JP2022167931A - レムナント腫瘍浸潤リンパ球並びにそれを調製及び使用する方法 - Google Patents

レムナント腫瘍浸潤リンパ球並びにそれを調製及び使用する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】レムナント腫瘍浸潤リンパ球並びにそれを調製及び使用する方法の提供。【解決手段】一部の実施形態において、癌の処置のために、治療的に有効な量の、腫瘍レムナントから得られた増殖した数の腫瘍浸潤リンパ球の送達を、それを必要とする患者において行う方法が開示される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
[001] 本国際出願は、２０１６年１１月１７日出願の米国仮特許出願第６２／４２３，７５０号及び２０１７年２月１７日出願の米国仮特許出願第６２／４６０，４４１号に対する優先権の利益を主張し、これらの出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
[002] 腫瘍レムナントから腫瘍浸潤リンパ球を増殖させる方法及び組成物が一部の実施形態において開示される。
発明の背景
[003] 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入を用いた嵩高い難治性の癌の処置は、予後が不十分な患者にとっての強力な治療アプローチを代表する。Gattinoni, et al, Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393。自己由来ＴＩＬによる養子Ｔ細胞療法は、転移性黒色腫患者の最大５５％の客観的奏効率及び＞２５％の永続的退縮を実現する。多数のＴＩＬが免疫療法を成功させるのに必要とされ、及びロバストで信頼性が高いプロセスが商業化に必要である。これは、細胞増殖に関する技術的問題、理論上の問題及び規制上の問題のために達成するのが困難であった。ＩＬ－２ベースのＴＩＬ増殖に続く「迅速な増殖プロセス」（ＲＥＰ）は、その速度及び効率のため、ＴＩＬ増殖の好ましい方法となった。Dudley, et al, Science 2002, 298, 850-54；Dudley, et al, J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley, et al, J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Riddell, et al, Science 1992, 257, 238-41；Dudley, et al, J. Immunother. 2003, 26, 332-42。切除された腫瘍からＴＩＬを生成するプロセスは、腫瘍を１～３ｍｍ３のフラグメントに細切除して、プレ迅速増殖プロトコル（プレＲＥＰ又は開始）工程においてＴＩＬをインターロイキン２（ＩＬ－２）の存在下で増殖させる工程を含む。プレＲＥＰ工程中、腫瘍内在免疫細胞が遊走且つ増殖し、及びこれらのＴＩＬが第２のＲＥＰプロセスにかけられて、照射された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）フィーダ、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ－３、ムロモナブ）及びＩＬ－２がＴＩＬの数を大幅に増大させる。現在まで、ＴＩＬ増殖プロセスは、全てプレＲＥＰプロセス後の残留腫瘍フラグメントを破棄している。
[004] 切除された腫瘍の酵素による直接的消化は、以前にプレＲＥＰに代わるものとして探究されてきたが、より少ないＴＩＬ培養体のみを与えることができ、ＩＬ－２によるプレＲＥＰ開始プロセスよりもＴＩＬを得る能力が低下すると報告されてきた。Dudley, et al, J. Immunother. 2003, 26, 332-42。この理由のため、癌の治療としてのＴＩＬの開発において消化がさらに探究されなかった。
[005] プレＲＥＰプロセス及びＲＥＰプロセスから得られたＴＩＬは、現在までＴＩＬの臨床研究の優勢を占めており、これは、適度な臨床応答を提供してきた。また、この分野は、特に黒色腫から他の腫瘍タイプへのＴＩＬ治療の延長線上において困難なままである。Goff, et al, J. Clin. Oncol. 2016, 34, 2389-97；Dudley, et al, J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39；Rosenberg, et al, Clin. Cancer Res. 2011, 17, 4550-57。多くの焦点が、特定のサブセット（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を選択するか、又はドライバ突然変異、例えば突然変異されたＥＲＢＢ２ＩＰエピトープ若しくはＫＲＡＳオンコジーンにおけるドライバ突然変異を標的化するための増殖中のＴＩＬの選択に定められてきた。Tran, et al., N. Engl. J. Med. 2016, 375, 2255-62; Tran, et al, Science 2014, 344, 641-45。しかしながら、そのような選択アプローチは、たとえ開発されてより大きい臨床試験において有効性を示し得るとしても、ＴＩＬ治療を実行する期間、複雑性及びコストを顕著に増大させて、様々なタイプの癌におけるＴＩＬ治療の広範な使用の可能性を制限する。したがって、癌治療に用いられる特性が向上したＴＩＬを提供することができるプロセスの開発が緊急に必要とされている。
[006] 本発明は、向上した特性を有するＴＩＬが、腫瘍レムナント細胞に基づくプロセスから得ることができ、及び予想外にも、そのようなレムナントＴＩＬ（ｒＴＩＬ）が正常なエミグラントＴＩＬ（ｅＴＩＬ）と表現型的且つ機能的に異なるという発見を提供する。癌免疫療法におけるｒＴＩＬの使用及びｒＴＩＬとｅＴＩＬとの組合せは、先のｅＴＩＬベースの治療を上回る大きい利点をもたらす。
発明の概要
[007] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４及びそれらの組合せからなる群から選択される。
[008] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４及びそれらの組合せからなる群から選択され、
腫瘍組織は、黒色腫腫瘍組織、頭頚部腫瘍組織、乳房腫瘍組織、腎臓腫瘍組織、膵臓腫瘍組織、膠芽腫腫瘍組織、肺腫瘍組織、結腸直腸腫瘍組織、肉腫腫瘍組織、トリプルネガティブ乳房腫瘍組織、子宮頸部腫瘍組織、卵巣腫瘍組織及び急性骨髄性白血病の骨髄又は腫瘍組織からなる群から選択される。
[009] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４及びそれらの組合せからなる群から選択され、
照射されたフィーダ細胞は、照射された同種末梢血単核細胞を含む。
[0010] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることと、ここで、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
ＩＬ－２は、約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で第２の細胞培地中に存在し、及びＯＫＴ－３抗体は、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で第２の細胞培地中に存在する。
[0011] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
ｒＴＩＬ中のＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞における少なくとも１つのＴ細胞疲弊マーカーは、ｅＴＩＬに対して少なくとも１０％だけ低下される。
[0012] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＬＡＧ３マーカーであり、ｒＴＩＬにおけるＬＡＧ３マーカーは、ｅＴＩＬに対して少なくとも２倍だけ低下される。
[0013] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＩＭ３マーカーであり、ｒＴＩＬにおけるＬＡＧ３マーカーは、ｅＴＩＬに対して少なくとも３倍だけ低下される。
[0014] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴＩＭ３マーカーであり、ｒＴＩＬにおけるＬＡＧ３マーカーは、ｅＴＩＬに対して少なくとも２倍だけ低下される。
[0015] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
ｒＴＩＬにおけるＴＩＭ３マーカー及びＬＡＧ３マーカーは、フローサイトメトリによって検出不可能である。
[0016] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
ｒＴＩＬにおけるＣＤ５６＋発現は、ｅＴＩＬにおけるＣＤ５６＋発現に対して少なくとも３倍だけ低下される。
[0017] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
ｒＴＩＬにおけるＣＤ６９＋発現は、ｅＴＩＬにおけるＣＤ６９＋発現に対して少なくとも２倍だけ増大される。
[0018] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
消化混合物は、デオキシリボヌクレアーゼ、コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼを含む。
[0019] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第１の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む。
[0020] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む。
[0021] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、処置は、治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に送達することを含み、ｒＴＩＬは、
（ａ）患者から腫瘍組織を得る工程であって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、工程と、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化する工程と、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供する工程と、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除く工程と、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化する工程と、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、レムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）の数を増殖させる工程と
を含む方法に従って調製され、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む。
[0022] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者を高用量ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含む。
[0023] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することであって、治療的に有効な量のｅＴＩＬは、ｒＴＩＬとの混合物中で患者に同時投与される、投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者を高用量ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含む。
[0024] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することであって、治療的に有効な量のｅＴＩＬは、ｒＴＩＬとの混合物中で患者に同時投与される、投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者を高用量ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含み、
癌は、黒色腫、二重不応性黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、頭頚部癌、腎細胞癌、急性骨髄性白血病、結腸直腸癌、肉腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及びトリプルネガティブ乳癌からなる群から選択される。
[0025] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することであって、非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンは、２日間にわたって６０ｍｇ／ｍ２／日の用量でシクロホスファミドを投与し、それに続いて、５日間にわたって２５ｍｇ／ｍ２／日の用量でフルダラビンを投与する工程を含む、処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することであって、治療的に有効な量のｅＴＩＬは、ｒＴＩＬとの混合物中で患者に同時投与される、投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者を高用量ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含む。
[0026] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することであって、治療的に有効な量のｅＴＩＬは、ｒＴＩＬとの混合物中で患者に同時投与される、投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者を高用量ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含み、
高用量ＩＬ－２レジメンは、耐容能まで８時間毎に１５分のボーラス静注として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む。
[0027] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４及びそれらの組合せからなる群から選択される。
[0028] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４及びそれらの組合せからなる群から選択され、
腫瘍組織は、黒色腫腫瘍組織、頭頚部腫瘍組織、乳房腫瘍組織、腎臓腫瘍組織、膵臓腫瘍組織、膠芽腫腫瘍組織、肺腫瘍組織、結腸直腸腫瘍組織、肉腫腫瘍組織、トリプルネガティブ乳房腫瘍組織、子宮頸部腫瘍組織、卵巣腫瘍組織及び急性骨髄性白血病の骨髄又は腫瘍組織からなる群から選択される。
[0029] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４及びそれらの組合せからなる群から選択され、
照射されたフィーダ細胞は、照射された同種末梢血単核細胞を含む。
[0030] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
ＩＬ－２は、約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で第２の細胞培地中に存在し、及びＯＫＴ－３抗体は、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で第２の細胞培地中に存在する。
[0031] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
ｒＴＩＬ中のＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞における少なくとも１つのＴ細胞疲弊マーカーは、ｅＴＩＬに対して少なくとも１０％だけ低下される。
[0032] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＬＡＧ３マーカーであり、ｒＴＩＬにおけるＬＡＧ３マーカーは、ｅＴＩＬに対して少なくとも２倍だけ低下される。
[0033] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＩＭ３マーカーであり、ｒＴＩＬにおけるＬＡＧ３マーカーは、ｅＴＩＬに対して少なくとも３倍だけ低下される。
[0034] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴＩＭ３マーカーであり、ｒＴＩＬにおけるＬＡＧ３マーカーは、ｅＴＩＬに対して少なくとも２倍だけ低下される。
[0035] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
ｒＴＩＬにおけるＴＩＭ３マーカー及びＬＡＧ３マーカーは、フローサイトメトリによって検出不可能である。
[0036] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
ｒＴＩＬにおけるＣＤ５６＋発現は、ｅＴＩＬにおけるＣＤ５６＋発現に対して少なくとも３倍だけ低下される。
[0037] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
ｒＴＩＬにおけるＣＤ６９＋発現は、ｅＴＩＬにおけるＣＤ６９＋発現に対して少なくとも２倍だけ増大される。
[0038] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
消化混合物は、デオキシリボヌクレアーゼ、コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼを含む。
[0039] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第１の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む。
[0040] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
を含み、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む。
[0041] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、処置は、治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に送達することを含み、ｒＴＩＬは、
（ａ）患者から腫瘍組織を得る工程であって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、工程と、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化する工程と、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供する工程と、
（ｄ）ｅＴＩＬを除く工程と、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化する工程と、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、レムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）の数を増殖させる工程と
を含む方法に従って調製され、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む。
[0042] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者を高用量ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含む。
[0043] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することであって、治療的に有効な量のｅＴＩＬは、ｒＴＩＬとの混合物中で患者に同時投与される、投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者を高用量ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含む。
[0044] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することであって、治療的に有効な量のｅＴＩＬは、ｒＴＩＬとの混合物中で患者に同時投与される、投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者を高用量ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含み、
癌は、黒色腫、二重不応性黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、頭頚部癌、腎細胞癌、急性骨髄性白血病、結腸直腸癌、肉腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及びトリプルネガティブ乳癌からなる群から選択される。
[0045] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することであって、非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンは、２日間にわたって６０ｍｇ／ｍ２／日の用量でシクロホスファミドを投与し、それに続いて、５日間にわたって２５ｍｇ／ｍ２／日の用量でフルダラビンを投与する工程を含む、処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することであって、治療的に有効な量のｅＴＩＬは、ｒＴＩＬとの混合物中で患者に同時投与される、投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者を高用量ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含む。
[0046] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）ｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することであって、治療的に有効な量のｅＴＩＬは、ｒＴＩＬとの混合物中で患者に同時投与される、投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者を高用量ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含み、
高用量ＩＬ－２レジメンは、耐容能まで８時間毎に１５分のボーラス静注として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む。
[0047] 一実施形態において、本発明は、養子Ｔ細胞治療のために、患者由来の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む増殖した数の腫瘍レムナント細胞を生じさせるプロセスを含む。一部の実施形態において、本発明のプロセスは、患者から腫瘍組織を得る工程を含み得、腫瘍組織は、ＴＩＬを含む。一部の実施形態において、本発明のプロセスは、腫瘍組織をフラグメント化する工程を含み得る。一部の実施形態において、本発明のプロセスは、細胞培地並びにインターロイキン２（ＩＬ－２）及び他のＴ細胞増殖因子又はアゴニスト抗体入りの気体透過性コンテナ内で腫瘍組織を処理して、腫瘍レムナント及び増殖した数のＴＩＬを提供する工程を含み得る。一部の実施形態において、本発明のプロセスは、増殖した数のＴＩＬを除く工程を含み得る。一部の実施形態において、本発明のプロセスは、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化する工程を含み得る。一部の実施形態において、本発明のプロセスは、腫瘍レムナント細胞を、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ムロモナブ又はＯＫＴ－３）及びＩＬ－２で処理して、増殖した数の腫瘍レムナント細胞を提供する工程を含み得る。一部の実施形態において、本発明のプロセスに従って調製される腫瘍レムナント細胞は、低いレベルの、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現するＴＩＬを含み得る。一部の実施形態において、腫瘍組織は、黒色腫腫瘍組織、頭頚部腫瘍組織、乳房腫瘍組織、腎臓腫瘍組織、膵臓腫瘍組織、肺腫瘍組織及び結腸直腸腫瘍組織からなる群から選択され得る。
[0048] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み得る。一部の実施形態において、処置は、治療的に有効な量の増殖した数の腫瘍レムナント細胞を患者に送達することを含み得、増殖した数の腫瘍レムナント細胞は、本明細書中に記載されるあらゆるプロセスに従って調製され得る。
図面の簡単な説明
[0049] 本発明の上述の概要及び以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。
[0050]腫瘍消化溶液の調製の例示的な図を示す。 [0051]腫瘍消化手順の例示的なフロースルー図を示す。この例では、２つの消化方法を同時に実行しており、各消化方法の有効性を比較するように設計した２つの異なるプレＲＥＰの一部として別々にシードしている。 [0052]ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬにおける重要なマーカーの差次的な表現型の発現を示す。 [0053]迅速な増殖前に代謝能を評価するための、２－（Ｎ－（７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース（２－ＮＢＤＧ）（Ａ）及びMitotracker（Ｂ）によるｅＴＩＬ及びｒＴＩＬの研究を示す。 [0054]ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬを、ブレフェルディンＡを有するＣＤ３／ＣＤ２８／４－１ＢＢビードでＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞について一晩刺激した実験の結果を示す。ＰＭＡ及びイオノマイシンを４～５時間加えた。インターフェロン－γを細胞内フローサイトメトリ分析（ｎ＝３）によって評価した。 [0055]迅速な増殖中に（Ａ）ｒＴＩＬが増殖し、及び（Ｂ）ｅＴＩＬと表現型的に異なったままであることを示す結果を示す。 [0056]本発明のｒＴＩＬを用いて患者を処置する例示的なプロセスを示す。 [0057]本発明のｒＴＩＬを用いて患者を処置するプロセスの例示的なタイムラインを示す。 [0058]ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬにおけるＴＣＲ－ｖβレパートリの多様性（すなわち多様性スコア）を示す。 [0059]ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬにおける共有ＣＤＲ３のパーセントを示す。 [0060]トリプルネガティブ乳癌、大腸癌、肺癌、腎癌及び黒色腫における細胞増殖分析を示す。５つの全ての腫瘍におけるＣＤ４＋集団又はＣＤ８＋集団由来のｅＴＩＬは、抗ＣＤ３抗体によるｒＴＩＬとの共培養の直後に、ｅＴＩＬのみと比較した場合、Cell Trace色素の推移（又は色素の希釈）によって実証される増殖能力の増強を実証した。ｒＴＩＬと共培養した場合、赤色は、ｅＴＩＬを表し、青色は、ｅＴＩＬを表す。 [0061]Nanostring分析から作成したヒートマップを示し、これは、ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬについて遺伝子発現プロファイルが大きく異なることを示す。 [0062]Nanostring分析から作成したグラフを示し、これは、いくつかの遺伝子がｅＴＩＬと比較してｒＴＩＬにおいて大きく上方制御又は下方制御されていることを示す。 [0063]卵巣癌由来のｅＴＩＬ及びｒＴＩＬ（３つのｅＴＩＬ／ｒＴＩＬ対について）間の上位５０の共有ＣＤＲ３を示すクローン型グラフを示す。 [0064]腎癌由来のｅＴＩＬ及びｒＴＩＬ（３つのｅＴＩＬ／ｒＴＩＬ対について）間の上位５０の共有ＣＤＲ３を示すクローン型グラフを示す。 [0065]トリプルネガティブ乳癌由来のｅＴＩＬ及びｒＴＩＬ（３つのｅＴＩＬ／ｒＴＩＬ対について）間の上位５０の共有ＣＤＲ３を示すクローン型グラフを示す。
配列リストの簡単な説明
[0066] 配列番号１は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
[0067] 配列番号２は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
[0068] 配列番号３は、組換えヒトＩＬ－２タンパク質のアミノ酸配列である。
[0069] 配列番号４は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
[0070] 配列番号５は、組換えヒトＩＬ－４タンパク質のアミノ酸配列である。
[0071] 配列番号６は、組換えヒトＩＬ－７タンパク質のアミノ酸配列である。
[0072] 配列番号７は、組換えヒトＩＬ－１５タンパク質のアミノ酸配列である。
[0073] 配列番号８は、組換えヒトＩＬ－２１タンパク質のアミノ酸配列である。
発明の詳細な説明
[0074] 別途定義されない限り、本明細書中で用いられる技術用語及び科学用語の全ては、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中で言及される特許及び刊行物の全ては、その全体が参照により組み込まれる。
定義
[0075] 用語「疲弊表現型」及び「疲弊マーカー」は、抗原による長期間にわたるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の刺激に応答する、Ｔ細胞疲弊に特有の細胞表面マーカーを指す。疲弊表現型を示すＴ細胞は、阻害受容体、例えばＴ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ３又はＴＩＭ－３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３又はＬＡＧ－３）、免疫グロブリンドメイン及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）並びにプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）を発現し、且つエフェクタサイトカインの産生及び有効な免疫応答を増大させる能力を欠いている。Ｔ細胞の疲弊は、Yi, et al., Immunology 2010, 129, 474-81に記載されており、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[0076] 本明細書中で用いられる用語「共投与」、「共投与すること」、「組み合わせて投与される」、「組み合わせて投与すること」、「同時の」及び「同時的な」は、ヒト対象への２つ以上の有効医薬成分の、両方の有効医薬成分及び／又はそれらの代謝物質がヒト対象中に同時に存在するような投与を包含する。共投与として、別個の組成物の同時投与、別個の組成物の異なる時点での投与又は２つ以上の有効医薬成分が存在する組成物の投与が挙げられる。別個の組成物の同時投与及び両方の剤が存在する組成物の投与も本発明の方法に包含される。
[0077] 用語「インビボ」は、対象の体内で起こるイベントを指す。
[0078] 用語「インビトロ」は、対象の体外で起こるイベントを指す。インビトロアッセイは、生きた細胞又は死んだ細胞が使用される細胞ベースのアッセイを包含し、且つ無傷の細胞が使用されない無細胞アッセイも包含し得る。
[0079] 用語「抗原」は、免疫応答を誘導する物質を指す。一部の実施形態において、抗原は、抗体又はＴＣＲによって結合されることができる分子である（主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される場合）。本明細書中で用いられる用語「抗原」は、Ｔ細胞エピトープも包含する。抗原は、加えて、免疫系によって認識されることができる。一部の実施形態において、抗原は、体液性免疫応答又は細胞性免疫応答を誘導して、Ｂリンパ球及び／又はＴリンパ球の活性化を引き起こすことができる。場合により、これは、抗原がＴｈ細胞エピトープを含有するか又はＴｈ細胞エピトープに関連があることを必要とし得る。抗原は、１つ以上のエピトープ（例えば、Ｂ－エピトープ及びＴ－エピトープ）も有し得る。一部の実施形態において、抗原は、好ましくは、典型的には高い特異性で且つ選択的にその対応する抗体又はＴＣＲと反応することとなり、他の抗原によって誘導され得る多数の他の抗体又はＴＣＲとは反応しない。
[0080] 本明細書中に記載される用語「有効な量」又は「治療的に有効な量」は、疾患の処置が挙げられるが、これに限定されない意図される用途を達成するのに十分な化合物又は化合物の組合せの量を指す。治療的に有効な量は、意図される用途（インビトロ又はインビボ）又は処置されることとなるヒト対象及び疾患の状態（例えば、対象の体重、年齢及び性別）、疾患症状の重症度、投与の様式などに応じて変動し得、当業者によって容易に決定され得る。この用語は、標的細胞において特定の応答（例えば、血小板の接着及び／又は細胞の移動の低下）を誘導することとなる用量にも当てはまる。具体的な用量は、選択される特定の化合物、それに続く投薬レジメン、化合物が、他の化合物と組み合わされて投与されるか、投与のタイミング、投与される組織及び化合物が運び込まれる身体の送達系に応じて変動することとなる。治療的に有効な量は、「有効な抗腫瘍量」及び／又は「有効な腫瘍阻害量」であり得、これらは、投与されるべき本発明の組成物の正確な量であり得、医師が患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度及び状態の個々の差異を考慮して決定することができる。概して、本明細書中に記載される細胞障害性リンパ球又はｒＴＩＬを含む医薬組成物は、１０４～１０１１細胞／体重ｋｇ（例えば、１０５～１０６、１０５～１０１０、１０５～１０１１、１０６～１０１０、１０６～１０１１、１０７～１０１１、１０７～１０１０、１０８～１０１１、１０８～１０１０、１０９～１０１１又は１０９～１０１０細胞／体重ｋｇ）（これらの範囲内の全ての整数値を含む）の投薬量で投与され得ると述べることができる。細胞障害性リンパ球又はｒＴＩＬ組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与され得る。細胞障害性リンパ球又はｒＴＩＬは、免疫療法において一般的に知られている注入技術を用いて投与され得る（例えば、Rosenberg et al., N. Eng. J. Med. 319: 1676, 1988を参照されたい）。特定の患者にとって最適な投薬量及び処置レジームは、疾患の徴候について患者を監視して、処置を然るべく調整することにより、医学の当業者によって容易に決定され得る。
[0081] 本明細書中で用いられる用語「治療効果」は、ヒト対象における治療的利益及び／又は予防的利益を包含する。予防的効果として、疾患若しくは症状の所見を遅延させるか若しくは除外すること、疾患若しくは症状の病徴の発現を遅延させるか若しくは除外すること、疾患若しくは症状の進行を遅らせ、停止させるか若しくは回復に向かわせること、又はそれらのあらゆる組合せが挙げられる。
[0082] 「薬学的に許容できるキャリア」又は「薬学的に許容できる賦形剤」として、あらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤並びに不活性成分が挙げられることが意図される。そのような薬学的に許容できるキャリア又は薬学的に許容できる賦形剤の有効医薬成分への使用は、当該技術分野において周知である。従来のあらゆる薬学的に許容できるキャリア又は薬学的に許容できる賦形剤が有効医薬成分と適合しない場合を除き、本発明の治療組成物での使用が意図される。追加の有効医薬成分、例えば他の薬物も、記載される組成物及び方法に組み込まれ得る。
[0083] 用語「処置」、「処置すること」、「処置する」等は、所望の薬理学的効果及び／又は生理学的効果を得ることを指す。この効果は、疾患若しくはその病徴を完全に若しくは部分的に予防する点から見ると予防的であり得、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する副作用の部分的な若しくは完全な治療の点から見ると治療的であり得る。本明細書中で用いられる「処置」は、哺乳類、特にヒトにおける疾患のあらゆる処置を包含し、以下を含む：（ａ）疾患の傾向があり得るが、疾患を患っていると依然として診断されていない対象において、疾患が発症するのを予防することと、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち疾患の発症又は進行を抑制することと、（ｃ）疾患を和らげること、すなわち疾患の退縮を引き起こし、及び／又は１つ以上の病徴を和らげること。「処置」は、疾患又は症状すらない場合における、薬理効果をもたらすための剤の送達を包含することも意味する。例えば、「処置」は、疾患症状がない場合における、例えばワクチンの場合における、免疫応答を誘発することができるか又は免疫を付与することができる組成物の送達を包含する。
[0084] 核酸又はタンパク質の部分に関して用いられる場合の用語「異種」は、核酸又はタンパク質が２つ以上のサブ配列を含み、これらが、自然界での互いとの関係について同じである関係が見出されないことを示す。例えば、核酸が典型的に組換えにより生じて、無関係な遺伝子由来の２つ以上の配列、例えばある源由来のプロモータ及び別の源由来のコード領域又は異なる源由来のコード領域が新しい機能的核酸を形成するように構成されることである。同様に、異種起源のタンパク質は、タンパク質が２つ以上のサブ配列を含み、これらが、自然界での互いとの関係について同じである関係が見出されないことを示す（例えば、融合タンパク質）。
[0085] 用語「迅速な増殖」は、抗原特異的ＴＩＬの数の、１週間にわたる少なくとも約３倍（又は４倍、５倍、６倍、７倍、８倍若しくは９倍）、より好ましくは１週間にわたる少なくとも約１０倍（又は２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍若しくは９０倍）、最も好ましくは１週間にわたる少なくとも約１００倍の増大を意味する。いくつかの迅速な増殖プロトコルが本明細書中で概説される。
[0086] 本明細書中の「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」は、対象の血流から離れて腫瘍中に移行した白血球として元々得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬとして、以下に限定されないが、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞並びにＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬとして、一次ＴＩＬ及び二次ＴＩＬの両方が挙げられる。「一次ＴＩＬ」は、本明細書中で概説されるように患者組織サンプルから得られる（時折「新たに収穫される」と呼ばれる）ものであり、及び「二次ＴＩＬ」は、本明細書中で考察されるように増殖されたあらゆるＴＩＬ細胞集団であり、以下に限定されないが、バルクＴＩＬ及び増殖ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」又は「ポストＲＥＰ ＴＩＬ」）が挙げられる。特定の実施形態において、用語「一次ＴＩＬ」は、ｒＴＩＬ並びにｅＴＩＬ及びｒＴＩＬの混合物を含み得る。
[0087] 本明細書中の（ＴＩＬを含む）「細胞の集団」は、共通の形質を共有するいくつかの細胞を意味する。一般に、集団は、概して、数が１×１０６～１×１０１０個に及び、様々なＴＩＬ集団が様々な数を含む。例えば、ＩＬ－２の存在下での一次ＴＩＬの最初の増殖では、およそ１×１０８細胞のバルクＴＩＬの集団となる。ＲＥＰ増殖は、概して、注入のために１．５×１０９～１．５×１０１０細胞の集団を提供するようになされる。
[0088] 用語「末梢血単核細胞」及び「ＰＢＭＣ」は、円形核を有する末梢血球を指し、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞）及び単球が挙げられる。好ましくは、末梢血単核細胞は、照射された同種末梢血単核細胞である。ＰＢＭＣは、抗原提示細胞の一種である。
[0089] 本明細書中の「低温保存ＴＩＬ」は、一次ＴＩＬ、バルクＴＩＬ又は増殖ＴＩＬ（ＲＥＰ ＴＩＬ）が約－１５０℃～－６０℃の範囲で処理及び貯蔵されていることを意味する。また、低温保存のための一般的な方法が本明細書中の他の箇所に記載されている。明確にするために、「低温保存ＴＩＬ」は、ｒＴＩＬを含む一次ＴＩＬの源として用いられ得る凍結組織サンプルと区別可能である。
[0090] 本明細書中の「解凍された低温保存ＴＩＬ」は、以前に低温保存されてから、細胞培養温度又はＴＩＬが患者に投与され得る温度が挙げられるが、これらに限定されない室温以上に戻るように処理されたＴＩＬ（例えば、ｒＴＩＬ）の集団を意味する。
[0091] ２つ以上の核酸又はポリペプチドに関連して、用語「配列同一性」、「パーセント同一性」及び「配列パーセント同一性」は、あらゆる保存的アミノ酸置換を配列同一性の一部として考慮しないで、最大一致について比較且つアラインされた（必要に応じてギャップを導入した）場合の、同じであるか又は特定のパーセンテージで同じヌクレオチド若しくはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを用いて、又は視覚による検査によって測定され得る。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを得るのに用いられ得る種々のアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野において知られている。パーセント配列同一性を判定する適切なプログラムとして、例えば米国政府のNational Center for Biotechnology Information BLASTのウェブサイトから入手可能なBLASTプログラム集が挙げられる。２つの配列間の比較は、BLASTN又はBLASTPのアルゴリズムを用いて実行され得る。BLASTNは、核酸配列を比較するのに用いられる一方、BLASTPは、アミノ酸配列を比較するのに用いられる。ALIGN、ALIGN-2（Genentech, South San Francisco, California）又はMegAlign（DNASTARから入手可能）は、配列をアラインするのに用いられ得る公表されている更なるソフトウェアプログラムである。当業者であれば、特定のアラインメントソフトウェアにより、最大アラインメントに適したパラメータを決定することができる。特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが用いられる。
[0092] 用語「保存的アミノ酸置換」は、抗原への抗体の結合を排除しないアミノ酸配列の修飾を意味する。保存的アミノ酸置換として、あるクラス内のアミノ酸の、同じクラスのアミノ酸による置換が挙げられ、クラスは、共通の物理化学的アミノ酸側鎖の特性及び自然界に見出される相同タンパク質における高い置換頻度によって定義され、これらは、例えば、標準的なDayhoff頻度交換マトリックス又はBLOSUMマトリックスによって判定される。アミノ酸側鎖の６つの一般的なクラスがカテゴリ化されており、以下が挙げられる：クラスＩ（Ｃｙｓ）；クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；及びクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。例えば、Ａｓｐの、クラスＩＩＩの別の残基、例えばＡｓｎ、Ｇｌｎ又はＧｌｕとの置換は、保存的置換である。したがって、タンパク質中の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じクラス由来の別のアミノ酸残基で置換されている。抗原結合を失わせないアミノ酸保存的置換を特定する方法が当該技術分野において周知である（例えば、Brummell, et al, Biochemistry 1993, 32, 1180-1187；Kobayashi, et al., Protein Eng. 1999, 12, 879-884 (1999)；及びBurks, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 412-417を参照されたい）。
[0093] 「ペグ化」は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体と、１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体フラグメントに取り付けられる条件下で典型的に反応する抗体若しくは融合タンパク質又はそのフラグメントの修飾を指す。ペグ化は、例えば、抗体（例えば、血清）の生物学的半減期を増大させ得る。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似する反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して実行される。本明細書中で用いられる用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質、例えばモノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシ－若しくはアリールオキシ－ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール－マレイミドを誘導体化するのに用いられたＰＥＧのあらゆる形態を包含することが意図される。ペグ化されることとなるタンパク質又は抗体は、非グリコシル化タンパク質又は非グリコシル化抗体であり得る。ペグ化の方法が当該技術分野において知られており、且つ本発明の抗体に用いられ得、例えば欧州特許第０１５４３１６号及び欧州特許第０４０１３８４号並びに米国特許第５，８２４，７７８号に記載されており、これらの各開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[0094] 用語「ＯＫＴ－３」（本明細書中で「ＯＫＴ３」とも呼ぶ）は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に向けられるモノクローナル抗体又はそのバイオシミラー若しくは変異体（ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又はマウス抗体が挙げられる）を指し、市販されている形態、例えばＯＫＴ－３（３０ｎｇ／ｍＬ、MACS GMP CD3 pure, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA）及びムロモナブ又はそれらの変異体、保存的アミノ酸置換体、グリコフォーム若しくはバイオシミラーが挙げられる。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列が表１（配列番号１及び配列番号２）に与えられている。ＯＫＴ－３を産生することができるハイブリドーマがAmerican Type Culture Collectionに寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ ８００１が割り当てられている。また、ＯＫＴ－３を産生することができるハイブリドーマがEuropean Collection of Authenticated Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）に寄託されており、カタログ番号８６０２２７０６が割り当てられている。また、抗ＣＤ３抗体として、ＵＨＣＴ１クローン（BioLegend, San Diego, CA, USAから市販されている）（Ｔ３及びＣＤ３εとしても知られている）が挙げられる。
Figure 2022167931000001
[0095] 用語「ＩＬ－２」（本明細書中で「ＩＬ２」とも呼ぶ）は、インターロイキン－２として知られているＴ細胞増殖因子を指し、ヒトの形態及び哺乳類の形態、それらの保存的アミノ酸置換体、グリコフォーム、バイオシミラー及び変異体が挙げられるＩＬ－２の全ての形態を含む。ＩＬ－２は、例えば、Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88及びMalek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79に記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明での使用に適した組換えヒトＩＬ－２のアミノ酸配列が表２に与えられている（配列番号３）。例えば、用語ＩＬ－２は、ＩＬ－２のヒト組換え形態、例えばアルデスロイキン（PROLEUKIN、複数の供給者から単回使用バイアルあたり２２００万ＩＵで市販されている）並びにCellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA（CELLGRO GMP）又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－２０９－ｂ）によって商業的に供給される組換えＩＬ－２の形態及び他のベンダー由来の他の市販の均等物を包含する。アルデスロイキン（デス－アラニル－１、セリン－１２５ヒトＩＬ－２）は、およそ１５ｋＤａの分子量を有するＩＬ－２の非グリコシル化ヒト組換え形態である。本発明での使用に適したアルデスロイキンのアミノ酸配列が表２に与えられている（配列番号４）。用語ＩＬ－２は、本明細書中に記載されるＩＬ－２のペグ化形態も包含しており、ペグ化ＩＬ２プロドラッグＮＫＴＲ－２１４（Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USAから入手可能）が挙げられる。本発明での使用に適したＮＫＴＲ－２１４及びペグ化ＩＬ－２が米国特許出願公開第２０１４／０３２８７９１Ａ１号及び国際公開第２０１２／０６５０８６Ａ１号に記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明での使用に適した結合ＩＬ－２の代替形態が米国特許第４，７６６，１０６号、米国特許第５，２０６，３４４号、米国特許第５，０８９，２６１号及び米国特許第４，９０２，５０２号に記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明での使用に適したＩＬ－２の製剤が米国特許第６，７０６，２８９号に記載されており、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
Figure 2022167931000002
