JP2020522516A - 二重抵抗性黒色腫において腫瘍浸潤リンパ球を使用する方法 - Google Patents

二重抵抗性黒色腫において腫瘍浸潤リンパ球を使用する方法 Download PDF

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Abstract

腫瘍浸潤リンパ球を使用して他の療法に抵抗性の黒色腫を処置する方法が開示される。

Description

関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、２０１７年６月５日に出願された米国仮特許出願第６２／５１５，２５７号の利益を主張し、その全体が参照により組み込まれる。
配列表
[0002] 本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩの写しは、２０１８年６月５日に、116983-5031-WO_ST25.txtの名称で、１２２キロバイトのサイズで作成された。
発明の分野
[0003] 二重抵抗性黒色腫の処置において腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を使用する方法が、本明細書に開示される。
発明の背景
[0004] 黒色腫の処置は、特に、ニボルマブ単独療法、ペンブロリズマブ単独療法、ニボルマブとイピリムマブの併用療法、イピリムマブ単独療法、ダブラフェニブとトラメチニブの併用療法、ベムラフェニブ単独療法、ペグ化インターフェロン（プレインターフェロン）アルファ−２ｂを含む、一般的に使用される初期選択治療に応答しない患者にとって、依然として困難である。転移性黒色腫につき承認された第一選択処置には、ＰＤ−１（ペンブロリズマブ、ニボルマブ）を遮断する、若しくはニボルマブと抗ＣＴＬＡ４遮断剤イピリムマブを組み合わせる免疫療法戦略、又はＢＲＡＦ経路の特定の活性化変異を標的とする薬剤による化学療法（例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブ）が含まれる。疾患の進行後、患者は抗ＰＤ−１単独療法；ニボルマブ／イピリムマブ併用療法；イピリムマブ単独療法； ＢＲＡＦ変異体の場合は標的療法；高用量アルデスロイキン（インターロイキン−２；ＩＬ−２）；細胞傷害性剤（例えば、ダカルバジン、テモゾロミド、パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン）；又はＫＩＴ変異黒色腫につきイマチニブによる追加的な処置を受けることができる。２０１５年、腫瘍溶解性生ウイルス療法であるtalimogene laherparepvecは、初期の外科的切除後に再発した黒色腫を有する患者の切除不可能な皮膚、皮下、及び結節性病変の局所的処置につき承認された。この製品は、全生存率を改善すること、又は内臓転移に効果を有することは示されていない。
[0005] 最近まで、高用量のアルデスロイキンは、持続的な客観的癌応答を誘発することのできる転移性黒色腫に対する唯一のＦＤＡに承認された全身療法であり、全奏効率（ＯＲＲ）は１６％であり、処置を受けた患者の最大６％で持続的な完全腫瘍退縮（ＣＲ）が観察された（Proleukin（登録商標）（アルデスロイキン）Label、ＦＤＡ、２０１２年７月）。Alva, et al. Cancer Immunol. Immunother. 2016, 65, 1533-1544。最近承認されたＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤ペンブロリズマブ及びニボルマブは、アルデスロイキン処置と比較して転移性黒色腫の持続的応答の割合をおよそ２倍にする。Larkin, et al., N. Engl. J. Med. 2015, 373, 23-34; Robert, et al., N. Engl. J. Med. 2015, 372, 2521-32。以前に処置された患者では、ニボルマブのＯＲＲは３２％であり、腫瘍によるＰＤ−１リガンド発現のより高いレベルと相関して、より高く且つより持続性の応答が得られ；イピリムマブによる先行療法後のペンブロリズマブのＯＲＲは２１％である（表２）。未処置の患者では、ニボルマブとイピリムマブを組み合わせて投与すると、患者の５０％で持続的な客観的応答が達成されるが、ＣＲ率は８．９％と低いままである（Opdivo（登録商標）（ニボルマブ）Label、ＦＤＡ、２０１６年１０月）。
[0006] チェックポイント阻害薬の使用は、肺炎、大腸炎、肝炎、腎炎、及び腎機能障害を含む、免疫関連の有害事象の範囲に関連している（Opdivo（登録商標）（ニボルマブ）Label、ＦＤＡ、２０１６年１０月）。Hofmann, et al., Eur. J. Cancer 2016, 60, 190-209。ニボルマブとイピリムマブの併用療法で処置された患者においては、毒性の増加が観察される。治療中止につながる処置関連の有害事象は、それぞれ併用療法、ニボルマブ単独又はイピリムマブ単独を受けた患者の３６．４％、７．７％、及び１４．８％で発生した。Larkin, et al., N. Engl. J. Med. 2015, 373, 23-34; Johnson, et al., N. Engl. J. Med. 2016, 375, 1749-1755。
[0007] 標的療法及び免疫チェックポイント阻害剤は、転移性黒色腫を有する患者において劇的な応答を達成できるが、この癌での死亡率は２０３０年まで安定したままであると予測されている。年齢調製した黒色腫の全死亡率は、２０１１年には１０００００あたり２．７であり、２０１５年にはこのレベルのままであった。Guy, et al., Morbidity Mortality Weekly Rep. 2015, 64, 591-596。
[0008] 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子自己移植を用いたかさ高い、抵抗性の癌の処置は、予後不良の患者に対する治療への強力なアプローチとなる。Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393。ＴＩＬはＴ細胞が優勢であり、ＩＬ−２に基づくＴＩＬ拡大培養とそれに続く「急速拡大培養プロセス」（ＲＥＰ）とは、そのスピードと効率のためにＴＩＬ拡大培養のための好ましい方法となっている。Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley, et al., J. Clin .Oncol. 2008, 26, 5233-39; Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。黒色腫におけるＴＩＬ療法に対する応答を改善し、ＴＩＬ療法を他の種類の腫瘍に拡大培養するための、いくつかのアプローチが探求され、限られた成功を伴い、この分野は依然として課題となっている。Goff, et al., J. Clin. Oncol. 2016, 34, 2389-97; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Rosenberg, et al., Clin. Cancer Res. 2011, 17, 4550-57。ＴＩＬの生産を標準化すること、並びにＴＩＬ療法の恩恵を受ける可能性が最も高い、患者集団及び特定の種類の癌を特定することに、満たされていない需要が存在する。
[0009] 本発明は、免疫チェックポイント阻害剤を含み得る少なくとも２つの先行治療に対して抵抗性である黒色腫に罹患している患者のサブ集団の処置において、ＴＩＬが使用され得るという驚くべき発見を提供する。
発明の概要
[0010] 一実施形態において、本開示は、それを必要とする患者において二重抵抗性転移性黒色腫を処置する方法を提供し、この方法は、患者に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療有効集団を投与することを含む。
[0011] 一実施形態において、及び上記に従って、二重抵抗性転移性黒色腫は、皮膚の二重抵抗性転移性黒色腫である。
[0012] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、二重抵抗性転移性黒色腫は、ネオアジュバント療法又はアジュバント療法を含まない、少なくとも２つの先行全身処置過程に対して抵抗性である。
[0013] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、二重抵抗性転移性黒色腫は、アルデスロイキン又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である。
[0014] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、二重抵抗性転移性黒色腫は、ペンブロリズマブ又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である。
[0015] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、二重抵抗性転移性黒色腫は、ニボルマブ又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である。
[0016] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、二重抵抗性転移性黒色腫は、イピリムマブ又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である。
[0017] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、二重抵抗性転移性黒色腫は、イピリムマブ又はそのバイオシミラー及びペンブロリズマブ又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である。
[0018] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、二重抵抗性転移性黒色腫は、イピリムマブ又はそのバイオシミラー及びニボルマブ又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である。
[0019] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、二重抵抗性転移性黒色腫は、ＢＲＡＦ阻害剤に対して抵抗性である。
[0020] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、二重抵抗性転移性黒色腫は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤に対して抵抗性である。
[0021] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、及びそれらのバイオシミラーからなる群から選択される。
[0022] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、二重抵抗性転移性黒色腫は、ＰＤ−１阻害剤とＣＴＬＡ−４阻害剤の組み合わせに対して抵抗性である。
[0023] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、ＰＤ−１阻害剤は、ニボルマブ又はそのバイオシミラーであり、ＣＴＬＡ−４阻害剤は、イピルムマブ、トレメリムマブ、及びそれらのバイオシミラーからなる群から選択される。
[0024] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、二重抵抗性転移性黒色腫は、ＢＲＡＦ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組み合わせに対して抵抗性である。
[0025] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、ＢＲＡＦ阻害剤は、ダブラフェニブ又はその薬学的に許容される塩であり、ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物である。
[0026] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、転移性黒色腫は、ＰＤ−１阻害剤又はＰＤ−Ｌ１阻害剤に耐性がある。
[0027] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、及びそれらのバイオシミラーからなる群から選択される。
[0028] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、患者はＢＲＡＦ変異を有しない。
[0029] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、患者は、ＴＩＬの治療有効集団を投与される前に、最大で４用量のニボルマブ又はそのバイオシミラーを投与されている。
[0030] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、患者は、悪化しているか、又は少なくとも２つの先行全身処置過程に対する応答を有しなかった。
[0031] 一実施形態において、本開示は、それを必要とする患者において二重抵抗性転移性黒色腫を処置する方法を提供し、この方法は、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
（ｃ）ＩＬ−２、及び任意選択によりＯＫＴ−３、を含む細胞培養培地で第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るため約３〜１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団を入手するために第２の拡大培養が約７〜１４日間実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収したＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
（ｆ）ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること、及び任意選択により回収したＴＩＬ集団を凍結保存すること；並びに
（ｇ）治療有効量の回収したＴＩＬ集団を、二重抵抗性転移性黒色腫を有する患者に投与すること
を含む。
[0032] 一実施形態において、及び上記の方法に従って、患者は、以前にＰＤ−１阻害剤又はそのバイオシミラーで処置されている。
[0033] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、ＰＤ−１阻害剤は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらのバイオシミラーからなる群から選択される。
[0034] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、患者は、以前にＰＤ−Ｌ１阻害剤又はそのバイオシミラーで処置されている。
[0035] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、及びそれらのバイオシミラーからなる群から選択される。
[0036] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、ＰＤ−１阻害剤又はそのバイオシミラーは、ＣＴＬＡ−４阻害剤又はそのバイオシミラーと共投与された。
[0037] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、ＰＤ−Ｌ１阻害剤又はそのバイオシミラーは、ＣＴＬＡ−４阻害剤又はそのバイオシミラーと共投与された。
[0038] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、患者は、１つの更なる優先選択の全身療法で以前に処置されている。
[0039] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、１つの更なる優先選択の全身療法は、ＢＲＡＦ阻害剤又はその薬学的に許容される塩である。
[0040] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、ＢＲＡＦ阻害剤は、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、及びそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
[0041] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、１つの更なる優先選択の全身療法は、ＭＥＫ阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物である。
[0042] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ、コビメチニブ、及びそれらの薬学的に許容される塩又は溶媒和物からなる群から選択される。
[0043] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、１つの更なる優先選択の全身療法は、ＢＲＡＦ阻害剤又はその薬学的に許容される塩と、ＭＥＫ阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物との組み合わせである。
[0044] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、ＢＲＡＦ阻害剤は、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、及びそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択され、ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ、コビメチニブ、及びそれらの薬学的に許容される塩又は溶媒和物からなる群から選択される。
[0045] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、１つの更なる優先選択の全身療法は、ＣＴＬＡ−４阻害剤又はそのバイオシミラーである。
[0046] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、ＣＴＬＡ−４阻害剤は、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びそれらのバイオシミラーからなる群から選択される。
[0047] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、１つの更なる優先選択の全身療法は、化学療法レジメンである。
[0048] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、化学療法レジメンはダカルバジン又はテモゾリミドを含む。
[0049] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、第１の拡大培養は、約１１日間の期間にわたって実施される。
[0050] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、第１の拡大培養ステップ（ｃ）において、ＩＬ−２が、細胞培養培地中に１０００ＩＵ／ｍＬ〜６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在する。
[0051] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、第２の拡大培養ステップ（ｄ）において、ＩＬ−２が１０００ＩＵ／ｍＬ〜６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、ＯＫＴ−３抗体が約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する。
[0052] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、第１の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して実施される。
[0053] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、第２の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して実施される。
[0054] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、第１の拡大培養ステップ（ｃ）における細胞培養培地は、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインを更に含む。
[0055] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、第２の拡大培養ステップ（ｄ）における細胞培養培地は、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインを更に含む。
[0056] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、ＴＩＬを患者に投与する前に、患者を骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンで処置するステップを更に含む。
[0057] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間シクロホスファミドを投与し、続いて２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間フルダラビンを投与するステップを含む。
[0058] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、患者へのＴＩＬの投与の翌日に開始する、ＩＬ−２レジメンで患者を処置するステップを更に含む。
[0059] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、ＩＬ−２レジメンは、許容量まで８時間ごとに１５分のボーラス静脈内注入として投与される、６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン、又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む高用量ＩＬ−２レジメンである。
[0060] 一実施形態において、及び上記のいずれかに従って、ＴＩＬの治療有効集団は、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個のＴＩＬを含む。
図面の簡単な説明
[0061] 前述の概要、及び以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めばよりよく理解されるであろう。
[0062]ＴＩＬ拡大培養及び治療的処置プロセスを図示する。ステップ１は、１０個のG-Rex 10フラスコへの４つの腫瘍断片の添加を指す。ステップ２では、およそ４０×１０６ＴＩＬ以上が入手される。ステップ３では、ＲＥＰ用に３６個のG-Rex 100フラスコへの分割が生じる。ステップ４では、ＴＩＬを遠心分離によって回収する。新鮮ＴＩＬ生成物は、およそ４３日の合計プロセス時間の後にステップ５で入手され、その時点で、ＴＩＬは患者に注入され得る。 [0063]本開示及び図１のプロセスに従って調製されたＴＩＬとともに使用するための処理及び製造のタイムラインを示す。手術（及び腫瘍切除）は開始時に行われ、リンパ球枯渇化学療法は、本明細書の他の箇所に記載されているように、化学療法を伴う骨髄非破壊的リンパ球枯渇を指す。 [0064]プレＲＥＰ ＴＩＬがＲＥＰプロセスに直接配置される「ＲＥＰへの直接」ステップを含む、ＴＩＬ拡大培養及び治療処置プロセスを示す。総プロセス時間はおよそ２２日で、この時点でＴＩＬが患者に注入され得る。 [0065]６日目の細胞数が２５０×１０６を超える場合、本開示及び図３のプロセスに従って調製されたＴＩＬとともに使用するための処理及び製造のタイムラインを示す。 [0066]６日目の細胞数が２５０×１０６未満の場合、及び患者のリンパ球減少前にＴＩＬ産物の生存率を評価できるように、後にリンパ球枯渇が開始される場合、本開示及び図３のプロセスに従って調製されたＴＩＬとともに使用するための処置及び製造のタイムラインを示す。 [0067]図３によるＴＩＬ製造プロセスの詳細な概略図を示す。 [0068]二重抵抗性黒色腫において異なる方法で調製されたＴＩＬ療法を使用した臨床研究の設計を示す。 [0069]臨床研究における患者の特徴を概括する。 [0070]臨床研究における患者の特徴を概括する。 [0071]臨床研究における処置により発生した重篤な有害事象を概括する。「＊」は、処置の６か月後に発生した治療事象に関連しないことを示す。 [0072]臨床研究における有効性の結果を概括する。 [0073]臨床研究における有効性を示す応答プロットのウォーターフォールを示す。応答はＢＲＡＦの変異状態に依存しない。 [0074]臨床試験における最良の応答までの時間と期間を示す。 [0075]臨床試験における直径の合計の変化率を示す。 [0076]完全寛解状態の患者からのスキャンを示す。 [0077]ＴＩＬ療法を使用した臨床研究の設計を示す。 [0078]Radvanyi, et al., Clin. Cancer Res. 2012, 18, 6758-70に記載されるようにＴＩＬ製造プロセスを使用して実施する第２の臨床研究の結果を示す。ＮＴは未検査、ＷＴは野生型、ｉｒＲＣは免疫関連応答基準を指す。ＴＩＬ回収の場所は次の通り特定される：１：皮膚／ＳＣ；２：リンパ節；３：肺；及び４：胃腸／内臓。 [0078]Radvanyi, et al., Clin. Cancer Res. 2012, 18, 6758-70に記載されるようにＴＩＬ製造プロセスを使用して実施する第２の臨床研究の結果を示す。ＮＴは未検査、ＷＴは野生型、ｉｒＲＣは免疫関連応答基準を指す。ＴＩＬ回収の場所は次の通り特定される：１：皮膚／ＳＣ；２：リンパ節；３：肺；及び４：胃腸／内臓。 [0079]ステップＡ〜Ｆの概要を提供する例示的なプロセス２Ａチャート。 [0080]プロセス２Ａのプロセスフローチャート。 [0080]プロセス２Ａのプロセスフローチャート。 [0080]プロセス２Ａのプロセスフローチャート。 [0081]凍結保存ＴＩＬの例示的な製造プロセス（約２２日間）の実施形態の図を示す。 [0082]プロセス２Ａ、ＴＩＬ製造の２２日間プロセスの実施形態の図を示す。 [0083]プロセス１Ｃ及びプロセス２Ａの例示的な実施形態からのステップＡ〜Ｆの比較表。 [0084]プロセス１Ｃの実施形態とプロセス２Ａの実施形態の詳細な比較。 [0085]最終データカットからのコホート１の更新された有効性データ（Ｎ＝２３患者）。略称：ＰＲ、部分応答；ＳＤ、病状が安定している疾患；ＰＤ、進行性疾患。 [0085]最終データカットからのコホート１の更新された有効性データ（Ｎ＝２３患者）。略称：ＰＲ、部分応答；ＳＤ、病状が安定している疾患；ＰＤ、進行性疾患。 [0086]Ｇｅｎ ２凍結保存ＬＮ−１４４製造プロセスのスキーム。 [0087]転移性黒色腫患者に投与される新規凍結保存ＴＩＬの多施設第２段階臨床試験の研究計画のスキーム。 [0088]コホート１（ＡＳＣＯ２０１７）とコホート２の患者特性の比較を示す表。 [0089]処置により発生した有害事象を示す表（≧３０％）。 [0090]注入製品及びＴＩＬ療法の有効性。 [0091]ＳＤ又はより良い応答を示す評価可能な患者の応答の臨床状態。 [0092]直径の合計の変化率。 [0093]ＨＭＧＢ１レベルの増加が、ＴＩＬ処置時に観察された。 [0094]バイオマーカーＩＬ−１０の増加がＬＮ−１４４注入後に観察された。 [0095]２番目のデータカットからの転移性黒色腫の第２段階臨床試験のコホート２の更新された患者特性（Ｎ＝１７患者）。 [0096]２番目のデータカットからのコホート２（≧３０％）の処置により発生した有害事象（Ｎ＝１７患者）。 [0097]２番目のデータカットからのコホート２の評価可能な患者（病状が安定しているかそれより良好）の応答時間（Ｎ＝１７患者）。有効性セットの１０人の患者のうち、１人の患者（患者１０）は、図に示さない最初の腫瘍評価の前に黒色腫関連で死亡したため評価できなかった。 [0098]２番目のデータカットからのコホート２の更新された有効性データ（Ｎ＝１７患者）。注入されるＴＩＬの平均数は３４×１０９である。前回の治療の中央値は４．５であった。ＢＲＡＦ変異がある患者は、野生型ＢＲＡＦを有する患者と同様に応答した（＊はＢＲＡＦ変異を有する患者を指す）。１人の患者（患者１０）は、最初の腫瘍評価の前に黒色腫関連で死亡したため評価できなかったが有効性セットではなおも考慮されていた。略称：ＰＲ、部分応答；ＳＤ、病状が安定している疾患；ＰＤ、進行性疾患。 [0099]２番目のデータカットからのコホート２からの評価可能な患者の更新された有効性データ（Ｎ＝１７患者）。＊は、最初の評価に到達しなかった評価不可能な患者を示す。全ての有効性評価可能な患者は、以前に抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害薬治療を受けていた。 [00100]コホート２からのＰＲを持つ患者（００３−０１５）の代表的なコンピュータ断層撮影、２番目のデータカット。
配列表の簡単な説明
[00101] 配列番号１は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
[00102] 配列番号２は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
[00103] 配列番号３は、組換えヒトＩＬ−２タンパク質のアミノ酸配列である。
[00104] 配列番号４は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
[00105] 配列番号５は、組換えヒトＩＬ−４タンパク質のアミノ酸配列である。
[00106] 配列番号６は、組換えヒトＩＬ−７タンパク質のアミノ酸配列である。
[00107] 配列番号７は、組換えヒトＩＬ−１５タンパク質のアミノ酸配列である。
[00108] 配列番号８は、組換えヒトＩＬ−２１タンパク質のアミノ酸配列である。
[00109] 配列番号９は、ヒト４−１ＢＢのアミノ酸配列である。
[00110] 配列番号１０は、マウス４−１ＢＢのアミノ酸配列である。
[00111] 配列番号１１は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の重鎖である。
[00112] 配列番号１２は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の軽鎖である。
[00113] 配列番号１３は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00114] 配列番号１４は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00115] 配列番号１５は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ１である。
[00116] 配列番号１６は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ２である。
[00117] 配列番号１７は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ３である。
[00118] 配列番号１８は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00119] 配列番号１９は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00120] 配列番号２０は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00121] 配列番号２１は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の重鎖である。
[00122] 配列番号２２は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の軽鎖である。
[00123] 配列番号２３は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00124] 配列番号２４は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00125] 配列番号２５は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ１である。
[00126] 配列番号２６は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ２である。
[00127] 配列番号２７は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ３である。
[00128] 配列番号２８は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00129] 配列番号２９は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00130] 配列番号３０は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00131] 配列番号３１は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のＦｃドメインである。
[00132] 配列番号３２は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00133] 配列番号３３は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00134] 配列番号３４は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00135] 配列番号３５は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00136] 配列番号３６は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00137] 配列番号３７は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00138] 配列番号３８は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00139] 配列番号３９は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00140] 配列番号４０は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00141] 配列番号４１は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00142] 配列番号４２は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のＦｃドメインである。
[00143] 配列番号４３は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00144] 配列番号４４は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00145] 配列番号４５は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00146] 配列番号４６は、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）アミノ酸配列である。
[00147] 配列番号４７は、４−１ＢＢＬポリペプチドの可溶性部分である。
[00148] 配列番号４８は、４−１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４−１−１バージョン１の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00149] 配列番号４９は、４−１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４−１−１バージョン１の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00150] 配列番号５０は、４−１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４−１−１バージョン２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00151] 配列番号５１は、４−１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４−１−１バージョン２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00152] 配列番号５２は、４−１ＢＢアゴニスト抗体Ｈ３９Ｅ３−２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00153] 配列番号５３は、４−１ＢＢアゴニスト抗体Ｈ３９Ｅ３−２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00154] 配列番号５４は、ヒトＯＸ４０のアミノ酸配列である。
[00155] 配列番号５５は、マウスＯＸ４０のアミノ酸配列である。
[00156] 配列番号５６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の重鎖である。
[00157] 配列番号５７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の軽鎖である。
[00158] 配列番号５８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00159] 配列番号５９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00160] 配列番号６０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の重鎖ＣＤＲ１である。
[00161] 配列番号６１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の重鎖ＣＤＲ２である。
[00162] 配列番号６２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の重鎖ＣＤＲ３である。
[00163] 配列番号６３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00164] 配列番号６４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00165] 配列番号６５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00166] 配列番号６６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖である。
[00167] 配列番号６７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖である。
[00168] 配列番号６８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00169] 配列番号６９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00170] 配列番号７０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ１である。
[00171] 配列番号７１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ２である。
[00172] 配列番号７２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ３である。
[00173] 配列番号７３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00174] 配列番号７４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00175] 配列番号７５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00176] 配列番号７６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖である。
[00177] 配列番号７７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖である。
[00178] 配列番号７８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00179] 配列番号７９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00180] 配列番号８０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ１である。
[00181] 配列番号８１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ２である。
[00182] 配列番号８２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ３である。
[00183] 配列番号８３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00184] 配列番号８４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00185] 配列番号８５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00186] 配列番号８６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９−１２２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00187] 配列番号８７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９−１２２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00188] 配列番号８８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９−１２２の重鎖ＣＤＲ１である。
[00189] 配列番号８９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９−１２２の重鎖ＣＤＲ２である。
[00190] 配列番号９０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９−１２２の重鎖ＣＤＲ３である。
[00191] 配列番号９１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９−１２２の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00192] 配列番号９２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９−１２２の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00193] 配列番号９３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９−１２２の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00194] 配列番号９４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６−２２２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00195] 配列番号９５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６−２２２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00196] 配列番号９６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６−２２２の重鎖ＣＤＲ１である。
[00197] 配列番号９７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６−２２２の重鎖ＣＤＲ２である。
[00198] 配列番号９８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６−２２２の重鎖ＣＤＲ３である。
[00199] 配列番号９９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６−２２２の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00200] 配列番号１００は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６−２２２の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00201] 配列番号１０１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６−２２２の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00202] 配列番号１０２は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）アミノ酸配列である。
[00203] 配列番号１０３は、ＯＸ４０Ｌポリペプチドの可溶性部分である。
[00204] 配列番号１０４は、ＯＸ４０Ｌポリペプチドの代替的可溶性部分である。
[00205] 配列番号１０５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体００８の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00206] 配列番号１０６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体００８の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00207] 配列番号１０７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０１１の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00208] 配列番号１０８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０１１の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00209] 配列番号１０９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２１の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00210] 配列番号１１０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00211] 配列番号１１１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２３の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00212] 配列番号１１２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２３の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00213] 配列番号１１３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00214] 配列番号１１４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00215] 配列番号１１５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00216] 配列番号１１６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00217] 配列番号１１７は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00218] 配列番号１１８は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00219] 配列番号１１９は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00220] 配列番号１２０は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00221] 配列番号１２１は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00222] 配列番号１２２は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00223] 配列番号１２３は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00224] 配列番号１２４は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00225] 配列番号１２５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00226] 配列番号１２６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
発明の詳細な説明
[00227] 他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及された全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
定義
[00228] 他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及された全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[00229] 用語「インビボ」は、対象の体内で起こる事象を指す。
[00230] 用語「インビトロ」は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセイは、生細胞又は死細胞を利用した細胞ベースのアッセイを包含し、また、インタクトな細胞を利用しない無細胞アッセイも包含し得る。
[00231] 用語「エキソビボ」は、対象の体から摘出された細胞、組織及び／又は臓器の処置又は処置の実施を含む事象を指す。適切には、細胞、組織、及び／又は臓器は、手術又は処置の方法で対象の体に戻され得る。
[00232] 用語「急速拡大培養」は、１週間の期間にわたって少なくとも約３倍（又は４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、又は９倍）、より好ましくは、１週間の期間にわたって少なくとも約１０倍（又は２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、又は９０倍）、又は最も好ましくは、１週間の期間にわたって少なくとも約１００倍の抗原特異的ＴＩＬの数の増加を意味する。複数の急速拡大培養プロトコルを以下に概説する。
[00233] 本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬとしては、限定はされないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬは、初代及び二次ＴＩＬの両方を含む。「初代ＴＩＬ」は、本明細書に概説される通り患者組織サンプルから得られるものであり（「新鮮に回収された」と称されることもある）、及び「二次ＴＩＬ」は、限定はされないが、バルクＴＩＬ、及び拡大培養ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」又は「ポストＲＥＰ ＴＩＬ」）を含め、本明細書で考察する通り拡大培養された又は成長した任意のＴＩＬ細胞集団である。ＴＩＬ細胞集団は、遺伝子修飾ＴＩＬを含み得る。
[00234] 本明細書において「細胞集団」（ＴＩＬを含む）は、共通の形質を共有する多数の細胞を意味する。一般に、集団は、概して数が１×１０６〜１×１０１０個の範囲であり、異なるＴＩＬ集団は異なる数を含む。例えば、ＩＬ−２の存在下での初代ＴＩＬの初期成長は、およそ１×１０８個の細胞のバルクＴＩＬ集団をもたらす。ＲＥＰ拡大培養は、概して１．５×１０９〜１．５×１０１０個の注入用の細胞集団が提供されるように行われる。
[00235] 本明細書において「凍結保存ＴＩＬ」とは、初代、バルク、又は拡大培養（ＲＥＰ ＴＩＬ）のいずれかのＴＩＬが約−１５０℃〜−６０℃の範囲で処理及び保存されることを意味する。一般的な凍結保存方法はまた、実施例を含め、本明細書の他の部分にも記載される。明確にするために言えば、「凍結保存ＴＩＬ」は、初代ＴＩＬの供給源として用いられ得る凍結組織サンプルと区別可能なものである。
[00236] 本明細書において「解凍した凍結保存ＴＩＬ」とは、かつて凍結保存されていたが、次に処理により、限定はされないが細胞培養温度又はＴＩＬを患者に投与し得る温度を含め、室温以上に戻されたＴＩＬ集団を意味する。
[00237] ＴＩＬは一般的に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、又は腫瘍に浸潤し処置に影響を及ぼすそれらの能力によって機能的に、定義することができる。ＴＩＬは、一般に、以下のバイオマーカーのうちの１つ以上を発現することによって分類することができる：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ αβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ−１、及びＣＤ２５。加えて、及び或いは、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。
[00238] 用語「凍結保存培地（cryopreservation media）」又は「凍結保存培地（cryopreservation medium）」は、細胞の凍結保存に使用できる任意の培地を指す。かかる培地には、７％〜１０％のＤＭＳＯを含む培地が含まれ得る。例示的培地には、CryoStor CS10、Hyperthermasol、及びそれらの組み合わせが含まれる。用語「ＣＳ１０」は、Stemcell Technologies又はBiolife Solutionsから入手した凍結保存培地を指す。ＣＳ１０倍地は、商品名「CryoStor（登録商標）CS10」と称される場合がある。ＣＳ１０培地は、ＤＭＳＯを含む無血清、無動物成分培地である。
[00239] 用語「セントラルメモリーＴ細胞」は、ヒトではＣＤ４５Ｒ０＋であり、且つＣＣＲ７（ＣＣＲ７ｈｉ）及びＣＤ６２Ｌ（ＣＤ６２ｈｉ）を構成的に発現するＴ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型にはまた、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）、及びＩＬ−１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＣＬ−６、ＢＣＬ−６Ｂ、ＭＢＤ２、及びＢＭＩ１が含まれる。セントラルメモリーＴ細胞はＴＣＲ惹起後にエフェクター分子としてＩＬ−２及びＣＤ４０Ｌを主に分泌する。セントラルメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ４区画において優勢であり、ヒトにおいてはリンパ節及び扁桃腺において比例的に濃縮されている。
[00240] 用語「エフェクターメモリーＴ細胞」は、セントラルメモリーＴ細胞と同様にＣＤ４５Ｒ０＋であるが、ＣＣＲ７の構成的発現が欠損しており（ＣＣＲ７ｌｏ）、且つＣＤ６２Ｌ発現が不均一であるか又は低い（ＣＤ６２Ｌｌｏ）、ヒト又は哺乳類Ｔ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型にはまた、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）、及びＩＬ−１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＬＩＭＰ１が含まれる。エフェクターメモリーＴ細胞は、抗原刺激後に、インターフェロン−γ、ＩＬ−４、及びＩＬ−５を含む、高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ８区画において優勢であり、ヒトにおいては肺、肝臓及び腸において比例的に濃縮されている。ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞は多量のパーフォリンを有する。
[00241] 用語「閉鎖系」は、外部環境に対して閉鎖されている系を指す。本発明の方法では、細胞培養方法に適切な任意の閉鎖系を用いることができる。閉鎖系としては、例えば、限定はされないが、閉鎖型Ｇコンテナが挙げられる。閉鎖系に腫瘍セグメントが加えられた後は、ＴＩＬの患者への投与直前までこの系は外部環境に対して開放されない。
[00242] 腫瘍を破砕するプロセスを説明するために本明細書で使用される「断片化」、「断片」、及び「断片化された」という用語には、腫瘍組織の破砕、スライス、分割、及び細切、並びに腫瘍組織の物理的構造を破砕する任意の他の方法などの機械的断片化方法が含まれる。
[00243] 用語「末梢血単核球」及び「ＰＢＭＣ」は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球を含めた、円形の核を有する末梢血細胞を指す。好ましくは、末梢血単核球は、照射された同種異系末梢血単核球である。ＰＢＭＣは抗原提示細胞の一種である。
[00244] 用語「抗ＣＤ３抗体」は、抗体又はその変異体、例えばモノクローナル抗体であって、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含むものを指す。抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ−３が含まれる。抗ＣＤ３抗体には、Ｔ３及びＣＤ３εとしても知られるＵＨＣＴ１クローンも含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビジリズマブが含まれる。
[00245] 用語「ＯＫＴ−３」（本明細書では「ＯＫＴ３」とも称される）は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体中のＣＤ３受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含む、モノクローナル抗体若しくはバイオシミラー又はその変異体を指し、ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ、MACS GMP CD3 pure、Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA）及びムロモナブ又はそれらの変異体、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、若しくはバイオシミラーなどの市販の形態を含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表１に示す（配列番号１及び配列番号２）。ＯＫＴ−３を産生することができるハイブリドーマは、American Type Culture Collectionに寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ ８００１が割り当てられている。ＯＫＴ−３を産生することができるハイブリドーマもまた、European Collection of Authenticated Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）に寄託されており、カタログ番号８６０２２７０６が割り当てられている。ＯＫＴ−３を産生することができるハイブリドーマは、American Type Culture Collectionに寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ ８００１が割り当てられている。ＯＫＴ−３を産生することができるハイブリドーマもまた、European Collection of Authenticated Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）に寄託されており、カタログ番号８６０２２７０６が割り当てられている。抗ＣＤ３抗体には、Ｔ３及びＣＤ３εとしても知られるＵＨＣＴ１クローン（BioLegend, San Diego, CA, USAから市販されている）も含まれる。
Figure 2020522516
[00246] 用語「ＩＬ−２」（本明細書では「ＩＬ２」とも称される）は、インターロイキン−２として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及びそれらの変異体を含む全ての形態のＩＬ−２を含む。ＩＬ−２は、例えば、Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88及びMalek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−２のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号３）。例えば、ＩＬ−２という用語は、アルデスロイキン（PROLEUKIN、単回使用バイアルあたり２２００万ＩＵで複数の供給元から市販されている）、並びにCellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA（CELLGRO GMP）又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ−２０９−ｂ）から市販で供給される組換えＩＬ−２の形態、及び他の販売業者からの他の市販の同等物などのＩＬ−２のヒト組換え型を包含する。アルデスロイキン（デス−アラニル−１、セリン−１２５ヒトＩＬ−２）は、分子量およそ１５ｋＤａの非グリコシル化ヒト組換え型ＩＬ−２である。本発明における使用に適したアルデスロイキンのアミノ酸配列を表２に示す（配列番号４）。ＩＬ−２という用語はまた、本明細書に記載されているように、Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USAから入手可能なペグ化ＩＬ２プロドラッグＮＫＴＲ−２１４を含む、ペグ化形態のＩＬ−２も包含する。本発明での使用に好適なＮＫＴＲ−２１４及びペグ化ＩＬ−２が米国特許出願公開第２０１４／０３２８７９１ Ａ１号及び国際公開第２０１２／０６５０８６ Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本発明での使用に適したコンジュゲートＩＬ−２の代替形態は、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号、同第５，０８９，２６１号及び同第４９０２，５０２号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適したＩＬ−２の製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
Figure 2020522516
[00247] 用語「ＩＬ−４」（本明細書では「ＩＬ４」とも称される）は、インターロイキン４として知られるサイトカインを指し、これはＴｈ２ Ｔ細胞によって、並びに好酸球、好塩基球、及び肥満細胞によって産生される。ＩＬ−４は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）からＴｈ２ Ｔ細胞への分化を調節する。Steinke and Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70。ＩＬ−４によって活性化されると、Ｔｈ２ Ｔ細胞は続いてポジティブフィードバックループにおいて、更なるＩＬ−４を産生する。ＩＬ−４はまた、Ｂ細胞拡大培養及びクラスＩＩ ＭＨＣ発現を刺激し、Ｂ細胞からのＩｇＥ及びＩｇＧ１発現へのクラス切り替えを誘導する。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−４は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ−２１１）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−１５組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ ＣＴＰ００４３）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−４のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号５）。
[00248] 用語「ＩＬ−７」（本明細書では「ＩＬ７」とも称される）は、インターロイキン７として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指し、これは間質及び上皮細胞、並びに樹状細胞から入手し得る。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。ＩＬ−７は、Ｔ細胞の発生を刺激することができる。ＩＬ−７は、胸腺内のＴ細胞発生及び末梢内での生存に重要な一連のシグナルにおいて、ＩＬ−７受容体アルファ及び一般的なガンマ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるＩＬ−７受容体に結合する。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−７は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ−２５４）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA （ヒトＩＬ−１５組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ ＰＨＣ００７１）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−７のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号６）。
[00249] 用語「ＩＬ−１５」（本明細書では「ＩＬ１５」とも称される）は、インターロイキン−１５として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及びそれらの変異体を含む全ての形態のＩＬ−２を含む。ＩＬ−１５は、例えば、Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−１５は、β及びγシグナル伝達受容体サブユニットをＩＬ−２と共有する。組換えヒトＩＬ−１５は、分子量１２．８ｋＤａの１１４個のアミノ酸（及びＮ末端メチオニン）を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ−１５は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ−２３０−ｂ）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA （ヒトＩＬ−１５組換えタンパク質、カタログ番号３４−８１５９−８２）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−１５のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号７）。
[00250] 用語「ＩＬ−２１」（本明細書では「ＩＬ２１」とも称される）は、インターロイキン−２１として知られる多面発現性サイトカインタンパク質を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及びそれらの変異体を含む全ての形態のＩＬ−２１を含む。ＩＬ−２１は、例えば、Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−２１は、主にナチュラルキラーＴ細胞及び活性化ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞によって産生される。組換えヒトＩＬ−２１は、分子量１５．４ｋＤａの１３２個のアミノ酸を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ−２１は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ−４０８−ｂ）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA （ヒトＩＬ−２１組換えタンパク質、カタログ番号１４−８２１９−８０）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−２１のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号８）。
[00251] 「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、又は「治療量」が指示されるとき、本発明の組成物の正確な投与量は、医師が、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度、及び患者（対象）の状態の個体差を考慮して決定することができる。概して、本明細書に記載される腫瘍浸潤リンパ球（例えば、二次ＴＩＬ又は遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球）を含む医薬組成物は１０４〜１０１１細胞／ｋｇ体重（例えば、１０５〜１０６、１０５〜１０１０、１０５〜１０１１、１０６〜１０１０、１０６〜１０１１、１０７〜１０１１、１０７〜１０１０、１０８〜１０１１、１０８〜１０１０、１０９〜１０１１、又は１０９〜１０１０細胞／ｋｇ体重）（これらの範囲内にある全ての整数値を含む）の投薬量で投与されてもよいと言うことができる。腫瘍浸潤リンパ球（場合によっては遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球を含む）組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与されてもよい。腫瘍浸潤リンパ球（ある場合には、遺伝子的なものを含む）は、免疫療法で一般に公知の注入技法を用いることにより投与し得る（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988を参照のこと）。特定の患者に対する最適な投与量及び処置レジメンは、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて処置を調製することによって、医学の当業者によって容易に決定され得る。
[00252] 用語「血液悪性腫瘍」は、血液、骨髄、リンパ節、及びリンパ系の組織を含むがこれらに限定されない、哺乳動物の癌及び造血系及びリンパ系組織の腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液体腫瘍」とも称される。血液悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。用語「Ｂ細胞血液悪性腫瘍」は、Ｂ細胞に影響を及ぼす血液悪性腫瘍を指す。
[00253] 用語「固形腫瘍」は、嚢胞又は液体領域を通常含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。用語「固形腫瘍癌」は、悪性、新生物性、又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、及び膀胱癌などの、肉腫、癌腫、及びリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されるものではない。固形腫瘍の組織構造は、柔組織（癌細胞）を含む相互依存的組織コンパートメント、及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
[00254] 用語「液性腫瘍」は、本来流動性である異常な細胞塊を指す。液性腫瘍癌としては、白血病、骨髄腫、及びリンパ腫、並びに他の血液悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。液体腫瘍から得られたＴＩＬは、本明細書では骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）とも称され得る。
[00255] 本明細書で使用される「微小環境」という用語は、全体としての固形若しくは血液腫瘍微小環境又は微小環境内の細胞の個々のサブセットを指し得る。本明細書で使用される腫瘍微小環境は、Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473に記載されているように、「新生物性形質転換を促進し、腫瘍の成長及び浸潤をサポートし、腫瘍を宿主の免疫から保護し、治療抵抗性を培い、優勢な転移を成功させるニッチを提供する、細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス、及び機械的手がかり」の複合的な混合物を指す。腫瘍はＴ細胞によって認識されるべき抗原を発現するが、免疫系による腫瘍の排除は、微小環境による免疫抑制のため、希少である。
[00256] 本明細書で使用される「共投与」、「共投与すること」、「〜と組み合わせて投与される」、「〜と組み合わせて投与すること」、「同時（simultaneous）」、及び「同時（concurrent）」という用語は、両方の活性医薬成分及び／又はそれらの代謝産物が同時に対象内に存在するための、２つ以上の活性医薬成分（本発明の好ましい実施形態において、例えば、複数のＴＩＬと組み合わせた少なくとも１つのカリウムチャネルアゴニスト）の対象への投与を包含する。共投与には、別々の組成物中での同時投与、別々の組成物中での異なる時点における投与、又は２つ以上の活性医薬成分が存在する組成物での投与が含まれる。別々の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。
[00257] 用語「有効量」又は「治療有効量」は、疾患処置を含むがこれに限定されない、意図された用途を達成するのに十分な、本明細書に記載の化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図される用途（インビトロ又はインビボ）、又は処置されている対象及び疾患状態（例えば、対象の体重、年齢及び性別）、疾患状態の重症度、又は投与方法によって変動し得る。この用語はまた、標的細胞において特定の応答（例えば、血小板接着及び／又は細胞遊走の減少）を誘発する用量にも適用される。特定の用量は、選択された特定の化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織、及び化合物が運ばれる物理的送達システムによって変動する。
[00258] 用語「処置」、「処置している」、「処置する」などは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を達成することを指す。効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に防ぐという意味で予防的であってもよく、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害作用を部分的に又は完全に治癒するという意味で治療的であってもよい。「処置」及びその文法的均等物は、本明細書で使用されるとき、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、まだそれを有するとは診断されてない対象において疾患の発生を防ぐこと；（ｂ）疾患を阻害すること、即ちその発症又は進行を止めること；及び（ｃ）疾患を軽減すること、即ち疾患の退縮を生じさせること及び／又は１つ以上の疾患症状を軽減することが含まれる。「処置」はまた、疾患又は病態がない場合であっても、薬理学的効果を提供するための薬剤の送達を包含することも意図される。例えば、「処置」は、例えばワクチンの場合に、疾患状態がない中で免疫応答を誘発し又は免疫を付与することのできる組成物の送達を包含する。
[00259] 核酸又はタンパク質の部分に関して使用される場合の「異種」という用語は、その核酸又はタンパク質が、天然には互いに同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換え的に産生され、新しい機能性核酸を作成するように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列、例えば、１つの供給源からのプロモーター及び別の供給源からのコーディング領域、又は異なる供給源からのコーディング領域を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、天然には互いに同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
[00260] ２つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈における「配列同一性」、「パーセント同一性」及び「配列パーセント同一性」（又はそれらの同義語、例えば「９９％同一」）という用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大限の対応につき比較し、整合させた場合に（必要であればギャップを導入する）、同じであるか、同じヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する、２つ以上の配列又は部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使用するか、又は目視検査によって測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを入手するために使用することができる様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野において公知である。パーセント配列同一性を決定するための適切なプログラムには、例えば、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のＢＬＡＳＴウェブサイトから入手可能なＢＬＡＳＴプログラム一式が含まれる。２つの配列間の比較は、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために使用される一方、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。ALIGN、ALIGN-2（Genentech, South San Francisco, California）又はDNASTARから入手可能なMegAlignは、配列を整合するために使用することができる、公に入手可能な更なるソフトウェアプログラムである。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによって最大アラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
[00261] 本明細書で使用される「変異体」という用語は、参照抗体のアミノ酸配列内又はそれに隣接する特定の位置での１つ以上の置換、欠失、及び／又は付加により、参照抗体のアミノ酸配列とは異なる、アミノ酸配列、を含む抗体又は融合タンパク質を包含するが、これに限定されるものではない。変異体は、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列中に１つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電又は非荷電であるアミノ酸の置換を含み得る。変異体は、参照抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持している。変異体という用語は、ペグ化抗体又はタンパク質も含む。
[00262] 本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬとしては、限定はされないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬは、初代及び二次ＴＩＬの両方を含む。「初代ＴＩＬ」は、本明細書に概説される通り患者組織サンプルから得られるものであり（「新鮮に回収した」と称されることもある）、及び「二次ＴＩＬ」は、限定はされないが、バルクＴＩＬ、拡大培養ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」）並びに本明細書で考察する通りの「ｒｅＲＥＰ ＴＩＬ」を含め、本明細書で考察する通り拡大培養された又は成長した任意のＴＩＬ細胞集団である。ｒｅＲＥＰ ＴＩＬは、例えば、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含む、図２７のステップＤに記載されたものなど）を含み得る。
[00263] ＴＩＬは一般的に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、又は腫瘍に浸潤し処置に影響を及ぼすそれらの能力によって機能的に、定義することができる。ＴＩＬは、一般的に、次のバイオマーカー：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ αβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ−１、及びＣＤ２５、のうちの１つ以上を発現することによって分類することができる。加えて、及び或いは、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、更に効力によって特徴付けられてもよく−例えば、ＴＩＬは、例えばインターフェロン（ＩＦＮ）遊離が約５０ｐｇ／ｍＬより高い、約１００ｐｇ／ｍＬより高い、約１５０ｐｇ／ｍＬより高い、又は約２００ｐｇ／ｍＬより高い場合に効力があると見なすことができる。
[00264] 用語「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」は、ありとあらゆる溶媒、分散剤、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、並びに不活性成分を含むものとする。活性医薬成分のためのかかる薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤の使用は当該技術分野において周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤が活性医薬成分と適合しない場合を除いて、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加の活性医薬成分もまた、記載の組成物及び方法に組み込むことができる。
[00265] 用語「約」及び「およそ」は、統計的に意味のある値の範囲内を指す。かかる範囲は、所定の値又は範囲の一桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、更により好ましくは１０％以内、更により好ましくは５％以内であり得る。用語「約」又は「およそ」に含まれる許容変動は、研究中の特定の系に依存し、当業者には容易に理解できる。更に、本明細書で使用される場合、用語「約」及び「およそ」は、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状、及びその他の量及び特性が正確ではなく、及び正確である必要がないことを意味するが、近似及び／又はより大きい又はより小さい場合があり、必要に応じて、公差、変換係数、四捨五入、測定誤差など、及び当業者に公知の他の因子を反映する。一般に、寸法、サイズ、製剤、パラメータ、形状、又は他の量若しくは特性は、明示的にそうであると明記されているか否かにかかわらず、「約」又は「およそ」である。大きく異なるサイズ、形状及び寸法の実施形態が、記載された用語を引用する場合があることに留意されたい。
[00266] 添付の特許請求の範囲で使用される場合、「を含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という移行用語は、記載されていない追加の請求要素又はステップがある場合、それらが特許請求の範囲から除外されることに関して、元の形式及び修正された形式で、特許請求の範囲を定義する。用語「を含む」は、包括的又は無制限であることを意図しており、追加の、引用されていない要素、方法、ステップ、又は材料を除外するものではない。用語「からなる」は、特許請求の範囲で指定されたもの以外の任意の要素、ステップ、又は材料を除外し、後者の場合、指定された材料に関連する通常の不純物を除外する。用語「から本質的になる」は、特許請求の範囲を特定の要素、ステップ又は材料、及び請求された発明の基本的及び新規の特性に実質的に影響しないものに限定する。本発明を具体化する本明細書に記載の全ての組成物、方法及びキットは、代替実施形態において、「を含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という移行用語のいずれかによってより具体的に定義され得る。
癌を処置する方法
[00267] 本明細書に記載のＴＩＬ（及びその集団）を含む組成物及び方法は、過剰拡大培養性障害を処置するための方法において使用することができる。好ましい一実施形態において、それらは癌の処置に使用するためのものである。好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が転移性黒色腫である方法を提供する。好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が転移性二重抵抗性黒色腫である方法を提供する。
[00268] 本発明に従って転移性二重抵抗性黒色腫を処置する方法は、それを必要とする患者に、その患者自身の腫瘍に由来する治療用ＴＩＬＳ集団（自己細胞産物）を投与することを含む。特定の実施形態において、細胞産物は、９０％以上のＣＤ４５＋ＣＤ３＋ Ｔ細胞から構成される。一部の実施形態において、細胞産物は、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上のＣＤ４５＋ＣＤ３＋ Ｔ細胞から構成される。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＢ細胞は、細胞産物中に存在し得るが、通常、細胞産物中、総細胞の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満しか存在しない。
[00269] 本明細書に記載の処置方法のいずれについても、ＴＩＬ療法の投与経路は一般的に静脈内注入による。本明細書で更に詳細に説明するように、ＴＩＬのこの投与は、２つ以上の先行全身療法の後に続く。ＴＩＬ療法のこの投与はまた、シクロホスファミド及び／又はフルダラビンなどの骨髄非破壊的リンパ球除去療法に続いてもよい。更なる実施形態において、ＩＬ−２はＴＩＬ療法後に患者に投与される。
[00270] 理解されるように、本明細書に記載の処置方法で使用されるＴＩＬは、当該技術分野で公知であり本明細書に記載される方法を使用して入手及び処理することができる。特定の例示的な実施形態において、本発明の処置方法で使用される治療用ＴＩＬ集団は、転移性二重抵抗性黒色腫を有する患者から切除された腫瘍から拡大培養される。従って、治療用ＴＩＬ集団は、患者の腫瘍からのＴＩＬに「由来する」。拡大培養の方法は、更なる実施形態において、「腫瘍浸潤リンパ球を拡大培養する方法」と題されたセクションにおいて本明細書に記載されるような拡大培養を含む。簡潔には、そのような方法は、患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ、腫瘍を断片化するステップ、腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させて、そのＴＩＬの第１の集団をＴＩＬの第２の集団へと拡大培養するステップ、ＴＩＬの第２の集団を、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含有する細胞培養培地と接触させて、ＴＩＬの第３の集団を得るために、そのＴＩＬの第２の集団の拡大培養を実施するステップ、を含み、ここで、そのＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を患者に投与することができる。一般に、細胞の第２の集団の、第３の（治療）集団への拡大培養は、１４日間以下の期間にわたって実施される。追加の実施形態において、ＴＩＬを拡大培養する方法は、同時係属出願２０１７年１０月２６日に提出された国際公開第２０１８／０８１４７３号；２０１８年１月５日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６０５号；及び２０１８年１月５日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ１８／１２６３３号において例示されているものを含み、これらはそれぞれ、全ての目的、特に腫瘍サンプルからＴＩＬを拡大培養する方法に関する全ての教示について、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[00271] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が転移性二重抵抗性皮膚黒色腫である方法を提供する。
[00272] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が転移性二重抵抗性ブドウ膜（眼）黒色腫である方法を提供する。
[00273] 本明細書で更に詳細に考察されるように、「二重抵抗性黒色腫」という用語は、２つ以上の先行全身療法に抵抗性の黒色腫を包含する。先行全身療法に抵抗性であるとは、先行全身療法を受けた後に患者が応答しなかったか、又は悪化したことを意味する。
[00274] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌は、少なくとも２つの先行全身療法に抵抗性の転移性二重抵抗性黒色腫であり、これら２つの先行全身療法は、インターフェロン−αなどのネオアジュバント療法又はアジュバント療法を含まない。理解されるように、ネオアジュバント療法は、主要な処置が施される前に腫瘍のサイズを縮小するための第１のステップとして施される療法を包含する。更に理解されるように、アジュバント療法は、癌が再発するリスクを低下させるために、一次処置後に施される追加的な癌処置を含む。本開示の発明は、黒色腫が、少なくとも２つの先行一次治療に応答しなかったか、又はその後進行した後の、第三、第四又は第五選択治療であるＴＩＬ処置を含む。更なる実施形態において、患者は、本明細書に記載の方法に従ってＴＩＬ処置を受ける前に、１つの更なる優先選択の全身療法で以前に処置されている。
[00275] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法を提供し、ここで、癌は、インターフェロン−αなどのネオアジュバント療法又はアジュバント療法を含まない少なくとも２つの先行全身療法に抵抗性の転移性二重抵抗性黒色腫であり、イピリムマブ及びニボルマブなどの複数の薬剤を含有する先行全身療法、又は複数の承認済み若しくは実験的療法の同時投与は、単一の先行全身療法としてカウントされる。換言すると、２つの先行全身療法には、単一療法と見なされる２つ以上の療法を含む併用処置の一次療法が含まれ得る。理解されるように、これらの併用療法は、同じタイプの療法の組み合わせ（２つのチェックポイント阻害剤など）を含み得、又は単一療法と組み合わせて提供されることが多い様々な種類の療法（放射線療法及び化学療法など）を含み得る。
[00276] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）チェックポイント阻害剤及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法を提供する。
[00277] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）ＢＲＡＦ阻害剤及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法を提供する。更なる実施形態において、少なくとも１つの他の先行全身療法はチェックポイント阻害剤であり、また更なる実施形態において、チェックポイント阻害剤はＰＤ−１阻害剤である。
[00278] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）チェックポイント阻害剤及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法であって、１つの他の先行全身療法は療法の組み合わせである、方法を提供する。
[00279] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）ＰＤ−１阻害剤及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法を提供する。更なる実施形態において、患者は、本発明に従うＴＩＬによる処置を受ける前に、ＰＤ−１阻害剤の４用量以下を受けた。また更なる実施形態において、患者は、本発明に従うＴＩＬによる処置を受けつつ、ＰＤ−１阻害剤の１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２用量以下を受けた。
[00280] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）ＰＤ−Ｌ１阻害剤及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法を提供する。
[00281] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）ＣＴＬＡ−４阻害剤及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法を提供する。
[00282] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）ＰＤ−１阻害剤及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法であって、１つの他の先行全身療法は療法の組み合わせである、方法を提供する。
[00283] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）ＰＤ−Ｌ１阻害剤及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法であって、１つの他の先行全身療法は療法の組み合わせである、方法を提供する。
[00284] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）ＣＴＬＡ−４阻害剤及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法であって、１つの他の先行全身療法は療法の組み合わせである、方法を提供する。
[00285] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）チェックポイント阻害剤及び（２）アルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体（ペグ化ＩＬ−２を含む）に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法を提供する。
[00286] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、別個の先行治療として投与された少なくとも２つのチェックポイント阻害剤に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法を提供する。
[00287] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）ペンブロリズマブ、又はそのバイオシミラー若しくは変異体、及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法を提供する。
[00288] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）ニボルマブ、又はそのバイオシミラー若しくは変異体、及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法を提供する。
[00289] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）イピリムマブ、又はそのバイオシミラー若しくは変異体、及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法を提供する。
[00290] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）ニボルマブとイピリムマブの組み合わせ、又はそのバイオシミラー若しくは変異体、及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法を提供する。
[00291] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）チェックポイント阻害剤及び（２）アルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体（ペグ化ＩＬ−２を含む）に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法を提供する。
[00292] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）ペンブロリズマブ又はそのバイオシミラー若しくは変異体、及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法であって、１つの他の先行全身療法は療法の組み合わせである、方法を提供する。
[00293] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）ニボルマブ又はそのバイオシミラー若しくは変異体、及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法であって、１つの他の先行全身療法は療法の組み合わせである、方法を提供する。
[00294] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）イピリムマブ又はそのバイオシミラー若しくは変異体、及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法であって、１つの他の先行全身療法は療法の組み合わせである、方法を提供する。
[00295] 好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法であって、癌が、（１）ニボルマブとイピリムマブの組み合わせ又はそのバイオシミラー若しくは変異体、及び（２）少なくとも１つの他の先行全身療法に抵抗性の、転移性二重抵抗性黒色腫である方法であって、１つの他の先行全身療法は療法の組み合わせである、方法を提供する。
[00296] 前述の実施形態のいずれかにおいて、転移性二重抵抗性黒色腫は、皮膚の転移性二重抵抗性黒色腫であり得る。
[00297] 本明細書で更に詳細に説明するように、本発明の処置方法のいずれかにおいて使用される治療用ＴＩＬ集団は、凍結保存されているものであっても、凍結保存されていないものであってもよい。凍結保存されたＴＩＬは、当該技術分野で公知の方法に従って、又は本明細書で更に詳細に説明するように生成される。
[00298] 上記の実施形態のいずれかによると、二重抵抗性転移性黒色腫は、ＰＤ−１阻害剤、例えば、ＰＤ−１を標的とする抗体、例えば、限定されないが、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、Bristol-Myers Squibb；Opdivo（登録商標））、ペンブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５又はＭＫ−３４７５、Merck；Keytruda（登録商標））、ヒト化抗ＰＤ−１抗体ＪＳ００１（ShangHai JunShi）、モノクローナル抗ＰＤ−１抗体ＴＳＲ−０４２（Tesaro, Inc.）、ピジリズマブ（抗ＰＤ−１ ｍＡｂ ＣＴ−０１１、Medivation）、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ＢＧＢ−Ａ３１７（BeiGene）、及び／又は抗ＰＤ−１抗体ＳＨＲ−１２１０（ShangHai HengRui）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Regeneron）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ−１１０６（Bristol-Myers Squibb）、及び／又はヒト化抗ＰＤ１ ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Novartis）を含み得るもの、に対して抵抗性であり得る。一部の実施形態において、ＰＤ−１抗体は、クローン：ＲＭＰ１−１４（ラットＩｇＧ）−BioXcellカタログ番号ＢＰ０１４６からのものである。他のＰＤ−１抗体は、米国特許第８，００８，４４９号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものを含む。一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分はＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ−１とのその相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。ＰＤ−Ｌ１に結合してＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する当該技術分野において公知の任意の抗体はまた、二重抵抗性黒色腫が抵抗性である全身療法の１つであってもよい。例えば、ＰＤ−Ｌ１を標的とし、臨床試験中又は承認済みで市販されている抗体には、アベルマブ（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ、Pfizer、Bavencio（登録商標））、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６、AstraZeneca、Imfinzi（登録商標））、ＢＭＳ−９３６５５９（Bristol-Myers Squibb）及びアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、Genentech、Tecentriq（登録商標））が含まれる。ＰＤ−Ｌ１を標的とする他の好適な抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示される。当業者は、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本発明の方法に従って処置される黒色腫が抵抗性である療法として役立ち得る、ことを理解するであろう。
[00299] 同様に、本明細書に記載の方法に従って処置される黒色腫は、ＢＲＡＦタンパク質に直接影響を及ぼす阻害剤又はＭＥＫに影響を及ぼす阻害剤を含むがこれらに限定されないＢＲＡＦ阻害剤に対して抵抗性であり得る。ＢＲＡＦ阻害剤には、ベムラフェニブ（Zelboraf（登録商標））及びダブラフェニブ（Tafinlar（登録商標））、並びにＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０、又はソラフェニブ（Nexavar（登録商標））が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＭＥＫ阻害剤には、トラメチニブ（Mekinist（登録商標））及びコビメチニブ（Cotellic（登録商標））が含まれるが、これらに限定されるものではない。
[00300] 特定の実施形態において、及び本明細書に記載の実施形態のいずれかに従って、記載された発明に従って処置される患者は、特定の種類の処置に対する感受性又は耐性を示す遺伝子構造を保有し得る（又は遺伝子構造を保有する腫瘍を有し得る）。例えば、患者は低いＰＤＬ１発現を示し得るか、又はＢＲＡＦ遺伝子に変異を保有している（又は保有していない）ことがあり得る。特定の実施形態において、本明細書に記載の二重抵抗性黒色腫の処置は、ＢＲＡＦの状態（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子の変異の存在又は不存在）に非感受性／不可知である。一部の実施形態において、患者は、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤に耐性の黒色腫を示し得る。ヤヌスキナーゼ１及びヤヌスキナーゼ２タンパク質の変異をコードする遺伝子内の変異に基づく耐性、並びにベータ−２−ミクログロブリンをコードする遺伝子内の変異及び他の変異に基づく耐性を含む、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１阻害剤に対する耐性のメカニズムは当該技術分野で知られている。これは、例えば、Zaretsky, et al., Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma, N. Engl.J. Med.2016, 375, 819-29に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
[00301] 上記で考察される実施形態のいずれかに従って、二重抵抗性黒色腫を有する患者に提供されるＴＩＬ療法は、ＴＩＬ単独の治療用集団での処置を含み得るか、又はＴＩＬ及び１つ以上の他の療法を含む併用処置を含み得る。例えば、一部の実施形態において、本明細書に記載される通り作製されるＴＩＬは、以下に記載する抗体など、１つ以上の免疫チェックポイント調節因子と併用して投与することができる。例えば、ＰＤ−１を標的とする、且つ本発明のＴＩＬと共投与し得る抗体としては、例えば、限定はされないが、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、Bristol-Myers Squibb；Opdivo（登録商標））、ペンブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５又はＭＫ−３４７５、Merck；Keytruda（登録商標））、ヒト化抗ＰＤ−１抗体ＪＳ００１（ShangHai JunShi）、モノクローナル抗ＰＤ−１抗体ＴＳＲ−０４２（Tesaro, Inc.）、ピジリズマブ（抗ＰＤ−１ ｍＡｂ ＣＴ−０１１、Medivation）、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ＢＧＢ−Ａ３１７（BeiGene）、及び／又は抗ＰＤ−１抗体ＳＨＲ−１２１０（ShangHai HengRui）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Regeneron）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ−１１０６（Bristol-Myers Squibb）、及び／又はヒト化抗ＰＤ−１ ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Novartis）が挙げられる。一部の実施形態において、ＰＤ−１抗体は、クローン：ＲＭＰ１−１４（ラットＩｇＧ）−BioXcellカタログ番号ＢＰ０１４６からのものである。本明細書に記載される通りのステップＡ〜Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適な他の好適な抗体は、米国特許第８，００８，４４９号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示される抗ＰＤ−１抗体である。一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分はＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ−１とのその相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。ＰＤ−Ｌ１に結合してＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する当該技術分野において公知の任意の抗体が、本明細書に記載される通りのステップＡ〜Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適である。例えば、ＰＤ−Ｌ１を標的とし、臨床試験中又は承認済みで市販されている抗体には、アベルマブ（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ、Pfizer、Bavencio（登録商標））、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６、AstraZeneca、Imfinzi（登録商標））、ＢＭＳ−９３６５５９（Bristol-Myers Squibb）及びアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、Genentech、Tecentriq（登録商標））が含まれる。ＰＤ−Ｌ１を標的とする他の好適な抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示される。当業者は、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、ＴＩＬとの共投与方法における使用に好適であることを理解するであろう。一部の実施形態において、ＴＩＬの組み合わせを投与された患者は、患者が悪化したか、抗ＰＤ−１抗体単独による処置に応答しなかった場合に、抗ＰＤ−１抗体と共投与される。同様に、ＴＩＬ療法は、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、及び黒色腫の処置に有用であることが当該技術分野で知られている他の治療などの、他の治療と共投与されてもよい。
[00302] 理解されるように、上記の処置方法のいずれかに従って、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、及びＣＴＬＡ−４阻害剤を含む本明細書に記載の追加的な処置様式のいずれかには、そのような阻害剤及びその薬学的に許容される塩の実施形態が含まれる。
[00303] 一実施形態において、本明細書に開示されるＴＩＬ療法で処置される患者は、過去の対照から期待される応答に対する改善された応答を示し、改善された応答は全体的な応答率として決定される。一実施形態において、本明細書に開示されるＴＩＬ療法で処置される患者は、過去の対照から期待される応答に対して改善された応答を示し、改善された応答は全体的な応答率として決定され、全体的な応答率の改善は少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、又は少なくとも５０％である。一実施形態において、本明細書に開示されるＴＩＬ療法で処置される患者は、過去の対照から期待される応答に対する改善された応答を示し、改善された応答は応答の持続時間として決定される。一実施形態において、本明細書に開示されるＴＩＬ療法で処置される患者は、過去の対照から期待される応答に対して改善された応答を示し、改善された応答は応答の持続時間として決定され、応答の持続時間の改善は少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、又は少なくとも５０％である。
化学療法による骨髄非破壊的リンパ球枯渇
[00304] 実験的知見は、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合要素（「サイトカインシンク」）を排除することによって処置効果を高めるのに重要な役割を果たすことを示す。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のＴＩＬを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」とも称される）を利用する。
[00305] 一実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で二重抵抗性黒色腫を処置する方法を提供し、ここで患者はＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、１つ以上の化学療法剤を含む。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入の２７〜２３日前）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。一実施形態において、本開示による骨髄非破壊的化学療法及びＴＩＬ注入（０日目）の後、患者は生理学的許容量まで８時間ごとに７２０，０００ＩＵ／ｋｇでＩＬ−２の静脈内注入を受ける。更なる実施形態において、ＩＬ−２は、ＴＩＬ注入後３〜２４時間の間に投与される。更なる実施形態において、ＩＬ−２は、ＴＩＬ注入の３〜３０、５〜２５、７〜２０、９〜１５時間後に投与される。更に別の実施形態において、ＩＬ−２は、ＴＩＬ注入後５日間にわたり、生理的許容量まで、８〜１２時間ごとに、５００，０００；５５０，０００；６００，０００；６５０，０００；７００，０００；７５０，０００；８００，０００ＩＵ／ｋｇで投与される。
[00306] 一般的に、リンパ球枯渇はフルダラビン又はシクロホスファミド（活性型はマホスファミドと称される）及びその組み合わせの投与を使用して達成される。かかる方法については、Gassner, et al., Cancer Immunol.Immunother.2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat.Clin.Pract.Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-5239、及びDudley, et al., J. Clin.Oncol.2005, 23, 2346-2357（これらは全て、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
[00307] 一部の実施形態において、フルダラビンは、０．５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、又は７日以上にわたって実施される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、３５ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日、又は４５ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２〜７日間実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で４〜５日間実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、２５ｍｇ／ｋｇ／日で４〜５日間実施される。
[00308] 一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により０．５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの濃度で入手される。一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により１μｇ／ｍＬの濃度で入手される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、又は７日以上にわたって実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、１００ｍｇ／ｍ２／日、１５０ｍｇ／ｍ２／日、１７５ｍｇ／ｍ２／日、２００ｍｇ／ｍ２／日、２２５ｍｇ／ｍ２／日、２５０ｍｇ／ｍ２／日、２７５ｍｇ／ｍ２／日、又は３００ｍｇ／ｍ２／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは静脈内（即ち、ｉ．ｖ．）投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２〜７日間実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で、４〜５日間実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で、４日間実施される。
[00309] 一部の実施形態において、リンパ球枯渇は、フルダラビン及びシクロホスファミドを共に患者に投与することによって行われる。一部の実施形態において、４日間にわたって、フルダラビンは２５ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与され、シクロホスファミドは、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与される。
[00310] 一実施形態において、リンパ球枯渇は、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与と、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与により実施される。
腫瘍浸潤リンパ球を拡大培養する方法
[00311] これらの特徴のいくつかを含むプロセス２Ａとして知られるＴＩＬプロセスの例を図１９に示し、プロセス１Ｃに対する本発明の本実施形態の利点のいくつかを、図Ｆ及びＧに示す。プロセス２Ａの実施形態を図１８に示す。
[00312] 本明細書において考察される通り、本発明は、患者への移植前に凍結保存ＴＩＬを再刺激することによりその代謝活性、ひいては相対的健康を増加させること、及び前記代謝的健康の試験方法に関するステップを含み得る。一般的に本明細書に概説される通り、ＴＩＬは一般的に患者サンプルから採取し、操作することにより、患者への移植前にその数が拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択により、以下に考察する通り、遺伝的に操作されてもよい。
[00313] 一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存され得る。解凍後、ＴＩＬは、患者への注入前に、その代謝を高めるために再刺激されてもよい。
[00314] 一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察する通り、第１の拡大培養（プレＲＥＰと称されるプロセス及び図１８にステップＡとして示されるプロセスを含む）は、３〜１４日に短縮され、第２の拡大培養（ＲＥＰと称されるプロセス及び図１８にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、７〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、第１の拡大培養（例えば、図１８のステップＢとして記載される拡大培養）は１１日間に短縮され、第２の拡大培養（例えば、図１８のステップＤに記載される拡大培養）は１１日間に短縮される。一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察するように、第１の拡大培養及び第２の拡大培養（例えば、図１８のステップＢ及びステップＤとして記載される拡大培養）の組み合わせは２２日間に短縮される。
[00315] 以下の「ステップ」の名称Ａ、Ｂ、Ｃ等は、図１８を参照し、本明細書に記載の特定の実施形態を参照している。以下及び図１８におけるステップの順序は例示であり、ステップの任意の組み合わせ又は順序、並びに追加的なステップ、ステップの繰り返し、及び／又はステップの省略が、本願及び本明細書に開示される方法によって企図される。
ステップＡ：患者の腫瘍サンプルを入手
[00316] 一般に、ＴＩＬは、初めは患者腫瘍サンプルから入手され（「初代ＴＩＬ」）、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためより大きい集団へと拡大培養され、任意選択で凍結保存され、本明細書に概説される通り再刺激され、及び任意選択でＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
[00317] 患者腫瘍サンプルは当該技術分野において公知の方法を用いて、概して、外科的切除、針生検又はその他の、腫瘍とＴＩＬ細胞との混合物を含むサンプルを入手するための手段によって入手されてもよい。一般に、腫瘍サンプルは、原発腫瘍、浸潤性腫瘍又は転移性腫瘍を含めた任意の固形腫瘍からであってもよい。腫瘍サンプルはまた、血液悪性腫瘍から入手された腫瘍など、液性腫瘍であってもよい。固形腫瘍は、限定はされないが、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌、及び皮膚癌（限定はされないが、扁平上皮癌、基底細胞癌、及び黒色腫を含む）を含めた任意の癌型のものであってもよい。一部の実施形態において、有用なＴＩＬは、特に高レベルのＴＩＬを有すると報告されていることに伴い悪性黒色腫腫瘍から入手される。
[00318] 「固形腫瘍」という用語は、嚢胞又は液体領域を通常含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。「固形腫瘍癌」という用語は、悪性、新生物性、又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、限定はされないが、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、及び膀胱癌など、肉腫、癌腫、及びリンパ腫が挙げられる。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌（例えば、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、及び非小細胞肺癌から選択される。固形腫瘍の組織構造は、柔組織（癌細胞）を含む相互依存的組織コンパートメント、及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
[00319] 「血液悪性腫瘍」という用語は、血液、骨髄、リンパ節、及びリンパ系の組織を含むがこれらに限定されない、哺乳動物の癌及び造血系及びリンパ系組織の腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液体腫瘍」とも称される。血液悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。「Ｂ細胞血液悪性腫瘍」という用語は、Ｂ細胞に影響を及ぼす血液悪性腫瘍を指す。
[00320] 入手後、腫瘍サンプルは一般的に鋭的な切離を用いて１〜約８ｍｍ３の小片に断片化され、約２〜３ｍｍ３が特に有用である。ＴＩＬは酵素的腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。そのような腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640緩衝液、２ｍＭグルタメート、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮａｓｅ及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ）中でのインキュベーション、続いて機械的分離（例えば、組織分離剤を使用）によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍を約１分間機械的に分離した後、続いて５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片しか存在しなくなるまで前述の条件下で機械的分離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製されてもよい。このプロセスの終わりに、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するためにFICOLL分岐親水性多糖を用いた密度勾配分離を行うことができる。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号に記載されているものなどの、当該技術分野で公知の代替的方法を使用してもよく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。前述の任意の方法は、ＴＩＬを拡大培養する方法又は癌を処置する方法のために、本明細書に記載の任意の実施形態において使用され得る。
[00321] 一般に、回収された細胞懸濁液は「初代細胞集団」又は「新鮮に回収した」細胞集団と呼ばれる。
[00322] 一部の実施形態において、断片化は、例えば切離並びに消化を含めた物理的断片化を含む。一部の実施形態において、断片化は物理的断片化である。一部の実施形態において、断片化は切離である。一部の実施形態において、断片化は消化による。一部の実施形態において、ＴＩＬは初めに、患者から入手された酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。一実施形態において、ＴＩＬは初めに、患者から入手された酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。
[00323] 一部の実施形態において、腫瘍が固形腫瘍である場合、例えばステップＡ（図１８に提供される）における腫瘍サンプルの入手後に、腫瘍は物理的断片化を受ける。一部の実施形態において、断片化は凍結保存前に行われる。一部の実施形態において、断片化は凍結保存後に行われる。一部の実施形態において、断片化は、腫瘍の入手後に、いかなる凍結保存もなしに行われる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養用の各容器に１０、２０、３０、４０個又はそれを超える数の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養用の各容器に３０又は４０個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は断片化され、第１の拡大培養用の各容器に４０個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、複数の断片は、約４〜約５０個の断片を含み、各断片は約２７ｍｍ３の容積を有する。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３〜約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０〜約６０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１ｇ〜約１．５ｇの総質量を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約４個の断片を含む。
[00324] 一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍断片から入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は鋭的な切離によって入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３〜１０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３〜８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約２ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約３ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約４ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約５ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約６ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約７ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約９ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍は１〜４ｍｍ×１〜４ｍｍ×１〜４ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍は１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍は２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍は３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍は４ｍｍ×４ｍｍ×４ｍｍである。
[00325] 一部の実施形態において、各断片上の出血、壊死、及び／又は脂肪組織の量を最小限にするために、腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の出血組織の量を最小限にするために、腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の壊死組織の量を最小限にするために、腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の脂肪組織の量を最小限にするために、腫瘍が切除される。
[00326] 一部の実施形態において、腫瘍の内部構造を維持するために、腫瘍の断片化が実施される。一部の実施形態において、腫瘍の断片化は、メスでの鋸引き運動を実施することなく実施される。一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍消化物から入手される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、酵素培地中、例えば限定はされないが、ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ GlutaMAX、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮアーゼ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的解離（GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA）によって作成した。腫瘍を酵素培地に置いた後、腫瘍を約１分間機械的に分離し得る。次に溶液を５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、次にそれを再び約１分間機械的に破壊し得る。再び５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍を３度目に約１分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、３度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、５％ＣＯ２下３７℃での更に３０分間のインキュベーションを伴う又は伴わない１回又は２回の更なる機械的分離をサンプルに適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、フィコールを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。
[00327] 一部の実施形態において、第１の拡大培養ステップ前の回収された細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に回収した」細胞集団と呼ばれる。
[00328] 一部の実施形態において、細胞は、以下に更に詳細に記載し、図１８に例示する、ステップＢに記載の拡大培養に進む前に、任意選択でサンプル回収後に凍結され、凍結貯蔵されてもよい。
ステップＢ：第１の拡大培養
[00329] 一部の実施形態において、本方法は、対象／患者への投与時に複製サイクルを増加させることができる幼若ＴＩＬを得ることを提供し、したがって、成熟ＴＩＬ（即ち、被験者／患者への投与前に更に多くの回数の複製を受けたＴＩＬ）を超える追加の治療上の利点を提供し得る。幼若ＴＩＬの特徴が、文献に記載されている。例えば、Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 （2012）; Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 （2010）、Huang et al., J Immunother, 28（3）:258-267 （2005）、Besser et al., Clin Cancer Res, 19（17）:OF1-OF9 （2013）、Besser et al., J Immunother 32:415-423 （2009）、Robbins, et al., J Immunol 2004; 173:7125-7130、Shen et al., J Immunother, 30:123-129 （2007）、Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 （2005）、及びTran, et al., J Immunother, 31:742-751 （2008）であり、これらは全て、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
[00330] Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）、及びＣ（定数）の遺伝子セグメントは、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、本方法によって得られたＴＩＬは、新たに回収したＴＩＬ及び／又は例えば、図１８に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、図２２及び／又は図２３に例示されているように、本方法によって得られたＴＩＬは、新たに回収したＴＩＬ及び／又は、プロセス１Ｃと称される方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第１の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性はＴ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（即ち、ＴＣＲα／β）の発現が増加する。
[00331] 腫瘍断片の切離又は消化後、例えば、図１８のステップＡに記載されたように、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ−２において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２と共に含む培地中でインキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して３〜１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、７〜１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、１０〜１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、約１１日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。
[00332] 好ましい実施形態において、以下及び本明細書で説明するように、初期バルクＴＩＬ拡大培養ステップ（例えば、プレＲＥＰと称されるプロセスを含み得る図１８のステップＢで説明したものなど）、その後の、以下ステップＤの下及び本明細書に記載されているように、第２の拡大培養（ステップＤ、高速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるプロセスを含む）、その後の、任意選択の凍結保存、及びその後の第２ステップＤ（再刺激ＲＥＰステップと称されるプロセスを含む）を使用してＴＩＬの拡大培養を実施することができる。このプロセスによって入手したＴＩＬは、任意選択により、本明細書に記載される通り表現型特徴及び代謝パラメータが特徴付けられてもよい。
[00333] 実施形態において、ＴＩＬ培養が２４ウェルプレートで、例えばCostar２４ウェル細胞培養クラスター、平底（Corning Incorporated、Corning, NYを使用して開始される場合、各ウェルには、ＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍＬ；Chiron Corp.、Emeryville, CA）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中、１×１０６個の腫瘍消化物細胞又は１個の腫瘍断片を播種することができる。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３〜１０ｍｍ３である。
[00334] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、ステップＢのＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス、及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ１６４０からなる。培養が、４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN）内で開始される実施形態において（図１）、各フラスコに、１０〜４０ｍＬのＩＬ−２含有ＣＭ中の１０〜４０×１０６個の腫瘍消化物生細胞又は５〜３０個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び２４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ−２を補充し、５日目以降は２〜３日毎に培地の半分を交換した。
[00335] 腫瘍断片の調製後、得られた細胞（即ち断片）は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ−２において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２と共に含む培地中で（又は、ある場合には、本明細書に概説される通り、ａＡＰＣ細胞集団の存在下で）インキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して１０〜１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、第１の拡大培養の間の成長培地はＩＬ−２又はその変異体を含む。一部の実施形態において、ＩＬは組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）である。一部の実施形態においてＩＬ−２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２０〜３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ−２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ−２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき２５×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態においてＩＬ−２ストック溶液は１ｍｇバイアルにつき３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は４〜８×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ−２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は５〜７×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ−２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は６×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ−２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は実施例９に記載される通り調製される。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２又は約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、乃至約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、乃至約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、乃至約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−２を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００〜３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００〜４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００〜５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００〜６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００〜７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００〜８０００ＩＵ／ｍＬ、又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。
[00336] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、乃至約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、乃至約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、乃至約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−１５を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。
[00337] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、乃至約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−２１を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。
[00338] 一実施形態において、細胞培養培地は、ＯＫＴ−３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地はＯＫＴ−３抗体を含まない。一部の実施形態において、ＯＫＴ−３抗体はムロモナブである。
Figure 2020522516
[00339] 一部の実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４−１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４−１ＢＢアゴニストであり、４−１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ−１０１、融合タンパク質、並びにそれらの断片、誘導体、変異体、バイオシミラー、及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、２０μｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
[00340] 一部の実施形態において、１つ以上のＴＮＦＲＳＦに加えて、細胞培養培地は、初期濃度約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び初期濃度約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を更に含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４−１ＢＢアゴニストを含む。
[00341] 一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、これはＣＭ１（培養培地１）と称される。一部の実施形態において、ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス、及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ１６４０からなる。培養が、４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN）内で開始される実施形態において（図１）、各フラスコに、１０〜４０ｍＬのＩＬ−２含有ＣＭ中の１０〜４０×１０６個の腫瘍消化物生細胞又は５〜３０個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び２４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ−２を補充し、５日目以降は２〜３日毎に培地の半分を交換した。一部の実施形態において、ＣＭは、実施例に記載されるＣＭ１である。一部の実施形態において、第１の拡大培養は初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地中で行われる。一部の実施形態において、初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地はＩＬ−２を含む。
[00342] 一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第１の拡大培養（例えば、プレＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図１８のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは３〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、例えば、図４及び５並びに、例えば、図１８のステップＢに記載されている実施例を含む実施例で考察されているように、第１の拡大培養（例えば、プレＲＥＰと称されることもある図１８のステップＢに記載されるプロセスなどを含み得る）は７〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、ステップＢの第１の拡大培養は１０〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、例えば、図１８のステップＢに記載されている拡大培養で考察されるように、第１の拡大培養は１１日間に短縮される。
[00343] 一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は３日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は４日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は５日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は６日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は７日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は８日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は９日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１０日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１１日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１２日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１３日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は３日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は４日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は５日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は６日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は７日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は８日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は９日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１０日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は１１日間続行され得る。
[00344] 一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及び／又はＩＬ−２１の組み合わせが、第１の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及び／又はＩＬ−２１、並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図１８による、並びに本明細書に記載されている通り、ステップＢプロセス中を含む、第１の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１の組み合わせが、第１の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１、並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図１８による、及び本明細書に記載されている通りステップＢプロセス中に含められ得る。
[00345] 一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第１の拡大培養（例えば、プレＲＥＰと称される図１８のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは３〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、ステップＢの第１の拡大培養は７〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、ステップＢの第１の拡大培養は１０〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、第１の拡大培養は１１日間に短縮される。
[00346] 一部の実施形態において、第１の拡大培養、例えば、図１８によるステップＢは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX -10又はG-REX -100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
ステップＣ：第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行
[00347] ある場合には、例えば、図１８に示されるように、例えばステップＢから得られるＴＩＬ集団を含む、第１の拡大培養から得られるバルクＴＩＬ集団は、以下本明細書で考察されるプロトコルを使用して、直ちに凍結保存してもよい。或いは、第２のＴＩＬ集団と称される第１の拡大培養から得られたＴＩＬ集団は、第２の拡大培養（ＲＥＰと呼ばれることがある拡大培養を含み得る）に供し、その後、以下で考察するように凍結保存してもよい。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬが治療に使用される場合、第１のＴＩＬ集団（バルクＴＩＬ集団と称されることもある）又は、第２のＴＩＬ集団（一部の実施形態において、ＲＥＰ ＴＩＬ集団と称される集団を含み得る）は、拡大培養の前又は、第１の拡大培養の後で第２の拡大培養の前に、適切な処置のために遺伝子修飾に供してもよい。
[00348] 一部の実施形態において、第１の拡大培養から（例えば、図１８に示される通りのステップＢから）入手されたＴＩＬは、選択のためのフェノタイピングまで貯蔵される。一部の実施形態において、第１の拡大培養から（例えば、図１８に示される通りのステップＢから）入手されたＴＩＬは、貯蔵されず第２の拡大培養に直接進む。一部の実施形態において、第１の拡大培養から入手されたＴＩＬは、第１の拡大培養後、第２の拡大培養前に凍結保存されない。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約３日〜１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約４日〜１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約４日〜１０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約７日〜１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約１４日の時点で行われる。
[00349] 一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから３日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから４日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから５日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから６日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから７日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから８日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから９日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１０日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１１日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１２日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１３日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから２日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから３日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから４日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから５日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから６日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから７日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから８日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから９日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１０日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１１日で行われる。
[00350] 一部の実施形態において、ＴＩＬは第１の拡大培養の後、第２の拡大培養の前に貯蔵されず、ＴＩＬは第２の拡大培養に直接進む（例えば、一部の実施形態において、図１８に示すように、ステップＢからステップＤへの移行中に貯蔵は行われない）。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、移行は閉鎖系で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養からのＴＩＬは、第２のＴＩＬ集団からのＴＩＬであり、移行期間を伴わず第２の拡大培養に直接進む。
[00351] 一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、例えば、図１８によるステップＣは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX -10又はG-REX -100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
サイトカイン
[00352] 本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当該技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にＩＬ−２を含む培養培地を使用する。
[00353] 或いは、ＴＩＬの急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することが更に可能であり、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１のうちの２つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第２０１５／１８９３５６号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（全ての目的、特に細胞拡大培養方法におけるサイトカインの使用に関する全ての教示について、その全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる）に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ−２とＩＬ−１５、ＩＬ−２とＩＬ−２１、ＩＬ−１５とＩＬ−２１とＩＬ−２、ＩＬ−１５とＩＬ−２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。
Figure 2020522516
ステップＤ：第２の拡大培養
[00354] 一部の実施形態において、ＴＩＬ細胞集団は、例えば、図１８）に記載の通り、ステップＡ及びステップＢ、並びにステップＣと称される移行後、回収及び初期バルク処理の後、数が増加する。この更なる増加は、本明細書では第２の拡大培養と称され、これは、当該技術分野で一般に急速拡大培養法と称される拡大培養プロセス（ＲＥＰ、並びに図１８のステップＤに示されるプロセス）を含み得る。第２の拡大培養は、概して、フィーダー細胞、サイトカイン源、及び抗ＣＤ３抗体を含め、幾つもの成分を含むガス透過性容器内の培養培地を使用して達成することができる。
[00355] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養又は第２のＴＩＬ拡大培養（これはＲＥＰと称されることもある拡大培養；並びに図１８のステップＤに示されるプロセスを含み得る）は、当業者に公知の任意のＴＩＬフラスコ又は容器を使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約７日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約８日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約９日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１０日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１１日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１２日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１３日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は約１４日間続行し得る。
[00356] 一実施形態において、第２の拡大培養は、本開示の方法（例えば、ＲＥＰと呼ばれる膨張、並びに図１８のステップＤに示されるプロセスを含む）を使用して、ガス透過性容器内で実施することができる。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いて急速に拡大培養することができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激としては、例えば、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている）又は、ＵＨＣＴ−１（BioLegend、San Diego, CA, USAから市販されている）を挙げることができる。ＴＩＬは、任意選択で３００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２又はＩＬ−１５など、Ｔ細胞成長因子の存在下で、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）結合ペプチド、例えば、０．３μΜ ＭＡＲＴ−１：２６−３５（２７Ｌ）又はｇｐｌ ００：２０９−２１７（２１０Ｍ）など、任意選択でベクターから発現させることのできる、１つ又は複数のエピトープなど、その抗原性部分を含めた癌の１つ以上の抗原を、第２の拡大培養の間に誘導することにより、インビトロでのＴＩＬの更なる刺激を誘発するように拡大培養することができる。他の好適な抗原としては、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＳＳＸ−２、及びＶＥＧＦＲ２、又はその抗原性部分を挙げることができる。ＴＩＬはまた、ＨＬＡ−Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ１つ又は複数の抗原による再刺激によっても急速に拡大培養し得る。或いは、ＴＩＬは、例えば照射自己リンパ球によるか、又は照射ＨＬＡ−Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ−２によって更に再刺激することができる。一部の実施形態において、再刺激は、第２の拡大培養の一部として生じる。一部の実施形態において、照射された自己リンパ球の存在下で、又は照射されたＨＬＡ−Ａ２＋同種リンパ球及びＩＬ−２とともに第２の拡大培養が発生する。
[00357] 一実施形態において、第２の拡大培養ステップのための細胞培養培地は、ＩＬ−２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００〜３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００〜４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００〜５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００〜６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００〜７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００〜８０００ＩＵ／ｍＬ、又は８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。
[00358] 一実施形態において、細胞培養培地は、ＯＫＴ−３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地はＯＫＴ−３抗体を含まない。一部の実施形態において、ＯＫＴ−３抗体はムロモナブである。
[00359] 一部の実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４−１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４−１ＢＢアゴニストであり、４−１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ−１０１、融合タンパク質、並びにそれらの断片、誘導体、変異体、バイオシミラー、及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、２０μｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
[00360] 一部の実施形態において、１つ以上のＴＮＦＲＳＦに加えて、細胞培養培地は、初期濃度約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び初期濃度約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を更に含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４−１ＢＢアゴニストを含む。
[00361] 一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及び／又はＩＬ−２１の組み合わせが、第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及び／又はＩＬ−２１、並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図１８による、並びに本明細書に記載されている通り、ステップＤプロセス中を含む、第２の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１の組み合わせが、第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１、並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図１８による、及び本明細書に記載されている通りステップＤプロセス中に含められ得る。
[00362] 一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、抗原提示フィーダー細胞、及び任意選択によりＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む添加細胞培養培地で実施されてもよい。一部の実施形態において、第２の拡大培養は添加細胞培養培地で行われる。一部の実施形態において、添加細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ；抗原提示フィーダー細胞とも称される）を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示フィーダー細胞を含む細胞培養培地で生じる（即ち、抗原提示細胞）。
[00363] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、乃至約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、乃至約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、乃至約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−１５を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。
[00364] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、乃至約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、乃至約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−２１を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。
[00365] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）はＰＢＭＣである。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣ及び／又は抗原提示細胞との比は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００、又は約１：５００である。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：５０〜１：３００である。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：１００〜１：２００である。
[00366] 一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、バルクＴＩＬを１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバに移すまで培地補充が行われる（一般的に新鮮培地による呼吸を介した３分の２の培地補充）。別の成長チャンバには、以下に更に十分に考察する通りのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
[00367] 一部の実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰプロセスと称されるプロセスを含み得る）は、実施例及び図で考察されるように、７〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、第２の拡大培養は１１日間に短縮される。
[00368] 一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、前述のように（Tran, et al., J. Immunother.2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother.2003, 26, 332-42）Ｔ−１７５フラスコ及び気体透過性バッグ又はガス透過性培養器具（G-Rexフラスコ）を使用して実施してもよい。一部の実施形態において、第２の拡大培養（急速拡大培養と称される拡大培養を含む）は、Ｔ−１７５フラスコで実施され、１５０ｍＬの培地に懸濁した約１×１０６個のＴＩＬを各Ｔ−１７５フラスコに加えてもよい。ＴＩＬは、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３を添加したＣＭ及びAIM-V培地の１対１の混合物で培養してもよい。Ｔ−１７５フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートしてもよい。培地の半分は、５日目に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む５０／５０培地を使用して交換されてもよい。一部の実施形態において、７日目に、２つのＴ−１７５フラスコからの細胞を３Ｌバッグに合わせることができ、その３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む３００ｍＬのAIM Vを加えた。毎日又は２日毎に各バッグの細胞数をカウントし、新鮮培地を加えて細胞数を０．５〜２．０×１０６細胞／ｍＬに保った。
[00369] 一実施形態において、第２の拡大培養（これはＲＥＰと称される拡大培養；並びに図１８のステップＤに参照されるものを含み得る）は、１００ｃｍガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量ガス透過性フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USAから市販されている）において実施され得、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を添加した４００ｍＬの５０／５０培地中で５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬをＰＢＭＣと培養し得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得る。５日目、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心し得る。５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬの新鮮培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻し加え得る。G-Rex 100フラスコ内でＴＩＬを連続的に拡大培養するときは、７日目に各G-Rex 100のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁してもよく、及び細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割してもよく、それらを３つのG-Rex 100フラスコの播種に使用し得る。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートしてもよく、４日後、各G-Rex100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを加え得る。細胞は培養１４日目に回収し得る。
[00370] 一実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、バルクＴＩＬを１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２と混合してフラスコ内で実施される。一部の実施形態において、細胞が別の成長チャンバに移されるまで培地交換が行われる。一部の実施形態において、培地の２／３が新鮮培地による呼吸に置き換えられる。一部の実施形態において、別の成長チャンバには、以下に更に十分に考察する通りのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
[00371] 一実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）が実施され、これは優れた腫瘍応答性に関してＴＩＬを選択するステップを更に含む。当該技術分野において公知の任意の選択方法を用いることができる。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号に記載されている方法は、優れた腫瘍反応性に関するＴＩＬの選択に使用され得る。
[00372] 任意選択で、第２の拡大培養（ＲＥＰ拡大培養と称される拡大培養を含む）の後に、当該技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬのサンプルに対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。一部の実施形態において、Cellometer K2自動セルカウンター（Nexcelom Bioscience、Lawrence, MA）を使用してＴＩＬサンプルをカウントし、生存率を決定することができる。
[00373] 一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、先述の通りＴ−１７５フラスコ及びガス透過性バッグ（Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751及びDudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342）又はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２の拡大培養はフラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、第２の拡大培養はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、第２の拡大培養はＴ−１７５フラスコで実施され、約１×１０６個のＴＩＬを約１５０ｍＬの培地中に懸濁し、これを各Ｔ−１７５フラスコに加える。ＴＩＬは、「フィーダー」細胞としての照射（５０Ｇｙ）された同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養し、及び細胞は、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を添加したＣＭとAIM-V培地との１対１混合物（５０／５０培地）で培養した。T-175フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートする。一部の実施形態において、培地は、５日目に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む５０／５０培地を使用して交換される。一部の実施形態において、７日目、２つのT-175フラスコからの細胞を３Ｌバッグに合わせ、その３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む３００ｍＬのAIM-Vを加える。毎日又は２日毎に各バッグの細胞数をカウントしてもよく、新鮮培地を加えて細胞数を約０．５〜約２．０×１０６細胞／ｍＬに保ち得る。
[00374] 一部の実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、１００ｃｍ２ガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf）において実施され（図１）、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を添加した４００ｍＬの５０／５０培地中で約５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬを照射同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養する。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされる。一部の実施形態において、５日目に、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１ｇ）で１０分間遠心する。次に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬの新鮮５０／５０培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex100フラスコに加え戻し得る。ＴＩＬがG-Rex100フラスコ内で連続的に拡大培養される実施形態において、７日目に各G-Rex100内のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁し、及び細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割しており、それらを３つのG-Rex100フラスコの播種に使用される。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを各フラスコに加える。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされ、４日後、各G-Rex100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを加える。細胞は培養１４日目に回収される。
[00375] Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメントＶ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）、及びＣ（定数）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第２の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性はＴ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／又はベータの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（即ち、ＴＣＲα／β）の発現が増加する。
[00376] 一部の実施形態において、第２の拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下で更に詳細に考察する通り、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、並びに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。
[00377] 一部の実施形態において、第２の拡大培養、例えば、図１８によるステップＤは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX -10又はG-REX -100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
フィーダー細胞及び抗原提示細胞
[00378] 一実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順（例えば、図１８のステップＤに記載された拡大培養、並びにＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＲＥＰ ＴＩＬ拡大培養中及び／又は第２の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。
[00379] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかにより不活性化され、同種異系ＰＢＭＣの複製能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する実施例に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用される。
[00380] 一部の実施形態において、１４日目の生細胞の総数がＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目に培養（即ち、第２の拡大培養の開始日）に移行した初期生細胞数より少ない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。
[00381] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ−２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち、第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。
[00382] 一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ−２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち、第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能とみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、５〜６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び１０００〜６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、１０〜５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００〜５０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２０〜４０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００〜４０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２５〜３５ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２５００〜３５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。
[00383] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞はＰＢＭＣである。一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は人工抗原提示フィーダー細胞である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は、約１対２５、約１対５０、約１対１００、約１対１２５、約１対１５０、約１対１７５、約１対２００、約１対２２５、約１対２５０、約１対２７５、約１対３００、約１対３２５、約１対３５０、約１対３７５、約１対４００、又は約１対５００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対５０〜１対３００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は１対１００〜１対２００である。
[00384] 一実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞と約１００×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞と約５０×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞と約２５×１０６個のＴＩＬを必要とする。
[00385] 一実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、第２の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。一実施形態において、ＰＢＭＣの代わりに人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞が使用される。
[00386] 一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかによって不活性化され、図及び実施例に記載された例示的な手順を含む、本明細書に記載されたＴＩＬ拡大培養手順で使用される。
[00387] 一実施形態において、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替として、又はそれと組み合わせて、第２の拡大培養で使用される。
サイトカイン
[00388] 本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当該技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にＩＬ−２を含む培養培地を使用する。
[00389] 或いは、ＴＩＬの急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することが更に可能であり、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１のうちの２つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第２０１５／１８９３５６号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（参照により全体として明示的に本明細書に組み込まれる）に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ−２とＩＬ−１５、ＩＬ−２とＩＬ−２１、ＩＬ−１５とＩＬ−２１とＩＬ−２、ＩＬ−１５とＩＬ−２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。
ステップＥ：ＴＩＬを回収する
[00390] 第２の拡大培養ステップの後、細胞は回収することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図１８に提供される通り、１、２、３、４回又はそれ以上の拡大培養ステップの後に回収される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図１８に提供される通り、２回の拡大培養ステップの後に回収される。
[00391] ＴＩＬは、例えば遠心によることを含め、任意の適切な且つ無菌の方法で回収することができる。ＴＩＬ回収方法は当該技術分野において周知であり、本プロセスと共に任意のかかる公知の方法を用いることができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは自動化系を使用して回収される。
[00392] セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、例えば、Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer、及びInotech Biosystems International, Inc.を含む様々な供給源から市販されている。任意選択の細胞ベースのハーベスターを本方法で使用することができる。一部の実施形態において、セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、膜ベースの細胞ハーベスターである。一部の実施形態において、細胞回収は、LOVO系（Fresenius Kabi製）などの細胞処理系を介して行われる。用語「LOVO細胞処理系」は、滅菌及び／又は閉鎖系環境で、回転膜又は回転フィルターなどの膜又はフィルターを通して細胞を含む溶液を送り出すことができ、ペレット化せず上清又は細胞培地を除去する連続フロー及び細胞処理を可能にする、あらゆる販売業者によって製造された機器又は装置も指す。一部の実施形態において、セルハーベスター及び／又は細胞処理系は、閉鎖、無菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮、及び／又は他の細胞処理ステップを実施することができる。
[00393] 一部の実施形態において、回収、例えば、図１８によるステップＥは、閉鎖系バイオリアクターから実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX -10又はG-REX -100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは単一のバイオリアクターである。
[00394] 一部の実施形態において、図１８によるステップＥは、実施例７に記載のプロセスに従って実施される。一部の実施形態において、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、閉鎖系は滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。一部の実施形態において、実施例７に記載されるような閉鎖系が使用される。
[00395] 一部の実施形態において、実施例に記載された方法に従ってＴＩＬが回収される。
ステップＦ：最終的な製剤化及び／又は輸注バッグへの移動
[00396] 図１８に例示的順序で提供される通りの、且つ上記及び本明細書に詳細に概説される通りのステップＡ〜Ｅが完了した後、細胞は患者への投与における使用のため容器に移される。一部の実施形態において、上記に記載される拡大培養方法を用いて治療上十分な数のＴＩＬが入手されると、ＴＩＬは患者への投与における使用のため容器に移される。
[00397] 一実施形態において、本開示のＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当該技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与されてよい。一部の実施形態において、Ｔ細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約３０〜６０分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内が挙げられる。
任意選択の細胞培地成分
１．抗ＣＤ３抗体
[00398] 一部の実施形態において、本明細書に記載の拡大培養方法で使用される培養培地（ＲＥＰと称されるものを含み、例えば、図１８を参照のこと）は、抗ＣＤ３抗体も含む。抗ＣＤ３抗体をＩＬ−２と併用すると、ＴＩＬ集団においてＴ細胞活性化及び細胞分裂が誘導される。この効果は完全長抗体並びにＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片で見ることができ、前者が概して好ましい；例えば、Tsoukas et al., J.Immunol.1985, 135, 1719（参照により全体として本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
[00399] 当業者が理解し得る通り、本発明において使用が見出される好適な抗ヒトＣＤ３抗体は、限定はされないが、ネズミ科動物、ヒト、霊長類、ラット、及びイヌ科動物抗体を含めた、様々な哺乳類からの抗ヒトＣＤ３ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含め、幾つも存在する。詳細な実施形態において、ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体が使用される（Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている）。
Figure 2020522516
２．４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト
[00400] 一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストである。４−１ＢＢアゴニストは、当該技術分野で公知の任意の４−１ＢＢ結合分子であり得る。４−１ＢＢ結合分子は、ヒト又は哺乳類４−１ＢＢに結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。４−１ＢＢアゴニスト又は４−１ＢＢ結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。４−１ＢＢアゴニスト又は４−１ＢＢ結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語はまた、抗体（全長抗体を含む）、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体、並びに抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片、及び４−１ＢＢに結合する抗体の操作された形態、例えばｓｃＦｖ分子、を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のための４−１ＢＢアゴニストは、抗４−１ＢＢ抗体、ヒト抗４−１ＢＢ抗体、マウス抗４−１ＢＢ抗体、哺乳動物抗４−１ＢＢ抗体、モノクローナル抗４−１ＢＢ抗体、ポリクローナル抗４−１ＢＢ抗体、キメラ抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢアドネクチン、抗４−１ＢＢドメイン抗体、単鎖抗４−１ＢＢ断片、重鎖抗４−１ＢＢ断片、軽鎖抗４−１ＢＢ断片、抗４−１ＢＢ融合タンパク質、及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、若しくはバイオシミラーを含む。アゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体は、強い免疫応答を誘導することが知られている。Lee, et al., PLOS One 2013, 8, e69677。好ましい実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、アゴニスト性、抗４−１ＢＢヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体（即ち、単一細胞株に由来する抗体）である。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ＥＵ−１０１（Eutilex Co. Ltd.）、ウトミルマブ、又はウレルマブ、又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、若しくはバイオシミラーである。好ましい一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブ又はウレルマブ、又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、若しくはバイオシミラーである。
[00401] 好ましい実施形態において、４−１ＢＢアゴニスト又は４−１ＢＢ結合分子は、融合タンパク質でもあり得る。好ましい実施形態において、三量体又は六量体４−１ＢＢアゴニスト（３つ又は６つのリガンド結合ドメインを有する）などの多量体４−１ＢＢアゴニストは、典型的には２つのリガンド結合ドメインを保有するアゴニスト性モノクローナル抗体と比較して、優れた受容体（４−１ＢＢＬ）のクラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。３つのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン及びＩｇＧ１−Ｆｃを含み、任意選択によりこれらの融合タンパク質の２つ以上を更に連結する、三量体（三価）又は六量体（又は六価）又はそれより大きい融合タンパク質は、例えば、Gieffers, et al., Mol.Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47に記載される。
[00402] アゴニスト性４−１ＢＢ抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘導することが知られている。好ましい実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、毒性を低減するのに十分な方法で４−１ＢＢ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、例えばＮＫ細胞の細胞傷害性を抑制する、アゴニスト性４−１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を抑制する、アゴニスト性４−１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を抑制する、アゴニスト性４−１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ領域機能性を抑制する、アゴニスト性４−１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。
[00403] 一部の実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、高い親和性及びアゴニスト活性でヒト４−１ＢＢ（配列番号９）に結合することを特徴とする。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ヒト４−１ＢＢ（配列番号９）に結合する結合分子である。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、マウス４−１ＢＢ（配列番号１０）に結合する結合分子である。４−１ＢＢアゴニスト又は結合分子が結合する４−１ＢＢ抗原のアミノ酸配列を表６に概括する。
Figure 2020522516
[00404] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス、及び方法は、約１００ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約９０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約８０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約７０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約６０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約５０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約４０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、又は約３０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合する、４−１ＢＢアゴニストを含む。
[00405] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス、及び方法は、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約８×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約８．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約９×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約９．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、又は約１×１０６ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合する、４−１ＢＢアゴニストを含む。
[00406] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス、及び方法は、約２×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．１×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．２×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．３×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．４×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．５×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．６×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、又は約２．７×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．８×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．９×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、又は約３×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合する、４−１ＢＢアゴニストを含む。
[00407] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス、及び方法は、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約９ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約８ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約７ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約６ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約５ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約４ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約３ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、又は約１ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合する、４−１ＢＢアゴニストを含む。
[00408] 好ましい実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ＰＦ−０５０８２５６６又はＭＯＲ−７４８０としても知られるウトミルマブ、又はその断片、誘導体、変異体、若しくはバイオシミラーである。ウトミルマブはPfizer, Inc.から入手できる。ウトミルマブは、免疫グロブリンＧ２−ラムダ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ９（腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー９、４−１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７）］、ヒト（Homo sapiens）（完全ヒト）モノクローナル抗体である。ウトミルマブのアミノ酸配列を表７に示す。ウトミルマブは、Ａｓｎ５９及びＡｓｎ２９２のグリコシル化部位；位置２２−９６（ＶＨ−ＶＬ）、１４３−１９９（ＣＨ１−ＣＬ）、２５６−３１６（ＣＨ２）及び３６２−４２０（ＣＨ３）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２２’−８７’（ＶＨ−ＶＬ）及び１３６’−１９５’（ＣＨ１−ＣＬ）の軽鎖内ジスルフィド架橋；ＩｇＧ２Ａアイソフォーム位置２１８−２１８、２１９−２１９、２２２−２２２、及び２２５−２２５、ＩｇＧ２Ａ／Ｂアイソフォーム位置２１８−１３０、２１９−２１９、２２２−２２２、及び２２５−２２５、並びにＩｇＧ２Ｂアイソフォーム位置２１９−１３０（２）、２２２−２２２、及び２２５−２２５の鎖内重鎖−重鎖ジスルフィド架橋；ＩｇＧ２Ａアイソフォーム位置１３０−２１３’（２）、ＩｇＧ２Ａ／Ｂアイソフォーム位置２１８−２１３’及び１３０−２１３’、並びにＩｇＧ２Ｂアイソフォーム位置２１８−２１３’（２）の鎖内重鎖−軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウトミルマブ並びにその変異体及び断片の調製並びに特性は、米国特許第８，８２１，８６７号；第８，３３７，８５０号；及び第９，４６８，６７８号、並びに国際公開第２０１２／０３２４３３ Ａ１号に記載され、これらのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み込まれる。ウトミルマブの前臨床的特徴は、Fisher, et al., Cancer Immunolog. & Immunother.2012, 61, 1721-33に記載される。様々な血液学的及び固形腫瘍の適応症におけるウトミルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０２４４４７９３、ＮＣＴ０１３０７２６７、ＮＣＴ０２３１５０６６、及びＮＣＴ０２５５４８１２が含まれる。
[00409] 一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号１１で示される重鎖及び配列番号１２で示される軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体、若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00410] 一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号１３に示される配列を含み、４−１ＢＢアゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号１４に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
[00411] 一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにそれらの保存的アミノ酸置換を含む。
[00412] 一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブに関して薬物規制当局によって承認された４−１ＢＢアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む４−１ＢＢ抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出された４−１ＢＢアゴニスト抗体であり、４−１ＢＢアゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。４−１ＢＢアゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。
Figure 2020522516
[00413] 好ましい実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ＢＭＳ−６６３５１３及び２０Ｈ４．９．ｈ４ａとしても知られるモノクローナル抗体ウレルマブ、又はその断片、誘導体、変異体、又はバイオシミラーである。ウレルマブは、Bristol-Myers Squibb, Inc.及びCreative Biolabs, Inc.から入手できる。ウレルマブは、免疫グロブリンＧ４−カッパ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ９（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９、４−１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７）］、ヒト（Homo sapiens）（完全ヒト）モノクローナル抗体である。ウレルマブのアミノ酸配列を表７に示す。ウレルマブは、位置２９８（及び２９８’’）のＮ−グリコシル化部位；位置２２−９５（ＶＨ−ＶＬ）、１４８−２０４（ＣＨ１−ＣＬ）、２６２−３２２（ＣＨ２）及び３６８−４２６（ＣＨ３）（並びに位置２２’’−９５’’、１４８’’−２０４’’、２６２’’−３２２’’及び３６８’’−４２６’’）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２３’−８８’（ＶＨ−ＶＬ）及び１３６’−１９６’（ＣＨ１−ＣＬ）（並びに位置２３’’’−８８’’’及び１３６’’’−１９６’’’）の軽鎖内ジスルフィド架橋；位置２２７−２２７’’及び２３０−２３０’’の鎖内重鎖−重鎖ジスルフィド架橋；並びに位置１３５−２１６’及び１３５’’−２１６’’’の鎖内重鎖−軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウレルマブ並びにその変異体及び断片の調製及び特性は、米国特許第７，２８８，６３８号及び第８，９６２，８０４号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ウレルマブの前臨床的及び臨床的特徴は、http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272で入手可能なSegal, et al., Clin.Cancer Res.2016に記載される。様々な血液学的及び固形腫瘍の適応症におけるウレルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０１７７５６３１、ＮＣＴ０２１１００８２、ＮＣＴ０２２５３９９２、及びＮＣＴ０１４７１２１０が含まれる。
[00414] 一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号２１で示される重鎖及び配列番号２２で示される軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体、若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00415] 一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ウレルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号２３に示される配列を含み、４−１ＢＢアゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号２４に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
[00416] 一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00417] 一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ウレルマブに関して薬物規制当局によって承認された４−１ＢＢアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む４−１ＢＢ抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出された４−１ＢＢアゴニスト抗体であり、４−１ＢＢアゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。４−１ＢＢアゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。
Figure 2020522516
[00418] 一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、１Ｄ８、３Ｅｌｏｒ、４Ｂ４（BioLegend 309809）、Ｈ４−１ＢＢ−Ｍ１２７（BD Pharmingen 552532）、ＢＢＫ２（Thermo Fisher MS621PABX）、１４５５０１（Leinco Technologies B591）、ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１１２４８として寄託され、米国特許第６，９７４，８６３号に開示されている細胞株によって産生される抗体、５Ｆ４（BioLegend 31 1503）、Ｃ６５−４８５（BD Pharmingen 559446）、米国特許出願公開第２００５／００９５２４４号に開示されている抗体、米国特許第７，２８８，６３８号に開示されている抗体（２０Ｈ４．９−ＩｇＧｌ（ＢＭＳ−６６３０３１）など）、同第６，８８７，６７３号に開示されている抗体（４Ｅ９又はＢＭＳ−５５４２７１など）、同第７，２１４，４９３号に開示されている抗体、同第６，３０３，１２１号に開示されている抗体、同第６，５６９，９９７号に開示されている抗体、同第６，９０５，６８５号に開示されている抗体（４Ｅ９又はＢＭＳ−５５４２７１など）、同第６，３６２，３２５号に開示されている抗体（１Ｄ８又はＢＭＳ−４６９４９２；３Ｈ３又はＢＭＳ−４６９４９７；又は３Ｅｌなど）、同第６，９７４，８６３号に開示されている抗体（５３Ａ２など）；同第６，２１０，６６９号に開示されている抗体（１Ｄ８、３Ｂ８、又は３Ｅ１など）、同第５，９２８，８９３号に記載されている抗体、同第６，３０３，１２１号に開示されている抗体、同第６，５６９，９９７号に開示されている抗体、国際公開第２０１２／１７７７８８号、同第２０１５／１１９９２３号、及び同第２０１０／０４２４３３号に開示されている抗体、並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、又はバイオシミラー、からなる群から選択され、ここで、前述の特許又は特許出願公開のそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00419] 一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、国際公開第２００８／０２５５１６ Ａ１号、同第２００９／００７１２０ Ａ１号、同第２０１０／００３７６６ Ａ１号、同第２０１０／０１００５１ Ａ１号、及び同第２０１０／０７８９６６ Ａ１号；米国特許出願公開第２０１１／００２７２１８ Ａ１号、同第２０１５／０１２６７０９ Ａ１号、同第２０１１／０１１１４９４ Ａ１号、同第２０１５／０１１０７３４ Ａ１号、及び同第２０１５／０１２６７１０ Ａ１号；並びに米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号、及び同第８，４５０，４６０号に記載されている４−１ＢＢアゴニスト性融合タンパク質であり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
[00420] 一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、構造Ｉ−Ａ（Ｃ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）又は構造Ｉ−Ｂ（Ｎ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）に示される４−１ＢＢアゴニスト性融合タンパク質、又はその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、若しくはバイオシミラーである。
Figure 2020522516
[00421] 構造Ｉ−Ａ及びＩ−Ｂにおいて、円柱は個々のポリペプチド結合ドメインを指す。構造Ｉ−Ａ及びＩ−Ｂは、例えば、４−１ＢＢＬ、又は４−１ＢＢに結合する抗体、に由来する、３つの直鎖状に連結されたＴＮＦＲＳＦ結合ドメインを含み、これは折り畳まれて三価タンパク質を形成し、次いで、ＩｇＧ１−Ｆｃ（ＣＨ３及びＣＨ２ドメインを含む）を介して第２の三価（triavelent）タンパク質に連結され、次いで、これはジスルフィド結合（小さな細長い楕円形）を介して２つの三価タンパク質を連結するために使用され、構造を安定化し、６つの受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン及びシグナル伝達タンパク質をあわせてシグナル伝達複合体を形成できるアゴニストを提供する。円柱として示されるＴＮＦＲＳＦ結合ドメインは、例えば、親水性残基並びに柔軟性のためのＧｌｙ及びＳｅｒ配列、並びに溶解性のためのＧｌｕ及びＬｙｓを含み得るリンカーにより接続されたＶＨ及びＶＬ鎖を含む、ｓｃＦｖドメインであり得る。de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44；Ahmad, et al., Clin. & Dev.Immunol.2012, 980250；Monnier, et al., Antibodies, 2013, 2, 193-208；又は、本明細書の別の箇所に組み込まれた参考文献に記載されているものなどの任意のｓｃＦｖドメイン設計が使用され得る。この形態の融合タンパク質構造は、米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号、及び同第８，４５０，４６０号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
[00422] 構造Ｉ−Ａの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表９に示す。Ｆｃドメインは、好ましくは、完全定常ドメイン（配列番号３１のアミノ酸１７〜２３０）、完全ヒンジドメイン（配列番号３１のアミノ酸１〜１６）又はヒンジドメインの一部（例えば、配列番号３１のアミノ酸４〜１６）を含む。Ｃ末端Ｆｃ抗体を接続するための好ましいリンカーは、追加的ポリペプチドの融合に適したリンカーを含む、配列番号３２〜配列番号４１に示される実施形態から選択され得る。
Figure 2020522516
[00423] 構造Ｉ−Ｂの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表１０に示す。構造Ｉ−ＢのようにＦｃ抗体断片がＴＮＲＦＳＦ融合タンパク質のＮ末端に融合される場合、Ｆｃモジュールの配列は好ましくは配列番号４２に示されるものであり、リンカー配列は好ましくは配列番号４３〜配列番号４５に示される実施形態から選択される。
Figure 2020522516
[00424] 一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウレルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、表９に記載されている可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、上記の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ、並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、及びバイオシミラーからなる群から選択される１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含む。
[00425] 一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、４−１ＢＢＬ配列を含む１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、配列番号４６による配列を含む１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、可溶性４−１ＢＢＬ配列を含む１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、配列番号４７による配列を含む１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含む。
[00426] 一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、表１１に示されるＶＨ及びＶＬ配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。
Figure 2020522516
[00427] 一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性４−１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性４−１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性４−１ＢＢ結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインである。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性４−１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性４−１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性４−１ＢＢ結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインであり、可溶性４−１ＢＢドメインのそれぞれは、ストーク領域（三量体化に寄与し、細胞膜まで一定の距離を提供するが、４−１ＢＢ結合ドメインの一部ではない）を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３〜８アミノ酸長を有する。
[00428] 一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、を含む４−１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、ここで、可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインのそれぞれは、ストーク領域を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３〜８アミノ酸長を有し、各ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインは４−１ＢＢ結合ドメインである。
[00429] 一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、前述のＶＬドメインのいずれかに連結された前述のＶＨドメインのいずれかを含む４−１ＢＢアゴニスト性ｓｃＦｖ抗体である。
[00430] 一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、BPS Bioscience４−１ＢＢアゴニスト抗体カタログ番号７９０９７−２であり、これはBPS Bioscience, San Diego, CA, USAから市販されている。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、Creative Biolabs４−１ＢＢアゴニスト抗体カタログ番号ＭＯＭ−１８１７９であり、これはCreative Biolabs, Shirley, NY, USAから市販されている。
３．ＯＸ４０（ＣＤ１３４）アゴニスト
[00431] 一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）アゴニストである。ＯＸ４０アゴニストは、当該技術分野で公知の任意のＯＸ４０結合分子であり得る。ＯＸ４０結合分子は、ヒト又は哺乳類ＯＸ４０に結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。ＯＸ４０アゴニスト又はＯＸ４０結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。ＯＸ４０アゴニスト又はＯＸ４０結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語はまた、抗体（全長抗体を含む）、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体、並びに抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片、及びＯＸ４０に結合する抗体の操作された形態、例えばｓｃＦｖ分子、を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のためのＯＸ４０アゴニストは、抗ＯＸ４０抗体、ヒト抗ＯＸ４０抗体、マウス抗ＯＸ４０抗体、哺乳動物抗ＯＸ４０抗体、モノクローナル抗ＯＸ４０抗体、ポリクローナル抗ＯＸ４０抗体、キメラ抗ＯＸ４０抗体、抗ＯＸ４０アドネクチン、抗ＯＸ４０ドメイン抗体、単鎖抗ＯＸ４０断片、重鎖抗ＯＸ４０断片、軽鎖抗ＯＸ４０断片、抗ＯＸ４０融合タンパク質、及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、若しくはバイオシミラーを含む。好ましい実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、アゴニスト性、抗ＯＸ４０ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体（即ち、単一細胞株に由来する抗体）である。
[00432] 好ましい実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト又はＯＸ４０結合分子は、融合タンパク質でもあり得る。ＯＸ４０Ｌに融合したＦｃドメインを含むＯＸ４０融合タンパク質は、例えば、Sadun, et al., J. Immunother.2009, 182, 1481-89に記載されている。好ましい実施形態において、三量体又は六量体ＯＸ４０アゴニスト（３つ又は６つのリガンド結合ドメインを有する）などの多量体ＯＸ４０アゴニストは、典型的には２つのリガンド結合ドメインを保有するアゴニスト性モノクローナル抗体と比較して、優れた受容体（ＯＸ４０Ｌ）のクラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。３つのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン及びＩｇＧ１−Ｆｃを含み、任意選択によりこれらの融合タンパク質の２つ以上を更に連結する、三量体（三価）又は六量体（又は六価）又はそれより大きい融合タンパク質は、例えば、Gieffers, et al., Mol.Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47に記載される。
[00433] アゴニスト性ＯＸ４０抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘発することが知られている。Curti, et al., Cancer Res.2013, 73, 7189-98。好ましい実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、毒性を低減するのに十分な方法でＯＸ４０抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、例えばＮＫ細胞の細胞傷害性を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｆｃ領域機能性を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。
[00434] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、高い親和性及びアゴニスト活性でヒトＯＸ４０（配列番号５４）に結合することを特徴とする。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、ヒトＯＸ４０（配列番号５４）に結合する結合分子である。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、マウスＯＸ４０（配列番号５５）に結合する結合分子である。ＯＸ４０アゴニスト又は結合分子が結合するＯＸ４０抗原のアミノ酸配列を表１２に概括する。
Figure 2020522516
[00435] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス、及び方法は、約１００ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約７０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約６０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約５０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約４０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約３０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
[00436] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス、及び方法は、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約７．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９．５×１０５ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約１×１０６ １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
[00437] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス、及び方法は、約２×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．１×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．２×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．３×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．４×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．５×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．６×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約２．７×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．８×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．９×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約３×１０−５ １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
[00438] 一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス、及び方法は、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約７ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約６ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約５ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約４ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約３ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約１ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
[00439] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、ＭＥＤＩ０５６２又はＭＥＤＩ−０５６２としても知られるタボリキシズマブである。タボリキシズマブは、AstraZeneca, Incの子会社MedImmuneから入手できる。タボリキシズマブは、免疫グロブリンＧ１−カッパ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ４（腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー４、ＯＸ４０、ＣＤ１３４）］、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体である。タボリキシズマブのアミノ酸配列を表１３に示す。タボリキシズマブは、フコシル化複合二分岐ＣＨＯ型グリカンを伴い位置３０１及び３０１’’のＮ−グリコシル化部位；位置２２−９５（ＶＨ−ＶＬ）、１４８−２０４（ＣＨ１−ＣＬ）、２６５−３２５（ＣＨ２）及び３７１−４２９（ＣＨ３）（並びに位置２２’’−９５’’、１４８’’−２０４’’、２６５’’−３２５’’及び３７１’’−４２９’’）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２３’−８８’（ＶＨ−ＶＬ）及び１３４’−１９４’（ＣＨ１−ＣＬ）（並びに位置２３’’’−８８’’’及び１３４’’’−１９４’’’）の軽鎖内ジスルフィド架橋；位置２３０−２３０’’及び２３３−２３３’’の鎖内重鎖−重鎖ジスルフィド架橋；並びに位置２２４−２１４’及び２２４’’−２１４’’’の鎖内重鎖−軽鎖ジスルフィド架橋を含む。様々な固形腫瘍の適応症におけるタボリキシズマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０２３１８３９４及びＮＣＴ０２７０５４８２が含まれる。
[00440] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号５６で示される重鎖及び配列番号５７で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体、若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00441] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、タボリキシズマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号５８に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号５９に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
[00442] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６０、配列番号６１、及び配列番号６２に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00443] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、タボリキシズマブに関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。
Figure 2020522516
[00444] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは１１Ｄ４であり、これはPfizer, Inc.から入手可能な完全ヒト抗体である。１１Ｄ４の調製及び特性は、米国特許第７，９６０，５１５号；同第８，２３６，９３０号；及び同第９，０２８，８２４号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。１１Ｄ４のアミノ酸配列を表１４に示す。
[00445] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号６６で示される重鎖及び配列番号６７で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体、若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00446] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１１Ｄ４の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号６８に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号６９に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00447] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号７３、配列番号７４、及び配列番号７５に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00448] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１１Ｄ４に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。
Figure 2020522516
[00449] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは１８Ｄ８であり、これはPfizer, Inc.から入手可能な完全ヒト抗体である。１８Ｄ８の調製及び特性は、米国特許第７，９６０，５１５号；同第８，２３６，９３０号；及び同第９，０２８，８２４号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。１８Ｄ８のアミノ酸配列を表１５に示す。
[00450] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号７６で示される重鎖及び配列番号７７で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体、若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
[00451] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１８Ｄ８の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号７８に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号７９に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00452] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８０、配列番号８１、及び配列番号８２に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号８３、配列番号８４、及び配列番号８５に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00453] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１８Ｄ８に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。
Figure 2020522516
[00454] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＨｕ１１９−１２２であり、これはGlaxoSmithKline plc.から入手可能なヒト化抗体である。Ｈｕ１１９−１２２の調製及び特性は、米国特許第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号、並びに国際公開第２０１２／０２７３２８号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。Ｈｕ１１９−１２２のアミノ酸配列を表１６に示す。
[00455] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１１９−１２２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号８６に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号８７に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00456] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８８、配列番号８９、及び配列番号９０に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号９１、配列番号９２、及び配列番号９３に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00457] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１１９−１２２に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９−１２２である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９−１２２である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９−１２２である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９−１２２である。
Figure 2020522516
[00458] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＨｕ１０６−２２２であり、これはGlaxoSmithKline PLC.から入手可能なヒト化抗体である。Ｈｕ１０６−２２２の調製及び特性は、米国特許第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号、並びに国際公開第２０１２／０２７３２８号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。Ｈｕ１０６−２２２のアミノ酸配列を表１７に示す。
[00459] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１０６−２２２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号９４に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号９５に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
[00460] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９６、配列番号９７、及び配列番号９８に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換、並びにそれぞれ配列番号９９、配列番号１００、及び配列番号１０１に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
[00461] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１０６−２２２に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６−２２２である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された、又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６−２２２である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていてもよい。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６−２２２である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６−２２２である。
Figure 2020522516
[00462] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト抗体はＭＥＤＩ６４６９（９Ｂ１２とも称される）である。ＭＥＤＩ６４６９はマウスモノクローナル抗体である。Weinberg, et al., J. Immunother.2006, 29, 575-585。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Weinberg, et al., J. Immunother.2006, 29, 575-585に記載されているように、Biovest Inc.（Malvern, MA, USA）に寄託された、９Ｂ１２ハイブリドーマによって産生される抗体であり、その開示は参照により全体として本明細書に組み込まれる。一部の実施形態において、抗体は、ＭＥＤＩ６４６９のＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、抗体は、ＭＥＤＩ６４６９の重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。
[00463] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｌ１０６ ＢＤ（Pharmingen Product #340420）である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体Ｌ１０６（BD Pharmingen Product #340420）のＣＤＲを含む。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体Ｌ１０６（BD Pharmingen Product #340420）の重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＡＣＴ３５（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号２００７３）である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体ＡＣＴ３５（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号２００７３）のＣＤＲを含む。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体ＡＣＴ３５（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号２００７３）の重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、マウスモノクローナル抗体抗ｍＣＤ１３４／ｍＯＸ４０（クローンＯＸ８６）であり、InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NHから市販されている。
[00464] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、国際公開第９５／１２６７３号、同第９５／２１９２５号、同第２００６／１２１８１０号、同第２０１２／０２７３２８号、同第２０１３／０２８２３１号、同第２０１３／０３８１９１号、及び同第２０１４／１４８８９５号；欧州特許第０６７２１４１号；米国特許出願公開第２０１０／１３６０３０号、同第２０１４／３７７２８４号、同第２０１５／１９０５０６号、及び同第２０１５／１３２２８８号；並びに米国特許第７，５０４，１０１号、同第７，５５０，１４０号、同第７，６２２，４４４号、同第７，６９６，１７５号、同第７，９６０，５１５号、同第７，９６１，５１５号、同第８，１３３，９８３号、同第９，００６，３９９号、及び同第９，１６３，０８５号（２０Ｅ５及び１２Ｈ３を含む）に記載されるＯＸ４０アゴニストから選択され、それぞれの開示は、全ての目的、特にＯＸ４０アゴニスト及びそれらの使用に関する全ての教示について、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[00465] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、構造Ｉ−Ａ（Ｃ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）又は構造Ｉ−Ｂ（Ｎ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）に示されるＯＸ４０アゴニスト性融合タンパク質、又はその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、若しくはバイオシミラーである。構造Ｉ−Ａ及びＩ−Ｂの特性は、上記並びに米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号、及び同第８，４５０，４６０号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。構造Ｉ−Ａのポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表９に示す。Ｆｃドメインは、好ましくは、完全定常ドメイン（配列番号３１のアミノ酸１７〜２３０）、完全ヒンジドメイン（配列番号３１のアミノ酸１〜１６）又はヒンジドメインの一部（例えば、配列番号３１のアミノ酸４〜１６）を含む。Ｃ末端Ｆｃ抗体を接続するための好ましいリンカーは、追加的ポリペプチドの融合に適したリンカーを含む、配列番号３２〜配列番号４１に示される実施形態から選択され得る。同様に、構造Ｉ−Ｂのポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表１０に示す。構造Ｉ−ＢのようにＦｃ抗体断片がＴＮＲＦＳＦ融合タンパク質のＮ末端に融合される場合、Ｆｃモジュールの配列は好ましくは配列番号４２に示されるものであり、リンカー配列は好ましくは配列番号４３〜配列番号４５に示される実施形態から選択される。
[00466] 一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、タボリキシズマブの可変重鎖及び可変軽鎖、１１Ｄ４の可変重鎖及び可変軽鎖、１８Ｄ８の可変重鎖及び可変軽鎖、Ｈｕ１１９−１２２の可変重鎖及び可変軽鎖、Ｈｕ１０６−２２２の可変重鎖及び可変軽鎖、表１７に記載されている可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、上記の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ、並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体、及びバイオシミラーからなる群から選択される１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。
[00467] 一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、ＯＸ４０Ｌ配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１０２による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、可溶性ＯＸ４０Ｌ配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１０３による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１０４による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。
[00468] 一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、表１８に示されるＶＨ及びＶＬ配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。
Figure 2020522516
Figure 2020522516
[00469] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＯＸ４０結合ドメインを含むＯＸ４０アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインである。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＯＸ４０結合ドメインを含むＯＸ４０アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインであり、可溶性ＯＸ４０結合ドメインのそれぞれは、ストーク領域（三量体化に寄与し、細胞膜まで一定の距離を提供するが、ＯＸ４０結合ドメインの一部ではない）を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３〜８アミノ酸長を有する。
[00470] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、を含むＯＸ４０アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、ここで、可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインのそれぞれは、ストーク領域を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３〜８アミノ酸長を有し、ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインはＯＸ４０結合ドメインである。
[00471] 一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＭＥＤＩ６３８３である。ＭＥＤＩ６３８３はＯＸ４０アゴニスト性融合タンパク質であり、米国特許第６，３１２，７００号に記載されているように調製することができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
[00472] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、前述のＶＬドメインのいずれかに連結された前述のＶＨドメインのいずれかを含むＯＸ４０アゴニスト性ｓｃＦｖ抗体である。
[00473] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Creative BiolabsＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体ＭＯＭ−１８４５５であり、これはCreative Biolabs, Inc., Shirley, NY, USAから市販されている。
[00474] 一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、BioLegend, Inc., San Diego, CA, USAから市販されているＯＸ４０アゴニスト性抗体クローンＢｅｒ−ＡＣＴ３５である。
任意選択の細胞生存率分析
[00475] 任意選択で、第１の拡大培養（初めのバルク拡大培養と称されることがある）の後に、当該技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬのサンプルに対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。生存率の試験に用いられる他のアッセイとしては、限定はされないが、アラマーブルーアッセイ；及びＭＴＴアッセイを挙げることができる。
１．細胞数、生存率、フローサイトメトリー
[00476] 一部の実施形態において、細胞数及び／又は生存率が測定される。限定はされないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ５６などのマーカー、並びに本明細書に開示又は記載される任意の他のものの発現を抗体によるフローサイトメトリー、例えば限定はされないが、FACSCanto（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences）を使用してBD Bio-sciences（BD Biosciences、San Jose, CA）から市販されているものによって測定することができる。細胞は、ディスポーザブルc-chip血球計算盤（VWR、Batavia, IL）を使用して手動でカウントすることができ、及び生存率は、限定はされないがトリパンブルー染色を含め、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて評価することができる。細胞生存率はまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ １５／８６３，６３４に基づいてアッセイすることができる。
[00477] ある場合には、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察するプロトコルを用いて直ちに凍結保存することができる。或いは、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察する通り、ＲＥＰに供し、次に凍結保存してもよい。同様に、療法において遺伝子修飾ＴＩＬが使用されることになる場合、バルク又はＲＥＰ ＴＩＬ集団を好適な処置のための遺伝子修飾に供してもよい。
[00478] 本開示によれば、ＴＩＬの生存率をアッセイする方法及び／又は対象への投与における更なる使用。一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（tumor infiltratitng lymphocyte）（ＴＩＬ）のアッセイ方法は、
（ｉ）第１のＴＩＬ集団を入手すること；
（ｉｉ）ＩＬ−２、及び任意選択によりＯＫＴ−３、を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；及び
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団より少なくとも５０倍数が多いこと；
（ｉｖ）第３のＴＩＬ集団を回収し、洗浄し、及び凍結保存すること；
（ｖ）凍結保存ＴＩＬを極低温で貯蔵すること；
（ｖｉ）第３のＴＩＬ集団を解凍して解凍された第３のＴＩＬ集団を提供すること；及び
（ｖｉｉ）第３の集団の細胞培養培地にＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及びＡＰＣを添加することにより、解凍された第３のＴＩＬ集団の一部の追加的な第２の拡大培養を少なくとも３日の追加的拡大培養期間（ｒｅＲＥＰ期間と称される場合もある）にわたって実施することであって、この第３の拡大培養を実施して第４のＴＩＬ集団を入手し、第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数を第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と比較して比を求めること；
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の比に基づき、解凍されたＴＩＬ集団が患者への投与に好適かどうかを決定すること；
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）において第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５：１より大きいと決定されるとき、治療上有効な投薬量の解凍された第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
[00479] 一部の実施形態において、ＴＩＬはステップ（ｖｉｉ）の後に生存率に関してアッセイされる。
[00480] 本開示はまた、更なるＴＩＬのアッセイ方法も提供する。一部の実施形態において、本開示は、ＴＩＬのアッセイ方法を提供し、この方法は、
（ｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を入手すること；
（ｉｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を解凍すること；
（ｉｉｉ）ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の一部を少なくとも３日の追加的拡大培養期間（ｒｅＲＥＰ期間と称される場合もある）にわたって培養することにより第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１のＴＩＬ集団からの一部を第２のＴＩＬ集団と比較してＴＩＬ数の比を求め、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比が５：１より大きいこと；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の比に基づき、第１のＴＩＬ集団が患者への治療的投与における使用に好適かどうかを決定すること；
（ｖ）ステップ（ｉｖ）において第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５：１より大きいと決定されるとき、第１のＴＩＬ集団が治療的投与における使用に好適であると決定すること
を含む。
[00481] 一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比は５０：１より大きい。
[00482] 一部の実施形態において、本方法は、本明細書に提供される任意の実施形態に記載される通りの方法によりステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体の拡大培養を実施することを更に含む。
[00483] 一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体を患者に投与することを更に含む。
２．細胞培養
[00484] 一実施形態において、ＴＩＬの拡大培養方法は、上記で考察され図１８で例示されているものを含み、約５，０００ｍＬ〜約２５，０００ｍＬの細胞培地、約５，０００ｍＬ〜約１０，０００ｍＬの細胞培地、又は約５，８００ｍＬ〜約８，７００ｍＬの細胞培地を使用することを含み得る。一部の実施形態において、培地は無血清培地である。一部の実施形態において、第１の拡大培養の培地は無血清である。一部の実施形態において、第２の拡大培養の培地は無血清である。一部の実施形態において、第１及び第２の拡大培養の培地は双方とも無血清である。一実施形態において、ＴＩＬ数の拡大には１種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地、例えば、AIM-V細胞培地（Ｌ−グルタミン、５０μＭ硫酸ストレプトマイシン、及び１０μＭ硫酸ゲンタマイシン）細胞培養培地（Invitrogen、Carlsbad CA）を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、ＴＩＬ数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。一実施形態において、ＴＩＬの数を拡大することは、３日又は４日に１回以下の頻度で細胞にフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内の細胞数を増やすことは、細胞を拡大培養するのに必要なフィード頻度を減らすことによって細胞数を増やすのに必要な手順を単純化する。
[00485] 一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地は濾過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞数を拡大培養させるために必要な手順を単純化し得る。一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地は、ベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を欠いている。
[00486] 一実施形態において、哺乳類から腫瘍組織サンプルを入手すること；細胞培地が中に入った第１のガス透過性容器内で腫瘍組織サンプルを培養すること；腫瘍組織サンプルからＴＩＬを入手すること；細胞培地を含有する第２のガス透過性容器内でＴＩＬ数を約７〜１４日間、例えば約１１日間拡大することを含む本方法の所要期間。一部の実施形態において、プレＲＥＰは約７〜１４日間、例えば、約１１日間である。一部の実施形態において、ＲＥＰは約７〜１４日間、例えば、約１１日間である。
[00487] 一実施形態において、ＴＩＬはガス透過性容器内で拡大培養する。ガス透過性容器は、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含め、当該技術分野において公知の方法、組成物、及び装置を用いたＰＢＭＣを使用したＴＩＬの拡大培養に用いられている。一実施形態において、ＴＩＬはガス透過性バッグ内で拡大培養される。一実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）などの、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、及び約１０Ｌからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。
[00488] 一実施形態において、ＴＩＬはG-Rexフラスコ（Wilson Wolf Manufacturingから市販されている）において拡大培養することができる。かかる実施形態は、細胞集団を約５×１０５細胞／ｃｍ２から１０×１０６〜３０×１０６細胞／ｃｍ２へと拡大培養することを可能にする。一実施形態において、これはフィードを伴わない。一実施形態において、これは、G-Rexフラスコ内に約１０ｃｍの高さの培地がある限りフィードなしである。一実施形態において、これにフィードはないが、１つ以上のサイトカインが加えられる。一実施形態において、サイトカインを培地と混合する必要なく、サイトカインをボーラスとして添加することができる。かかる容器、装置、及び方法は当該技術分野において公知で、ＴＩＬの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７ Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８ Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０ Ｂ２号、国際公開第２０１１／０７２０８８ Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３ Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５ Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０ Ｂ２号、国際公開第２０１３／１７３８３５ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６ Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものが含まれる。かかるプロセスはまた、Jin et al., J.Immunotherapy, 2012, 35:283-292.にも記載されている。
任意選択のＴＩＬ遺伝子操作
[00489] 一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択で、限定はされないが、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ−１、ＨＥＲ２、若しくはＮＹ−ＥＳＯ−１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ、又は腫瘍関連細胞表面分子（例えばメソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えばＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、追加的な機能性を含むように遺伝子操作される。
任意選択のＴＩＬ凍結保存
[00490] 上記で考察し、及び図１８に提供されるステップＡ〜Ｅにおいて例示した通り、ＴＩＬ拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、（例えば、図１８のステップＤに従って提供される）第２の拡大培養後の拡大培養されたＴＩＬ集団は、凍結保存することができる。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中にＴＩＬ集団を置くことにより達成し得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、−８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択で凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照のこと。一部の実施形態において、ＴＩＬは５％ＤＭＳＯ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは細胞培養培地＋５％ＤＭＳＯ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、実施例１０に提供される方法に従い凍結保存される。
[00491] 適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は概して完全培地中に再懸濁され、任意選択で１回以上洗浄される。一部の実施形態において、当該技術分野において公知の通り解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
ＴＩＬ製造用閉鎖系
[00492] 本発明は、ＴＩＬ培養プロセス中の閉鎖系の使用を提供する。かかる閉鎖系は、微生物汚染の防止及び／又は削減を可能にし、使用するフラスコの数が少なくなり、コスト削減が可能となる。一部の実施形態において、閉鎖系は２つの容器を使用する。
[00493] かかる閉鎖系は、当該技術分野で公知であり、例えば、http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及びhttps://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm.に記載されている。
[00494] 滅菌接続装置（ＳＴＣＤ：Sterile Connecting Device）は、互換性のある２つの配管の間に滅菌溶接を産生する。この手順により、様々な直径の容器及びチューブを滅菌接続できる。一部の実施形態において、閉鎖系は、ルアーロック及びヒートシール系を含む。一部の実施形態において、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、閉鎖系は滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。一部の実施形態において、実施例に記載されるような閉鎖系が使用される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、実施例に記載される方法に従って最終産物製剤容器中に製剤化される。
[00495] 一部の実施形態において、閉鎖系は、腫瘍断片が得られた時点からＴＩＬが患者への投与又は凍結保存の準備が整うまで１つの容器を使用する。一部の実施形態において、２つの容器が使用される場合、第１の容器は閉鎖型Ｇコンテナであり、ＴＩＬ集団は遠心され、第１の閉鎖型Ｇコンテナを開かずに輸注バッグに移される。一部の実施形態において、２つの容器が使用される場合、輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。閉鎖系又は閉鎖ＴＩＬ細胞培養系は、腫瘍サンプル及び／又は腫瘍断片が追加されると、系が外側からしっかりと密閉され、細菌、真菌、及び／又はその他の微生物汚染がない閉鎖環境を形成することを特徴とする。
[00496] 一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約５％〜約１００％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約５％〜約９５％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約５％〜約９０％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約１０％〜約９０％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は約１５％〜約８５％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％である。
[00497] 閉鎖系は、微生物汚染の不在下及び／又は大幅に減少させＴＩＬを成長させる。
[00498] 更に、ＴＩＬ細胞培養環境のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧は、細胞が培養されるにつれてそれぞれ変化する。したがって、たとえ細胞培養に適した培地が流通していても、ＴＩＬ成長に最適な環境として閉鎖環境を常に維持する必要がある。このため、閉鎖環境の培地内のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧の物理的要因は、センサーによって監視され、そのセンサーの信号は、培養環境の入口に設置されたガス交換器の制御に使用され、閉鎖環境のガス分圧は、細胞培養環境を最適化するため、培地の変化に従ってリアルタイムで調製されることが望ましい。一部の実施形態において、本発明は、閉鎖環境への入口に、閉鎖環境のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧を測定し、監視装置からの信号に基づいてガス濃度を自動的に調製することにより、細胞培養環境を最適化する監視装置を備えたガス交換器を一体化した閉鎖細胞培養系を提供する。
[00499] 一部の実施形態において、閉鎖環境内の圧力は連続的又は断続的に制御される。つまり、閉鎖環境内の圧力は、例えば、圧力維持装置によって変化させることができ、即ち、空間が、陽圧状態のＴＩＬの成長に適していることを保証するか、又は陰圧状態の流体の滲出を促進し、ひいては、細胞成長を促進することを確実にする。更に、断続的に負圧を加えることにより、閉鎖環境の容積の一時的な収縮によって閉鎖環境内の循環液を均一且つ効率的に交換することが可能である。
[00500] 一部の実施形態において、ＴＩＬの成長に最適な培養成分を置換又は追加することができ、ＩＬ−２及び／又はＯＫＴ３などの要因、並びに組み合わせを追加してもよい。
任意選択のＴＩＬ凍結保存
[00501] バルクＴＩＬ集団又はＴＩＬの拡大培養集団のいずれかを、必要に応じて凍結保存できる。一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団で凍結保存が行われる。一部の実施形態において、凍結保存は、第２の拡大培養後に回収したＴＩＬで生じる。一部の実施形態において、図１８の例示的ステップＦのＴＩＬで凍結保存が行われる。一部の実施形態において、ＴＩＬは輸注バッグ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、輸注バッグでの置換前に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、凍結保存されるが輸注バッグ中には置かれない。一部の実施形態において、凍結保存は凍結保存培地を使用して実施される。一部の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する。これは、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中にＴＩＬ集団を入れることにより達成される。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、−８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択で凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照のこと。
[00502] 適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は概して完全培地中に再懸濁され、任意選択で１回以上洗浄される。一部の実施形態において、当該技術分野において公知の通り解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
[00503] 好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団はＣＳ１０凍結保存培地（CryoStor 10、BioLife Solutions）を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は凍結保存培地（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する）を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は、１：１（容積：容積）の比のＣＳ１０及び細胞培養培地を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は、約１：１（容積：容積）の比のＣＳ１０及び細胞培養培地を使用し、更に追加のＩＬ−２を含んで凍結保存される。
[00504] 上記でステップＡ〜Ｅにおいて考察した通り、ＴＩＬ拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、ステップＢに係る第１の拡大培養後のバルクＴＩＬ集団又はステップＤに係る１回以上の第２の拡大培養後の拡大培養ＴＩＬ集団が凍結保存されてもよい。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中にＴＩＬ集団を置くことにより達成し得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、−８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択で凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照のこと。
[00505] 適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は概して完全培地中に再懸濁され、任意選択で１回以上洗浄される。一部の実施形態において、当該技術分野において公知の通り解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
[00506] ある場合には、ステップＢのＴＩＬ集団は、以下で考察するプロトコルを用いて直ちに凍結保存することができる。或いは、バルクＴＩＬ集団にステップＣ及びステップＤを施し、ステップＤ後に凍結保存することができる。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬを治療に使用する場合、ステップＢ又はステップＤのＴＩＬ集団は、適切な処置のため遺伝子修飾の対象となり得る。
医薬組成物、投薬量、及び投与レジメン
[00507] 一実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養したＴＩＬは医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当該技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与されてよい。一部の実施形態において、Ｔ細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約３０〜６０分間継続される。他の適切な投与経路には、腹腔内投与、髄腔内投与、及びリンパ管内投与が含まれる。
[00508] 任意の適切な用量のＴＩＬを投与することができる。一部の実施形態において、特に癌が黒色腫である場合、平均が約７．８×１０１０個のＴＩＬである約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個のＴＩＬが投与される。一実施形態において、約１．２×１０１０〜約４．３×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約３×１０１０〜約１２×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約４×１０１０〜約１０×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約５×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約６×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約７×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、治療有効投与量は約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、特に、癌が黒色腫である場合、治療有効投与量は約７．８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約１．２×１０１０〜約４．３×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約３×１０１０〜約１２×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約４×１０１０〜約１０×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約５×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約６×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は約７×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬである。
[00509] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３個である。一実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、１ｘ１０６〜５ｘ１０６、５ｘ１０６〜１ｘ１０７、１ｘ１０７〜５ｘ１０７、５ｘ１０７〜１ｘ１０８、１ｘ１０８〜５ｘ１０８、５ｘ１０８〜１ｘ１０９、１ｘ１０９〜５ｘ１０９、５ｘ１０９〜１ｘ１０１０、１ｘ１０１０〜５ｘ１０１０、５ｘ１０１０〜１ｘ１０１１、５ｘ１０１１〜１ｘ１０１２、１ｘ１０１２〜５ｘ１０１２、及び５ｘ１０１２〜１ｘ１０１３個の範囲内である。
[00510] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、例えば、医薬組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖより低い。
[00511] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％、１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％、１８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、又はｖ／ｖより高い。
[00512] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．０００１％〜約５０％、約０．００１％〜約４０％、約０．０１％〜約３０％、約０．０２％〜約２９％、約０．０３％〜約２８％、約０．０４％〜約２７％、約０．０５％〜約２６％、約０．０６％〜約２５％、約０．０７％〜約２４％、約０．０８％〜約２３％、約０．０９％〜約２２％、約０．１％〜約２１％、約０．２％〜約２０％、約０．３％〜約１９％、約０．４％〜約１８％、約０．５％〜約１７％、約０．６％〜約１６％、約０．７％〜約１５％、約０．８％〜約１４％、約０．９％〜約１２％又は約１％〜約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
[00513] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、約０．０２％〜約４．５％、約０．０３％〜約４％、約０．０４％〜約３．５％、約０．０５％〜約３％、約０．０６％〜約２．５％、約０．０７％〜約２％、約０．０８％〜約１．５％、約０．０９％〜約１％、約０．１％〜約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
[00514] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ、又は０．０００１ｇ以下である。
[00515] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ、又は１０ｇ超である。
[00516] 本発明の医薬組成物において提供されるＴＩＬは、広い投与量範囲にわたって有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、処置されるべき対象の性別及び年齢、処置されるべき対象の体重、並びに担当医の選好及び経験に依存するであろう。臨床的に確立されたＴＩＬの投与量もまた、適切ならば使用され得る。ＴＩＬの投与量などの、本明細書の方法を使用して投与される医薬組成物の量は、処置されるヒト又は哺乳動物、疾患又は状態の重症度、投与速度、活性医薬成分の性質及び処方医の裁量に依存するであろう。
[00517] 一部の実施形態において、ＴＩＬは単回投与で投与され得る。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、ＴＩＬは複数回投与で投与され得る。投与は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回、又は６回を超えてもよい。投与は、月に１回、２週間に１回、週に１回、又は隔日に１回であり得る。ＴＩＬの投与は必要な限り継続し得る。
[00518] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３個である。一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、１ｘ１０６〜５ｘ１０６、５ｘ１０６〜１ｘ１０７、１ｘ１０７〜５ｘ１０７、５ｘ１０７〜１ｘ１０８、１ｘ１０８〜５ｘ１０８、５ｘ１０８〜１ｘ１０９、１ｘ１０９〜５ｘ１０９、５ｘ１０９〜１ｘ１０１０、１ｘ１０１０〜５ｘ１０１０、５ｘ１０１０〜１ｘ１０１１、５ｘ１０１１〜１ｘ１０１２、１ｘ１０１２〜５ｘ１０１２、及び５ｘ１０１２〜１ｘ１０１３個の範囲内である。
[00519] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ〜約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ〜約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ〜約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ〜約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇｍｇ〜約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ〜約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ〜約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ〜約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、又は約２．８５ｍｇ／ｋｇ〜約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
[00520] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約３００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５ｍｇ〜約４５ｍｇ、約１０ｍｇ〜約４０ｍｇ、約１５ｍｇ〜約３５ｍｇ、約２０ｍｇ〜約３０ｍｇ、約２３ｍｇ〜約２８ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ〜約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ〜約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ〜約１１０ｍｇ、又は約９５ｍｇ〜約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ〜約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ〜約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ〜約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ〜約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ〜約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ〜約２０５ｍｇ、又は約１９８〜約２０７ｍｇの範囲内である。
[00521] 有効量のＴＩＬは、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射によること、静脈内、腹腔内、非経口的、筋肉内、皮下、局所、移植によること、又は吸入によることを含め、同様の有用性を有する薬剤について一般に認められている任意の投与方式により、単回用量又は複数回用量のいずれで投与されてもよい。
特定の例示的な実施形態
[00522] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫である、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00523] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、二重抵抗性転移性黒色腫は、皮膚の二重抵抗性転移性黒色腫である、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00524] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、二重抵抗性転移性黒色腫は、ネオアジュバント療法又はアジュバント療法を含まない、少なくとも２つの先行全身処置過程に対して抵抗性である、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00525] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、二重抵抗性転移性黒色腫は、アルデスロイキン又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00526] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、二重抵抗性転移性黒色腫は、ペンブロリズマブ又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00527] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、二重抵抗性転移性黒色腫は、ニボルマブ又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団によりＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップを含む、一実施形態において腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する本発明の初期拡大培養を実施するステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
であって、癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、二重抵抗性転移性黒色腫は、イピリムマブ又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である。
[00528] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、二重抵抗性転移性黒色腫は、イピリムマブ又はそのバイオシミラー及びペンブロリズマブ又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00529] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、二重抵抗性転移性黒色腫は、イピリムマブ又はそのバイオシミラー及びニボルマブ又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00530] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、初期拡大培養が、２１日以下の期間にわたって実施される、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00531] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、初期拡大培養が、１１日以下の期間にわたって実施される、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00532] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、ＩＬ−２が、第１の細胞培養培地中に１０００ＩＵ／ｍＬ〜６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在する、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00533] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、第２の細胞培養培地中に、ＩＬ−２が１０００ＩＵ／ｍＬ〜６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、ＯＫＴ−３抗体が約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00534] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、初期拡大培養が、ガス透過性容器を使用して行われる、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00535] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ；
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、急速拡大培養が、ガス透過性容器を使用して行われる、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00536] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、第１の細胞培養培地が、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインを更に含む、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00537] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、第２の細胞培養培地が、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインを更に含む、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00538] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、ＴＩＬの第３の集団を患者に投与する前に、患者を骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンで処置するステップを更に含む、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00539] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間シクロホスファミドを投与し、続いて２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間フルダラビンを投与するステップを含む、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00540] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、患者へのＴＩＬの第３の集団の投与の翌日に開始する、ＩＬ−２レジメンで患者を処置するステップを更に含む、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
[00541] 一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から腫瘍を切除するステップであって、腫瘍がＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）腫瘍を腫瘍断片に断片化するステップ；
（ｃ）腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を得るステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数がＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数がＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地がＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）、及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、急速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、
癌が、二重抵抗性転移性黒色腫であり、ＩＬ−２レジメンは、許容量まで８時間ごとに１５分のボーラス静脈内注入として投与される、６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン、又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む高用量ＩＬ−２レジメンである、
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて癌を処置する方法を提供する。
実施例
[00542] 本明細書に包含される実施形態は、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は説明のみを目的として提供され、本明細書に包含される開示は決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
実施例１：治療に適したＴＩＬの製造プロセス
[00543] ＴＩＬは、当該技術分野において公知の方法及び本明細書に記載の任意の方法を用いて製造され得る。例えば、ＴＩＬを拡大培養させるための例示的な方法が図１に示される。ＴＩＬの製造及び図１のプロセスに従って拡大培養されたＴＩＬを有する癌患者の処置のための例示的なタイムラインは図２に示す。手術（及び腫瘍切除）は開始時に行われ、リンパ球枯渇化学療法は、本明細書の他の箇所に記載されているように、化学療法を伴う骨髄非破壊的リンパ球枯渇を指す。
[00544] 図３は、プレＲＥＰ ＴＩＬがＲＥＰプロセスに直接配置される「ＲＥＰへの直接」ステップを含む、ＴＩＬ拡大培養及び治療処置プロセスを示す。総プロセス時間は約２２日で、この時点でＴＩＬが患者に注入され得る。図４は、６日目の細胞数が２５０×１０６を超える場合、本開示及び図３のプロセスに従って調製されたＴＩＬとともに使用するための処理及び製造のタイムラインを示す。この状況では、ＴＩＬ産物は成功する可能性が非常に高いと考えられ、適切な最終ＴＩＬ産物が得られることを予想して患者のリンパ球枯渇するリスクの正当な理由となる。図５は、６日目の細胞数が２５０×１０６未満の場合、及び患者のリンパ球減少の決定がされる前にＴＩＬ産物の生存率を評価できるように、後にリンパ球枯渇が開始される場合、本開示及び図３のプロセスに従って調製されたＴＩＬとともに使用するための処置及び製造のタイムラインを示す。図６は、図３によるＴＩＬ製造プロセスの詳細な概略図を示す。
実施例２：二重抵抗性黒色腫におけるＴＩＬ療法の臨床試験１
[00545] このフェーズ２の多施設３つのコホート研究は、転移性黒色腫患者の治療のため図１に従って製造されたＴＩＬ療法の安全性及び有効性を評価するよう設計されている。コホート１及び２は、それぞれ最大３０人の患者を登録し、コホート３は最大１０人の患者への第２のＴＩＬ注入用の再処置コホートである。最初の２つのコホートは、２つの異なる製造プロセスを評価している（それぞれ図１及び図３）。コホート１の患者は新鮮な非凍結保存ＴＩＬ（図１）を受け、コホート２の患者はより合理化され、急速な３週間手順（図３）で製造された産物を受け、凍結保存産物を産生する。研究設計を図７に示す。この研究は、転移性黒色腫患者のサブ集団の処置のための自己ＴＩＬの安全性及び有効性を評価するフェーズ２、多施設、３コホート研究である。主要選択基準には、測定可能な転移性黒色腫及びＴＩＬ生成のために切除可能な病変が≧１；全身療法の少なくとも１つの前の段階；年齢≧１８歳；０〜１のＥＣＯＧパフォーマンスステータス、が含まれる。処置コホートには、非凍結保存ＴＩＬ産物（図１のプロセスを使用して調製）、凍結保存ＴＩＬ産物（図３のプロセスを使用して調製）、及び無応答又は初期応答後に進行する患者に対するＴＩＬ産物による再処置が含まれる。プライマリエンドポイントは安全性であり、セカンダリエンドポイントは有効性であり、客観的奏効率（ＯＲＲ：Objective Response Rate）、完全寛解率（ＣＲＲ：Complete Remission Rate）、無増悪生存率（ＰＦＳ：Progression Free Survival）、奏効期間（ＤＯＲ：Duration of Response）、及び全生存期間（ＯＳ：Overall Survival）で定義される。
[00546] コホート１の患者１６人から得たデータをここに示す。これらの進行した転移性黒色腫患者は、年齢の中央値が５５歳であり、ベースライン時では、著しい腫瘍負荷を伴う複数ある以前の治療方針に対して非常に抵抗性であった。全てが以前に抗ＰＤ−１療法を受け、８８％が抗ＣＴＬＡ４療法を受け、６４％が３回又はそれ以上の以前の療法を受けていた。結果は、評価可能な患者のうち、単一ＴＩＬ処置投与後１５か月を超えて継続する１つの完全奏効（ＣＲ）を含む２９％の客観的奏効率が報告されたことを示した。更に、患者の７７％は標的腫瘍サイズを縮小した。最初の反応までの平均時間は１．６か月で、ＣＲは６か月で発現した。腫瘍を保有する野生型又はＢＲＡＦ変異型の患者で応答が観察された。このプロトコルでは、最大６投与量のアルデスロイキンを投与できる。アルデスロイキン投与の中央値は６回であった。
[00547] 患者の特徴を図８及び図９に示す。前回の治療の中央値は３であった（範囲１−６）。ベースライン時での標的病変の直径の合計の中央値は１０．２ｃｍであった。患者の８１％はステージＩＶの疾患であった。患者集団は、複数の以前行われた治療方針に対して非常に抵抗性であり、ベースライン時で著しい腫瘍負荷を伴い、少なくとも１つのチェックポイント阻害薬の後に進行した。
[00548] 処置により発生した重篤な有害事象を図１０に、有効性の結果を図１１に要約する。１４人の患者のうちの１人は、最初の腫瘍評価の前に黒色腫関連死のために評価できなかった。研究に参加した全ての患者は、抗ＰＤ−１チェックポイント阻害剤を投与された。応答プロットのウォーターフォールを図１２に示す。ＯＲＲは２９％である。腫瘍の減少は、標的病変で腫瘍が減少したことを示した患者の７７％で見られた。ＢＲＡＦ突然変異状態に関わらず、一つの長期持続ＣＲ（１５か月以上）を含む応答が認められた。図１３は、臨床試験における最良の応答までの時間と期間を示している。最初の応答までの平均時間は１．６か月であった。図１３に示されるデータの経過観察期間の中央値は、４．１か月であった。図１４は、臨床試験における直径の合計の変化率を示している。図１５は、腫瘍サイズの減少を示す、完全寛解状態の患者からのスキャンを示している。
[00549] 更に、ＢＲＡＦ標的療法後、ＢＲＡＦ突然変異陽性の場合、この研究のプロトコルは、免疫チェックポイント阻害療法（例、抗ＰＤ−１）後に進行した切除不可能又は転移性黒色腫の患者数を更に明確化するとともに、研究のサンプルサイズを増やすために修正された。
[00550] 二重抵抗性転移性黒色腫を治療するため本開示のＴＩＬ療法の能力を示すこれらの結果に基づいて、図１６に示すように臨床試験は修正された。更に、プライマリエンドポイントはＯＲＲに変更され、セカンダリポイントがＣＲＲ、ＤＣＲ、ＰＦＳ、ＤＯＲ、ＯＲ、ＯＳ及び安全性に変更された。
実施例３：二重抵抗性黒色腫におけるＴＩＬ療法の臨床試験２
[00551] ＴＩＬ産物の代替プロセス、例えば、Radvanyi, et al., Clin.Cancer Res.2012, 18, 6758-70で述べられたプロセス（補足情報を含む）もまた一部の実施形態で用いられる。その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。抗ＰＤ−１（ペンブロリズマブ又はニボルマブ）及びイピリムマブの両方に抵抗性のある患者の処置におけるこの方法によって生成されたＴＩＬ使用による結果を図１７に示す。
実施例４：レトロスペクティブ臨床試験
[00552] 切除不可能な転移性黒色腫患者を対象にレトロスペクティブ研究を実施し、疾患に対する２つ以上の全身療法後の有効性データを評価する。これは、レトロスペクティブチャートレビュー研究である。この研究は、全身療法の２ライン以上を受けた後に進行した再発／抵抗性の切除不可能な転移性黒色腫患者の疾患応答に関するレトロスペクティブデータの取得が含まれる。この全身療法は、ＢＲＡＦ突然変異陽性疾患が確認された患者に対して、ＰＤ−１及びＢＲＡＦ阻害剤少なくとも１ラインが含まなくてはならない。患者集団の選択は、先を見越して決定された選択基準に基づいており、その後にレトロスペクティブチャートレビューが行われる。
[00553] このレトロスペクティブ研究の主な目的は、固形腫瘍の応答判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）１．１に続く局所評価により判断された客観的奏効率（ＯＲＲ）を評価することである。この研究の二次的な目的には、（ｉ）ＲＥＣＩＳＴ１．１で判断された応答期間（ＤＯＲ）及び疾患制御率（ＤＣＲ）の局所評価による有効性エンドポイントの評価、（ｉｉ）研究対象集団のレトロスペクティブデータに基づいた全生存期間（ＯＳ）の評価が含まれる。予備的な目的には、この研究集団の治療パターンの評価が更に含まれる。
[00554] 投与量と処置は、切除不可能な転移性黒色腫の二次選択又はそれ以降の選択の処置を必要とする個々の施設のデータに基づいている。
[00555] 米国内の最大３つの大規模な医療データベース（例、病院、学術機関、腫瘍学臨床試験グループ）からレトロスペクティブデータは収集される。
[00556] このレトロスペクティブデータ評価研究では、患者は積極的に処置されない。利用可能な施設のデータに基づいて、レトロスペクティブデータレビューの適格性について、少なくとも約１００人の患者が評価される。
[00557] ＢＲＡＦ突然変異陽性疾患が確認された患者に対して少なくとも１ラインの抗ＰＤ−１及びＢＲＡＦ阻害剤を含まなければならない２ライン以上の全身性治療の後、患者は、再発／抵抗性の切除不可能な転移性黒色腫になる。患者は同意の時点で１８歳以上であり、米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）のパフォーマンスステータスは０又は１である。
[00558] 追加の選択基準には次のものが含まれている。患者は十分な造血機能と臓器機能を備えていなければならない。患者は、保護された健康情報の使用及び開示について書面による許可を提供したか、又はＧＣＰ及び現地の倫理基準に準拠して、臨床データの使用を許可する制度上の規制がある。
[00559] 以下の基準を満たす患者はこの研究から除外される。ブドウ膜／眼原発の黒色腫患者。症候性及び／又は未処置の転移性脳腫瘍（あらゆるサイズ及び数）の患者。過去３年以内に別の原発性悪性腫瘍を罹患した患者（乳房、子宮頸部又は膀胱の上皮内癌、限局性前立腺癌及び適切に治療された非黒色腫皮膚癌を除く）。ＢＲＡＦ変異陽性（Ｖ６００）であることを示しているが、ＢＲＡＦ指向性キナーゼ阻害剤による先行全身療法を受けていない患者。
[00560] 有効性は、選択基準／除外基準に従い識別された患者のカルテから利用可能なデータへのＲＥＣＩＳＴ１．１の適用に基づいて評価される。以下のパラメータが計算された。ＯＲＲ、ＤＯＲ、ＤＣＲ。データは、個々の組織データによって、可能であれば集計として報告される。
[00561] ＯＳの概要は、保留中の個々の組織データも評価される。可能であれば、集計されたＯＳデータが報告される。
[00562] 一次統計分析は、各施設からのレトロスペクティブデータから得られた有効性パラメータに基づいており、施設ごとにレトロスペクティブデータの個々のセットによって実行される。
[00563] レトロスペクティブデータセット間の統計的比較は、実行される場合とされない場合がある。
[00564] 確認された完全（ＣＲ）又は部分（ＰＲ）奏効のＲＥＣＩＳＴ１．１基準を満たす患者は、ＯＲＲの分析で奏効者として分類される。
[00565] 生存期間有効性のエンドポイントは全て、Kaplan-Meierメソッドを使用してデータを要約する。そのような全ての分析の時間の起点（応答期間を除く）は、患者がこの研究の療法による治療を開始した日付となる。
[00566] 個々のレトロスペクティブデータセット間で正式な比較がある場合とない場合がある。
実施例５：プレＲＥＰ及びＲＥＰプロセス用の培地調製
[00567] 本例は、限定はされないが、転移性黒色腫、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、卵巣癌、トリプルネガティブ乳癌、及び肺腺癌を含めた様々な腫瘍型に由来する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の培養が関わるプロトコルに用いられる組織培養培地の調製手順について説明する。本願及び実施例に記載される任意のＴＩＬの調製にこの培地を使用することができる。
ＣＭ１の調製
[00568] 低温貯蔵庫から以下の試薬を取り出し、３７℃の水浴中で加温した：（ＲＰＭＩ１６４０、ヒトＡＢ血清、２００ｍＭＬ−グルタミン）。以下の表１９に従い、ろ過される容積に適切な０．２μｍフィルターユニットの上部に成分の各々を加えることによりＣＭ１培地を調製した。４℃で保管。
Figure 2020522516
[00569] 使用当日、所要量のＣＭ１を３７℃の水浴中で予め加温し、６０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を添加した。
[00570] 追加的な補充−必要があれば表２０に準じる。
Figure 2020522516
ＣＭ２の調製
[00571] 冷蔵庫から調製済みのＣＭ１を取り出した、又は上記セクション７．３に従い新鮮ＣＭ１を調製する。AIM-V（登録商標）を冷蔵庫から取り出し、滅菌培地ボトル内に調製済みＣＭ１を等容積のAIM-V（登録商標）と混合することにより、必要な量のＣＭ２を調製した。使用当日、ＣＭ２培地に３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を加えた。使用当日、十分な量の３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２含有ＣＭ２を作成した。ＣＭ２培地ボトルに、その名前、調製者のイニシャル、それがろ過／調製された日付、２週間の有効期限の表示を付し、組織培養に必要になるまで４℃で貯蔵した。
ＣＭ３の調製
[00572] 使用が必要になった当日に、ＣＭ３を調製した。ＣＭ３はAIM-V（登録商標）培地と同じであり、使用当日に３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を添加した。AIM-Vのボトル又はバッグにＩＬ−２ストック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のＣＭ３を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた後すぐに、ボトルに「３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２」の表示を付す。過剰なＣＭ３がある場合、これを培地名、調製者のイニシャル、培地の調製日、及びその有効期限（調製後７日）を表示したボトルに４℃で貯蔵した。ＩＬ−２を添加した培地は４℃で７日間の貯蔵後に廃棄した。
ＣＭ４の調製
[00573] ＣＭ４はＣＭ３と同じであり、加えて２ｍＭのGlutaMAX（商標）（最終濃度）を添加した。１ＬのＣＭ３につき１０ｍｌの２００ｍＭ GlutaMAX（商標）を加えた。AIM-Vのボトル又はバッグにＩＬ−２ストック溶液及びGlutaMAX（商標）ストック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のＣＭ４を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた後すぐに、ボトルに「３０００ＩＬ／ｎｉｌ ＩＬ−２及びGlutaMAX」の表示を付した。過剰なＣＭ４がある場合、これを培地名「G1utaMAX」、及び有効期限（調製後７日）とボトルにラベル付けし、４℃で貯蔵した。ＩＬ−２を添加した培地は４℃で７日間の貯蔵後に廃棄した。
実施例６：ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１サイトカインカクテルの使用
[00574] この実施例では、追加のＴ細胞成長因子として機能するＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１サイトカインの使用を、実施例１〜１０のＴＩＬプロセスと組み合わせて説明する。
[00575] 実施例１〜１０のプロセスを使用して、実験の片腕で、ＩＬ−２の存在下で、結腸直腸、黒色腫、子宮頸、三種陰性乳房、肺及び腎臓の腫瘍から、もう一方で、培養の開始時にＩＬ−２の代わりにＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１の組み合わせで、ＴＩＬを成長させた。プレＲＥＰの完了時に、培養物の拡大培養、表現型、機能（ＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮ−γ）及びＴＣＲ Ｖβレパートリーを評価した。ＩＬ−１５及びＩＬ−２１は、本明細書の他の箇所及びGruijl, et al.,に記載されている通り、ＩＬ−２１は、ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋腫瘍浸潤リンパ球の成長を促進し、細胞傷害能が高く、制御性Ｔ細胞の副次的成長が少ない。Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/）。
[00576] 結果は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１で処理した条件のＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の両方で、ＩＬ−２のみの条件と比較して複数の組織でＴＩＬ拡大培養の増強（＞２０％）が観察されたことを示した。ＩＬ−２のみの培養物に比べて、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１で処理した培養物から得られたＴＩＬには、偏ったＴＣＲ Ｖβレパートリーを含むＣＤ８＋集団が主に偏っていた。ＩＦＮ−γ及びＣＤ１０７ａは、ＩＬ−２のみで処理したＴＩＬと比較して、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１で処理したＴＩＬで上昇した。
実施例７：ガンマ線照射末梢単核球の個々のロットの適格性
[00577] 本実施例は、γ線照射した末梢単核球（ＰＢＭＣ、別名ＭＮＣ）の個々のロットが本明細書に記載される例示的方法における同種異系フィーダー細胞としての使用に適格か判定するための新規簡略手順について説明する。
[00578] 各照射ＭＮＣフィーダーロットは個別のドナーから調製した。精製抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下におけるＲＥＰでＴＩＬを拡大培養するその能力に関して各ロット又はドナーを個別にスクリーニングした。加えて、フィーダー細胞の各ロットを、ＴＩＬを加えずに試験して、受けたガンマ線線量がそれらを複製不能にするのに十分であったことを確認した。
背景
[00579] ＴＩＬのＲＥＰには、γ線照射した拡大培養が止まったＭＮＣフィーダー細胞が必要であった。ＲＥＰフラスコ内でフィーダーＭＮＣ上の膜受容体が抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体に結合し、ＴＩＬに架橋することにより、ＴＩＬが拡大培養されるように刺激される。フィーダーロットは、個別のドナーから採取された全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物をFicoll-Hypaqueで遠心に供し、洗浄し、照射し、及びＧＭＰ条件下で凍結保存した。
[00580] 移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こし得るため、ＴＩＬ療法を受ける患者が生細胞のフィーダー細胞を注入されないことが重要である。従って、フィーダー細胞は、ガンマ線照射を細胞に与え、その結果二本鎖ＤＮＡ切断が生じて再培養時にＭＮＣ細胞が細胞生存能力を失うことにより、拡大培養が止められる。
判定基準及び実験セットアップ
[00581] フィーダーロットは２つの基準で判定された。１）共培養においてＴＩＬを１００倍超に拡大培養するその能力、及び２）その複製不能性。
[00582] 直立Ｔ２５組織培養フラスコ内で成長させた２つの初代プレＲＥＰ ＴＩＬ株を利用するミニＲＥＰフォーマットでフィーダーロットを試験した。各ＴＩＬ株がＲＥＰにおいて活性化に応答して拡大培養するその能力はユニークであるため、フィーダーロットは２つの異なるＴＩＬ株に対して試験した。制御として、歴史的に上記の基準に適合することが示されている照射ＭＮＣフィーダー細胞の１ロットを、実験ロットと並行して実施した。
[00583] 単一の実験で試験した全てのロットが等価な試験を受けることを確実にするため、全ての条件及び全てのフィーダーロットの試験に同じプレＲＥＰ ＴＩＬ株の十分なストックが利用可能であった。
[00584] 試験したフィーダー細胞の各ロットにつき、合計６つのＴ２５フラスコがあった：プレＲＥＰ ＴＩＬライン＃１（２フラスコ）；プレＲＥＰ ＴＩＬライン＃２（２フラスコ）；及びフィーダー制御（２フラスコ）。ＴＩＬ株＃１及び＃２が入ったフラスコは、フィーダーロットがＴＩＬを拡大培養させる能力を判定した。フィーダー対照フラスコは、フィーダーロットの複製不能性を判定した。
実験プロトコル
−２／３日目、ＴＩＬ株の解凍
[00585] ＣＭ２培地を調製した。３７℃の水浴中でＣＭ２を加温した。３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を添加した４０ｍｌのＣＭ２を調製した。使用時まで保温する。使用したＴＩＬ株の名前の表示を付した２つの５０ｍｌコニカルチューブの各々に、ＩＬ−２を含まない２０ｍｌの予め加温したＣＭ２を入れた。ＬＮ２貯蔵庫から２つの指定のプレＲＥＰ ＴＩＬ株を取り出し、バイアルを組織培養室に移した。残りの氷が少量になるまでバイアルを３７℃の水浴中の密封されたジッパー式貯蔵用バッグの内部に置くことにより、バイアルを解凍した。
[00586] 滅菌移送ピペットを使用してバイアルの内容物を直ちに表示を付した調製済み５０ｍｌコニカルチューブ内の２０ｍｌのＣＭ２中に移した。ＩＬ−２を含まないＣＭ２を使用して４０ｍｌまでＱＳして細胞を洗浄した。４００×ＣＦで５分間遠心した。上清を吸引し、３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を添加した５ｍｌの温ＣＭ２に再懸濁した。
[00587] 少量のアリコート（２０μｌ）をデュプリケートで取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントを記録した。カウントする一方で、ＴＩＬ細胞が入った５０ｍｌコニカルチューブは、キャップを緩めてガス交換を可能にして、加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置いた。細胞濃度を決定し、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＣＭ２でＴＩＬを１×１０６細胞／ｍｌに希釈した。
[00588] 加湿した３７℃インキュベーター内で必要に応じた数のウェルにおいて２４ウェル組織培養プレートのウェル当たり２ｍｌでミニＲＥＰの０日目まで培養した。混同及び潜在的な交差汚染を避けるため、異なるＴＩＬ株は別個の２４ウェル組織培養プレートにおいて培養した。
０日目、ミニＲＥＰを開始する
[00589] 試験するフィーダーロットの数に十分なＣＭ２培地を調製した（例えば、１回に４つのフィーダーロットを試験するために、８００ｍｌのＣＭ２培地を調製した）。上記で調製したＣＭ２の一部をアリコートに分け、細胞の培養のため、それに３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を添加した（例えば、１回に４つのフィーダーロットを試験するために、５００ｍｌの３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２含有ＣＭ２培地を調製する）。
[00590] 各ＴＩＬ株を別々に作業して交差汚染を防ぎながら、ＴＩＬ培養物が入った２４ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、ＢＳＣに移した。
[00591] 滅菌移送ピペット又は１００〜１０００μｌピペッター及びチップを使用して、使用するＴＩＬの各ウェルから約１ｍｌの培地を取り出し、２４ウェル組織培養プレートの使用されていないウェルに入れた。
[00592] 新鮮な滅菌移送ピペット又は１００〜１０００μｌピペッター及びチップを使用して、ウェル内で残りの培地をＴＩＬと混合して細胞を再懸濁し、次にＴＩＬ名が表示された５０ｍｌコニカルチューブに細胞懸濁液を移し、容積を記録した。
[00593] 確保しておいた培地でウェルを洗浄し、その容積を同じ５０ｍｌコニカルチューブに移した。細胞を４００×ＣＦでスピンして細胞ペレットを収集した。培地上清を吸引して取り除き、３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含有する２〜５ｍｌのＣＭ２培地中に細胞ペレットを再懸濁する；使用される容積は、回収されるウェルの数及びペレットのサイズに基づく（容積は＞１．３×１０６細胞／ｍｌの濃度を確保するのに十分であろう）。
[00594] 血清用ピペットを使用して、細胞懸濁液を完全に混合し、容積を記録した。２００μｌを取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントする一方で、ＴＩＬ細胞が入った５０ｍｌコニカルチューブは、キャップを緩めてガス交換を可能にして、加湿した、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに置いた。カウントを記録した。
[00595] ＴＩＬ細胞が入った５０ｍｌコニカルチューブをインキュベーターから取り出し、３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を添加した温ＣＭ２中にそれらの細胞を１．３×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。キャップを緩めたまま、５０ｍｌコニカルチューブをインキュベーターに戻した。
[00596] 第２のＴＩＬ株について上記のステップを繰り返した。
[00597] 実験用のＴ２５フラスコにＴＩＬをプレーティングする直前に、ＴＩＬは以下に従い１．３×１０５細胞／ｍｌの最終濃度に１：１０希釈した。
MACS GMP CD3純粋（ＯＫＴ３）作業溶液を調製する
[00598] ４℃の冷蔵庫からＯＫＴ３のストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を取り出し、ＢＳＣに置いた。ミニＲＥＰの培地中には３０ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ３の最終濃度を使用した。
[00599] 実験の各Ｔ２５フラスコ内の２０ｍｌにつき６００ｎｇのＯＫＴ３が必要であった；これは各２０ｍｌにつき６０μｌの１０μｇ／ｍｌ溶液、又は各フィーダーロットについて試験する６つ全てのフラスコにつき３６０μｌの相当量であった。
[00600] 試験する各フィーダーロットについて、１０μｇ／ｍｌの作業濃度に対して４００μｌの１：１００希釈の１ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３を作成した（例えば、１回に４つのフィーダーロットを試験するために、１６００μｌの１：１００希釈の１ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３：１６μｌの１ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３＋１．５８４ｍｌの３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２含有ＣＭ２培地を作成した）。
Ｔ２５フラスコを調製する
[00601] 各フラスコに表示を付し、フィーダー細胞を調製する前にフラスコにＣＭ２培地を充填した。フラスコを３７℃の加湿された５％ＣＯ２インキュベーターに置くことにより、残りの構成成分を加えるまでの間、培地を保温した。フィーダー細胞を調製し終えたら、各フラスコ内のＣＭ２に構成成分を加える。
Figure 2020522516
フィーダー細胞を調製する
[00602] 本プロトコルについては、試験したロット当たり最低７８×１０６個のフィーダー細胞が必要であった。ＳＤＢＢによって凍結された各１ｍｌバイアルは、凍結時に１００×１０６個の生細胞を有した。ＬＮ２貯蔵庫からの解凍時に５０％回収率と仮定すると、各ＲＥＰにつき推定１００×１０６個の生細胞を所与として、ロット当たりフィーダー細胞の１ｍｌバイアルを少なくとも２本解凍することが推奨された。或いは、１．８ｍｌバイアルで供給される場合、１本のバイアルのみで十分なフィーダー細胞が提供された。
[00603] フィーダー細胞の解凍前に、試験しようとする各フィーダーロットにつき約５０ｍｌのＩＬ−２不含ＣＭ２を予め加温した。ＬＮ２貯蔵庫から指定のフィーダーロットバイアルを取り出し、ジッパー式貯蔵用バッグに入れ、氷上に置いた。３７℃の水浴に浸すことにより、閉じたジッパー式貯蔵用バッグ内でバイアルを解凍した。ジッパー式バッグからバイアルを取り出し、７０％ＥｔＯＨを噴霧するか又はそれで拭き取り、バイアルをＢＳＣに移した。
[00604] 移送ピペットを使用して、フィーダーバイアルの内容物を５０ｍｌコニカルチューブ内の３０ｍｌの温ＣＭ２中に直ちに移した。バイアルを少量のＣＭ２で洗浄してバイアル内に残った細胞を全て取り出した。４００×ＣＦで５分間遠心した。上清を吸引し、４ｍｌ温ＣＭ２＋３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２に再懸濁した。２００μｌを取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントを記録した。
[00605] 細胞を温ＣＭ２＋３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２中に１．３×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。ＴＩＬ細胞を１．３×１０６細胞／ｍｌ〜１．３×１０５細胞／ｍｌに希釈した。
共培養をセットアップする
[00606] ＴＩＬ細胞を１．３×１０６細胞／ｍｌ〜１．３×１０５細胞／ｍｌに希釈した。１５ｍｌコニカルチューブに４．５ｍｌのＣＭ２培地を加えた。インキュベーターからＴＩＬ細胞を取り出し、１０ｍｌ血清用ピペットを使用して十分に再懸濁した。１．３×１０６細胞／ｍｌ ＴＩＬ懸濁液から０．５ｍｌの細胞を取り出し、１５ｍｌコニカルチューブ内の４．５ｍｌの培地に加えた。ＴＩＬストックバイアルをインキュベーターに戻した。十分に混合した。第２のＴＩＬ株につき繰り返した。
[00607] 単一のフィーダーロットについての予め加温した培地が入ったフラスコをインキュベーターからＢＳＣに移した。１ｍｌピペットチップで上下に数回ピペッティングすることによりフィーダー細胞を混合し、１ｍｌ（１．３×１０７細胞）を当該のフィーダーロットの各フラスコに移した。各フラスコに６０μｌのＯＫＴ３作業ストック（１０μｇ／ｍｌ）を加えた。２つの対照フラスコをインキュベーターに戻した。
[00608] １ｍｌ（１．３×１０５）の各ＴＩＬロットを対応する表示のＴ２５フラスコに移した。フラスコをインキュベーターに戻し、直立でインキュベートした。５日目まで手を加えなかった。
[00609] 試験した全てのフィーダーロットについて繰り返した。
５日目、培地交換
[00610] ３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２でＣＭ２を調製した。各フラスコに１０ｍｌ必要である。１０ｍｌピペットで、３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む１０ｍｌ温ＣＭ２を各フラスコに移した。フラスコをインキュベーターに戻し、７日目まで直立でインキュベートした。試験した全てのフィーダーロットについて繰り返した。
７日目、回収
[00611] インキュベーターからフラスコを取り出してＢＳＣに移し、及びフラスコの底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。フラスコの底に成長する細胞を乱すことなく、各試験フラスコから１０ｍｌの培地、及び対照フラスコの各々から１５ｍｌの培地を取り出した。
[00612] １０ｍｌ血清用ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、十分に混合して細胞集塊を全て壊した。ピペッティングにより細胞懸濁液を完全に混合した後、２００μｌを取り出して細胞をカウントした。適切な標準実施要領を自動セルカウンター装置と併せて用いてＴＩＬをカウントした。７日目のカウントを記録した。
[00613] 試験した全てのフィーダーロットについて繰り返した。
[00614] 以下の表２２に従い、フィーダー対照フラスコについて複製不能性を判定し、及びＴＩＬが入ったフラスコについて０日目からの拡大倍数を判定した。
７日目、１４日目までのフィーダー対照フラスコの継続
[00615] ７日目にフィーダー対照フラスコをカウントし終えた後、対照フラスコの各々に、３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含有する新鮮ＣＭ２培地１５ｍｌを加えた。対照フラスコをインキュベーターに戻し、１４日目まで直立位置でインキュベートした。
１４日目、フィーダー対照フラスコの非拡大培養の延長
[00616] インキュベーターからフラスコを取り出してＢＳＣに移し、及びフラスコの底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。フラスコの底に成長する細胞を乱すことなく、各対照フラスコから約１７ｍｌの培地を取り出した。５ｍｌ血清用ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、十分に混合して細胞集塊を全て壊した。各フラスコの容積を記録した。
[00617] ピペッティングにより細胞懸濁液を完全に混合した後、２００μｌを取り出して細胞をカウントした。適切な標準実施要領を自動セルカウンター装置と併せて用いてＴＩＬをカウントした。カウントを記録した。
[00618] 試験した全てのフィーダーロットについて繰り返した。
結果及び適合基準
結果
[00619] ガンマ線照射の線量はフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であった。全てのロットが判定基準に適合するものと予想され、また、０日目と比較してＲＥＰ培養の７日目に残る生存フィーダー細胞総数の減少も実証された。
[00620] 全てのフィーダーロットが、ＲＥＰ培養の７日目までにＴＩＬ増殖の１００倍の拡大という判定基準に適合するものと予想された。
[00621] フィーダー対照フラスコの１４日目のカウントは、７日目に見られた非拡大培養傾向が続くものと予想された。
適合基準
[00622] フィーダー細胞の各ロットについて試験した各複製ＴＩＬ株は、以下の適合基準を満たしていた。
[00623] 以下の通り（以下の表２２に概説する）、適合は２倍であった。
Figure 2020522516
[00624] ３０ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２の存在下で培養したとき放射線量がＭＮＣフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であったかどうかを判定した。複製不能かどうかは、ＲＥＰの７日目及び１４日目に自動細胞カウントによって決定したときの総生細胞数（ＴＶＣ）によって判定した。
[00625] 適合基準は「成長なし」であったが、これは、ＲＥＰの０日目に培養を開始した初期生細胞数から７日目及び１４日目に総生細胞数が増加しなかったことを意味した。
[00626] フィーダー細胞がＴＩＬ拡大培養を支持する能力を判定した。ＲＥＰの０日目の培養開始からＲＥＰの７日目までの生細胞の拡大倍数の点でＴＩＬ成長を測定した。７日目、自動細胞カウントによって判定したとき、ＴＩＬ培養物は最低でも１００倍の拡大（即ち、ＲＥＰ ０日目に培養を開始した総ＴＩＬ生細胞数の１００倍より多い）を実現した。
適合基準を満たさないＭＮＣフィーダーロットのコンティンジェンシーテスト
[00627] ＭＮＣフィーダーロットが上記に概説される適合基準のいずれかを満たさなかった場合、その原因として単純な実験者エラーを排除するため以下のステップを行ってロットを再試験する。
[00628] ロットのサテライトの試験バイアルが２つ以上残っている場合、そのロットは再試験した。ロットのサテライトの試験バイアルが１つ残っているか又は残っていなかった場合、上記に挙げる適合基準に基づきそのロットは不適合とした。
[00629] 適格とされるには、問題のロット及び対照ロットが適合基準を達成しなければならなかった。これらの基準に適合すると、そのロットはリリースされた。
実施例８：ガンマ線照射末梢血単核球の個々のロットの適格性
[00630] 本実施例は、γ線照射末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の個々のロットが本明細書に記載される例示的方法における同種異系フィーダー細胞としての使用に適格か判定するための新規簡略手順について記載する。本例は、臨床用ＴＩＬロットの生産における使用に関する照射ＰＢＭＣ細胞ロットの判定プロトコルを提供する。個別のドナーから各照射ＰＢＭＣロットを調製した。１００を超える適格性判定プロトコルを通して、いずれの場合にも、ＳＤＢＢ（サンディエゴ血液バンク（San Diego Blood Bank））からの照射ＰＢＭＣロットはＲＥＰの７日目にＴＩＬを＞１００倍に拡大することが示された。この改良された適格性判定プロトコルは、受けたガンマ線線量がそれらを複製不能にするのに十分であったことを確認するため更に試験されたＳＤＢＢからの照射ドナーＰＢＭＣロットに適用することが意図された。それが１４日間にわたって複製不能を維持することが実証されると、ドナーＰＢＭＣロットは、臨床用ＴＩＬロットの生産への使用に「適格である」と見なした。
背景
[00631] ＴＩＬの現行の標準ＲＥＰには、γ線照射した拡大培養が止まったＰＢＭＣが必要であった。培養下でＰＢＭＣ上の膜受容体が抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体に結合し、ＴＩＬに架橋することにより、ＴＩＬが拡大するように刺激される。ＰＢＭＣロットは、個別のドナーから採取された全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物をFicoll-Hypaqueで遠心に供し、洗浄し、照射し、及びＧＭＰ条件下で凍結保存した。
[00632] 移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こし得るため、ＴＩＬ療法を受けた患者が生細胞ＰＢＭＣを注入されないことが重要である。従ってドナーＰＢＭＣは、ガンマ線照射を細胞に与え、その結果二本鎖ＤＮＡ切断が生じて再培養時にＰＢＭＣが細胞生存能力を失うことにより、拡大培養が止められる。
判定基準
[00633] ７．２．１ 照射ＰＢＭＣロットの判定基準はその複製不能性であった。
実験セットアップ
[00634] 直立Ｔ２５組織培養フラスコを使用して、フィーダーロットをＴＩＬと共培養したかのようにミニＲＥＰフォーマットで試験した。対照ロット：歴史的に７．２．１の基準に適合することが示されている照射ＰＢＭＣの１つのロットを、対照として実験ロットと並行して実行した。試験する照射ドナーＰＢＭＣの各ロットについて、デュプリケートのフラスコを実行した。
実験プロトコル
０日目
[00635] 試験しようとするドナーＰＢＭＣの各ロットにつき約９０ｍｌのