 직접 장착하여 세포를 회수할 수가 있기 때문에, 세포회수작업의 간이화를 실현할 수 있다.

(8) 세포가 접종된 배지를 수용하는 가요성의 배양백(18)을, 진탕장치(80)의 진탕기구(91)에 있어서의 작동판(85)의 돌출부(86)가 반복해서 압박하고, 해당 배양백(18)내의 배양액을 교반함으로써, 이 배양백(18)내의 세포의 분포 및 배지의 성분농도가 균일화되며, 또 산소공급능도 높아지게 되어, 세포의 증식이 촉진되고, 세포의 배양효율을 향상시킬 수가 있다. 또, 세포는, 진탕장치(80)의 작동판(85)에 의하여 반복적으로 압박되어 교반된 배양액 내를 부유하는 것 뿐이기 때문에, 손상을 입는 것이 방지된다.

[B] 제2의 실시형태(도18~도21)

도18은, 본발명에 있어서의 세포배양용 진탕장치의 제2의 실시형태가 적용된 배양유니트 및 세포배양장치의 구성(분화유도상태)을 나타내는 레이아웃도면이다. 도19는, 도18의 배양유니트의 분화유도 전 상태의 구성을 나타내는 레이아웃도면이다. 이 제2의 실시형태에 있어서, 상기 제1의 실시형태와 동일한 부분은, 동일한 부호를 붙이고 설명을 생략한다.

이 제2의 실시형태의 세포배양장치(100)는, 제1의 실시형태의 세포배양장치(10)에 있어서의 세포접종카세트(19)(도5)를, 분화유도인자가 미리 첨가된 분화유도배양용기로서의 분화유도카세트(101)로 바꾸어놓은 것이다. 그리고, 이 세포배양장치(100)에서는, 배지카세트(20)의 배지백(67)에서 배양백(18)으로 제2 펌프(49)의 기동에 의하여 배지를 유도하여 세포를 증식시킨 후에, 이 증식한 세포를 제1 펌프(48)의 기동에 의하여 분화유도카세트(101)로 유도하여 해당 세포에 역할을 부여하는, 즉 해당 세포를 분화시킨다. 여기서, 분화란, 세포에 심장의 세포로 서의 역할을 가지게 하거나, 간장의 세포로서의 역할을 가지게 하거나 하는 것 등이다. 배양백(18)에서 증식된 세포를 분화유도카세트(101)로 분화시키기 전까지는, 도19에 나타낸 바와 같이, 이 분화유도카세트(101) 대신에 더미카세트(102)가 배치되고, 배양백(18)내의 사용이 끝난 배지가, 제1 펌프(48)의 기동에 의하여 더미카세트(102)를 통하여 배지카세트(20)의 사용이 끝난 배지백(68)으로 배출된다. 상기 더미카세트(102)는, 더미카세트(70)(도5)와 마찬가지로, 단순히 배지를 유동시키기 위한 유로로서 기능한다.

이 제2의 실시형태에서는, 도18에 나타낸 바와 같이, 분화유도카세트(101)내에서 분화되어있는 세포의 화상을 CCD카메라(88)가 소정시간마다 촬영한다. 이 촬영을 실행하기 위한 프로그램이, 운전제어반(13)의 기록장치에 기억되어 있다. 화상처리용 컴퓨터(14)는, 이 세포의 화상을, 예를 들면 2치화처리나 다치화처리하여, 세포의 형태를 평가파라미터로서 취득한다. 이 평가파라미터의 취득을 실시하기 위한 프로그램이 화상처리용 컴퓨터(14)의 기록장치에 기억되어 있다. 화상처리용 컴퓨터(14)는, 세포형태의 경시적변화로부터 해당 세포가 분화되었는지에 대한 여부를 판정한다. 화상처리용 컴퓨터(14)로부터의 신호를 받은 운전제어반(13)은, 이 분화유도카세트(101)에 의한 분화유도조작을 제어한다. 예를 들면, 운전제어반(13)은, 화상처리용 컴퓨터(14)가, 해당 세포에 분화의 가능성이 있다고 판단했을 경우에는 분화유도조작을 계속하고, 그렇지 않은 경우에는, 그 결과를 표시한다. 상술한 분화의 판정을 실행하기 위한 프로그램이 화상처리용 컴퓨터(14)의 기록장치에 기억되고, 분화유도조작을 실행하기 위한 프로그램이, 운전제어반(13)의 기록장치에 기억되어 있다.

이어서, 상기 세포배양장치(100)에 의한 분화유도 간헐식 관류배양공정을, 도20 및 도21을 이용하여 설명한다.

먼저, 조작자는, 클린벤치 등의 내부에서 배양백(18)에 배지 및 세포를 첨가하고(도20의 S71), 이 배양백(18)을 재치대(46)를 통하여 배양백트레이(47)에 재치하고, 이 배양백트레이(47)를 라지트레이(45)에 부착한다(도20의 S72). 그리고, 조작자는, 이 라지트레이(45)를 항온조(11)의, 표시등(44)이, 예를 들면 녹색으로 점등된 단일한 캐니스터(16)내에 반입한다.

이어서, 조작자는, 상기 캐니스터(16)내의 라지트레이(45)에 배지카세트(20)를 장착하고, 더미카세트(102)(도19)를 장착한다(도20의 S73). 그리고, 조작자에 의하여 상기 캐니스터(16)의 캐니스터도어(31)가 닫혀지고, 배양백(18)내에서의 세포의 정치배양이 개시된다(도20의 S74). 이 정치배양에 있어서, 당초 배양백(18)내에 배양액이 적을 경우에는, 조작자는, 경사모터(76)를 기동시켜 재치대(46)의 승강부를 하강시켜서, 배양백(18)에 액체체류부(78)(도8)를 형성해둔다.

정치배양개시후, 운전제어반(13)은, 제2 펌프(49)를 기동시키고, 배지카세트(20)의 배지백(67)으로부터의 배지를 배양백(18)으로 유가시킨다(도20의 S75). 운전제어반(13)은, 배양백(18)내의 배양액이 소정값 a 이상이 되었는지에 대한 여부를, 중량계(43)의 계측값으로부터 확인하고(도20의 S76), 중량계의 계측값이 상기 소정값 a 이상이 된 경우에, 경사모터(76)를 기동시켜 재치대(46)의 승강부를 상승시켜서, 배양백(18)을 수평상태로 하여 액체체류부(78)를 해소한다(도20의 S77).

그 후, 운전제어반(13)은, 중량계(43)에 의하여 계측되는 배양백(18)내의 배양액의 중량이 소정값 b 이상이 되었는지에 대한 여부를 판단하고(도20의 S78), 소정값 b 이상이 된 시점에서 작동모터(81)를 기동시키고, 진탕장치(80)를 작동시켜서 진탕배양을 개시한다(도20의 S79). 운전제어반(13)은, 계속해서, 중량계(43)에 의하여 계측되는 배양백(18)내의 배양액의 중량이 소정값 c 이상이 되었는지에 대한 여부를 판단하고(도20의 S80), 소정값 c이상이 된 시점에서, 제2 펌프(49)를 정지하고, 배지카세트(20)의 배지백(67)에서 배양백(18)으로의 배지의 유가를 정지하고, 작동모터(81)를 정지하여, 배양백(18)내에서의 진탕배양을 정지한다(도20의 S81).

운전제어반(13)은, 배양백(18)내에서 세포가 침강한 후에, 제1 펌프(48)를 작동시켜, 배양백(18)내의 사용이 끝난 배지(배양백(18)내의 상청)를 배지카세트(20)의 사용이 끝난 배지백(68)으로 배출한다(도21의 S82). 그 후, 운전제어반(13)은 제2 펌프(49)를 기동하고, 배지카세트(20)의 배지백(67)에서 배양백(18)으로 배지를 유가시키고, 작동모터(81)를 기동하여, 진탕장치(80)에 의하여 배양백(18)내에서 진탕배양을 실시한다(도21의 S83). 소정시간경과후, 운전제어반(13)은, 제2 펌프(49)를 정지하고, 배지카세트(20)의 배지백(67)에서 배양백(18)으로의 배지의 유가를 정지하고, 작동모터(81)를 정지하여 배양백(18)내에서의 진탕배양을 정지한다(도21의 S84).

운전제어반(13)이, 증식되는 세포의 사용일시에 따른 소망하는 배양기간에 이르렀는지에 대한 여부를 판단하고, 또는, 화상처리용 컴퓨터(14)가, 배양백(18)내에서의 세포가 소망하는 세포수에 이르렀는지에 대한 여부를 판단한다(도21의 S85). 배양백(18)내에서 세포가 소망하는 세포수에 이르렀는지에 대하여 판단할 때에는, 운전제어반(13)은, 제3 펌프(50)를 기동시켜, 배양백(18)내의 세포의 일부를 더미카세트(102)로 이행시키고, 이 세포를 CCD카메라(88)로 촬영한다. 이 세포의 화상을 화상처리용 컴퓨터(14)가 화상처리하고, 세포수가 규정값 이상인지에 대한 여부를 판단하여 운전제어반(13)으로 송신한다. 운전제어반(13)은, 이들의 배양기간 또는 세포수에 이르지 않았을 경우에는, 스텝 S82~S85의 조작을 반복한다.

상기 스텝 S81~S85는, 배양백(18)내에서 사용이 끝난 배지의 배출과, 배양백(18)내로의 새로운 배지의 공급(유가)을 교대로 실시하는 간헐식 관류배양이다.

여기서, 스텝 S77~S85에 있어서, 운전제어반(13)은, 중량계(43)의 계측값으로부터 배지카세트(20)의 배지백(67)에 배지가 없어졌다고 판단한 경우에는, 배지카세트(20)를 새로운 배지카세트로 교환하도록 조작자에게 촉구한다. 이 새로운 배지카세트(20)로의 교환에 있어서도, 운전제어반(13)은, 배지카세트(20)에서 배양백(18)으로의 배지의 유가와, 진탕장치(80)에 의한 진탕배양을, 배지카세트(20)의 교환이 완료될 때까지 일시 중단시킨다. 운전제어반(13)은, 스텝 S85에 있어서 소망하는 배양기간에 이르거나, 또는 소망하는 세포수에 이른 시점에서, 제1 펌프(48)를 기동시켜, 배양백(18)내의 사용이 끝난 배지를 배지카세트(20)의 사용이 끝난 배지백(68)으로 배출하고, 중량계(43)의 계측값에 기초하여, 배양백(18)내의 배양액이 약 1/2~1/3 정도가 되기까지 세포를 농축시킨다(도21의 S86).

그 후, 운전제어반(13)에 의하여 제1 펌프(48)가 정지된 후에, 조작자는, 도18에 나타낸 바와 같이, 더미카세트(102)를 분화유도카세트(101)로 교환한다(도21의 S87).

분화유도카세트(101)로의 교환이 완료된 후에, 운전제어반(13)은, 제2 펌프(49)를 기동하고, 배지카세트(20)의 배지백(67)내의 배지를 배양백(18)으로 유가시키고, 작동모터(81)를 기동하여 배양백(18)내를 진탕장치(80)에 의하여 진탕배양시킨다(도21의 S88). 이어서, 운전제어반(13)은, 제1 펌프(48)를 기동하고, 배양백(18)내에서의 진탕배양 및 배지카세트(20)로부터의 배지의 유가를 계속하면서, 배양백(18)내의 배양액을 분화유도카세트(101)로 이동시킨다(도21의 S89). 이에 의하여, 이 분화유도카세트(101)내에서 분화유도배양이 개시된다(도21의 S90).

운전제어반(13)은, 상기 분화유도배양중에, 분화유도카세트(101)내의 세포를 CCD카메라(88)에 의하여 소정 시간(예를 들면 6시간)마다 촬영한다. 화상처리용 컴퓨터(14)는, 이 촬영화상을 화상처리하고, 세포의 형태를 평가파라미터로서 취득하고, 이 세포형태의 경시적 변화로부터, 해당 세포가 분화유도카세트(101)내에서 분화되었는지에 대한 여부를 판단한다(도21의 S91).

운전제어반(13)은, 스텝 S91에서 화상처리용 컴퓨터(14)로부터 세포가 분화되었다고 판단한 신호를 받았을 때에, 제2 펌프(49), 제1 펌프(48) 및 작동모터(81)를 정지하고, 분화유도배양을 정지하여, 세포배양을 종료한다(도21의 S92). 이 배양종료후에, 조작자는, 클린벤치 등 내부에서의 세포회수조작에 의하여, 분화유도카세트(101)내의 세포를 회수한다(도21의 S93).

이상과 같이 구성됨으로써, 상기 제2의 실시형태에 의하면, 상기 제1의 실시형태의 효과 (2)~(6) 및 (8)과 같은 효과(단, 세포접종카세트(19)를 분화유도카세트(101)로 환치한다)를 갖는 것 외에, 다음의 효과(9)를 나타낸다.

(9) 분화유도카세트(101)내의 세포의 화상을 화상처리하여 세포배양의 평가파라미터(세포의 형태)를 취득하고, 당해 세포의 배양상황(세포가 분화되었는지에 대한 여부)를 판정하고, 이 배양상황에 따른 배양조작(배지카세트(20)에서 배양백(18)으로의 소정의 유가속도에서의 배지유가나 배양백(18)으로부터 분화유도카세트(101)로의 세포이행의 타이밍 등)을 실시함으로써, 세포의 배양상황을 비접촉·비침습상태로 판정할 수 있기 때문에, 해당 세포에 손상을 주는 일 없이, 샘플링에 의한 콘타미네이션의 위험성 및 세포의 손실을 회피할 수가 있으며, 또한, 조작자의 노력을 경감시킬 수가 있다. 더욱이, 한 환자의 세포를 단일의 캐니스터(16)내에 수납하는 배양카세트(17)의 배양백(18)에서 증식시키고, 분화유도카세트(101)에 있어서 분화시키기 때문에, 환자마다 세포의 배양을 적절하게 실시할 수가 있으며, 크로스콘타미네이션을 회피할 수가 있다.

또, 상기 제1 및 제2의 실시형태에 있어서의 세포배양장치(10) 및 (102)에 의하면, 다음의 효과(10)를 나타낸다.

(10) 세포배양장치(10) 및 (100)는, 동일하게, 다른 배양환경에서 세포를 배양하는 복수의 배양용기 가운데, 하나의 배양용기에서 배양된 세포가, 하류측의 다른 배양용기로 이행되고 있다. 즉, 세포배양장치(10)에서는, 하나의 배양용기인 세포접종카세트(19)로 증식을 위해 유도인자에 의하여 세포를 자극하고, 그 후, 이 세포접종카세트(19)로부터 다른 배양용기인 배양백(18)으로 상기 세포를 이동시키고, 해당 세포를 증식시키고 있다. 또, 세포배양장치(100)에서는, 하나의 배양용기인 배양백(18)으로 세포를 증식한 후에, 이 배양백(18)으로부터 배양용기인 분화유도카세트(101)로 상기 세포를 이행시켜, 해당 세포를 분화시키고 있다. 이와 같이, 세포배양장치(10) 및 (100)에 의하면, 세포의 배양형태의 변이(variation)를 확대시킬 수가 있다.

이상, 본 발명을 상기 실시형태에 기초하여 설명하였으나, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

예를 들면, 제1, 제2의 실시형태에서는, 화상처리용 컴퓨터(14)가 CCD카메라(88)의 화상을 화상처리하여 평가파라미터를 산출하고, 해당 평가파라미터로부터 세포의 배양상황(세포의 증식가능성, 세포의 증식능력)을 판정하는 것으로 설명하였으나, 이 화상처리용 컴퓨터(14)의 기능을 운전제어반(13)이 실시하도록 하여도 좋다. 또, CCD카메라(88)에 의한 세포화상의 촬영은, 배양백(18)에 있어서 실시하여도 좋다. 더욱이, 유도인자 자극연속식 관류배양공정(도16 및 도17)에 있어서, 진탕장치(80)에 의한 진탕배양을 실시하지 않는 경우에는, 제2 펌프(49)와 배양백(18)의 사이에 필터(71)를 배치하지 않아도 좋다.

또, 제1, 제2의 실시형태에서는, 운전제어반(13) 및 화상처리용 컴퓨터(14)가 하나의 항온조내의 각 캐니스터에 대하여 제어하는 것으로 설명하였으나, 동일한 항온조가 복수개있으며, 이들의 항온조의 각 캐니스터에 대하여, 운전제어반(13) 및 화상처리용 컴퓨터(14)가 제어를 실행하여도 좋다.

[C] 제3의 실시형태(도22~도34)

도22는, 본 발명에 있어서의 세포배양용 진탕장치의 제3의 실시형태가 적용된 배양유니트 및 세포배양장치를 나타내는 구성도면이다. 도23은, 제3의 실시형태에 있어서의 세포배양장치(200)에 있어서의 하나의 공간적으로 독립한 배양실(240)과 저온실(230), 이 배양실(240)내에 수납되는 배양백트레이(241)와 저온실(230)에 수납되는 배지백트레이(231), 폐액백트레이(232)로 이루어지는 배양유니트(212)의 구성을 나타내는 레이아웃도면이다.

도22에 나타내는 세포배양장치(200)는, 특히, 면역세포요법에 사용되는 부유계 세포를 배양하는 것이며, 복수개(예를 들면 3개)의 배양유니트(212)를 구비한 배양장치(210)와, 이 복수개의 배양유니트(212)의 운전을 제어하는 운전제어용PLC(programable logic controller)(223)와, 세포의 화상을 처리하기 위한 화상처리용 유니트(221)와, 모든 데이터를 수집하는 데이터 수집장치(224)와, 운전제어용PLC(223)와 화상처리용 유니트(221)의 정보표시 및 제어입력하는 터치패널(222)과, 허브(225)를 통하여 운전제어용PLC(223), 화상처리용 유니트(221), 데이터 수집장치(224)에 접속되고, 세포배양장치(200) 및 배양유니트(212)를 감시하기 위한 감시용 컴퓨터(226)를 가지고 구성된다. 상기 운전제어용PLC(223) 및 화상처리용 유니트(221)가 제어수단으로서 기능한다. 복수개의 배양유니트(212)는, 각각 관찰용 카메라(CCD카메라)(302)를 구비하고 있다.

여기서, 상기 부유계 세포로서는, 말초혈 단핵구, LAK세포(Lymphokine Activated Killer세포), 신경간세포, ES세포 등이 알려져 있다. 이들의 부유계 세 포를 이하 간단하게 세포라고 칭한다. 본 세포배양장치(200)는, 상기 부유계 세포 이외의 접착의존성 세포(예를 들면, 간엽계간세포)를 배양하는 경우에도 적용가능하다.

상기 세포배양장치(200)는, 공간적·구조적으로 독립한 복수개(예를 들면 3개)의 배양유니트(212)가 겹쳐진 구조로서, 각 배양유니트(212)는 도23에 나타낸 바와 같이 저온실(230)과 배양실(240)로 분리된다. 이 세포배양장치(200)내에는, 배양백트레이(241), 배지백트레이(231) 및, 폐액백트레이(232)가 수납되어 있다. 배양백트레이(241)에는, 후에 자세히 설명하는 바와 같이, 항체자극 및 증식용 배양용기로서의 배양백(242)이 재치되고, 배지백트레이(231), 및 폐액백트레이(232)에는, 배지저류수단으로서의 배지백(새 배지백)(233) 및 폐액저류수단으로서의 폐액백(폐 배지백)(234)이 각각 재치된다.

상기 배양유니트(212)는, 배양실(240) 및 저온실(230)에 개폐가능한 도어(미도시)를 구비하고 있다. 이 배양유니트(212)는, 도어를 닫은 상태로, 배양실(240)내의 환경(온도 및 CO2농도)을, 세포를 배양하는데 필요한 환경으로 유지하고, 저온실(230)내의 환경(온도)을, 배지보존에 최적의 환경으로 유지한다.

이를 위하여, 배양유니트(212)에는, 온도센서(236, 243), CO2센서(244), 도어센서(미도시) 및 히터(미도시)가 설치되어 있다. 또한 세포배양장치(200)(배양유니트(212))에는, CO2공급계(245)를 경유하여, 외부에 설치된 가스봄베(미도시)가 연결된다. 온도센서(236, 243), CO2센서(244) 및 도어센서로부터의 신호는, 운전제어용PLC(223)로 송신된다. 이 운전제어용PLC(223)는, 온도센서(236, 243)로부터의 온도신호에 기초하여 히터를 제어하고, CO2센서(244)로부터의 CO2농도 신호에 기초하여, 가스봄베로부터 각 배양유니트(212)내로 공급되는 CO2가스량을 제어한다. 실내의 CO2는 순환펌프(246)에 의하여, 미리 설정된 일정량씩 배출된다.

교반팬(247)의 운전은 운전제어용PLC(223)에 의하여 제어되며, 배양유니트(212)의 도어가 열린다는 신호가 도어센서로부터 운전제어용PLC(223)로 송신되었을 때에, 교반팬(247)의 운전이 정지되고, 배양유니트(212)내의 환경변화가 완화된다.

이 세포배양장치(200)는, 건열멸균기능을 가지고 있으며, 배양백트레이, 배지백트레이, 폐액백트레이를 각각 세트 한 상태에서, 장치내의 멸균 및 각 트레이를 멸균하는 것이 가능하며, 배양유니트(212)내에서의 세균증식을 방지할 수가 있다. 또, 각 배양유니트(212)가 각각 독립한 공간구조로 되어 있기 때문에, 다른 배양유니트(212)내의 세포에 대하여 격리됨과 동시에, 배양유니트(212)에 수납되는 배양백(242), 배지백(233), 폐액백(234)은, 클린벤치 등의 내부에서 접속된 후, 배양유니트(212)에 설치되기 때문에, 이 배양유니트(212)에 수납되는 배양백(242)은 폐쇄계(비개방계)로 확보되며, 배양백(242)내의 세포가 잡균에 의하여 오염되는 콘타미네이션이 방지된다.

배양유니트(212)에는, 다시 도어센서(미도시), 도어록센서(미도시), 온도센서(236, 243), 도어록기구(미도시), 히터(미도시) 및 교반팬(247)이 형성되어 있다. 운전제어용PLC(223)는, 온도센서(236, 243)로부터의 온도신호에 기초하여 히터를 제어한다. 또, 운전제어용PLC(223)는, 교반팬(247)의 운전을 제어하고, 배양 실(240)내에서 공기 및 CO2가스를 순환시킨다. 이와 같이 하여, 배양실(240) 안은 세포를 배양하기 위한 최적의 환경으로 유지된다.

또, 운전제어용PLC(223)는, 하나의 세포배양장치(200)에 있어서 2이상의 배양유니트(212)의 도어가 동시에 열림동작을 하지 않도록 도어록기구의 동작을 제어한다. 이에 의하여, 서로 다른 배양유니트(212)사이에서 세포나 배지 등이 바뀌어서 반입되는 일이 방지된다. 이 도어록기구의 잠금동작은 도어록센서에 의하여 검출되고, 운전제어용PLC(223)로 송신된다. 또, 배양유니트(212)의 도어의 개폐상태는 도어센서에 의하여 검출되고, 운전제어용PLC(223)로 송신된다.

도23에 나타내는 배양유니트(212)내의 하부에는, 배양실(240)내에 수납되는 배양백트레이(241)를 지지하는 프레임(250)이 설치되며, 이 프레임(250)을 배양유니트(212)상부에 설치한 중량계(251)가 지지하여 설치된다. 이 중량계(251)는, 배양실(240)내에 수납된 배양백트레이(241)의 배양백(242)의 중량을 계측하는 것으로서, 실제로는, 배양백(233)에서 배양백(242)으로 제공되는 배지량을 계측하는 것과, 배양백(242)으로부터 폐액백(234)에 배출되는 폐액량을 계측한다. 이 중량계(251)의 계측값도 운전제어용PLC(223)로 송신된다. 또, 배양유니트(212) 본체에는, 배양유니트(212)내의 배양백(242)의 유무를 표시하는 표시등(미도시)이 설치된다. 운전제어용PLC(223)는, 배양실(240)내에 배양백(242)이 수납되어 있을 때에, 표시등을, 예를 들면 적색 점등시키고, 배양실(240)내에 배양백(242)이 수납되어 있지 않을 때에는, 표시등을 예를 들면 녹색으로 점등시킨다.

여기서, 상기 배양백트레이(241)에 대하여 설명한다.

이 배양백트레이(241)는, 도23에 나타낸 바와 같이 배양백(242)이 장착된 것으로서, 배양백(242)이 세포를 배양하는 배양용기이다. 이 배양백(242)은, 세포에 기능을 발현시키기(예를 들면 세포를 증식시키는, 세포를 분화시키는 등) 위한 기능발현용 배양용기이며, 본 실시형태에서는, 증식을 위하여 항체에 의해 세포를 자극하는 항체자극용 배양용기이다. 또, 동일한 배양백(242)에 있어서 항체에 의하여 자극된 세포를 증식하기 위한 증식용 배양용기이기도 하다.

배양백(242)은, 세포가 접종된 배지를 수용하는 가요성의 용기이며, 재치대(252)를 통하여, 배양백트레이(241)에 재치된다. 상기 배양백(242)은, 예를 들면 산소투과성재질로 이루어지는 백이다.

여기서, 배양유니트(212)에 대하여 설명한다.

배양실(240)에는, 도23에 나타낸 바와 같이, 공급펌프(261), 배출펌프(271)가 배치된다. 배양백(242)은, 일단측이 튜브(262)를 사용하여 공급펌프(261)를 통하여 공급계 조인트(264)에 접속된다. 또, 배양백(242)의 타단측은, 튜브(272)를 사용하여 배출펌프(271)를 통하여 배출계 조인트(274)에 접속된다.

이 배양유니트(212)에서는, 배양백(242)은, 튜브(262)에 의하여 공급계 조인트(264)에 접속됨과 동시에, 튜브(265)에 의하여 배지백(233)에 접속된다. 또, 배양백(242)은, 튜브(272)를 통하여 배출계 조인트(274)에 접속됨과 동시에, 튜브(275)에 의하여 폐액백(234)에 접속된다.

상기 배양백(242)은, 도23에 나타낸 바와 같이, 배양백(242)의 공급펌프(261)에 접속되는 일부 바닥면의 내측에 항체를 고층화(固層化)하고, 이 배양 백(242)에 배지를 투입하여, 이 배지에 세포를 접종하고, 이 배양백(242)을 배양백트레이(241)에 설치하여, 카세트구조로 구성한 것이다. 상기 배양백(242)에 항체를 고층화하고, 배지 및 세포를 넣는 작업은, 클린벤치 등의 내부에서 무균상태로 실시된다.

상기 배양백(242)에 있어서 일부 항체를 고층화한 것에 의하여, 즉 세포를 항체에 의해 자극하여 해당 세포에 증식기능을 발현시키기 위한 배양환경과, 세포를 증식시키기 위한 배양환경을 동일한 배양백(242)에서 만들어낼 수가 있다. 따라서, 배양백(242)의 일부에서 항체에 의하여 자극되어, 증식을 개시하기 시작한 세포에, 배지를 공급하는 것으로 효율적이며 동일한 배양백(242)에서 증식을 실시할 수가 있게 된다.

상기 배지백트레이(231), 및 폐액백트레이(232)에는, 배지저류용기로서의 배지백(233), 및 사용이 끝난 배지저류용기로서의 폐액백(234)이 각각 재치되어, 카세트구조로 구성된다. 상기 배지백(233)은, 배양백(242)으로 공급되는 배지를 저류하는 것이다. 또, 상기 폐액백(234)은, 배양백(242)으로부터 배출되는 사용이 끝난 배지(상청)를 저류하는 것이다. 배지백트레이(231)가 카세트구조로 구성되는 것에 의하여, 배양백(242)을 배양실(240)내에 유지한 상태에서, 해당 배양유니트(212)내의 저온실(230)에 배지백트레이(231)를 장착하는 것만으로 배지의 교환, 공급이 가능하게 된다.

상기 배양백트레이(241)는, 배양유니트(212)에 착탈 가능하게 장착된다. 이때에는, 배양백(242)의 공급계 조인트(264)는, 배지백(233)의 조인트에, 배출계 조 인트(274)는 폐액백(234)의 조인트에 각각 무균적으로 결합된다. 즉, 공급계 조인트(264)와 배지백(233)의 조인트는, 예를 들면 일방의 고무형상 결합부에 타방의 침상 결합부가 삽입되는 것에 의해 무균적으로 결합된다. 배출계 조인트(274)와 폐액백(234)과의 결합에 있어서도 동일하다. 상기 배양백(242)과, 배지백(233) 및 폐액백(234)을 결합시키는 작업은, 클린벤치 등의 내부에서 무균 상태로 실시된다.

배양백(242), 배지백(233) 및 폐액백(234)이 상술한 바와 같이 접속되는 것에 의하여, 배지백트레이(231)에 있어서의 배지백(233)내의 배지가 공급펌프(261)의 기동에 의하여 배양백(242)으로 공급되며, 이 배양백(242)내의 사용이 끝난 배지가 배출펌프(271)의 기동에 의하여 폐액백트레이(232)의 폐액백(234)으로 배출되는 폐쇄루프가 구성된다. 이 폐쇄루프의 구성에 의하여, 해당 계통(배양백(242), 배지백(233), 폐액백(234))이 무균상태로 유지된다.

배양백(242)내에서의 배양(세포증식)에는, 공급펌프(261)를 기동시켜, 배지백트레이(231)의 배지백(233)내의 배지를 배양백(242)으로 공급(유가)하는 것에 의해 세포를 증식시키는 정치배양(단순유가)과, 공급펌프(261) 및 배출펌프(271)를 구동시켜, 배양백(242)내의 사용이 끝난 배지를 폐액백트레이(232)의 폐액백(234)으로 배출하고, 또한 배지백(233)내의 배지를 배양백(242)으로 공급하는 것으로 세포를 증식시키는 관류배양과, 후술하는 진탕장치(290)를 사용한 진탕배양 등이 있다. 이 중, 관류배양에는, 사용이 끝난 배지의 배출과 배지의 공급을 교대로 실시하는 간헐식 관류배양과, 사용이 끝난 배지의 배출과 배지의 공급을 동시에 실시하는 연속식 관류배양이 있다. 이 연속식 관류배양에는, 통상, 배양백(242)과 배출펌 프(271)와의 사이의 튜브(272)에 세포의 이동을 저지하는 필터가 배치되며, 배양백(242)내의 세포가 폐액백(234)으로 배출되는 것을 방지한다.

상기 폐액백트레이(232)의 폐액백(234)으로는, 배양백(242)에 있어서의 세포의 증식종료후에, 배양백(242)내의 사용이 끝난 배지가 배출되고, 이 배양백(242)내의 세포가 농축된다. 이 사용이 끝난 배지의 배출은 배출펌프(271)의 기동에 의하여 실시되며, 중량계(251)의 계측값에 기초하여 운전제어용PLC(223)의 제어에 의하여, 배양백(242)내의 배지 및 세포의 용량이 약 1/2~1/3 정도가 되기까지 실시된다. 이 배양백(242)내에서의 세포의 농축에 의하여, 그 후에 실시되는 원심분리기에 의한 원심분리횟수가 저감된다.

또, 폐액백트레이(232)에서는, 배양백(242)에 있어서의 세포가 상술한 바와 같이 농축된 후에, 폐액백(234)을, 원심분리기에 장착이 가능한 세포회수용기로서의 세포회수백으로 환치하고, 이 세포회수백내로, 배양백(242)내에서 세포가 농축된 배양액(배지 및 세포)을, 배출펌프(271)의 기동에 의하여 공급하여도 좋다. 이 경우에는, 튜브(272)에 필터가 배치되어 있지 않은 것을 조건으로 한다. 이에 의하여, 원심분리기에 장착가능한 백에서의 세포의 회수를, 폐쇄계 공간인 배양유니트(212)내에서 실시할 수가 있으며, 세포의 회수작업이 간이화된다.

여기서, 도23에 나타낸 바와 같이, 배양유니트(212)내에는 배양백트레이(241)가 수납되며, 이 배양백트레이(241)가 배양실(240)의 프레임(250)에 지지되는바, 이 배양백트레이(241)상에 배양백(242)을 직접 재치하는 재치대(252)는, 승강하지 않는 파트(252a)와, 승강가능한 복수로 연결된 면적변화파트(252b, 252c)에 의하여 구성된다. 이들의 면적변화파트(252b, 252c)에 의하여 배양백(242)의 배양면적을 제어할 수가 있다. 또, 배양백트레이(241)의 면적변화파트(252b, 252c)가 배치되는 하방위치에는 경사모터(승강기구)(280), 캠기구(281) 및 위치결정센서(미도시)가 설치되어 있다. 상기 경사모터(280)는, 캠기구(281)를 회동시키고, 재치대(252)의 상기 면적변화파트(252b, 252c)를 서로 별개 독립적으로 승강시킨다. 이 승강부의 위치가 위치결정센서에 의하여 검출되고, 운전제어용PLC(223)로 송신된다. 경사모터(280)는 운전제어용PLC(223)에 의하여 제어되며, 배양백(242)에 있어서의 배양초기단계에서, 재치대(252)의 면적변화파트(252b, 252c)를 하강시키도록 제어된다. 이에 의하여, 배양백(242)의 면적변화파트(252b, 252c)에 대응하는 부분에 액체체류부가 형성된다. 예를 들면, 도24에 나타낸 재치대(252)는 면적변화파트(252b, 252c)의 높이를 각각 상하시키는 것으로 배양면적을 3단계로 변화시킬 수가 있다. 또한, 면적변화파트는 3개 이상 설치되어도 좋으며, 이것에 의하여 배양면적의 조정을 보다 미세하게 실시할 수가 있다. 여기서, 도24는, 도23의 재치대(252)의 구성을 나타내는 사시도이다.

배양백(242)에 있어서의 배양초기단계에서 세포 및 배지가 액체체류부에 저류되는 것에 의하여, 항체자극에 적당한 배양조건, 즉 배양백(242)내의 세포밀도가 증식에 적당한 밀도로 유지된다. 또 배양백(242)내에 배지 및 세포가 소정량 이상이 되는 배양중기 및 후기에는, 경사모터(280)가 캠기구(281)를 통하여 재치대(252)의 면적변화파트(252b, 252c)를 상승시켜, 배양백(242)을 소정 면적의 파트만을 수평상태로 하는 것에 의하여 상기 액체체류부의 면적을 변화시킨다. 배양의 진행에 맞춰서, 세포 및 배지의 액체체류부의 면적을 변화시키는 것에 의하여, 배양백(242)내의 면적 당 세포밀도가 증식에 적당한 밀도로 유지되고, 세포증식단계로 세포가 효율적으로 증식된다.

예를 들면, 도24에 나타낸 바와 같이, 재치대(252)가 액체체류를 2단으로 형성가능할 경우, 우선 가장 낮은 도24의 면적변화파트(252c)의 부분에 배지와 세포를 유지하고, 세포의 밀도가 낮아지지 않도록 한다. 세포가 증식을 개시하여 배지량을 증가시킨 때에는 도24의 면적변화파트(252c)의 높이를 1단계 올려서 면적변화파트(252b)와 면적변화파트(252c)를 동일한 높이로 하는 것에 의하여, 배양 가능한 배양백(242)의 면적을 일정량 확대한다. 이에 의하여, 재차 증식에 적당한 세포밀도를 일정 시간 유지할 수가 있다. 다시, 세포가 증식하여 배지량을 증식시켰을 때에는 면적변화파트(252b)와 면적변화파트(252c)의 높이를 다시 1단계 올려서 파트(252a)와 동일한 높이로 하여, 배양백(242) 전체에서 배양할 수가 있도록 한다.

다시, 배양실(240)내에는, 도23에 나타낸 바와 같이, 배양백트레이(241)의 배양백(242)이 배치되는 상방위치에 진탕장치(290)의 진탕기구(291)가 압박수단으로서 설치된다. 이 진탕장치(290)는, 상기 진탕기구(291), 작동모터(292), 캠기구(293) 및 위치결정센서(미도시)를 갖는다. 진탕기구(291)는, 도23에 나타낸 바와 같이, 장치프레임(250)에, 가이드로드(250a)를 통하여, 압박수단으로서의 작동판(291a)이 상하이동이 자유롭게 배치되며, 이 작동판(291a)의 바닥면에 복수의 돌출부(291b)가 돌출 형성된 것이다. 작동판(291a)이 작동모터(292)에 의하여, 캠기구(293)의 작용으로 상방 또는 하방으로 교대로 이동됨으로써, 이 작동판(291a)의 돌출부(291b)가, 진탕기구(291)의 하방에 위치하는 배양백(242)을 반복해서 압박, 즉, 배양백(242)에 대하여 압박과 압박해제를 반복한다. 이에 의하여, 배양백(242)내의 배지가 교반되고, 배양백(242)내의 세포가 배지내에서 부유하여 이동하고, 이 배양백(242)내에서의 세포분포 및 산소농도의 분포가 균일화되어, 세포의 증식이 촉진된다.

또, 도23에 나타낸 바와 같이, 상기 위치결정센서에 의하여 작동판(291a)의 위치가 검출되고 운전제어용PLC(223)로 송신되며, 또한 중량계(251)의 계측값이 이 PLC(223)에 의하여 작동모터(292)를 제어한다. 상기 진탕장치(290)를 사용한 배양백(242)내에서의 세포배양(진탕배양)은, 배양백(242)내에 배지 및 세포가 가득찰 정도로 채워지기 전에 실시되어도 좋으며, 또는 가득찰 정도로 채워진 후에 실시되어도 좋다. 이 진탕장치(290)는, 작동판의 검출위치 및 중량계(251)의 계측값에 기초하여, 운전제어용PLC(223)에 의하여 제어된다.

또, 배양실(240)내에는, 도23에 나타낸 바와 같이, 배양백(242)의 항체를 고층화한 부위가 배치되는 위치의 상방에 조명램프(301)가, 하방에 화상취득수단으로서의 CCD카메라(302)가 설치된다. CCD카메라(302)에는, 관찰형태 등에 따라서, 렌즈, 프리즘, 경통(鏡筒) 기타 광학기기를 추가로 사용한다. 조명램프(301)는, 배양백(242)을 상방으로부터 조명하는 것이다. CCD카메라(302)는, 배양백(242)내의 세포를 하방으로부터 촬영하고, 그 화상을 취득하는 것이다. 이들 조명램프(301)의 조명동작과 CCD카메라(302)의 촬영동작은, 운전제어용PLC(223)에 의하여 제어되며, 소정시간(예를 들면 6시간)마다 배양백(242)내의 세포의 화상을 취득한다. 소정시 간마다의 세포화상은 화상처리용 유니트(221)의 화상메모리회로(미도시)에 기억된다.

상기 화상처리용유니트(221)는, 화상처리용 유니트(221)의 화상메모리회로내에 기억된 소정시간마다의 세포화상을 화상처리, 예를 들면, 2치화처리나 다치화처리하고, 단일세포의 투영면적의 평균값과, 단일세포가 응집한 세포응집덩어리인 비단일세포의 증가속도를 세포배양의 평가파라미터로서 산출한다. 단일세포의 투영면적의 평균값(단일세포의 평균투영면적)은, 배양백트레이(241)에 배양백(242)을 장착하고, 이 배양백트레이(241)를 배양실(240)내에 수납하여 배양을 개시했을 때부터, 예를 들면 24시간 경과후의 세포화상으로부터 산출한다.

또, 상술한 바와 같은 비단일세포인지에 대한 여부의 판단은 투영면적이 100μ㎡을 기준으로하여, 100μ㎡ 이상의 경우를 비단일세포로 판단하고, 100μ㎡이하인 것을 단일세포로 판단하고 있다. 이것은, 배양초기의 단일세포의 투영면적을 측정한 결과, 모두 100μ㎡이하였기 때문이다. 세포의 경시적인 화상(예를 들면, 배양개시로부터 24시간, 48시간, 72시간 경과후의 화상)으로부터, 모든 세포에 대한 비단일세포의 비율의 변화를 연산하고, 비단일세포의 증가속도를 산출한다. 이 비단일세포의 증가속도와 상기 단일세포의 평균투영면적은, 화상처리용 유니트(221)로부터 운전제어용PLC(223)로 출력된다.

운전제어용PLC(223)는, 단일세포의 평균투영면적으로부터 래그타임을 산출하고, 해당 세포의 증식개시시기를 추정한다. 여기서, 상기 래그타임이란, 배양백트레이(241)의 항체고층부에 세포를 접종하고 나서 증식개시할 때까지의 필요한 유도 기의 시간이다. 운전제어용PLC(223)는, 세포의 증식개시시기로부터 해당 세포의 배양상황, 즉 해당 세포가 항체의 자극에 의하여 증식의 가능성이 있는지에 대한 여부를 판단하여 이 세포의 불량여부를 판정한다. 이 판정에 기초하여, 운전제어용PLC(223)는 증식가능성이 현저하게 낮은 세포에 대하여, 본 세포배양장치(200)에 있어서의 배양을 중지한다.

또, 운전제어용PLC(223)는, 비단일세포의 증가속도로부터 해당 세포의 최소배화시간을 산출한다. 여기서, 상기 최소배화시간이란, 어떤 시간에 있어서의 세포의 세포수가 곱의 세포수에 이르기까지 필요로 하는 시간을 말한다. 운전제어용PLC(223)는, 이 최소배화시간에 따라 해당 세포의 배양상황, 즉 해당 세포의 증식능력을 판단하고, 배양백(242)으로 배지를 유가시키는 타이밍이나 유가속도 등을 결정한다.

제어수단으로서 기능하는 운전제어용PLC(223) 및 화상처리용 유니트(221)는, 도시하지 않으나, 연산이나 제어를 실행하는 CPU와, 처리 프로그램이나 데이터를 기억하는 기억장치(메모리)와, 데이터나 지령 등을 입력하기 위한 키보드, 마우스 또는 터치패널 등의 입력장치나 모니터 등의 출력장치와의 접속을 실시하는 입출력회로를 가지고 구성된다. 또한, 화상처리용 유니트(221)에는, CCD카메라(302)로부터의 화상데이터를 기억하는 화상메모리회로를 구비한다.

화상처리용유니트(221)의 기억장치에는, CCD카메라(302)가 소정시간마다 촬영한 배양백(242)내의 세포의 화상을 화상처리(예를 들면 2치화처리나 다치화처리)하고, 세포배양의 평가파라미터(단일세포의 평균투영면적, 비단일세포의 증가속도) 등을 산출하기 위한 프로그램이 기억되어 있다.

또, 운전제어용PLC(223)의 기억장치에는, 세포배양의 평가파라미터로부터 세포의 배양상황(세포의 증식가능성, 세포의 증식능력)을 판정하기 위한 프로그램과, 이 세포의 배양상황에 따라서 세포배양장치(200) 및 배양유니트(212)에 관한 기기(예를 들면 공급펌프(261), 배출펌프(271) 등)를 제어하고, 배양조작을 실시하기 위한 프로그램이 기억되어 있다. 다시, 이 운전제어용PLC(223)의 기억장치에는, 세포배양장치(200) 및 배양유니트(212)의 각종 센서로부터의 신호에 기초하여, 이들 배양장치(210) 및 배양유니트(212)에 관한 기기를 제어하는 기기제어용의 프로그램도 기억되어 있다. 화상처리용 유니트(221)의 기억장치에는, CCD카메라(302)를 소정시간마다 제어하여 세포의 화상을 취득하는 등의 기기제어용 프로그램도 기억되어 있다.

이어서, 운전제어용PLC(223) 및 화상처리용 유니트(221)가 상기 프로그램을 실행하고 세포를 배양하는 공정을, 도25~도34의 공정도에 나타내는 플로우챠트를 따라서 설명한다.

도25 및 도26은, 항체자극 간헐식 관류배양공정을 나타내며, 배양백(242)에 세포를 회수하는 경우이다. 먼저, 도25에 나타낸 바와 같이, 조작자는, 클린벤치 등의 내부에서 배양백(242)에 항체를 고층화하고(도25의 W01), 배지를 투입하여, 세포를 접종시킨 배양백(242)을, 배양백트레이(241)에 장착한다. 이어서, 조작자는 클린벤치 등의 내부에서 배지를 투입한 배지백(233)을 배지백트레이(231)에 장착하고, 폐액백(234)을 폐액백트레이(232)에 장착하여, 배양백(242)과, 배지백(233) 및 폐액백(234)을 공급조인트(264) 및 폐액조인트(274)에 의하여 각각 연결한다(도25의 W02).

이어서, 조작자는, 이 배양백트레이(241), 배지백트레이(231) 및 폐액백트레이(232)를 세포배양장치(200)의, 표시등이 예를 들면 녹색으로 점등된 단일의 배양유니트(212)내에 반입하고, 배양백트레이(241)는 배양실(240)의 프레임(250)에 지지시켜, 배지백트레이(231) 및 폐액백트레이(232)는 저온실(230)에 설치한다. 그리고, 조작자는, 배양백(242)의 펌프튜브(262, 272)를 공급펌프(261) 및 배출펌프(271)에 각각 접속시킨다(도25의 W03).

이어서, 조작자는, 배양유니트(212)에 수납한 배양백(242)에 있어서의 CCD카메라(302)의 화상출력을 확인한다(도25의 W05). 이 화상출력을 확인하기 전에, 조작자는 해당 배양유니트(212)의 경사모터(280)를 기동시켜서 재치대(252)의 면적변화파트(252b, 252c)를 하강시키고, 배양백(242)에 액체체류부를 형성해둔다(도25의 W04). 다시 조작자는, 해당 배양유니트(212)의 중량계(251)에 의하여, 설치된 배양백(242)의 중량을 계측해둔다.

그 후, 조작자는, 배양유니트 도어를 닫고 해당 배양유니트(212)내에서 세포의 배양이 개시되도록 한다(도25의 W06). 이에 의하여, 배양백(242)의 액체체류부에 있어서, 증식을 위한 항체에 의하여 세포를 자극한다(도25의 W07). 해당 배양유니트(212)의 CCD카메라(302)는, 배양백(242)의 액체체류부의 세포를 소정시간(예를 들면 6시간)마다 촬영하고, 화상처리용 유니트(221)는, 이 촬영화상으로부터 세포배양의 평가파라미터를 산출한다. 운전제어용PLC(223)는, 이 평가파라미터로부터 래그타임을 산출하고, 해당 세포가 항체에 의하여 자극을 받아서 증식의 가능성이 있는지 여부를 판정하고, 다시 최소배화시간을 산출하여, 해당 세포의 증식능력을 판정한다(도25의 W08).

운전제어용PLC(223)는, 세포가 배양백(242)내에서 항체에 의하여 자극되고 나서 소정시간(예를 들면 24시간) 경과하여도 증식의 가능성이 인정되지 않을 경우에는, 본 세포배양장치(200)에서의 세포의 배양을 중지한다(도25의 W08'). 운전제어용PLC(223)는, 배양백(242)내의 세포에 증식의 가능성이 있다고 판단했을 때에는, 해당 세포의 증식능력에 기초하여, 해당 배양백(242)내로의 배지의 유가속도나 타이밍 등을 결정한다. 운전제어용PLC(223)는, 이 결정에 기초하여 공급펌프(261)를 작동하고, 배지백트레이(231)의 배지백(233)내의 배지를 배양백(242)으로 유가시킨다(도25의 W09).

이 공급펌프(261)의 작동에 의하여, 배양백(242)내에서 소정의 면적의 액체체류부에 있어서 세포의 정치배양이 개시된다(도25의 W10). 운전제어용PLC(223)는, 중량계(251)에 의하여 계측되는 배양백(242)내의 배지 및 세포의 중량이 소정값 a 이상이 되었는지에 대한 여부를 판단하고(도25의 W11), 소정값 a 이상이 된 시점에서 경사모터(280)을 기동시켜, 캠기구(281)를 통하여 재치대(252)의 면적변화파트(252b, 252c)를 상승시키고, 배양백(242)의 소정의 면적을 수평상태로 하여 액체체류부를 변화시킨다(도25의 W12). 이 공정은, 재치대(252)에 형성된 단차가 모두 해소되어, 배양백(242)이 수평이 되기까지 반복된다(도25의 W13).

그 후, 운전제어용PLC(223)는, 중량계(251)에 의하여 계측되는 배양백(242) 내의 배지 및 세포의 중량이 소정값 b 이상이 되었는지에 대한 여부를 판단하고(도25의 W14), 소정값 b 이상이 된 시점에서 작동모터(292)를 기동시킨다. 이에 의하여, 진탕장치(290)가 작동하고, 진탕장치(290)의 진탕기구(291)가 배양백(242)을 반복해서 압박하는 진탕배양을 개시한다(도25의 W15). 운전제어용PLC(223)는, 계속해서, 중량계(251)에 의하여 계측되는 배양백(242)내의 배지 및 세포의 중량이 소정값 c 이상이 되었는지에 대한 여부를 판단하고(도26의 W16), 소정값 c이상이 된 시점에서, 공급펌프(261)를 정지하여 배지백트레이(231)의 배지백(233)에서 배양백(242)으로의 배지의 유가를 정지하고(도26의 W17), 작동모터(292)를 정지하여 배양백(242)내에서의 진탕배양을 정지한다(도26의 W18).

운전제어용PLC(223)는, 배양백(242)내에서 세포가 침강된 후에, 배출펌프(271)를 작동시키고, 배양백(242)내의 사용이 끝난 배지(배양백(242)내의 상청)를 폐액백트레이(232)의 폐액백(234)으로 배출한다(도26의 W19). 그 후, 운전제어용PLC(223)는, 중량계(251)에 의하여 계측되는 배양백(242)내의 배지 및 세포의 중량이 소정값 d 이하로 되었는지에 대한 여부를 판단하고(도26의 W20), 소정값 d 이하로 된 시점에서, 배출펌프(271)를 정지하여 배양백(242)으로부터의 사용이 끝난 배지의 배출을 정지한다(도26의 W21). 그리고 공급펌프(261)를 기동하여 배지백트레이(231)의 배지백(233)에서 배양백(242)으로 배지를 유가시키고, 작동모터(292)를 기동하여, 진탕장치(290)에 의하여 배양백(242)내에서 진탕배양을 실시한다(도26의 W22). 소정 시간이 경과한 후, 운전제어용PLC(223)는, 공급펌프(261)를 정지하여 배지백트레이(231)의 배지백(233)에서 배양백(242)으로의 배지유가를 정지하 고, 작동모터(292)를 기동시킨 채 진탕배양을 계속한다(도26의 W23).

운전제어용PLC(223)는, 증식되는 세포의 사용일시에 따라서 소망하는 배양기간에 이르렀는지에 대한 여부를 판단하고, 또는 화상처리용 유니트(221)가, 배양백(242)내에서의 세포가 소망하는 세포수에 이르렀는지에 대한 여부를 판단하고(도26의 W24), 이들 소망하는 배양기간 또는 소망하는 세포수에 도달돼 있지 않은 경우에는, 스텝 W18~W23의 처리동작을 반복한다. 세포수의 측정을 실시하는 경우는 진탕장치(290)를 일시정지하고, 세포가 침강할 때까지 기다린다. 이어서, CCD카메라(302)로 배양백(242)내의 화상을 촬영한다. 화상처리용 유니트(221)는 취득한 화상으로부터 백의 내부에 존재하는 세포수를 추정·산출한다.

상기 스텝 W18~W23은, 배양백(242)내에서 사용이 끝난 배지의 배출과, 배양백(242)내로의 새로운 배지의 공급(유가)을 교대로 실시하는 간헐식 관류배양이다.

운전제어용PLC(223)는, 스텝 W24에 있어서 소망하는 배양기간 또는 세포수에 이르른 시점에서, 도26에 나타낸 바와 같이 작동모터(292)를 정지하고, 배양백(242)내에서의 진탕배양을 정지한다(도26의 W25). 이어서, 배양백(242)내에서 세포가 침강한 후에 배출펌프(271)를 기동시켜, 배양백(242)내의 사용이 끝난 배지를 폐액백트레이(232)의 폐액백(234)으로 배출하고, 중량계(251)의 계측값에 기초하여, 배양백(242)내의 배지 및 세포가 약 1/2~1/3 정도로 되기까지 세포를 농축시킨다(도26의 W26).

운전제어용PLC(223)는, 그 후 배출펌프(271)를 정지하고 세포배양을 종료한다(도26의 W27). 이 배양종료후에, 조작자에 의하여 배양백(242)내의 세포가 클린 벤치 등의 내부에서 원심분리기용의 용기로 옮겨지며, 그 후, 원심분리에 의하여 세포가 회수된다(도26의 W28).

다음은, 동일한 항체자극 간헐식 관류배양공정에 있어서, 세포회수백에 의하여 세포를 회수하는 처리가 포함되는 경우를 도27 및 도28에 나타낸다. 따라서, 도27 및 도28에 나타내는 공정의 스텝 W31~W56은, 도25 및 도26의 스텝 W01~W26과 동일하기 때문에 설명을 생략한다.

도28에 나타내는 스텝 W56에 있어서, 배출펌프(271)의 기동에 의하여 배양백(242)내의 세포가 농축된 후, 운전제어용PLC(223)는, 배출펌프(271)를 정지하고, 폐액백트레이(232)의 폐액백(234)을 세포회수백으로 교환하도록 조작자에게 촉구한다(도28의 W57). 이 세포회수백은, 원심분리기에 장착되어 원심분리에 사용될 수 있는 백이다.

폐액백트레이(232)의 폐액백(234)이 세포회수백으로 교환된 후, 운전제어용PLC(223)는, 배출펌프(271) 및 작동모터(292)를 기동한다. 이어서, 진탕장치(290)에 의하여 배양백(242)내를 진탕시키면서, 이 배양백(242)내의 세포를 배지와 함께 폐액백트레이(232)에 장착한 세포회수백으로 이동시킨다(도28의 W58). 운전제어용PLC(223)는, 그 후 배출펌프(271) 및 작동모터(292)를 정지하고 배양백(242)으로부터의 세포회수를 정지하여, 세포배양을 종료한다(도28의 W59). 이 세포회수 종료 후에, 조작자에 의하여 세포회수백이 원심분리기에 장착되어, 원심분리에 의하여 세포가 회수된다(도28의 W60).

이어서, 항체 자극연속식 관류배양공정을, 이 공정의 처리동작을 나타내는 도29 및 도30에 기초하여 설명한다. 이 도29 및 도30에 나타내는 항체 자극연속식 관류배양공정에 있어서의 스텝 X01~X15는, 도25 및 도26의 항체자극 간헐식 관류배양공정에 있어서의 스텝 W01~W15와 동일하기 때문에 설명을 생략한다. 이 항체 자극연속식 관류배양공정에서는, 배양백(242)과 배출펌프(271)의 사이에 필터(미도시)가 배치되어 있다.

운전제어용PLC(223)는, 배양백(242)내로 배지백트레이(231)의 배지백(233)으로부터 배지가 유가되며, 배양백(242)내에서의 진탕장치(290)에 의한 진탕배양이 실시되고 있는 동안에, 배양백(242)내의 배지 및 세포의 중량이 소정값 c 이상이 된 시점(도30의 X16)에서 배출펌프(271)를 기동시키고, 배양백(242)내의 사용이 끝난 배지를 폐액백트레이(232)의 폐액백(234)으로 배출시킨다. 이에 의하여, 배양백(242)으로의 배지의 유가와 배양백(242)으로부터의 배지의 배출을 동시에 실시하는 연속식 관류배양이 배양백(242)내에서 개시된다(도30의 X17). 이때, 배양백(242)내의 세포는, 필터에 의하여 유동이 저지되어 폐액백(234)내로 유동하는 일이 없다. 또한, 상기 연속식 관류배양 중에는, 진탕장치(290)에 의한 진탕배양도 동시에 실시되고 있다.

운전제어용PLC(223)는, 증식되는 세포의 사용일시에 따라서 소망하는 배양기간에 이르렀는지에 대한 여부를 판단하고, 또는 화상처리용 유니트(221)가, 배양백(242)내에서의 세포가 소망하는 세포수에 이르렀는지에 대한 여부를 판단한다(도30의 X18). 이들 소망하는 배양기간 또는 소망하는 세포수에 도달돼 있지 않은 경우에는, 스텝 X17의 연속식 관류배양을 반복한다. 세포수의 측정을 실시하는 경우 는 진탕장치(290)를 일시정지하고, 세포가 침강할 때까지 기다린다. 이어서 CCD카메라(302)로 배양백(242)내의 화상을 촬영한다. 화상처리용 유니트(221)는 취득한 화상으로부터 백의 내부에 존재하는 세포수를 추정·산출한다.

운전제어용PLC(223)는, 스텝 X18에 있어서의 소망하는 배양기간 또는 세포수에 이르른 시점에서, 공급펌프(261), 배출펌프(271) 및 작동모터(292)를 정지시키고, 관류배양 및 진탕배양을 정지시킨다(도30의 X19). 운전제어용PLC(223)는, 배양백(242)내에서 세포가 침강한 후에, 배출펌프(271)를 기동시켜, 배양백(242)내의 사용이 끝난 배지를 폐액백트레이(232)의 폐액백(234)으로 배출시키고, 중량계(251)의 계측값에 기초하여, 배양백(242)내의 배지 및 세포가 약 1/2~1/3 정도로 되기까지 세포를 농축시킨다(도30의 X20). 농축과정에 있어서 진탕장치를 정지시키는 것은 다량의 세포가 튜브로 유입하여, 필터가 막히게 되는 것을 방지하기 위함이다.

운전제어용PLC(223)는, 그 후 배출펌프(271)를 정지하여 세포배양을 종료한다(도30의 X21). 이 배양종료후에, 조작자에 의하여 배양백(242)내의 세포가 클린벤치 등의 내부에서 원심분리기용의 용기로 옮겨지고, 그 후, 원심분리에 의하여 세포가 회수된다(도30의 X22).

이어서, 항체자극 단순유가 배양공정을, 이 공정의 처리동작을 나타내는 도31 및 도32를 따라서 설명한다. 이 도31 및 도32에 나타내는 항체 자극연속식 관류배양공정에 있어서의 스텝 Y01~Y15은, 도25 및 도26의 항체자극 간헐식 관류배양공정에 있어서의 스텝 W01~W15와 동일하기 때문에 이에 관한 설명은 생략한다.

운전제어용PLC(223)는, 중량계(251)에 의하여 계측되는 배양백(242)내의 배지 및 세포의 중량이 소정값 c 이상이 되었는지에 대한 여부를 판단하고(도32의 Y16), 소정값 c 이상이 된 시점에서, 공급펌프(261)를 정지하고 배지백트레이(231)의 배지백(233)으로부터 배양백(242)으로의 배지의 유가를 정지하여, 작동모터(292)를 기동시킨 채 진탕배양을 계속한다(도32의 Y17).

운전제어용PLC(223)는, 증식되는 세포의 사용일시에 따라서 소망하는 배양기간에 이르렀는지에 대한 여부를 판단하고, 또는 화상처리용 유니트(221)가 배양백(242)내에서의 세포가 소망하는 세포수에 이르렀는지에 대한 여부를 판단하며(도32의 Y18), 이들 소망하는 배양기간 또는 소망하는 세포수에 이르지 않았을 경우에는, 진탕배양을 계속한다(Y18에서 No). 세포수의 측정을 실시하는 경우는 진탕장치(290)를 일시정지하고, 세포가 침강할 때까지 기다린다. 이어서, CCD카메라(302)로 배양백(242)내의 화상을 촬영한다. 화상처리용 유니트(221)는 취득한 화상으로부터 백의 내부에 존재하는 세포수를 추정·산출한다.

운전제어용PLC(223)는, 스텝 Y18에 있어서 소망하는 배양기간 또는 세포수에 이르른 시점에서, 도32에 나타낸 바와 같이 작동모터(292)를 정지시키고, 배양백(242)내에서의 진탕배양을 정지하고(도32의 Y19), 배양백(242)내에서 세포가 침강한 후에, 배출펌프(271)를 기동시켜, 배양백(242)내의 사용이 끝난 배지를 폐액백트레이(232)의 폐액백(234)으로 배출하여, 중량계(251)의 계측값에 기초하여, 배양백(242)내의 배지 및 세포가 약 1/2~1/3 정도로 되기까지 세포를 농축시킨다(도32의 Y20).

운전제어용PLC(223)는, 그 후, 배출펌프(271)를 정지하여 세포배양을 종료한다(도32의 Y21). 이 배양종료후에, 조작자에 의하여 배양백(242)내의 세포가 클린벤치 등의 내부에서 원심분리기용의 용기로 옮겨지며, 그 후, 원심분리에 의하여 세포가 회수된다(도32의 Y22).

이어서, 동일한 항체자극 단순유가 배양공정에 있어서, 세포회수백에 의하여 세포를 회수하는 처리가 포함되는 경우를, 이 처리동작을 나타내는 도33 및 도34에 나타낸다. 따라서, 이 도33 및 도34에 나타내는 공정의 스텝 Y31~Y50은, 도31 및 도32의 스텝 Y01~Y20과 동일하기 때문에 이에 관한 설명은 생략한다.

도34에 나타내는 스텝 Y50에 있어서, 배출펌프(271)의 기동에 의하여 배양백(242)내의 세포가 농축된 후, 운전제어용PLC(223)는, 배출펌프(271)를 정지하고, 폐액백트레이(232)의 폐액백(234)을 세포회수백으로 교환하도록 조작자에게 촉구한다(도34의 Y51). 이 세포회수백은, 원심분리기에 장착되어 원심분리에 사용될 수가 있는 백이다.

폐액백트레이(232)의 폐액백(234)이 세포회수백으로 교환된 후, 운전제어용PLC(223)는 배출펌프(271) 및 작동모터(292)를 기동시켜, 진탕장치(290)에 의하여 배양백(242)내를 진탕시키면서, 이 배양백(242)내의 세포를 배지와 동시에, 폐액백트레이(232)에 장착된 세포회수백으로 이행시킨다(도34의 Y52). 운전제어용PLC(223)는, 그 후 배출펌프(271) 및 작동모터(292)를 정지하여 배양백(242)으로부터의 세포회수를 정지하고, 세포배양을 종료한다(도34의 Y53). 이 세포회수 종료후에, 조작자에 의하여 세포회수백이 원심분리기에 장착되어 원심분리에 의하여 세포 가 회수된다(도34의 Y54).

이상과 같이 구성됨으로써, 상기 실시형태에 의하면, 다음과 같은 효과 (1)~(7)을 나타낸다.

(1) CCD카메라(302)가 촬영한 배양백(242)내의 세포의 화상을, 화상처리용 유니트(221)가 화상처리하여 세포배양의 평가파라미터(단일세포의 평균투영면적, 비단일세포의 증가속도)를 취득하고, 운전제어용PLC(223)가 해당 세포의 배양상황(세포의 증식가능성 및 증식능력)을 판정평가하고, 이 배양상황에 따른 배양조작(배지백(233)에서 배양백(242)으로의 소정 유가속도에서의 배지유가나 타이밍)을 실시한다. 이 결과, 세포의 배양상황을 비접촉상태로 판정할 수가 있기 때문에 해당 세포에 손상을 주는 일이 없으며, 또, 배양조작을 조작자가 차례로 실시할 필요가 없기 때문에 조작자의 노력을 경감할 수가 있다. 더욱이, 한 환자의 세포를 단일의 유니트(212)내에 수납되는 배양백(242)에 접종시키고, 이 세포마다, 세포의 배양상황에 따른 배양조작을 실시할 수가 있기 때문에 적절한 배양조작을 실현할 수가 있다. 이 세포의 배양상황에 따른 적절한 배양조작을 실현할 수가 있으므로, 시간단위에서의 배양조작이 가능하게 되며, 배양이 촉진되어 배양기간을 단축할 수가 있다.

(2) 배지백(233), 폐액백(234) 및 배양백(242)을 클린벤치 등의 내부에서 연결하고, 배양유니트(212)에 설치하기 위하여 폐쇄루프로 구성되는 것에 의하여, 완전 폐쇄계의 무균상태로 유지할 수가 있다.

(3) 배양백트레이(241), 배지백트레이(231) 및 폐액백트레이(232)를 배양을 개시할 때에 배양유니트(212)내에 설치하고 나서, 배양종료까지는 자동으로 배양공정이 실시되기 때문에, 환경변화에 따른 배양백(242)내의 세포에 대한 손상을 저감시킬 수가 있는 동시에, 클린벤치 등의 내부에서 배양백(242)에 배지를 공급하는 무균조작을 생략할 수가 있다.

(4) 배양백(242)내에서의 배양초기단계의 항체자극과 세포증식을 동일 배양백(242)내에서 실시하고, 이 배양백(242)내에서 세포 및 배지가 저류되는 액체체류부를 소정의 면적으로 변화시킬 수가 있기 때문에, 배양중의 면적당 세포밀도를 증식에 적당한 밀도로 유지할 수 있으므로, 세포를 효율적으로 증식시킬 수가 있다.

(5) 배양백(242)내의 사용이 끝난 배지가 폐액백트레이(232)의 폐액백(234)에 배출되어 저류됨으로써, 배양백(242)의 세포밀도를 높여서 농축할 수가 있기 때문에, 세포 회수를 위한 원심분리의 조작횟수를 저감시킬 수가 있다. 이 결과, 세포회수작업의 간이화를 실현할 수 있음과 동시에, 원심분리에 따른 세포의 손상도 저감시킬 수가 있다.

(6) 배양백(242)내에서 농축된 세포를, 폐액백트레이(232)에 장착된 세포회수백에 전량 회수할 때에는, 이 세포회수백을 원심분리기에 직접장착하여 세포를 회수할 수가 있기 때문에, 세포회수작업의 간이화를 실현할 수가 있다.

(7) 세포가 접종된 배지를 수용하는 가요성의 배양백(242)을, 진탕장치(290)의 진탕기구(291)에 있어서의 작동판(291a)의 돌출부(291b)가 반복해서 압박하고, 해당 배양백(242)내의 배지를 교반하는 것에 의하여, 이 배양백(242)내의 세포분포 및 산소농도분포를 균일화할 수가 있기 때문에, 세포의 증식이 촉진되고, 세포의 배양효율을 향상시킬 수가 있다.

또, 세포는, 진탕장치(290)의 작동판(291a)에 의하여 반복적으로 압박되어 교반된 배지내부를 부유할 뿐이기 때문에, 손상을 받는 일이 방지된다.

(실시예)

이어서, 도35를 참조하면서, 도7의 진탕장치(80)를 사용한 세포배양의 실시예에 대하여 설명한다. 여기서, 도35는, 도7의 진탕장치(80)를 사용한 진탕방법에 의한 세포배양의 결과를, 종래의 진탕방법에 의한 세포배양의 결과, 및 정치배양(진탕을 실시하지 않은 것)에 의한 결과와 대비하여 나타내는 그래프이다. 이 도35에서는, 가로축에 배양시간(단위:시간), 세로축에 세포수(단위:10⁶개)를 취하고 있으며, 도면 중, ■는 진탕장치(80)를 사용한 경우의 배양결과, ◆는 종래의 로터리식의 진탕장치에 의한 배양결과, ●는 정치배양에 의한 배양결과를 각각 나타내고 있다.

본 실시예에서는 이하의 조건·순서로 세포배양을 실시하였다.

즉, 먼저, 건강한 일반인의 도너로부터 말초혈을 채취하고, 혈구분리용 비중액을 사용하여 말초혈 단핵구를 분리하였다.

얻어진 말초혈 단핵구 1.0×10⁷개를, ALyS203배양액(사이보우카가쿠가부시키가이샤 제품) 30ml(도너 자기혈장 2.4ml포함)에 현탁하여, 항 CD3항체를 고층화한 부유세포용 75T-Flask(SUMILON)에 파종하여 37℃, 5% CO₂의 인큐베이터에서 배양(전(前)배양)을 실시하였다.

전배양은 3일간 실시하고, 배양 4일째의 대수증식기(對數增殖期)에 들어간 세포를 회수하여, 2.0×10⁷개의 세포를 새로운 ALyS505N배양액(상기 회사제품) 350ml(도너 자기혈장 3.5ml포함)에 현탁하여 350ml 배양백(가부시키가이샤니프로 제품)으로 바꾸어 옮겨놓았다. 이 배양백은, 동일한 내용의 것을 3개 준비하였다.

이어서, 세포현탁액에 넣은 3개의 350ml 배양백에 대하여, 진탕장치(80)를 사용한 진탕방법에 있어서의 세포배양, 종래의 로터리식에 의한 진탕방법에 있어서의 세포배양, 및 정치배양 중 어느 하나의 배양을 실시하고, 이를 본 배양으로 하였다.

여기서, 종래의 로터리식의 진탕장치는 회전수를 30rpm으로 하고, 로터리테이블에 망을 걸쳐서, 배양백의 양면으로부터 산소투과가 가능하게 되도록 설치하였다.

또, 진탕장치(80)는 회전수를 30rpm으로 하고, 배양백을 압박·해제하는 돌출부(86)로서 진탕기구(91)에 원주형의 고무(직경 30mm, 높이 20mm)를 3개 배치하였다.

본 배양을 개시하고 나서 24시간, 48시간, 72시간 후에 배양백으로부터 2ml배양액(배지 및 세포를 포함하는)을 채취하고, 세포수를 측정한 바, 도35에 나타내는 바와 같이, 정치배양 및 종래의 로터리식의 진탕장치를 사용하여 배양한 것에 비하여, 진탕장치(80)를 사용하여 배양한 쪽의 것이, 본 배양 72시간 후에 있어서 세포수가 많다는 것이 명백하게 되었다.

청구항 1 내지 7에 기재된 발명에 의하면, 세포가 접종된 배양액을 수용하는 가요성 배양용기를 압박수단이 반복적으로 압박하여, 해당 배양용기내의 배양액을 교반하여, 즉, 세포의 분포 및 배지의 성분농도가 균일한 상태가 되게 함으로써 배양환경의 제어가 용이하게 되며, 또 산소공급능도 높아지게 되는 것에 의하여, 세포의 증식이 촉진되고, 세포의 배양효율을 향상시킬 수가 있다. 또, 세포는, 압박수단에 의하여 반복적으로 압박되어 교반된 배양액의 내부를 부유할 뿐이기 때문에, 물리적 손상을 받는 일이 방지된다.

Claims

세포가 접종된 배양액을 수용하는 가요성(可撓性) 배양용기내에서 세포를 배양하는데 있어서, 상기 배양용기를 반복해서 압박하는 압박수단을 구비하며, 이 압박수단의 압박에 의하여 상기 배양용기내의 배양액을 교반하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 세포배양용 진탕장치.
제 1항에 있어서,

상기 압박수단은 복수의 돌출부를 구비하며, 이들 돌출부가 배양용기를 압박하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 세포배양용 진탕장치.
제 1항 또는 2항에 있어서,

상기 세포는, 부유계 세포인 것을 특징으로 하는 세포배양용 진탕장치.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 세포는, 면역세포요법에 사용되는 것을 특징으로 하는 세포배양용 진탕장치.
세포가 접종된 배양액을 수용하는 가요성 배양용기내에서 세포를 배양하는 세포배양방법에 있어서,

상기 배양용기를 압박수단에 의하여 반복해서 압박하고, 해당 배양용기내에서 배양액을 교반하여 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 세포배양방법으로서의 진탕배양방법.
제 5항에 있어서,

상기 세포는, 부유계 세포인 것을 특징으로 하는 세포배양방법으로서의 진탕배양방법.
제 5항 또는 제 6항에 있어서,

상기 세포는, 면역세포요법에 사용되는 것을 특징으로 하는 세포배양방법으로서의 진탕배양방법.