[0096] 用語「ＩＬ－４」（本明細書中で「ＩＬ４」とも呼ぶ）は、インターロイキン４として知られているサイトカインを指し、これは、Ｔｈ２ Ｔ細胞により、且つ好酸球、好塩基球及び肥満細胞により産生される。ＩＬ－４は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）の、Ｔｈ２ Ｔ細胞への分化を調節する。Steinke and Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70。ＩＬ－４による活性化の直後に、Ｔｈ２ Ｔ細胞は、続いてポジティブフィードバックループにおいて追加のＩＬ－４を産生する。ＩＬ－４はまた、Ｂ細胞の増殖及びクラスＩＩ ＭＨＣの発現を誘発して、Ｂ細胞からのＩｇＥ及びＩｇＧ１の発現にスイッチするクラスを誘導する。本発明での使用に適した組換えヒトＩＬ－４は、複数の供給者から市販されており、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－２１１）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ－４組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ ＣＴＰ００４３）が挙げられる。本発明での使用に適した組換えヒトＩＬ－４のアミノ酸配列が表２に与えられている（配列番号５）。
[0097] 用語「ＩＬ－７」（本明細書中で「ＩＬ７」とも呼ぶ）は、インターロイキン７として知られているグリコシル化組織由来サイトカインを指し、これは、間質細胞及び上皮細胞並びに樹状細胞から得られ得る。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。ＩＬ－７は、Ｔ細胞の発達を刺激することができる。ＩＬ－７は、ＩＬ－７受容体（ＩＩＬ－７受容体であるアルファ鎖及び共通ガンマ鎖受容体からなるヘテロダイマー）に結合し、これは、一連のシグナルでは、胸腺内での発達及び末梢内でのＴ細胞の生存に重要である。本発明での使用に適した組換えヒトＩＬ－４が複数の供給者から市販されており、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－２５４）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ－７組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ ＰＨＣ００７１）が挙げられる。本発明での使用に適した組換えヒトＩＬ－７のアミノ酸配列が表２に与えられている（配列番号６）。
[0098] 用語「ＩＬ－１５」（本明細書中で「ＩＬ１５」とも呼ぶ）は、インターロイキン－１５として知られているＴ細胞増殖因子を指し、ヒトの形態及び哺乳類の形態、それらの保存的アミノ酸置換体、グリコフォーム、バイオシミラー及び変異体が挙げられるＩＬ－２の全ての形態を含む。ＩＬ－１５は、例えば、Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32に記載されており、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－１５は、β及びγシグナル伝達受容体サブユニットをＩＬ－２と共有する。組換えヒトＩＬ－１５は、１２．８ｋＤａの分子量を有する１１４個のアミノ酸（及びＮ末端メチオニン）を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－１５は、複数の供給者から市販されており、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－２３０－ｂ）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号３４－８１５９－８２）が挙げられる。本発明での使用に適した組換えヒトＩＬ－１５のアミノ酸配列が表２に与えられている（配列番号７）。
[0099] 用語「ＩＬ－２１」（本明細書中で「ＩＬ２１」とも呼ぶ）は、インターロイキン－２１として知られている多面発現性サイトカインタンパク質を指し、ヒトの形態及び哺乳類の形態、それらの保存的アミノ酸置換体、グリコフォーム、バイオシミラー及び変異体が挙げられるＩＬ－２１の全ての形態を含む。ＩＬ－２１は、例えば、Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95に記載されており、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－２１は、主にナチュラルキラーＴ細胞及び活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生される。組換えヒトＩＬ－２１は、１５．４ｋＤａの分子量を有する１３２個のアミノ酸を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－２１は、複数の供給者から市販されており、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ－４０８－ｂ）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ－２１組換えタンパク質、カタログ番号１４－８２１９－８０）が挙げられる。本発明での使用に適した組換えヒトＩＬ－２１のアミノ酸配列が表２に与えられている（配列番号８）。
[00100] 用語「バイオシミラー」は、モノクローナル抗体又は融合タンパク質が挙げられるバイオ生成物を意味し、これは、臨床的に不活性の構成要素内の差異が僅かであるにもかかわらず、米国で認可された基準バイオ生成物と高度に類似し、これについて、生成物の安全性、純度及び効力に関してバイオ生成物と基準生成物との間で臨床的に意味がある差異はない。さらに、類似のバイオ医薬品又は「バイオシミラー」医薬品は、European Medicines Agencyによって使用が既に認可された別のバイオ医薬品と類似するバイオ医薬品である。用語「バイオシミラー」は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に用いられる。バイオ生成物又はバイオ医薬品は、生物源、例えば細菌又は酵母によって製造されるか又はこれらに由来する医薬品である。これらは、比較的小さい分子、例えばヒトインスリン若しくはエリトロポイエチン又は複合分子、例えばモノクローナル抗体からなり得る。例えば、基準ＩＬ－２タンパク質がアルデスロイキン（PROLEUKIN）である場合、アルデスロイキンに関して薬物規制当局によって承認されるタンパク質は、アルデスロイキン及び「バイオシミラー」であり、又はアルデスロイキンの「そのバイオシミラー」である。欧州では、類似のバイオ医薬品又は「バイオシミラー」医薬品は、European Medicines Agency（ＥＭＡ）によって使用が既に認可された別のバイオ医薬品と類似するバイオ医薬品である。欧州における類似の生物学的用途についての関連する法的根拠は、規則（ＥＣ）Ｎｏ ７２６／２００４の第６条及び指令２００１／８３／ＥＣの第１０条第４項（改定）であるため、欧州において、バイオシミラーは、規則（ＥＣ）Ｎｏ ７２６／２００４の第６条及び指令２００１／８３／ＥＣの第１０条第４項の下で認可され得、認可又は認可の申請の対象が承認され得る。既に認可された元のバイオ医薬生成物は、欧州において「基準医薬生成物（reference medicinal product）」と呼ばれ得る。バイオシミラーとみなされるための生成物の一部の要件は、Similar Biological Medicinal Productsに関するＣＨＭＰガイドラインに概説されている。加えて、モノクローナル抗体バイオシミラーに関するガイドラインが挙げられる生成物特定ガイドラインは、生成物対生成物基準でＥＭＡによって提供されており、そのウェブサイト上に公開されている。本明細書中に記載されるバイオシミラーは、品質特性、生物学的活性、作用機構、安全性プロファイル及び／又は有効性が基準医薬生成物と類似し得る。加えて、バイオシミラーは、基準医薬生成物と同じ症状を処置するように用いられ得るか又はそのような使用が意図され得る。したがって、本明細書中に記載されるバイオシミラーは、基準医薬生成物と品質特性が類似するか又は高度に類似すると考えられ得る。代わりに又は加えて、本明細書中に記載されるバイオシミラーは、基準医薬生成物と生物学的活性が類似するか又は高度に類似すると考えられ得る。代わりに又は加えて、本明細書中に記載されるバイオシミラーは、基準医薬生成物と安全性プロファイルが類似するか又は高度に類似すると考えられ得る。代わりに又は加えて、本明細書中に記載されるバイオシミラーは、基準医薬生成物と有効性が類似するか又は高度に類似すると考えられ得る。本明細書中に記載される欧州におけるバイオシミラーは、ＥＭＡによって認可された基準医薬生成物と比較される。しかしながら、場合により、バイオシミラーは、特定の研究において、欧州経済地域（European Economic Area）外で認可されたバイオ医薬生成物（非ＥＥＡ認可「コンパレータ」）と比較され得る。そのような研究として、例えば特定の臨床研究及びインビボ非臨床的研究が挙げられる。本明細書中で用いられる用語「バイオシミラー」は、非ＥＥＡ認可コンパレータとなったか又はこれと匹敵し得るバイオ医薬生成物にも関する。特定のバイオシミラーは、タンパク質、例えば抗体、抗体フラグメント（例えば、抗原結合部分）及び融合タンパク質である。タンパク質バイオシミラーは、ポリペプチドの機能に大きい影響を及ぼさない、アミノ酸構造体中に微量の修飾（例えば、アミノ酸の欠失、付加及び／又は置換が挙げられる）を有するアミノ酸配列を有し得る。バイオシミラーは、その基準医薬生成物のアミノ酸配列に対して９７％以上、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。バイオシミラーは、１つ以上の翻訳後修飾、例えば、限定されないが、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び／又は切断を含み得、これらは、基準医薬生成物の翻訳後修飾と異なる（但し、差異が、医薬生成物の安全性及び／又は有効性の変化をもたらさない場合に限る）。バイオシミラーは、グリコシル化パターンが基準医薬生成物と同じであるか又は異なり得る。特に、排他的ではないが、バイオシミラーは、異なるグリコシル化パターンを有し得る（差異が基準医薬生成物と関連する安全性の問題に対処するか又は対処することが意図される場合）。加えて、バイオシミラーは、基準医薬生成物から例えばその強度、医薬形態、製剤、賦形剤及び／又は提示が逸脱し得る（但し、医薬生成物の安全性及び有効性が損なわれない場合に限る）。バイオシミラーは、基準医薬生成物と比較して例えば薬物動態学的（ＰＫ）プロファイル及び／又は薬力学的（ＰＤ）プロファイルの差異を含み得るが、認可されることとなるか又は認可に適しているとみなされる基準医薬生成物となおも十分に類似すると考えられる。特定の状況において、バイオシミラーは、基準医薬生成物と比較して異なる結合特性を示し、異なる結合特性は、規制当局、例えばＥＭＡにより、類似のバイオ生成物としての認可の障壁とならないとみなされる。用語「バイオシミラー」は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に用いられる。
[00101] 本明細書中で用いられる用語「変異体」は、以下に限定されないが、基準抗体のアミノ酸配列と、基準抗体のアミノ酸配列内の又はこれに隣接する特定の位置での１つ以上の置換、欠失及び／又は付加によって異なるアミノ酸配列を含む抗体又は融合タンパク質を包含する。変異体は、基準抗体のアミノ酸配列と比較して１つ以上の保存的置換をそのアミノ酸配列中に含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電したアミノ酸又は荷電しないアミノ酸の置換を含み得る。変異体は、基準抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持する。用語変異体は、ペグ化抗体又はペグ化タンパク質も含む。
[00102] 「ペグ化」は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体と、１つ以上のＰＥＧ基が抗体、抗体フラグメント又はタンパク質に取り付けられる条件下で典型的に反応する修飾抗体又はそのフラグメントを指す。ペグ化は、例えば、抗体又はタンパク質（例えば、血清）の生物学的半減期を増大させ得る。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似する反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して実行される。本明細書中で用いられる用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質、例えばモノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシ－若しくはアリールオキシ－ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール－マレイミドを誘導体化するのに用いられたＰＥＧのあらゆる形態を包含することが意図される。ペグ化されることとなる抗体又はタンパク質は、非グリコシル化抗体であり得る。ペグ化の方法が当該技術分野において知られており、且つ本発明の抗体に用いられ得、例えば欧州特許第０１５４３１６号及び欧州特許第０４０１３８４号に記載されている。
[00103] 用語「血液悪性腫瘍」は、以下に限定されないが、血液、骨髄、リンパ節及びリンパ系の組織が挙げられる造血組織及びリンパ組織の哺乳類の癌及び腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液性腫瘍」とも呼ばれる。血液悪性腫瘍として、以下に限定されないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。用語「Ｂ細胞血液悪性腫瘍」は、Ｂ細胞を襲う血液悪性腫瘍を指す。
[00104] 用語「固形腫瘍」は、嚢胞も液体領域も通常含有しない組織の異常な塊を指す。固形腫瘍は、良性であるか又は悪性であり得る。用語「固形腫瘍癌」は、悪性、腫瘍性又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌として、以下に限定されないが、肉腫、癌腫及びリンパ腫、例えば肺、乳房、前立腺、結腸、直腸及び膀胱の癌が挙げられる。固形腫瘍の組織構造体として、癌細胞が分散しており、且つ支持微環境を提供し得る、柔組織（癌細胞）及び支持間質細胞を含む相互依存組織コンパートメントが挙げられる。
[00105] 用語「液性腫瘍」は、自然界で流体である細胞の異常な塊を指す。液性腫瘍癌として、白血病、骨髄腫及びリンパ腫並びに他の血液悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。また、液性腫瘍から得られるＴＩＬは、本明細書中で骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）と呼ばれ得る。
[00106] 本明細書中で用いられる用語「微環境」は、固形腫瘍又は血液腫瘍の全体としての微環境又は微環境内の細胞の個々のサブセットを指し得る。本明細書中で用いられる腫瘍微環境は、Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473に記載される「悪性形質転換を促進し、腫瘍の増殖及び浸潤を支持し、腫瘍を宿主免疫から保護し、治療耐性を促進し、且つ発達するための優位な転移のためのニッチを提供する細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス及び機械的合図」の複合混合物を指す。腫瘍は、Ｔ細胞によって認識されるはずの抗原を発現するが、免疫系による腫瘍のクリアランスは、微環境による免疫抑制のために稀である。
[00107] 本明細書中で用いられる、腫瘍を崩壊させるプロセスを説明するための用語「フラグメンティング」、「フラグメント」及び「フラグメント化される」は、機械的なフラグメンテーション方法、例えば腫瘍組織の破砕、スライス、分割及び細切除並びに腫瘍組織の物理的構造を崩壊させる他のあらゆる方法を含む。
[00108] 用語「約」及び「およそ」は、値の統計学的に有意な範囲内を意味する。そのような範囲は、所定の値又は範囲の１桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、さらにより好ましくは１０％以内、さらにより好ましくは５％以内であり得る。用語「約」又は「およそ」によって包含される許容可能な変動は、研究中の特定の系次第であり、当業者によって容易に理解され得る。さらに、本明細書中で用いられる用語「約」及び「およそ」は、寸法、サイズ、式、パラメータ、形状並びに他の量及び特性が正確でなく、且つ正確である必要がないことを意味するが、所望に応じておよその及び／又はより大きいか若しくはより小さい反映耐容性（reflecting tolerance）、換算係数、四捨五入、測定エラー等、及び当業者に知られている他の係数であり得る。一般に、寸法、サイズ、式、パラメータ、形状又は他の量若しくは特性は、そうであると明確に述べられているか否かにかかわらず、「約」又は「およそ」である。なお、サイズ、形状及び寸法が非常に異なる実施形態は、記載される構成を使用し得る。
[00109] 移行用語「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」は、添付の特許請求の範囲において元の形態及び補正された形態で用いられる場合、記載されていない追加の特許請求の範囲の要素又は工程（存在する場合）が特許請求の範囲から除外されることに関して、特許請求の範囲を定義する。用語「含む」は、包含的であること又はオープンエンドであることが意図されており、記載されていない追加のいかなる要素、方法、工程又は材料も除外しない。用語「からなる」は、特許請求の範囲において指定されたもの以外、及び後の例では、指定された材料と通常関連する不純物以外のあらゆる要素、工程又は材料を排除する。用語「から本質的になる」は、特許請求の範囲を、指定された要素、工程又は材料並びに特許請求される本発明の基礎的な特性及び新規の特性に物質的に影響を及ぼさないものに限定する。本発明を具体化する本明細書中に記載される全ての組成物、方法及びキットは、代替の実施形態において、移行用語「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」のいずれかによってより具体的に定義され得る。
[00110] 疑義の回避のために、本明細書中では、本発明の特定の態様、実施形態又は実施例と関連して記載される特定の特徴（例えば、整数、特性、値、使用、疾患、式、化合物又は基）は、本明細書中に記載される他のあらゆる態様、実施形態又は実施例にそれらと不適合でない限り適用可能であると理解されるべきであることが意図される。したがって、そのような特徴は、本明細書中で定義される定義、特許請求の範囲又は実施形態のいずれかと関連して適切な場合に用いられ得る。本明細書中に開示される特徴の全て（添付の特許請求の範囲、要約及び図面を含む）及び／又はそのように開示されるあらゆる方法若しくはプロセスの工程の全てがあらゆる組合せで組み合わされ得るが、特徴及び／又は工程の少なくとも一部が相互排他的である組合せを除く。本発明は、開示されるあらゆる実施形態のいずれかの詳細に限定されない。本発明は、本明細書中に開示される特徴の新規の１つ若しくは新規の組合せ（添付の特許請求の範囲、要約及び図面を含む）又はそのように開示されるあらゆる方法若しくはプロセスの工程の新規の１つ若しくは新規の組合せに及ぶ。
レムナント腫瘍浸潤リンパ球を増殖させる方法
[00111] 一実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるように、腫瘍の消化後にレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を増殖させる方法を含む。
[00112] 一実施形態において、本発明は、ｒＴＩＬを増殖させる方法を含み、方法は、少なくとも１つのｒＴＩＬを含むｒＴＩＬの集団をＩＬ－２と接触させることによってｒＴＩＬを増殖させることを含む。
[00113] 一実施形態において、本発明は、ｒＴＩＬの集団を増殖させる方法を提供し、方法は、Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292に記載される工程を含み、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、腫瘍は、酵素媒体中に入れられ得、且つおよそ１分間、機械的にフラグメント化され得る。次に、混合物は、５％ＣＯ２中で３７℃において３０分間インキュベートされてから、ここでもおよそ１分間、機械的にフラグメント化され得る。５％ＣＯ２中での３７℃での３０分間のインキュベーション後、腫瘍は、３回目におよそ１分間、機械的にフラグメント化され得る。３回目の機械崩壊後、大きい片の組織が存在する場合、１回又は２回の追加の機械分離がサンプルに施され得、５％ＣＯ２中での３７℃での３０分の追加のインキュベーションがあってもなくてもよい。最後のインキュベーション終了後、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死んだ細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するために、Ｆｉｃｏｌｌを用いた密度勾配分離が実行され得る。ＴＩＬ培養を２４ウェルプレート（Costar 24ウェル細胞培養クラスタ、平底；Corning Incorporated, Corning, NY）内で開始し、各ウェルに対し、ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍＬ；Chiron Corp., Emeryville, CA）入りの２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中の１×１０６腫瘍消化細胞又はサイズがおよそ１～８ｍｍ３の１腫瘍フラグメントが播種され得る。ＣＭは、GlutaMAX入りの、１０％ヒトＡｂ血清、２５ｍＭ Hepes及び１０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンが補充されたRPMI 1640からなる。培養は、４０ｍＬ容量の、１０ｃｍ２の気体透過性シリコンボトムを有する気体透過性フラスコ（G-Rex 10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton）内で開始され得、各フラスコに対し、ＩＬ－２入りの１０～４０ｍＬのＣＭ中、１０～４０×１０６個の生存腫瘍消化細胞又は５～３０個の腫瘍フラグメントがロードされ得る。G-Rex 10及び２４ウェルプレートが、３７℃の加湿インキュベータ内において５％ＣＯ２中でインキュベートされ得、培養開始の５日後に半分の培地が除去されてフレッシュなＣＭ及びＩＬ－２で置換され得、第５日後に半分の培地が２～３日毎に変えられ得る。ＴＩＬのための迅速増殖プロトコル（ＲＥＰ）は、本明細書中の他の箇所に記載されるように、T-175フラスコ及び気体透過性バッグ又は気体透過性G-Rexフラスコを用いて実行され得る。T-175フラスコ内でのＲＥＰについて、１×１０６ｒＴＩＬが各フラスコ内の１５０ｍＬの培地中に懸濁され得る。ｒＴＩＬは、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ－３）が補充されたＣＭ及びAIM-V培地（５０／５０培地）の１対１混合物中で培養され得る。T-175フラスコは、５％ＣＯ２中で３７℃においてインキュベートされ得る。半分の培地は、５日目に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２入りの５０／５０培地を用いて変えられ得る。７日目に、２つのT-175フラスコ由来の細胞が３Ｌバッグ内で組み合わされ得、及び５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２入りの３００ｍＬのAIM-Vが３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に加えられ得る。各バッグ内の細胞数は、毎日又は２日毎にカウントされ得、及びフレッシュな培地は、０．５～２．０×１０６細胞／ｍＬの細胞数を維持するように加えられ得る。１００ｃｍ２の気体透過性シリコンボトムを有する５００ｍＬ容量フラスコ（例えば、本明細書中の他の箇所に記載されるG-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing）内でのＲＥＰについて、５×１０６又は１０×１０６ＴＩＬは、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ－３）が補充された４００ｍＬの５０／５０培地中で培養され得る。G-Rex 100フラスコは、５％ＣＯ２中で３７℃においてインキュベートされ得る。５日目に、２５０ｍＬの上清が除かれて遠心分離ボトル中に入れられ、１５００ｒｐｍ（４９１ｇ）において１０分間遠心分離され得る。得られたＴＩＬペレットは、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２入りの１５０ｍＬのフレッシュな５０／５０培地で再懸濁されて、G-Rex 100フラスコに戻され得る。ＴＩＬがG-Rex 100フラスコ内で順次増殖された場合、７日目に、各G-Rex 100中のＴＩＬは、各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地中に懸濁されて、細胞懸濁液は、３つのG-Rex 100フラスコに播種するのに用いられ得る３つの１００ｍＬアリコートに分割され得る。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２入りの約１５０ｍＬのAIM-Vが各フラスコに加えられ得る。次に、G-Rex 100フラスコが５％ＣＯ２中で３７℃においてインキュベートされ得、及び４日目後に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２入りの１５０ｍＬのAIM-Vが各G-Rex 100フラスコに加えられ得る。この後、ＲＥＰは、培養の１４日目に細胞を収穫することによって完了され得る。
[00114] 一実施形態において、癌を増殖させるか又は処理する方法は、ＴＩＬを患者の腫瘍サンプルから得る工程を含む。患者の腫瘍サンプルは、当該技術分野において知られている方法を用いて得ることができる。例えば、ＴＩＬは、酵素による腫瘍消化物及び鋭的切開由来の腫瘍フラグメント（約１～約８ｍｍ３のサイズ）から培養され得る。そのような腫瘍消化物は、酵素媒体中でのインキュベーション（例えば、Roswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）1640バッファ、２ｍＭグルタメート、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０ユニット／ｍＬ ＤＮａｓｅ及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ）、それに続く機械分離（例えば、組織ディソシエータ又はフラグメンテータを用いる）によって生成され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素媒体中に入れて、腫瘍を機械的におよそ１分間フラグメント化してから、５％ＣＯ２中で３７℃において３０分間インキュベーションした後、上述の条件下において、小さい組織片のみが存在するまで機械分離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことによって生成され得る。このプロセスの終了後、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死んだ細胞を含有する場合、FICOLL分枝状親水性多糖を用いた密度勾配分離がこれらの細胞を除去するために実行され得る。当該技術分野において知られている代替方法が用いられ得、例えば米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号に記載されるものがあり、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。上述の方法のいずれかが、本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、ＴＩＬを増殖させる方法又は癌を処理する方法に用いられ得る。
[00115] 一実施形態において、ｒＴＩＬのＲＥＰは、気体透過性コンテナ内で適切なあらゆる方法を用いて実行され得る。例えば、ｒＴＩＬは、例えば、国際公開第２０１５／１８９３５６Ａ１号及び国際公開第２０１５／１８９３５６Ａ１号に記載されるように、非特異的Ｔ細胞受容体の刺激をインターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）及び／又はインターロイキン－２１（ＩＬ－２１）の存在下で用いて迅速に増殖させることができ、これらの各開示は、参照により本明細書に組み込まれる。非特異的Ｔ細胞受容体の刺激は、例えば、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３（モノクローナル抗ＣＤ３抗体）（Ortho-McNeil, Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USAから市販されている）を含み得る。ＴＩＬは、癌の１つ以上の抗原（その抗原性部分、例えばエピトープが挙げられる）によるＴＩＬの更なるインビトロ刺激によって迅速に増殖し得、抗原は、任意選択的に、任意選択的にＴ細胞増殖因子、例えば３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２又はＩＬ－１５の存在下でベクターから発現され得る（例えば、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチド、例えば０．３μＭ MART-L26-35（２７Ｌ）又はgpl 00:209-217（２１０Ｍ））。他の適切な抗原として、例えばＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２及びＶＥＧＦＲ２又はそれらの抗原性部分が挙げられ得る。ＴＩＬは、ＨＬＡ－Ａ２発現抗原提示細胞上にパルスにされた癌の同じ抗原による再刺激によっても迅速に増殖し得る。これ以外にも、ＴＩＬは、例えば、照射された自己由来のリンパ球又は照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種リンパ球及びＩＬ－２でさらに再刺激され得る。
[00116] 一実施形態において、ＴＩＬを増殖させる方法は、約５０００ｍＬ～約２５０００ｍＬの細胞培地、約５０００ｍＬ～約１００００ｍＬの細胞培地又は約５８００ｍＬ～約８７００ｍＬの細胞培地を用いることを含み得る。一実施形態において、ＴＩＬを増殖させる方法は、約１０００ｍＬ～約２０００ｍＬの細胞培地、約２０００ｍＬ～約３０００ｍＬの細胞培地、約３０００ｍＬ～約４０００ｍＬの細胞培地、約４０００ｍＬ～約５０００ｍＬの細胞培地、約５０００ｍＬ～約６０００ｍＬの細胞培地、約６０００ｍＬ～約７０００ｍＬの細胞培地、約７０００ｍＬ～約８０００ｍＬの細胞培地、約８０００ｍＬ～約９０００ｍＬの細胞培地、約９０００ｍＬ～約１００００ｍＬの細胞培地、約１００００ｍＬ～約１５０００ｍＬの細胞培地、約１５０００ｍＬ～約２００００ｍＬの細胞培地又は約２００００ｍＬ～約２５０００ｍＬの細胞培地を用いることを含み得る。一実施形態において、ＴＩＬ数の増殖には、１種類以下の細胞培地を用いる。適切なあらゆる細胞培地が用いられ得、例えばAIM-V細胞培地（Ｌ－グルタミン、５０μＭストレプトマイシンサルフェート及び１０μＭゲンタマイシンサルフェート）細胞培地（Invitrogen, Carlsbad CA）がある。この点に関して、本発明の方法は、有利には、ＴＩＬの数を増殖させるのに必要とされる培地の量及び培地の種類数を引き下げる。一実施形態において、ＴＩＬ数の増殖は、３日毎又は４日毎よりも少ない頻度で細胞を供給することを含み得る。気体透過性コンテナ内での細胞数の増殖は、細胞を増殖させるのに必須の供給頻度を引き下げることによって細胞数を増殖させるのに必須の手順を単純化する。
[00117] 一実施形態において、迅速な増殖は、気体透過性コンテナを用いて実行される。そのような実施形態は、細胞集団を約５×１０５細胞／ｃｍ２から１０×１０６～３０×１０６細胞／ｃｍ２に増殖させ得る。一実施形態において、この増殖は、供給なしで起こる。一実施形態において、この増殖は、培地が気体透過性フラスコ内で約１０ｃｍの高さにおいて存在する限り、供給なしで起こる。一実施形態において、これは、供給なしであるが、１つ以上のサイトカインの添加がある。一実施形態において、サイトカインは、ボーラスとして加えられ得、サイトカインを培地と混合する必要は全くない。そのようなコンテナ、装置及び方法は、当該技術分野において知られており、ＴＩＬを増殖させるのに用いられており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０号、国際公開第２０１１／０７２０８８Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０号、国際公開第２０１３／１７３８３５Ａ１号及び米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６Ａ１号に記載されるものが挙げられ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。そのようなプロセスは、Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292にも記載されており、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00118] 一実施形態において、気体透過性コンテナは、G-Rex 10フラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、気体透過性コンテナは、１０ｃｍ２の気体透過性培養表面を備える。一実施形態において、気体透過性コンテナは、４０ｍＬの細胞培地容量を備える。一実施形態において、気体透過性コンテナは、２回の培地交換後に１億～３億ＴＩＬを提供する。
[00119] 一実施形態において、気体透過性コンテナは、G-Rex 100フラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、気体透過性コンテナは、１００ｃｍ２の気体透過性培養表面を備える。一実施形態において、気体透過性コンテナは、４５０ｍＬの細胞培地容量を備える。一実施形態において、気体透過性コンテナは、２回の培地交換後に１０億～３０億ＴＩＬを提供する。
[00120] 一実施形態において、気体透過性コンテナは、G-Rex 100Mフラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、気体透過性コンテナは、１００ｃｍ２の気体透過性培養表面を備える。一実施形態において、気体透過性コンテナは、１０００ｍＬの細胞培地容量を備える。一実施形態において、気体透過性コンテナは、培地交換なしで１０億～３０億ＴＩＬを提供する。
[00121] 一実施形態において、気体透過性コンテナは、G-Rex 100Lフラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、気体透過性コンテナは、１００ｃｍ２の気体透過性培養表面を備える。一実施形態において、気体透過性コンテナは、２０００ｍＬの細胞培地容量を備える。一実施形態において、気体透過性コンテナは、培地交換なしで１０億～３０億ＴＩＬを提供する。
[00122] 一実施形態において、気体透過性コンテナは、G-Rex 24ウェルプレート（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、気体透過性コンテナは、ウェルを有するプレートを備え、各ウェルは、２ｃｍ２の気体透過性培養表面を備える。一実施形態において、気体透過性コンテナは、ウェルを有するプレートを備え、各ウェルは、８ｍＬの細胞培地容量を備える。一実施形態において、気体透過性コンテナは、２回の培地交換後に１ウェルあたり２０００万～６０００万細胞を提供する。
[00123] 一実施形態において、気体透過性コンテナは、G-Rex 6ウェルプレート（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、気体透過性コンテナは、ウェルを有するプレートを備え、各ウェルは、１０ｃｍ２の気体透過性培養表面を備える。一実施形態において、気体透過性コンテナは、ウェルを有するプレートを備え、各ウェルは、４０ｍＬの細胞培地容量を備える。一実施形態において、気体透過性コンテナは、２回の培地交換後に１ウェルあたり１億～３億細胞を提供する。
[00124] 一実施形態において、第１の気体透過性コンテナ及び／又は第２の気体透過性コンテナ内の細胞培地は、濾過されていない。濾過されてない細胞培地の使用は、細胞数を増殖させるのに必須の手順を単純化し得る。一実施形態において、第１の気体透過性コンテナ及び／又は第２の気体透過性コンテナ内の細胞培地は、ベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）を欠いている。
[00125] 一実施形態において、方法の期間は、腫瘍組織サンプルを哺乳類から得ることと、腫瘍組織サンプルを、細胞培地を含有する第１の気体透過性コンテナ内で培養することと、ＴＩＬを腫瘍組織サンプルから得ることと、ＴＩＬ数を、細胞培地を含有する第２の気体透過性コンテナ内で約１４～約４２日、例えば約２８日の期間、増殖させることとを含む。
[00126] 一実施形態において、迅速な増殖におけるｒＴＩＬのＰＢＭＣに対する比率は、約１～２５、約１～５０、約１～１００、約１～１２５、約１～１５０、約１～１７５、約１～２００、約１～２２５、約１～２５０、約１～２７５、約１～３００、約１～３２５、約１～３５０、約１～３７５、約１～４００又は約１～５００である。一実施形態において、迅速な増殖におけるｒＴＩＬのＰＢＭＣに対する比率は、１～５０乃至１～３００である。一実施形態において、迅速な増殖におけるｒＴＩＬのＰＢＭＣに対する比率は、１～１００乃至１～２００である。
[00127] 一実施形態において、ｒＴＩＬのＰＢＭＣに対する比率（ｒＴＩＬ：ＰＢＭＣ）は、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１：１０５、１：１１０、１：１１５、１：１２０、１：１２５、１：１３０、１：１３５、１：１４０、１：１４５、１：１５０、１：１５５、１：１６０、１：１６５、１：１７０、１：１７５、１：１８０、１：１８５、１：１９０、１：１９５、１：２００、１：２２５、１：２５０、１：２７５、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０及び１：５００からなる群から選択される。好ましい実施形態において、ｒＴＩＬのＰＢＭＣに対する比率（ｒＴＩＬ：ＰＢＭＣ）は、約１：９０である。好ましい実施形態において、ＴＩＬのＰＢＭＣに対する比率（ｒＴＩＬ：ＰＢＭＣ）は、約１：９５である。好ましい実施形態において、ｒＴＩＬのＰＢＭＣに対する比率（ＴＩＬ：ＰＢＭＣ）は、約１：１００である。好ましい実施形態において、ｒＴＩＬのＰＢＭＣに対する比率（ＴＩＬ：ＰＢＭＣ）は、約１：１０５である。好ましい実施形態において、ｒＴＩＬのＰＢＭＣに対する比率（ＴＩＬ：ＰＢＭＣ）は、約１：１１０である。
[00128] 一実施形態において、細胞培地は、ＩＬ－２をさらに含む。好ましい実施形態において、細胞培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。一実施形態において、細胞培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ又は８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。
[00129] 一実施形態において、細胞培地は、ＯＫＴ－３抗体を含む。好ましい実施形態において、細胞培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。一実施形態において、細胞培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。
[00130] 一実施形態において、ＴＩＬのための迅速な増殖プロセスは、前述のように、T-175フラスコ及び気体透過性バッグ（Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51；Dudley, et al, J. Immunother. 2003, 26, 332-42）又は気体透過性培養器（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USAから市販されているG-Rexフラスコ）を用いて実行され得る。T-175フラスコ内でのＴＩＬ迅速増殖について、１５０ｍＬの培地中に懸濁された１×１０６ＴＩＬが各T-175フラスコに加えられ得る。ＴＩＬは、ＣＭ及びAIM-V培地の１対１混合物中で培養され得、１ｍＬあたり３０００ＩＵ（注射単位）のＩＬ－２及び１ｍＬあたり３０ｎｇの抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ－３）が補充される。T-175フラスコは、５％ＣＯ２中で３７℃においてインキュベートされ得る。半分の培地は、５日目に１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ－２入りの５０／５０培地を用いて交換され得る。７日目に、２つのT-175フラスコ由来の細胞が３リットルのバッグ内で組み合わされ得、５％ヒトＡＢ血清及び１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ－２入りの３００ｍＬのAIM-Vを３００ｍｌのＴＩＬ懸濁液に加えた。各バッグ内の細胞数を毎日又は２日毎にカウントし、フレッシュな培地を、０．５～２．０×１０６細胞／ｍＬの細胞数を維持するように加えた。
[00131] 一実施形態において、１００ｃｍの気体透過性シリコンボトムを有する５００ｍＬ容量の気体透過性フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USAから市販）内でのＴＩＬ迅速増殖について、５×１０６又は１０×１０６ＴＩＬが５％ヒトＡＢ血清、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ－２及び１ｍＬあたり３０ｎｇの抗ＣＤ３（ＯＫＴ－３）が補充された、５０／５０培地中で培養され得る。G-Rex 100フラスコは、５％ＣＯ２中で３７℃においてインキュベートされ得る。５日目に２５０ｍＬの上清が除かれて遠心分離ボトル中に入れられ、１５００ｒｐｍ（回転／分；４９１×ｇ）において１０分間遠心分離され得る。ＴＩＬペレットは、５％ヒトＡＢ血清、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ－２入りの１５０ｍＬのフレッシュな培地で再懸濁されて、元のG-Rex 100フラスコに戻され得る。ＴＩＬがG-Rex 100フラスコ内で順次増殖された場合、７日目に、各G-Rex 100中のＴＩＬは、各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地中に懸濁され得、及び細胞懸濁液は、３つのG-Rex 100フラスコに播種するのに用いられ得る３つの１００ｍＬアリコートに分割され得る。次に、５％ヒトＡＢ血清及び１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ－２入りの１５０ｍＬのAIM-Vが各フラスコに加えられ得る。G-Rex 100フラスコは、５％ＣＯ２中で３７℃においてインキュベートされ得、及び４日目後に１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ－２入りの１５０ｍＬのAIM-Vが各G-Rex 100フラスコに加えられ得る。細胞は、培養の１４日目に収穫され得る。
[00132] 一実施形態において、ＴＩＬは、以下のように調製され得る。２ｍｍ３の腫瘍フラグメントは、２ｍＭグルタミン（Mediatech, Inc. Manassas, VA）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Invitrogen Life Technologies）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Invitrogen Life Technologies）、５％熱不活化ヒトＡＢ血清（Valley Biomedical, Inc. Winchester, VA）及び６００ＩＵ／ｍＬ rhIL-2（Chiron, Emeryville, CA）が補充されたAIM-V培地（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）で構成される完全培地（ＣＭ）中で培養される。固形腫瘍の酵素による消化のため、腫瘍標本をさいの目に切ってRPMI-1640中に入れて、洗浄して、１５～２２℃で８００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離して、酵素消化バッファ（RPMI-1640中０．２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ及び３０ユニット／ｍｌ ＤＮａｓｅ）中に再懸濁させてから、室温で一晩回転させた。フラグメントから確立されたＴＩＬがＣＭ中で３～４週間増殖されて、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）入り熱不活化ＨＡＢ血清中でフレッシュに増殖又は低温保存されて、研究時まで－１８０℃で貯蔵され得る。腹水収集物から得た腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）を２４ウェルプレートのＣＭ中に３×１０６細胞／ウェルで播種した。ＴＩＬの増殖を、低倍率倒立顕微鏡を用いて約１日おきに検査した。
[00133] 一実施形態において、ＴＩＬは、気体透過性コンテナ内で増殖する。気体透過性コンテナは、当該技術分野において知られている方法、組成物及び装置を用いて、ＰＢＭＣを用いてＴＩＬを増殖させるのに用いられてきており、米国特許出願公開米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７Ａ１号に記載されるものが挙げられ、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬは、気体透過性バッグ内で増殖する。一実施形態において、ＴＩＬは、気体透過性バッグ内でＴＩＬを増殖させる細胞増殖系、例えばXuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）によって増殖する。一実施形態において、ＴＩＬは、気体透過性バッグ内でＴＩＬを増殖させる細胞増殖系、例えばXuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られているWAVE Bioreactor Systemによって増殖する。一実施形態において、細胞増殖系は、容量が、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約１１Ｌ、約１２Ｌ、約１３Ｌ、約１４Ｌ、約１５Ｌ、約１６Ｌ、約１７Ｌ、約１８Ｌ、約１９Ｌ、約２０Ｌ、約２５Ｌ及び約３０Ｌからなる群から選択される気体透過性細胞バッグを備える。一実施形態において、細胞増殖系は、容量範囲が、５０～１５０ｍＬ、１５０～２５０ｍＬ、２５０～３５０ｍＬ、３５０～４５０ｍＬ、４５０～５５０ｍＬ、５５０～６５０ｍＬ、６５０～７５０ｍＬ、７５０～８５０ｍＬ、８５０～９５０ｍＬ及び９５０～１０５０ｍＬからなる群から選択される気体透過性細胞バッグを備える。一実施形態において、細胞増殖系は、容量範囲が、１Ｌ～２Ｌ、２Ｌ～３Ｌ、３Ｌ～４Ｌ、４Ｌ～５Ｌ、５Ｌ～６Ｌ、６Ｌ～７Ｌ、７Ｌ～８Ｌ、８Ｌ～９Ｌ、９Ｌ～１０Ｌ、１０Ｌ～１１Ｌ、１１Ｌ～１２Ｌ、１２Ｌ～１３Ｌ、１３Ｌ～１４Ｌ、１４Ｌ～１５Ｌ、１５Ｌ～１６Ｌ、１６Ｌ～１７Ｌ、１７Ｌ～１８Ｌ、１８Ｌ～１９Ｌ及び１９Ｌ～２０Ｌからなる群から選択される気体透過性細胞バッグを備える。一実施形態において、細胞増殖系は、容量範囲が、０．５Ｌ～５Ｌ、５Ｌ～１０Ｌ、１０Ｌ～１５Ｌ、１５Ｌ～２０Ｌ、２０Ｌ～２５Ｌ及び２５Ｌ～３０Ｌからなる群から選択される気体透過性細胞バッグを備える。一実施形態において、細胞増殖系は、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日及び約２８日のロッキング時間を利用する。一実施形態において、細胞増殖系は、３０分～１時間、１時間～１２時間、１２時間～１日、１日～７日、７日～１４日、１４日～２１日及び２１日～２８日のロッキング時間を利用する。一実施形態において、細胞増殖系は、約２ロック／分、約５ロック／分、約１０ロック／分、約２０ロック／分、約３０ロック／分、約４０ロック／分のロッキング速度を利用する。一実施形態において、細胞増殖系は、２ロック／分～５ロック／分、５ロック／分～１０ロック／分、１０ロック／分～２０ロック／分、２０ロック／分～３０ロック／分、３０ロック／分～４０ロック／分のロッキング速度を利用する。一実施形態において、細胞増殖系は、約２°、約３°、約４°、約５°、約６°、約７°、約８°、約９°、約１０°、約１１°、約１２°のロッキング角度を利用する。一実施形態において、細胞増殖系は、２°～３°、３°～４°、４°～５°、５°～６°、６°～７°、７°～８°、８°～９°、９°～１０°、１０°～１１°及び１１°～１２°のロッキング角度を利用する。
[00134] 一実施形態において、ｒＴＩＬを増殖させる方法は、ｒＴＩＬを優れた腫瘍反応性について選択する工程をさらに含む。当該技術分野において知られているあらゆる選択方法が用いられ得る。例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号（この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法は、優れた腫瘍反応性についてのＴＩＬの選択に用いられ得る。
ｒＴＩＬの特性
[00135] 一実施形態において、本発明のｒＴＩＬは、１つ以上のＴ細胞疲弊マーカーによって特徴付けられる疲弊Ｔ細胞表現型を示す。一実施形態において、本発明のｒＴＩＬは、フローサイトメトリ分析を用いて１つ以上のＴ細胞疲弊マーカーによって特徴付けられる疲弊Ｔ細胞表現型を示す。一実施形態において、Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＰＤ－１である。一実施形態において、Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＬＡＧ３である。一実施形態において、Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３である。
[00136] 一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＰＤ－１発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％又は少なくとも１５０％だけ低下される。一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＰＤ－１発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は少なくとも１０倍だけ低下される。
[00137] 一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＬＡＧ３発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％又は少なくとも１５０％だけ低下される。一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＬＡＧ３発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は少なくとも１０倍だけ低下される。一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＬＡＧ３発現は、フローサイトメトリによって検出不可能である。
[00138] 一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＴＩＭ３発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％又は少なくとも１５０％だけ低下される。一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＴＩＭ３発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は少なくとも１０倍だけ低下される。一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＴＩＭ３発現は、フローサイトメトリによって検出不可能である。
[00139] 一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＴＩＧＩＴ発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％又は少なくとも１５０％だけ低下される。一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＴＩＧＩＴ発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は少なくとも１０倍だけ低下される。一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＴＩＧＩＴ発現は、フローサイトメトリによって検出不可能である。
[00140] 一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＣＴＬＡ－４発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％又は少なくとも１５０％だけ低下される。一実施形態において、ｒＴＩＬのＣＴＬＡ－４発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は少なくとも１０倍だけ低下される。一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＣＴＬＡ－４発現は、フローサイトメトリによって検出不可能である。
[00141] 一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＣＤ６９発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％又は少なくとも１５０％だけ増大される。一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＣＤ６９発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は少なくとも１０倍だけ増大される。
[00142] 一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＳ１ＰＲ１（スフィンゴシン－１－ホスファート受容体１）発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％又は少なくとも１５０％だけ減少される。一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＳ１ＰＲ１発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は少なくとも１０倍だけ減少される。
[00143] 一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるテロメア長は、ｅＴＩＬに対して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％又は少なくとも１５０％だけ増大される。一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるテロメア長は、ｅＴＩＬに対して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は少なくとも１０倍だけ増大される。
[00144] 一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＣＤ２８発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％又は少なくとも１５０％だけ増大される。一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＣＤ２８発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は少なくとも１０倍だけ増大される。
[00145] 一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＣＤ２７発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％又は少なくとも１５０％だけ増大される。一実施形態において、ｒＴＩＬにおけるＣＤ２７発現は、ｅＴＩＬに対して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は少なくとも１０倍だけ増大される。
[00146] 一部の実施形態において、本明細書中に記載される方法は、貯蔵培地（例えば、５％ＤＭＳＯを含有する培地）中でのｅＴＩＬ及び／又はｒＴＩＬの任意選択の低温保存を、本明細書中に記載される更なる工程を実行する前又は輸送、解凍及び／又は患者への投与前の本明細書中に記載されるＲＥＰ工程の完了後に含み得る。一部の実施形態において、本明細書中に記載される方法は、本明細書中に記載される更なる工程を実行する前に、低温保存されたＴＩＬ（例えば、低温保存されたｅＴＩＬ、低温保存されたｒＴＩＬ又はそれらの組合せ若しくは混合物）を解凍する工程を含み得る。一部の実施形態において、更なる工程は、ｅＴＩＬ及び／又はｒＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ）の追加の増殖又は反復増殖であり得、これは、例えば、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び／又はフィーダ細胞（例えば、抗原提示細胞）を含み、通常、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ；又は代わりに抗原提示細胞を用いる）を含む補充された細胞培地を用いて、解凍された細胞に実行され得、追加の増殖工程は、少なくとも１４日間実行され得る。一部の実施形態において、そのような培地は、ＩＬ－２単独ではなく、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２３の組合せも含有し得る。
[00147] 本明細書中で考察される低温保存は、ＴＩＬ増殖プロセスの全体を通して多数の点で起こり得る。一部の実施形態において、増殖後のバルクＴＩＬ集団（例えば、ｅＴＩＬ、ｒＴＩＬ又はそれらの組合せ若しくは混合物）は、低温保存され得る。低温保存は、通常、ＴＩＬ集団を凍結溶液、例えば８５％補足不活化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に入れることによって達成され得る。溶液中の細胞は、低温バイアル中に入れられて－８０℃で２４時間貯蔵され、任意選択的に低温保存のための気体窒素フリーザに移される。Sadeghi, et al, Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるＴＩＬは、５％ＤＭＳＯ中で低温保存され得る。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるＴＩＬは、細胞培地プラス５％ＤＭＳＯ中で低温保存され得る。
[00148] 適切な場合、本明細書中に記載される低温保存された細胞、例えば低温保存されたｒＴＩＬは、フリーザから取り出されて、溶液のおよそ４／５が解凍されるまで３７℃のウォータバス内で解凍される。細胞は、通常、完全培地中に再懸濁されて、任意選択的に１回以上洗浄される。一部の実施形態において、解凍されたＴＩＬは、当該技術分野において知られているようにカウントされ、且つ生存度について評価され得る。
ｒＴＩＬを得るために腫瘍を消化する方法
[00149] 一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、１つ以上の酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含む。腫瘍の消化に適した酵素がVolvitz, et al., BMC Neuroscience 2016, 17, 30に記載されており、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00150] 一部の実施形態において、本発明は、ｒＴＩＬを得る方法を含み得、これは、腫瘍組織又はその部分が挙げられ得る腫瘍を、デオキシリボヌクレアーゼ、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ又はそれらの組合せを用いて消化する工程を含む。
[00151] 一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、ＤＮＡ骨格中のリン酸ジエステル結合の加水分解切断を触媒する、したがってＤＮＡを分解するあらゆる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含む。一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を用いて腫瘍を消化する工程を含む。一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、デオキシリボヌクレアーゼ及び少なくとも１つの他の酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含む。一実施形態において、デオキシリボヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼＩである。一実施形態において、デオキシリボヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼＩＩである。一実施形態において、デオキシリボヌクレアーゼは、ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼＩ（Sigma D5025又は均等物）である。一実施形態において、デオキシリボヌクレアーゼは、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）において発現されるウシ由来の組換えデオキシリボヌクレアーゼＩ（Sigma D2821又は均等物）である。一実施形態において、デオキシリボヌクレアーゼは、組換えヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ（ｒｈＤＮＡａｓｅ Ｉ、ドルナーゼアルファとしても知られており、Genentech, Inc.からPULMOZYMEとして市販されている）である。一実施形態において、デオキシリボヌクレアーゼは、ウシ脾臓由来のデオキシリボヌクレアーゼＩＩ（Sigma D8764又は均等物）である。一実施形態において、デオキシリボヌクレアーゼは、ブタ脾臓由来のデオキシリボヌクレアーゼＩＩ（Sigma D4138又は均等物）である。一実施形態において、上述のデオキシリボヌクレアーゼのいずれも腫瘍消化物中に存在する。本発明での使用に適したデオキシリボヌクレアーゼの調製及び特性は、米国特許第５，７８３，４３３号；米国特許第６，３９１，６０７号；米国特許第７，４０７，７８５号；及び米国特許第７，２９７，５２６号並びに国際公開第２０１６／１０８２４４Ａ１号に記載されており、これらの各開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00152] 一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、コラーゲン中のペプチド結合の切断を触媒する、したがってコラーゲンを分解するあらゆる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含む。一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、コラゲナーゼを用いて腫瘍を消化する工程を含む。一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、コラゲナーゼ及び少なくとも１つの他の酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含む。一実施形態において、コラゲナーゼは、クロストリジウム・ヒストリチクム（Clostridium histolyticum）由来のコラゲナーゼである。一実施形態において、コラゲナーゼは、クロストリジオペプチダーゼＡである。一実施形態において、コラゲナーゼは、コラゲナーゼＩである。一実施形態において、コラゲナーゼは、コラゲナーゼＩＩである。一実施形態において、コラゲナーゼは、クロストリジウム・ヒストリチクム（Clostridium histolyticum）由来のコラゲナーゼ（Sigma C5138又は均等物）である。本発明での使用に適したコラゲナーゼの調製及び特性は、米国特許第３，２０１，３２５号；米国特許第３，７０５，０８３号；米国特許第３，８２１，３６４号；米国特許第５，１７７，０１７号；米国特許第５，４２２，２６１号；米国特許第５，９８９，８８８号；米国特許第９，２１１，３１６号に記載されており、これらの各開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00153] 一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、ヒアルロン酸の分解を触媒するあらゆる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含む。一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、ヒアルロニダーゼを用いて腫瘍を消化する工程を含む。一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、ヒアルロノグルコシダーゼ（hyaluronoglucosidase）を用いて腫瘍を消化する工程を含む。一実施形態において、ヒアルロニダーゼは、ウシ精巣由来のヒアルロニダーゼＩ型（Sigma H3506又は均等物）である。一実施形態において、ヒアルロニダーゼは、ヒツジ精巣由来のヒアルロニダーゼＩＩ型（Sigma H2126又は均等物）である。一実施形態において、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロニダーゼＩＩＩ型である。一実施形態において、ヒアルロニダーゼは、ウシ精巣由来のヒアルロニダーゼＩＶ型（ＩＶ－Ｓ型）（Sigma H3884又は均等物）である。一実施形態において、ヒアルロニダーゼは、ヒツジ精巣由来のヒアルロニダーゼＶ型（Sigma H6254又は均等物）である。一実施形態において、ヒアルロニダーゼは、ウシ精巣由来のヒアルロニダーゼＶＩＩＩ型（Sigma H3757又は均等物）である。一実施形態において、ヒアルロニダーゼは、組換えヒトヒアルロニダーゼ（Halozyme, Inc.からHYLENEXとして市販されている）である。本発明での使用に適したヒアルロニダーゼの調製及び特性は、米国特許第４，８２０，５１６号；米国特許第５，５９３，８７７号；米国特許第６，０５７，１１０号；米国特許第６，１２３，９３８号；米国特許第７，７６７，４２９号；米国特許第８，２０２，５１７号；米国特許第８，４３１，１２４号；及び米国特許第８，４３１，３８０号に記載されており、これらの各開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00154] 一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、デオキシリボヌクレアーゼ及びヒアルロニダーゼを用いて腫瘍を消化する工程を含む。一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、デオキシリボヌクレアーゼ及びコラゲナーゼを用いて腫瘍を消化する工程を含む。一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、ヒアルロニダーゼ及びコラゲナーゼを用いて腫瘍を消化する工程を含む。一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、デオキシリボヌクレアーゼ、ヒアルロニダーゼ及びコラゲナーゼを用いて腫瘍を消化する工程を含む。
[00155] 一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、デオキシリボヌクレアーゼ及びヒアルロニダーゼ並びに少なくとも１つの更なる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含む。一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、デオキシリボヌクレアーゼ及びコラゲナーゼ並びに少なくとも１つの更なる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含む。一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、ヒアルロニダーゼ及びコラゲナーゼ並びに少なくとも１つの更なる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含む。一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、デオキシリボヌクレアーゼ、ヒアルロニダーゼ及びコラゲナーゼ並びに少なくとも１つの更なる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含む。上述の実施形態のいずれにおいても、更なる酵素は、カゼイナーゼ、クロストリパイン、トリプシン及びそれらの組合せからなる群から選択される。
[00156] 一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、先に記載されるあらゆる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含み、且つ消化前、消化中又は消化後に腫瘍を機械的に崩壊させるか又はフラグメント化する工程をさらに含む。
[00157] 一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、先に記載されるあらゆる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含み、消化を、１５分、３０分、４５分、１時間、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間及び４８時間からなる群から選択される期間にわたって実行する。
[00158] 一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、先に記載されるあらゆる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含み、消化を、約１５分、約３０分、約４５分、約１時間、約９０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間及び約４８時間からなる群から選択される期間にわたって実行する。
[00159] 一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、先に記載されるあらゆる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含み、消化を、１５分未満、３０分未満、４５分未満、１時間未満、９０分未満、２時間未満、３時間未満、４時間未満、５時間未満、６時間未満、７時間未満、８時間未満、９時間未満、１０時間未満、１１時間未満、１２時間未満、１８時間未満、２４時間未満、３６時間未満及び４８時間未満からなる群から選択される期間にわたって実行する。
[00160] 一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、先に記載されるあらゆる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含み、消化を、１５分超、３０分超、４５分超、１時間超、９０分超、２時間超、３時間超、４時間超、５時間超、６時間超、７時間超、８時間超、９時間超、１０時間超、１１時間超、１２時間超、１８時間超、２４時間超、３６時間超及び４８時間超からなる群から選択される期間にわたって実行する。
[00161] 一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、先に記載されるあらゆる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含み、消化を、３０分～１時間、１時間～２時間、２時間～３時間、３時間～４時間、４時間～５時間、５時間～６時間、６時間～１２時間、１２時間～１８時間、１８時間～２４時間及び２４時間～４８時間からなる群から選択される期間にわたって実行する。
[00162] 一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、先に記載されるあらゆる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含み、消化を、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃及び約８０℃からなる群から選択される温度で実行する。
[00163] 一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、先に記載されるあらゆる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含み、消化を、２０℃～２５℃、２５℃～３０℃、３０℃～３５℃、３５℃～４０℃、４０℃～４５℃、４５℃～５０℃、５０℃～約５５℃、５５℃～６０℃、６０℃～６５℃、６５℃～７０℃、７０℃～７５℃及び７５℃～８０℃からなる群から選択される温度で実行する。
[00164] 一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、先に記載されるあらゆる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含み、（プレＲＥＰ後の）腫瘍レムナントが消化されれば、消化の時間及び温度がそれぞれ引き下げられる。一実施形態において、ｒＴＩＬを得る方法は、先に記載されるあらゆる酵素を用いて腫瘍を消化する工程を含み、（プレＲＥＰなしで）腫瘍フラグメント全体が消化されれば、消化の時間及び温度がそれぞれ増大する。
ｒＴＩＬ対ｅＴＩＬの比率を調節する方法
[00165] 一実施形態において、ｒＴＩＬのｅＴＩＬに対する濃度は、本明細書中に記載されるあらゆる増殖工程及び消化工程（プレＲＥＰを含む）の使用により、本明細書中に記載される癌の処置に用いられる治療ＴＩＬ生成物が所望のｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比を含有し得るように調節又は制御することができる。一実施形態において、本発明は、ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬの混合物からｅＴＩＬを除く方法を提供する。一実施形態において、本発明は、ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬの混合物からｒＴＩＬを除く方法を提供する。
[00166] 本発明の方法の一部の実施形態において、ｅＴＩＬ及び／又はｒＴＩＬは、最初の増殖工程前の培養体に第１の増殖工程（例えば、プレＲＥＰ）及び／又は第２の増殖工程（例えば、ＲＥＰ）で加えられ得る。本発明の方法の一部の実施形態において、ｅＴＩＬは、本明細書中に記載される培養工程又は増殖工程に従って１回、２回、３回又はそれを超える増殖を通して別々に培養されて、ｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの集団に選択されたｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比で加えられ得る。本発明の方法の一部の実施形態において、ｒＴＩＬは、本明細書中に記載される培養工程又は増殖工程に従って１回、２回、３回又はそれを超える増殖を通して別々に培養されて、ｅＴＩＬの集団に加えられて、ｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの混合物が、選択されたｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比で提供され得る。
[00167] 一実施形態において、本明細書中に記載される方法に従って調製されるｅＴＩＬは、ｒＴＩＬの集団に加えられて、結果として生じるｒＴＩＬ／ｅＴＩＬ混合物中で選択されたｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比を提供し得る。一実施形態において、本明細書中に記載される方法に従って調製されるｒＴＩＬは、ｅＴＩＬの集団に加えられて、結果として生じるｒＴＩＬ／ｅＴＩＬ混合物中で選択されたｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比を提供し得る。
[00168] 一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法を提供し、この処置は、治療的に有効な量のＴＩＬを患者に送達することを含み、ＴＩＬ中のｒＴＩＬのｅＴＩＬに対する比率（例えば、選択されるｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比）は、約０：１００、約１：９９、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約９９：１及び約１００：０のｒＴＩＬ対ｅＴＩＬからなる群から選択される。
[00169] 一実施形態において、ｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比は、選択方法を用いて調整され、これは、当業者により、必要に応じてｒＴＩＬ対ｅＴＩＬを高めるか又は引き下げるのに用いられ得る。一実施形態において、選択方法は、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４が挙げられる疲弊マーカーの不足に基づく。一実施形態において、選択方法は、ＣＤ６９発現の向上に基づく。一実施形態において、選択方法は、より上位のミトコンドリア質量に基づく。一実施形態において、選択方法は、細胞表面タンパク質のサブセットに基づく。一実施形態において、選択方法は、表現型に基づく。一実施形態において、選択方法は、機能に基づく。
[00170] 一実施形態において、ｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比は、ｒＴＩＬ及びｅＴＩＬを同じ細胞培地中で所望の比率が得られるまで共培養することによって調整される。一実施形態において、ｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比は、ｒＴＩＬ及びｅＴＩＬを同じ細胞培地中で所望の比率が得られるまで増殖中の様々な時点での細胞培地へのｒＴＩＬ又はｅＴＩＬの添加を含めて共培養することによって調整される。一実施形態において、ｒＴＩＬ増殖は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１が挙げられる、ＩＬ－２以外のサイトカインの添加によって細胞培地中で優先して増殖する。
[00171] 一実施形態において、本明細書中に記載される方法によって提供されるｒＴＩＬのｅＴＩＬに対する比率（例えば、選択されるｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比）は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は９９．９％のｒＴＩＬ対ｅＴＩＬであり得る。
[00172] 一実施形態において、本明細書中に記載される方法によって提供されるｒＴＩＬのｅＴＩＬに対する比率（例えば、選択されるｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比）は、最大で１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は９９．９％のｒＴＩＬ対ｅＴＩＬであり得る。
[00173] 一実施形態において、本明細書中に記載される方法によって提供されるｒＴＩＬのｅＴＩＬに対する比率（例えば、選択されるｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比）は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は９９．９％のｒＴＩＬ対ｅＴＩＬであり得る。
癌及び他の疾患を処置する方法
[00174] 本明細書中に記載されるｒＴＩＬ並びにｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの組合せは、ヒトにおいて疾患を処置する方法に用いられ得る。一実施形態において、これらは、高増殖性障害を処置するのに用いられる。一部の実施形態において、高増殖性障害は、癌である。一部の実施形態において、高増殖性障害は、固形腫瘍癌である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、黒色腫、二重不応性黒色腫（すなわち化学療法及びチェックポイント阻害薬を含む少なくとも２つの先行処置に不応性の黒色腫）、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウィルスによって引き起こされる癌、頭頚部癌、腎癌、腎細胞癌及び肉腫からなる群から選択される。一部の実施形態において、高増殖性障害は、血液悪性腫瘍（又は液性腫瘍癌）である。一部の実施形態において、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。本明細書中に記載されるｒＴＩＬ並びにｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの組合せは、本明細書中及び以下の段落で記載される他の障害を処置するのにも用いられ得る。
[00175] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、処置は、治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に送達することを含み、ｒＴＩＬは、
（ａ）患者から腫瘍組織を得る工程であって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、工程と、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化する工程と、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供する工程と、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除く工程と、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化する工程と、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、レムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）の数を増殖させる工程と
を含む方法に従って調製され、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む。
[00176] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者を高用量ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含む。
[00177] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することであって、治療的に有効な量のｅＴＩＬは、ｒＴＩＬとの混合物中で患者に同時投与される、投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者を高用量ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含む。
[00178] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することであって、治療的に有効な量のｅＴＩＬは、ｒＴＩＬとの混合物中で患者に同時投与される、投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者を高用量ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含み、
癌は、黒色腫、二重不応性黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、頭頚部癌、腎細胞癌、急性骨髄性白血病、結腸直腸癌、肉腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及びトリプルネガティブ乳癌からなる群から選択される。
[00179] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することであって、非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンは、２日間にわたって６０ｍｇ／ｍ２／日の用量でシクロホスファミドを投与し、それに続いて、５日間にわたって２５ｍｇ／ｍ２／日の用量でフルダラビンを投与する工程を含む、処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することであって、治療的に有効な量のｅＴＩＬは、ｒＴＩＬとの混合物中で患者に同時投与される、投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者を高用量ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含む。
[00180] 本明細書中に記載される方法の一部の実施形態において、少なくとも複数のｅＴＩＬを除く工程は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は１００％のｅＴＩＬを除くことを含む。
[00181] 示された疾患又は障害を処置、予防及び／又は管理する際の本明細書中に記載される化合物の有効性及び化合物の組合せは、当該技術分野において知られている種々のモデルを用いて試験され得、これらは、ヒト疾患の処置の指針を提供する。例えば、卵巣癌の処置の有効性を判定するモデルは、例えば、Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92；及びFong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12に記載されている。膵癌の処置の有効性を判定するモデルは、Herreros-Villanueva, et al, World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294に記載されている。乳癌の処置の有効性を判定するモデルは、例えば、Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212に記載されている。黒色腫の処置の有効性を判定するモデルは、例えば、Damsky, et al, Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859に記載されている。肺癌の処置の有効性を判定するモデルは、例えば、Meuwissen, et al, Genes & Development, 2005, 19, 643-664に記載されている。肺癌の処置の有効性を判定するモデルは、例えば、Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60；及びSano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32に記載されている。
ＩＬ－２の共投与
[00182] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法であって、
（ａ）本明細書中に記載される方法に従って、患者から切除した腫瘍からｒＴＩＬを得る工程と、
（ｂ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置する工程と、
（ｃ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与する工程と、
（ｄ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者をＩＬ－２レジメンで処置する工程と
を含む方法を提供する。
[00183] 一実施形態において、ＩＬ－２レジメンは、高用量ＩＬ－２レジメンを含み、高用量ＩＬ－２レジメンは、ＴＩＬの第３の集団の治療的に有効な部分を投与した翌日に開始して、静脈内投与されるアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含み、アルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体は、６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇ（患者体重）の用量において、最大１４用量について耐容能まで８時間毎に１５分のボーラス静注を用いて投与される。９日の休息日後、このスケジュールがさらに１４用量繰り返されて、合計で最大２８用量となり得る。
[00184] 一実施形態において、ＩＬ－２レジメンは、高用量ＩＬ－２レジメンを含み、高用量ＩＬ－２レジメンは、ＴＩＬの第３の集団の治療的に有効な部分を投与した翌日に開始して、静脈内投与されるアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含み、アルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体は、０．０３７ｍｇ／ｋｇ又は０．０４４ｍｇ／ｋｇ ＩＵ／ｋｇ（患者体重）の用量において、最大１４用量について耐容能まで８時間毎に１５分のボーラス静注を用いて投与される。９日の休息日後、このスケジュールがさらに１４用量繰り返されて、合計で最大２８用量となり得る。
[00185] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することであって、治療的に有効な量のｅＴＩＬは、ｒＴＩＬとの混合物中で患者に同時投与される、投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者を高用量ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含み、
高用量ＩＬ－２レジメンは、耐容能まで８時間毎に１５分のボーラス静注として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む。
[00186] 一実施形態において、ＩＬ－２レジメンは、漸減型ＩＬ－２レジメン（decrescendo IL-2 regimen）を含む。漸減型ＩＬ－２レジメンは、O’Day, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61及びEton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9に記載されており、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、漸減型ＩＬ－２レジメンは、６時間にわたって静脈内投与される１８×１０６ＩＵ／ｍ２、それに続く１２時間にわたって静脈内投与される１８×１０６ＩＵ／ｍ２、それに続く２４時間にわたって静脈内投与される１８×１０６ＩＵ／ｍ２、それに続く７２時間にわたって静脈内投与される４．５×１０６ＩＵ／ｍ２を含む。この処置サイクルは、２８日毎に繰り返されて、最大４サイクルとなり得る。一実施形態において、漸減型ＩＬ－２レジメンは、１日目の１８，０００，０００ＩＵ／ｍ２、２日目の９，０００，０００ＩＵ／ｍ２並びに３日目及び４日目の４，５００，０００ＩＵ／ｍ２を含む。
[00187] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することであって、治療的に有効な量のｅＴＩＬは、ｒＴＩＬとの混合物中で患者に同時投与される、投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者を漸減型ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含み、
漸減型ＩＬ－２レジメンは、６時間にわたって静脈内投与される１８×１０６ＩＵ／ｍ２、それに続く１２時間にわたって静脈内投与される１８×１０６ＩＵ／ｍ２、それに続く２４時間にわたって静脈内投与される１８×１０６ＩＵ／ｍ２、それに続く７２時間にわたって静脈内投与される４．５×１０６ＩＵ／ｍ２を含み、最大４サイクルが２８日毎に繰り返される。
[00188] 一実施形態において、ＩＬ－２レジメンは、ペグ化アルデスロイキンが挙げられるペグ化ＩＬ－２の投与を含む。一実施形態において、ＩＬ－２レジメンは、１、２、４、６、７、１４又は２１日毎の０．１０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の用量でのペグ化ＩＬ－２の投与を含む。
[00189] 一実施形態において、本発明は、癌の処置を、そのような処置を必要としている患者において行う方法を含み、方法は、
（ａ）患者から腫瘍組織を得ることであって、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、得ることと、
（ｂ）腫瘍組織をフラグメント化することと、
（ｃ）腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
（ｄ）少なくとも複数のｅＴＩＬを除くことと、
（ｅ）消化混合物を用いて、腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
（ｆ）腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することであって、
ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、
Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びそれらの組合せからなる群から選択され、
第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、提供することと、
（ｇ）患者にｒＴＩＬを投与する前に患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置することと、
（ｈ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に投与することであって、治療的に有効な量のｅＴＩＬは、ｒＴＩＬとの混合物中で患者に同時投与される、投与することと、
（ｉ）患者へのｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、患者をペグ化ＩＬ－２レジメンで処置することと
を含み、
ペグ化ＩＬ－２レジメンは、１、２、４、６、７、１４又は２１日毎の０．１０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の用量でのペグ化ＩＬ－２の投与を含む。
化学療法による非骨髄破壊リンパ球枯渇
[00190] 一実施形態において、本発明は、ｒＴＩＬの集団で癌を処置する方法を含み、患者は、本発明に従うｒＴＩＬの注入前に非骨髄破壊化学療法で前処置される。一部の実施形態において、ｒＴＩＬの集団は、ｅＴＩＬの集団と共に提供され得、患者は、本発明に従うｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの注入前に非骨髄破壊化学療法で前処置される。一実施形態において、非骨髄破壊化学療法は、２日間（ｒＴＩＬ注入よりも前の２７及び２６日目）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／ｄ及び５日間（ｒＴＩＬ注入よりも前の２７～２３日目）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／ｄである。一実施形態において、非骨髄破壊化学療法及び本発明に従うｒＴＩＬ注入（０日目）後、患者は、８時間毎に７２０，０００ＩＵ／ｋｇで静脈内にＩＬ－２の静注を生理学的耐容能まで受ける。
[00191] 実験に基づく発見は、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入よりも前のリンパ球枯渇が、免疫系の制御性Ｔ細胞及び競合要素（「サイトカインシンク」）を除外することにより、処置有効性の増強に重要な役割を果たしていることを示す。したがって、本発明の一部の実施形態は、本発明のｒＴＩＬの導入前にリンパ球枯渇工程（時折、「免疫抑制コンディショニング」とも呼ばれる）を患者に活用する。
[00192] 一般に、リンパ球枯渇は、フルダラビン又はシクロホスファミド（活性形態はマホスファミドと呼ばれる）及びそれらの組合せの投与を用いて達成される。そのような方法は、Gassner, et al, Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85、Muranski, et al, Nat. Clin. Pract. Oncol, 2006, 3, 668-681、Dudley, et al, J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239及びDudley, et al, J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357に記載されており、これらの全ては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[00193] 一部の実施形態において、フルダラビンは、０．５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのフルダラビン濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１μｇ／ｍＬのフルダラビン濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、１日、２日、３日、４日、５日、６日若しくは７日又はそれを超えて投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、３５ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日又は４５ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、２５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間投与される。
[00194] 一部の実施形態において、マホスファミド（シクロホスファミドの活性形態）は、シクロホスファミドの投与によって０．５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの濃度で得られる。一部の実施形態において、マホスファミド（シクロホスファミドの活性形態）は、シクロホスファミドの投与によって１μｇ／ｍＬの濃度で得られる。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、１日、２日、３日、４日、５日、６日若しくは７日又はそれを超えて投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、１００ｍｇ／ｍ２／日、１５０ｍｇ／ｍ２／日、１７５ｍｇ／ｍ２／日、２００ｍｇ／ｍ２／日、２２５ｍｇ／ｍ２／日、２５０ｍｇ／ｍ２／日、２７５ｍｇ／ｍ２／日又は３００ｍｇ／ｍ２／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、静脈内投与（ｉ．ｖ．）される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ２／日ｉ．ｖ．で４～５日間施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ２／日ｉ．ｖ．で４日間施される。
[00195] 一部の実施形態において、リンパ球枯渇は、フルダラビンを投与することによって実行され、及びシクロホスファミドは、患者に一緒に投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、２５ｍｇ／ｍ２／日ｉ．ｖ．で投与され、及びシクロホスファミドは、２５０ｍｇ／ｍ２／日ｉ．ｖ．で４日にわたって投与される。
[00196] 一実施形態において、リンパ球枯渇は、２日間にわたって６０ｍｇ／ｍ２／日の用量でシクロホスファミドを投与し、それに続いて、５日間にわたって２５ｍｇ／ｍ２／日の用量でフルダラビンを投与することによって実行される。
医薬組成物、投薬量及び投薬レジメン
[00197] 一実施形態において、本発明の方法を用いて増殖させたｒＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は、滅菌バッファ中のｒＴＩＬの懸濁液である。本発明の方法を用いて増殖させたｒＴＩＬは、当該技術分野において知られているあらゆる適切な経路によって投与され得る。好ましくは、ｒＴＩＬは、単一の動脈内注入剤又は静脈内注入剤として投与され、これらは、好ましくは、およそ３０～６０分続く。他の適切な投与経路として、腹腔内投与、髄腔内投与及びリンパ管内投与が挙げられる。
[00198] 一実施形態において、本発明の方法を用いて増殖させたｒＴＩＬ及びｅＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は、滅菌バッファ中のｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの懸濁液である。本発明の方法を用いて増殖させたｒＴＩＬ及びｅＴＩＬは、当該技術分野において知られているあらゆる適切な経路によって投与され得る。好ましくは、ｒＴＩＬ及びｅＴＩＬは、単一の動脈内注入剤又は静脈内注入剤として投与され、これらは、好ましくは、およそ３０～６０分続く。他の適切な投与経路として、腹腔内投与、髄腔内投与及びリンパ管内投与が挙げられる。
[00199] 適切なあらゆる用量のｒＴＩＬが投与され得る。好ましくは、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個のｒＴＩＬが投与され、特に癌が黒色腫である場合、平均およそ７．８×１０１０個のｒＴＩＬが投与される。一実施形態において、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０個のｒＴＩＬが投与される。
[00200] 適切なあらゆる用量のｒＴＩＬ及びｅＴＩＬが投与され得る。好ましくは、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０個のｒＴＩＬ及びｅＴＩＬが投与され、特に癌が黒色腫である場合、平均およそ７．８×１０１０個のｒＴＩＬ及びｅＴＩＬが投与される。一実施形態において、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０個のｒＴＩＬ及びｅＴＩＬが投与される。
[00201] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３及び８×１０１３、９×１０１３個である。一実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬの数は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２及び５×１０１２～１×１０１３個の範囲内である。
[00202] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３及び９×１０１３個である。一実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの数は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２及び５×１０１２～１×１０１３個の範囲内である。
[00203] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬの濃度は、例えば、医薬組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖ未満である。
[00204] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの濃度は、例えば、医薬組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖ未満である。
[00205] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬの濃度は、医薬組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％、１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％、１８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖ超である。
[00206] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの濃度は、医薬組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％、１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％、１８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖ超である。
[00207] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．０００１％～約５０％、約０．００１％～約４０％、約０．０１％～約３０％、約０．０２％～約２９％、約０．０３％～約２８％、約０．０４％～約２７％、約０．０５％～約２６％、約０．０６％～約２５％、約０．０７％～約２４％、約０．０８％～約２３％、約０．０９％～約２２％、約０．１％～約２１％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約１９％、約０．４％～約１８％、約０．５％～約１７％、約０．６％～約１６％、約０．７％～約１５％、約０．８％～約１４％、約０．９％～約１２％又は約１％～約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
[00208] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．０００１％～約５０％、約０．００１％～約４０％、約０．０１％～約３０％、約０．０２％～約２９％、約０．０３％～約２８％、約０．０４％～約２７％、約０．０５％～約２６％、約０．０６％～約２５％、約０．０７％～約２４％、約０．０８％～約２３％、約０．０９％～約２２％、約０．１％～約２１％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約１９％、約０．４％～約１８％、約０．５％～約１７％、約０．６％～約１６％、約０．７％～約１５％、約０．８％～約１４％、約０．９％～約１２％又は約１％～約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
[00209] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．００１％～約１０％、約０．０１％～約５％、約０．０２％～約４．５％、約０．０３％～約４％、約０．０４％～約３．５％、約０．０５％～約３％、約０．０６％～約２．５％、約０．０７％～約２％、約０．０８％～約１．５％、約０．０９％～約１％、約０．１％～約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
[00210] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．００１％～約１０％、約０．０１％～約５％、約０．０２％～約４．５％、約０．０３％～約４％、約０．０４％～約３．５％、約０．０５％～約３％、約０．０６％～約２．５％、約０．０７％～約２％、約０．０８％～約１．５％、約０．０９％～約１％、約０．１％～約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
[00211] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ又は０．０００１ｇ以下である。
[00212] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ又は０．０００１ｇ以下である。
[00213] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５ｇ、３ｇ、３．５ｇ、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ又は１０ｇ超である。
[00214] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５ｇ、３ｇ、３．５ｇ、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ又は１０ｇ超である。
[00215] 本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬは、広い投薬量範囲にわたって有効である。正確な投薬量は、投与経路、化合物が投与される形態、処置されることとなる対象の性別及び年齢、処置されることとなる対象の体重並びに主治医の選択及び経験によって決まることとなる。適切な場合、ｒＴＩＬの臨床的に確立された投薬量が用いられ得る。本明細書中の方法を用いて投与される医薬組成物の量、例えばｒＴＩＬの投薬量は、処置されることとなるヒト又は哺乳類、障害又は容体の重症度、投与速度、有効医薬成分の体内動態及び処置医師の裁量に依存することとなる。
[00216] 本発明の医薬組成物中に提供されるｒＴＩＬ及びｅＴＩＬは、広い投薬量範囲にわたって有効である。正確な投薬量は、投与経路、化合物が投与される形態、処置されることとなる対象の性別及び年齢、処置されることとなる対象の体重並びに主治医の選択及び経験によって決まることとなる。適切な場合、ｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの臨床的に確立された投薬量が用いられ得る。本明細書中の方法を用いて投与される医薬組成物の量、例えばｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの投薬量は、処置されることとなるヒト又は哺乳類、障害又は容体の重症度、投与速度、有効医薬成分の体内動態及び処置医師の裁量に依存することとなる。
[00217] 一部の実施形態において、ｒＴＩＬは、単回用量で投与され得る。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、ｒＴＩＬは、複数回用量で投与され得る。投薬は、１年あたり１回、２回、３回、４回、５回、６回又は６回超であり得る。投薬は、１ヶ月に１回、二週間毎に１回、週に１回又は１日おきに１回であり得る。必須である限り、ｒＴＩＬの投与が続き得る。
[00218] 一部の実施形態において、ｒＴＩＬ及びｅＴＩＬは、単回用量で投与され得る。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、ｒＴＩＬは、複数回用量で投与され得る。投薬は、１年あたり１回、２回、３回、４回、５回、６回又は６回超であり得る。投薬は、一ヶ月に１回、二週間毎に１回、週に１回又は１日おきに１回であり得る。必須である限り、ｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの投与が続き得る。
[00219] 一部の実施形態において、ｒＴＩＬの有効な投薬量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３及び８×１０１３、９×１０１３個である。一部の実施形態において、ｒＴＩＬの有効な投薬量は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２及び５×１０１２～１×１０１３個の範囲内である。
[00220] 一部の実施形態において、ｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの有効な投薬量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、９×１０１３個である。一部の実施形態において、ｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの有効な投薬量は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×ｌ０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２、５×１０１２～１×１０１３個の範囲内である。
[00221] 一部の実施形態において、ｒＴＩＬの有効な投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ～約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ～約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ～約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ～約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ～約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ又は約２．８５ｍｇ／ｋｇ～約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
[00222] 一部の実施形態において、ｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの有効な投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ～約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ～約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ～約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ～約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ～約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ又は約２．８５ｍｇ／ｋｇ～約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
[00223] 一部の実施形態において、ｒＴＩＬの有効な投薬量は、約１ｍｇ～約５００ｍｇ、約１０ｍｇ～約３００ｍｇ、約２０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５ｍｇ～約４５ｍｇ、約１０ｍｇ～約４０ｍｇ、約１５ｍｇ～約３５ｍｇ、約２０ｍｇ～約３０ｍｇ、約２３ｍｇ～約２８ｍｇ、約５０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ～約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ～約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ～約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ～約１１０ｍｇ、約９５ｍｇ～約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ～約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ～約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ～約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ～約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ～約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ～約２０５ｍｇ又は約１９８～約２０７ｍｇの範囲内である。
[00224] 一部の実施形態において、ｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの有効な投薬量は、約１ｍｇ～約５００ｍｇ、約１０ｍｇ～約３００ｍｇ、約２０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５ｍｇ～約４５ｍｇ、約１０ｍｇ～約４０ｍｇ、約１５ｍｇ～約３５ｍｇ、約２０ｍｇ～約３０ｍｇ、約２３ｍｇ～約２８ｍｇ、約５０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ～約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ～約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ～約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ～約１１０ｍｇ又は約９５ｍｇ～約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ～約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ～約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ～約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ～約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ～約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ～約２０５ｍｇ又は約１９８～約２０７ｍｇの範囲内である。
[00225] 有効な量のｒＴＩＬ及び／又はｅＴＩＬは、単回用量又は複数回用量において、ユーティリティが類似する剤の受け入れられるあらゆる投与様式によって投与され得、血流中への注入、腫瘍中への注入、動脈内、静脈内、腹膜内、非経口、筋肉内、皮下、局所注射、鼻腔内投与、移植又は吸入によるものが挙げられる。
実施例
[00226] 本明細書中に包含される実施形態は、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は、説明の目的でのみ記載され、本明細書中に包含される開示は、決してこれらの実施例に限定されるものとして解釈されるべきでなく、むしろ本明細書中に記載される教示の結果として明らかとなるあらゆる全ての変形形態を包含すると解釈されるべきである。
実施例１ － 腫瘍消化物からのｒＴＩＬの増殖
[00227] 腫瘍レムナントを以下の例示的な手順に従って消化した。この手順は、腫瘍浸潤リンパ球を得て単離するための、単細胞懸濁液へのフレッシュなヒト腫瘍サンプルの生存可能な消化を記載しており、ヒト腫瘍を分離するのにＤＮａｓｅ－コラゲナーゼ－ヒアルロニダーゼ（ＤＣＨ）法（本明細書中に記載する）を用いることができ、又はMACSヒト腫瘍分離キット（ＴＤＫ）（Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA）消化プロトコルを用いることができる。
[00228] ＣＭ１＋ＩＬ－２ワーキング培地の調製は、以下の通りである。５００ｍＬ RPMI 1640、２００ｍＭ Ｌ－グルタミン及び１００ｍＬヒトＡＢ血清を３７℃のウォータバス内に入れて、少なくとも３０分間平衡化する。この混合物の内容物をウォータバスからバイオセーフティキャビネットに、冷蔵庫からの１０００×β－ＭＬストック溶液及び５０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンストック溶液と共に移す。RPMI 1640から５０ｍＬを除いて、５０ｍＬヒトＡＢ血清、５ｍＬ ２００ｍＭ Ｌ－グルタミン、５００μＬ １０００×β－ＭＬ及び５００μＬ ５０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを加える。完全培地１に５００μＬの６０００Ｕ／ｍＬ再構成ヒトｒｈＩＬ－２（CellGenix, Inc., Portsmouth, ML USA）を加える。
[00229] １０×ＤＣＨストック溶液を以下の手順を用いて調製する。これは、図１に示されている。最初に、所望のワーキング溶液濃度を得るように各酵素を再構成するのに必要とされる容量を算出する。例えば、１５０，０００Ｕ（国際単位）のデオキシリボヌクレアーゼを１５ｍＬ中に再構成して、１０，０００Ｕ／ｍＬのワーキング溶液を得る。残りのワーキング溶液を等分する。凍結乾燥された酵素を、上で予め算出した量の滅菌ハンクス平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ、Sigma H6648, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA又は均等物）中で室温において再構成する。ボトルの側部及び保護ホイルからいかなる残留粉末も取り外す。ピペットで数回出し入れしてかき回して、完全な再構成を確実にする。１００，０００ＵのＤＮａｓｅ（ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼＩ、Sigma D5025又は均等物）、１ｇのコラゲナーゼ（クロストリジウム・ヒストリチクム（Clostridium histolyticum）由来のSigma C5138又は均等物）及び１００ｍｇのヒアルロニダーゼ（ヒツジ精巣由来のＶ型、Sigma H6254又は均等物）を加えて、１００ｍＬ滅菌ＨＢＳＳの最終容量にしてヒト腫瘍のための１０×三重酵素消化ストック溶液を得る。残りの酵素ワーキング溶液を１０，０００Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ、１０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ及び１ｍｇ／ｍＬヒアルロニダーゼに等分する。１００ｍＬの最終容量において、１０×ＤＣＨストック溶液は、以下の濃度を有する：ＤＮａｓｅ Ｉ １０００Ｕ／ｍＬ、コラゲナーゼ１０ｍｇ／ｍＬ及びヒアルロニダーゼ１ｍｇ／ｍＬ。１０×ＤＣＨストック溶液を腫瘍消化のためにＨＢＳＳ中１×ＤＣＨに希釈する。
[00230] 同時に、MACSのＴＤＫとのＤＣＨ消化の比較のために、MACSのＴＤＫ中に含まれる試薬を必要に応じてメーカーの規格に調製する。－２０℃で貯蔵してきたアリコートを室温で解凍する。
[00231] 腫瘍を以下のように消化のために調製することができる。腫瘍をその一次パッケージング及び二次パッケージングから取り出して、バイアルを秤量して質量を記録して、バイオセーフティキャビネットに移す。腫瘍をフラグメントにカットし、又は腫瘍を細切除する。いくつかのフラグメントを選択し、消化プロトコルに用いて必要に応じて追加のフラグメントを組織学及びＤＮＡ抽出のために保持する。
[00232] 例示的なＤＣＨベースの腫瘍消化手順を図２に示しており、これは、以下の工程を含む。１０×ＤＣＨストック溶液を消化のために１×ワーキング濃度に希釈しなければならない。腫瘍の消化に必要とされる総容量を算出する。これは、腫瘍の１ｃｍ２あたり約５ｍＬの溶液である。１部のＤＣＨを９部のＨＢＳＳに加えることにより、ＤＣＨワーキング溶液を１×に希釈する。腫瘍フラグメントを５０ｍＬ Falconコニカルチューブに、上で算出したＨＢＳＳの容量で移す。上で算出した１０×ＤＣＨの量を加えて、チューブをキャップし、任意選択的にシールする。３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベータ内における、１～２時間一定に回転するMACSチューブローテータ（Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA）に移す。これ以外にも、腫瘍フラグメントを室温で一晩、ここでも一定に回転させて消化することができる。０．７０μｍのストレーナを滅菌Falconコニカルチューブに取り付ける。インキュベータからピペットを用いて消化物を得て、消化物の全ての内容物をストレーナに加える。滅菌シリンジプランジャの端部（butt）を用いて、あらゆる固形物をストレーナに押し通す。ＤＣＨ消化ｒＴＩＬを含有するチューブをキャップする。本明細書中の他の箇所に記載するように細胞を洗浄して、消化物カクテルを除いてカウントし、ＲＥＰ増殖のための培地中に再懸濁させることができる。
[00233] プレＲＥＰ工程が、（以下の実施例のように）ｒＴＩＬとの比較のためにｅＴＩＬを提供するために所望される場合、プレＲＥＰのために、ＤＣＨ消化したｒＴＩＬを用いてG-REXフラスコに播種する。必須の数のG-REX 10フラスコにラベル付けして、消化物を加える。４０ｍＬの最終容量を得るようにＣＭ１＋ＩＬ－２を加える。３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベータ内にフラスコを入れる。細胞のカウント及び生存度を、４０μＬのサンプルを４０μＬのアクリジンオレンジ及びヨウ化プロピジウムデュアル染色溶液（ＡＯＰＩ）に用いるNexcelom Cellometer K2を用いて実行して、必要に応じて希釈して、各消化物又は各状態について２反復でカウントすることができる。凝集を回避するためにサンプルを十分混合して、ＡＯＰＩを、各サンプルをランさせる前に速やかにピペッティングして、生存度がヨウ化プロピジウムの細胞毒性作用によって不明瞭にされないことを確実にする。
[00234] 上に記載したＤＣＨ手順は、驚くべきことに、いくつかの理由のため、MACSのＴＤＫの酵素による消化混合物及び手順よりも優れていることが見出された。MACSのＴＤＫ混合物を用いた３つの独立した実験を実行した。第１の実験を、黒色腫腫瘍を用いて実行し、そこではｒＴＩＬ中でのＣＤ４＋／ＣＤ８＋集団の大きい下方制御が、MACS系を用いたフローサイトメトリによって観察された。そのような作用は、ＤＣＨ消化ｒＴＩＬにおいて観察されなかった。これは、MACS消化手順が表面マーカーの発現に悪影響を及ぼし得ることを示す。第２の実験において、エストロゲン受容体－陽性（ＥＲ＋）／プロゲステロン受容体－陽性（ＰＲ＋）乳房腫瘍を用い、及びMACS消化物は、２４－ウェルG-REXプレート内に残渣を出現させたが、ＤＣＨ消化物は、クリアな物質を生じさせた。これは、MACS酵素カクテルについて消化が不十分であったことを示す。最後に、MACSのＴＤＫの酵素による消化混合物及び手順を用いた異なるＥＲ＋／ＰＲ＋乳房腫瘍の第２の消化は、ｒＴＩＬの産出高及び生存度の両方を不十分とした。
実施例２ － 腫瘍消化物由来のｒＴＩＬの表現型の特性評価
[00235] プレＲＥＰ中、腫瘍内在ＴＩＬは、ｅＴＩＬとして遊走し且つ増殖する。ｒＴＩＬとの比較のためにｅＴＩＬを調製するのに用いたプレＲＥＰの長さを１１～２１日で細胞増殖に応じて変え得る。残留腫瘍フラグメント（レムナント）を通常破棄して、増殖したｅＴＩＬを、照射されたＰＢＭＣフィーダ、抗ＣＤ３及びＩＬ－２によるＲＥＰにかける。プレＲＥＰ後に腫瘍レムナント（ｒＴＩＬ）内に残っている生存可能なＴＩＬを、先に記載した実施例１に従う消化後に調査して、それらの機能及び表現型をｅＴＩＬとの比較において評価した。
[00236] 黒色腫、頭頚部、乳房、腎臓、膵臓、肺及び結腸直腸の腫瘍における腫瘍レムナント及びプレＲＥＰ懸濁液由来の細胞集団（すなわち増殖した細胞集団）（ｎ＝１７）を評価して比較した。興味深いことに、ｒＴＩＬは、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＰＤ－１、ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２７、ＣＤ５６、ＣＤ５７及びＨＬＡ－ＤＲが挙げられる種々のマーカーの差次的発現によって本明細書中で判定され、且つ示されるように、ｅＴＩＬと一貫して表現型的に異なる。腫瘍レムナント集団及びプレＲＥＰ集団のＲＥＰは、匹敵する増殖をもたらしたが、プレＲＥＰの結果と類似しており、表現型シグネチャは、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ２８に関して２つの集団間で様々であった。
[00237] 黒色腫、乳房、腎臓、膵臓、肺及び結腸直腸の腫瘍から得たｒＴＩＬ及びｅＴＩＬ（ｎ＝９）を評価して比較した。腫瘍ｒＴＩＬは、種々のマーカーの差次的発現によって判定されるように、ｅＴＩＬと一貫して表現型的に異なる（表３及び図３）。
Figure 2022167931000003
[00238] ｒＴＩＬのｅＴＩＬと比較した際の基本的な差異は、ＣＤ６９発現の増大（ＣＤ４＋において７倍の中央値蛍光強度（ＭＦＩ））（ｐ＜．０００１）、ＬＡＧ３発現の減弱（ＣＤ８＋Ｔ細胞において２倍のＭＦＩ）（ｐ＜０．０５）及びＴＩＭ３発現の減弱（ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞においてそれぞれ３倍及び２倍のＭＦＩ）（ｐ＜０．０５／０．０１）、ＣＤ１５４発現の減弱（ＣＤ４＋Ｔ細胞において３倍のＭＦＩ）（ｐ＜０．０１）並びにＣＤ５６発現の減弱（５％）（ｐ＜０．０５）であった。驚くべきことに、ｒＴＩＬ及びｅＴＩＬのＲＥＰは、実施例４に記載するｐｒｅ－ＲＥＰの結果と類似した匹敵する増殖をもたらした。ｒＴＩＬの表現型シグネチャは、フィデリティのあるＲＥＰ後に持続し、実施例４に記載するＬＡＧ３、ＴＩＭ３及びＣＤ２８の個々のレベルまで発現した。さらに、ＣＤ５７は、最終分化と関連する受容体であるため、結果は、ｒＴＩＬがｅＴＩＬよりも最終的に分化されない（すなわち死にそうにない）ことを示唆している。
[00239] 図３及び表３において報告した結果は、ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬが種々の腫瘍組織学における表現型発現において明白であるが一貫した差異を示すことを示す。最も顕著には、ｒＴＩＬにおいて、いわゆる「疲弊マーカー」（ＬＡＧ３及びＴＩＭ３）の発現の低下があった。興味深いことに、ＰＤ－１は、ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬにおいて同様に発現された。加えて、ｅＴＩＬと比較してｒＴＩＬにおけるＣＤ６９発現の増強があったが、それでも、ＫＬＲＧ１は、２つの集団間で類似した（データ示さず）。これは、ｒＴＩＬが最終的に分化されると思われないが、組織内在エフェクタ記憶Ｔ細胞に表現型的に類似しているという証拠をさらに提供する。
[00240] まとめて、これらの結果は、腫瘍内に残存し、又は腫瘍から増殖且つ進行する細胞集団の生物学の有意な差異並びに遊走及び保持と関連するシグナルを特定した。
実施例３ － 腫瘍消化物由来のｒＴＩＬの機能的特性評価
[00241] Ｔ細胞機能不全は、ミトコンドリア機能の喪失と直接関連する。Sharping, et al., Immunity 2016, 45, 374-88。さらに、ミトコンドリアバイオジェネシスを支持するようなＴ細胞の再プログラミングは、腫瘍内Ｔ細胞の持続性及び機能を増大させ得る。したがって、代謝的により活性なＴ細胞は、腫瘍に対する有効な免疫応答のマウンティングに重要である。ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬを機能的に評価する取り組みにおいて、ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬを、代謝能に関してMitotracker及び２－（Ｎ－（７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース（２－ＮＢＤＧ）を介して比較した。２－ＮＢＤＧを用いてグルコース吸収を測定することができるが、一次代謝プロセス、すなわちミトコンドリア内の完全な酸化又は糖分解のみ及びラクタートの生成は特定しない。Mitotracker色素（ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA）を用いてミトコンドリア質量を測定することができる。このアプローチによるｅＴＩＬ及びｒＴＩＬの比較は、図４に示すように、ｒＴＩＬにおけるグルコースアップデートの増強を実証した。この結果は、驚くべきものである。なぜなら、腫瘍から直接解放されるｒＴＩＬは、より解糖されると予想されるからである。しかしながら、ｒＴＩＬ中のミトコンドリア質量を評価した場合、ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬと比較して僅かに増強されたMitotrackerレベルを示した。これらの結果は、より活性がないと予想される場合、ｒＴＩＬがｅＴＩＬよりも代謝的に活性であったことを実証しており、及びｒＴＩＬがｅＴＩＬよりも腫瘍に対する免疫応答量を多くするより大きい能力を有し得ることを示唆している。
[00242] 機能的能力をさらに評価するために、ｒＴＩＬを、ブレフェルディンＡ並びに抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ１３７の抗体でコーティングしたビード（DYNABEADS、カタログ番号１１１６２Ｄ、ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USAから市販されている）で一晩刺激してＩＦＮ－γを測定した。細胞を収穫して、透過化処理後にＩＦＮ－γについて細胞内染色してフローサイトメトリによって評価した。結果を図５に示す。
[00243] また、細胞を１３－酢酸１２－ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）及びイオノマイシンで刺激して、サイトカインを産生するＴＩＬの能力を評価した。結果をまた図５に示す。また、グランザイムＢ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１７Ａのレベルを評価した。僅かなＩＬ－１７Ａのみが存在し、及びＴＮＦα又はグランザイムＢではｒＴＩＬとｅＴＩＬ間に差異はなかった（データ示さず）。驚くべきことに、ｅＴＩＬと比較してｒＴＩＬにおいて、ＣＤ４＋サブセット中（ＣＤ８＋Ｔ細胞中でない）の僅かに上昇したＩＦＮ－γレベルが抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８／抗ＣＤ１３７ビード及びＰＭＡ／イオノマイシン条件で観察された（ｎ＝３）。このデータは、ｒＴＩＬが機能的にコンピテントな細胞であり、及びｅＴＩＬよりも大きい機能的コンピテンスの証拠を示すことを示唆している。
実施例４ － 腫瘍消化物由来のｒＴＩＬ及びｅＴＩＬのＲＥＰの比較
[00244] ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬを、照射されたＰＢＭＣフィーダ、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）及びＩＬ－２による迅速な増殖プロトコル（ＲＥＰ）に１４日間かけた。生存度及び細胞数を３つの独立した腫瘍（ｎ＝３）において２反復で評価した。表現型の発現をフローサイトメトリによって評価した。ミニＲＥＰ実験の開始の成功をｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの両方について観察した。抗ＣＤ３抗体及びフィーダによるＴＩＬのＲＥＰ性能は、類似していたが、ｒＴＩＬは、驚くべきことに、ｅＴＩＬと比較して僅かに増強された細胞数を示した（ｐ＜０．０８）（図６Ａ）。ＲＥＰ前に観察されたように（実施例２を参照されたい）、ＲＥＰ後に得られたｅＴＩＬ及びｒＴＩＬは、表現型的に異なっていた。プレＲＥＰにおいて観察された多くの表現型差異は、ＲＥＰ中に保存され、例えばｒＴＩＬにおけるＬＡＧ３及びＴＩＭ３の発現の低下があった（図６Ｂ）。
[00245] ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬの追加特性を、（１）ディープＴＣＲシーケンシング、（２）共培養増殖（サイトカイン混合物によるｒＴＩＬ／ｅＴＩＬ共培養）及び更なる機能アッセイ、（３）転写プロファイリングについてのアッセイ（例えば、NanoString TechnologiesのNCOUNTER系を用いる）の結果に基づいて比較することができる。ＴＣＲシーケンシングは、Ｖｂレパートリが挙げられるＴＣＲレパートリのクローン性及び／又は多様性を評価することができる。また、テロメア長を評価して、ｒＴＩＬをｅＴＩＬと比較することができる。
実施例５ － ｒＴＩＬ並びにｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの組合せによるヒト疾患の処置
[00246] 本明細書中に記載するように、本発明のｒＴＩＬを癌の処置に用いることができる。患者の腫瘍由来のｒＴＩＬの増殖及び患者の処置についての全体的なプロセスフロー図を図７に示す。プロセスは、示すように、患者に注入されるＴＩＬ生成物中でのｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比の調整を可能にする。ｒＴＩＬのｅＴＩＬに対する比率は、ｒＴＩＬ及びｅＴＩＬ中でのＣＤ６９及び／又はＴ－細胞包括マーカーの差次的発現に基づく、当業者によって知られている親和性アッセイ又は他の細胞ソーティングアッセイによって選択することができる。
[00247] 図８に、ｒＴＩＬを患者の腫瘍から得て、ｒＴＩＬを、プレＲＥＰ後にＲＥＰステージを用いて腫瘍レムナントから増殖させて、リンパ球枯渇を実行して、ｒＴＩＬを患者に注入する例示的なプロセスを示すタイムラインを平行するｅＴＩＬプロセスと共に示す。
実施例６ － ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬにおいてＶβレパートリを評価する研究
[00248] ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬを多様性及び頻度に関してＶβＴ細胞受容体レパートリの差異について評価した。
[00249] 本研究において、６つのプレＲＥＰ ｅＴＩＬ／ｒＴＩＬ対を以下の組織構造から収穫した：卵巣癌；腎癌（ｎ＝２）；及び乳癌（ＴＮＢＣ ｎ＝２、ＥＲ＋ＰＲ＋ｎ＝ｌ）。ＲＮＡ抽出及びＶβシーケンシングのためにドライアイス上の細胞ペレットをiRepertoire（Huntsville, AL, USA）に出荷した。
[00250] 本研究の結果を図９、図１０及び図１４～図１６に示す。特に、図９及び図１０は、それぞれ多様性スコア及び共有ＣＤＲ３の％を示す。さらに、上位５０の共有ＣＤＲ３を示す３つのクローン型グラフを卵巣癌、腎癌及びトリプルネガティブ乳癌についてそれぞれ図１４、図１５及び図１６に示す。
[00251] 驚くべきことに、ＴＣＲｖβレパートリの多様性は、ｅＴＩＬにおけるよりもｒＴＩＬにおいて大きい（図９）。ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬにおける総ＣＤＲ３のおよそ３０～５０％が共有され（図１０）、これは、総ＣＤＲ３の高いパーセンテージが２つの集団において異なって発現されることを実証している。しかしながら、共有ＣＤＲ３のうち、上位５０のクローンは、ほとんどの場合、２つの集団間で共有された。これは、ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬが、抗原特異性が類似するクローンを有することを示唆している（図１４～図１６を参照されたい）。さらに、上位５０のクローンの頻度は変動した。これは、ここでも、ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬが驚くべきことに異なるＴ細胞集団であることを示唆している。
実施例７ － 共培養増殖アッセイの研究
[00252] 共培養の直後にｒＴＩＬがｅＴＩＬの増殖状態を変更することができるか（又はその逆）を判定するのにｅＴＩＬ及びｒＴＩＬを評価した。
[00253] 本研究において、５つのプレＲＥＰ ｅＴＩＬ／ｒＴＩＬ対を以下の組織構造から収穫した：腎癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、黒色腫、肺癌及び結腸直腸癌。３７℃で６０分の酵素による消化によってｒＴＩＬを腫瘍レムナントから単離した。ｅＴＩＬをCell Trace Yellowで着色し、且つｒＴＩＬをCell Trace Redで着色して、２つの異なる集団を独立して追跡した。ｅＴＩＬの１ｅ６、５ｅ５ ｅＴＩＬ＋５ｅ５ ｒＴＩＬ及び１ｅ６ ｒＴＩＬをＩＬ－２＋／－及びＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）と３７℃で４日間培養して、増殖についてフローサイトメトリによって評価した。
[00254] 本研究の結果を図１１に示す。図１１において、５つ全ての腫瘍におけるＣＤ４＋集団又はＣＤ８＋集団由来のｅＴＩＬが、抗ＣＤ３抗体によるｒＴＩＬとの共培養の直後に、ｅＴＩＬのみと比較した場合、Cell Trace色素の推移（又は色素の希釈）によって実証される増殖能力の増強を実証した。ｒＴＩＬと共培養した場合、赤色は、ｅＴＩＬを表し、青色は、ｅＴＩＬを表す。
実施例８ － 共培養増殖アッセイの研究
[00255] ｒＴＩＬ及びｅＴＩＬの遺伝子発現プロファイルの類似性及び／又は差異を識別するためにｅＴＩＬ及びｒＴＩＬを評価した。
[00256] 本研究において、Nanostring’s nCounter技術を利用した。これは、ｍＲＮＡに対して多重化されたカラーコード化バーコードを使用して、遺伝子発現のデジタル読取りを供給するものである。６つのマッチしたｅＴＩＬサンプル及びｒＴＩＬサンプルから精製したＲＮＡ（RNeasy, Qiagen）をnCounter Immunology V2パネルコードセットとサーモサイクラー上で１６時間ハイブリダイズさせた。コードセットは、サーモサイクリング中の２２ｂｐの相互作用により標的ＲＮＡと多重化される捕捉プローブ及びリポータプローブの混合物からなる。サンプルを１２ウェルSPRINTカートリッジ中にロードして、nCounter SPRINT装置上でランさせた。カウントデータをカスタムＲＣＣフォーマットでエクスポートして、ＲＬＦファイルにマッチさせ、これが遺伝子名をプローブＩＤにマッチさせる。標準化及び分析をnSolver 3.0（NanoString Technologies, Inc.）で行った。
[00257] 本研究の結果を図１２及び図１３に示す。図１２及び図１３に示すように、遺伝子発現プロファイルは、ｅＴＩＬ及びｒＴＩＬを比較した場合、大きく異なる（図１２におけるヒートマップを参照されたい）。いくつかの遺伝子がｅＴＩＬと比較してｒＴＩＬにおいて大きく上方制御又は下方制御されている（図１３）。

Claims (30)

  1. 養子Ｔ細胞治療のためのレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を調製する方法であって、
    （ａ）患者から腫瘍組織を得ることと、ここで、前記腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、
    （ｂ）前記腫瘍組織をフラグメント化することと、
    （ｃ）前記腫瘍組織を、第１の細胞培地及びインターロイキン２（ＩＬ－２）入りの気体透過性コンテナ内で処理して、腫瘍レムナント及び新生のＴＩＬ（ｅＴＩＬ）を提供することと、
    （ｄ）少なくとも複数の前記ｅＴＩＬを除くことと、
    （ｅ）消化混合物を用いて、前記腫瘍レムナントを腫瘍レムナント細胞に酵素で消化することと、
    （ｆ）前記腫瘍レムナント細胞を、気体透過性コンテナ内において、細胞培地、照射されたフィーダ細胞、ＯＫＴ－３抗体及びＩＬ－２を含む第２の細胞培地で増殖させて、増殖した数のレムナント腫瘍浸潤リンパ球（ｒＴＩＬ）を提供することと
    を含み、
    前記ｒＴＩＬは、前記ｅＴＩＬに対して低下したレベルのＴ細胞疲弊マーカーを発現し、前記Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４及びそれらの組合せからなる群から選択される、方法。
  2. 前記腫瘍組織は、黒色腫腫瘍組織、頭頚部腫瘍組織、乳房腫瘍組織、腎臓腫瘍組織、膵臓腫瘍組織、膠芽腫腫瘍組織、肺腫瘍組織、結腸直腸腫瘍組織、肉腫腫瘍組織、トリプルネガティブ乳房腫瘍組織、子宮頸部腫瘍組織、卵巣腫瘍組織及び急性骨髄性白血病の骨髄又は腫瘍組織からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記照射されたフィーダ細胞は、照射された同種末梢血単核細胞を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. ＩＬ－２は、約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で前記第２の細胞培地中に存在し、及びＯＫＴ－３抗体は、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で前記第２の細胞培地中に存在する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ｒＴＩＬ中のＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞における少なくとも１つのＴ細胞疲弊マーカーは、前記ｅＴＩＬに対して少なくとも１０％だけ低下する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＬＡＧ３マーカーであり、前記ｒＴＩＬにおける前記ＬＡＧ３マーカーは、前記ｅＴＩＬに対して少なくとも２倍だけ低下する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＩＭ３マーカーであり、前記ｒＴＩＬにおける前記ＬＡＧ３マーカーは、前記ｅＴＩＬに対して少なくとも３倍だけ低下する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記Ｔ細胞疲弊マーカーは、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴＩＭ３マーカーであり、前記ｒＴＩＬにおける前記ＬＡＧ３マーカーは、前記ｅＴＩＬに対して少なくとも２倍だけ低下する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ｒＴＩＬにおける前記ＴＩＭ３マーカー及び前記ＬＡＧ３マーカーは、フローサイトメトリによって検出不可能である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記ｒＴＩＬにおけるＣＤ５６＋発現は、前記ｅＴＩＬにおけるＣＤ５６＋発現に対して少なくとも３倍だけ低下する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ｒＴＩＬにおけるＣＤ６９＋発現は、前記ｅＴＩＬにおけるＣＤ６９＋発現に対して少なくとも２倍だけ増大する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記消化混合物は、デオキシリボヌクレアーゼ、コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記第１の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記第２の細胞培地は、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組合せからなる群から選択されるサイトカインをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記増殖した数のｒＴＩＬを低温保存して、低温保存されたｒＴＩＬ集団を形成する工程をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記低温保存されたｒＴＩＬ集団を解凍する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ｒＴＩＬは、ｅＴＩＬを実質的に含まない、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記第２の細胞培地で前記腫瘍レムナント細胞を増殖させる前記工程は、ｅＴＩＬを前記第２の細胞培地に加えて、選択されたｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比を提供することを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. ｅＴＩＬを前記ｒＴＩＬに加えて、選択されたｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比を提供する工程をさらに含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記選択されたｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比は、少なくとも１％のｒＴＩＬ対ｅＴＩＬである、請求項１８又は１９に記載の方法。
  21. 前記選択されたｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比は、最大で９９．９％のｒＴＩＬ対ｅＴＩＬである、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記選択されたｒＴＩＬ対ｅＴＩＬ比は、約１：９９、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５及び約９９：１のｒＴＩＬ対ｅＴＩＬからなる群から選択される、請求項１８又は１９に記載の方法。
  23. 癌の処置を、前記処置を必要としている患者において行う方法であって、前記処置は、治療的に有効な量のｒＴＩＬを患者に送達することを含み、前記ｒＴＩＬは、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法に従って調製される、方法。
  24. 癌の処置を、前記処置を必要としている患者において行う方法であって、
    （ａ）請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法に従って、患者から切除された腫瘍からｒＴＩＬを得る工程と、
    （ｂ）前記患者に前記ｒＴＩＬを投与する前に前記患者を非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンで処置する工程と、
    （ｃ）治療的に有効な量のｒＴＩＬを前記患者に投与する工程であって、前記治療的に有効な量のｒＴＩＬは、任意選択的に、低温保存され、且つ前記患者への前記投与前に解凍され得る、工程と、
    （ｄ）前記患者への前記ｒＴＩＬの投与の翌日に開始して、前記患者を高用量ＩＬ－２レジメンで処置する工程と
    を含む方法。
  25. 治療的に有効な量のｅＴＩＬは、前記ｒＴＩＬとの混合物中で前記患者に同時投与される、請求項２３又は２４に記載の方法。
  26. 前記非骨髄破壊リンパ球枯渇レジメンは、２日間にわたって６０ｍｇ／ｍ２／日の用量でシクロホスファミドを投与し、それに続いて、５日間にわたって２５ｍｇ／ｍ２／日の用量でフルダラビンを投与する工程を含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記高用量ＩＬ－２レジメンは、耐容能まで８時間毎に１５分のボーラス静注として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記癌は、黒色腫、二重不応性黒色腫、ブドウ膜黒色腫、卵巣癌、子宮頸部癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、頭頚部癌、腎細胞癌、急性骨髄性白血病、結腸直腸癌及び肉腫からなる群から選択される、請求項２３～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記癌は、乳癌であり、前記乳癌は、トリプルネガティブ乳癌、エストロゲン受容体陽性乳癌、プロゲステロン受容体陽性乳癌及びエストロゲン受容体陽性／プロゲステロン受容体陽性乳癌からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記癌は、肺癌であり、及び前記肺癌は、非小細胞肺癌及び小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
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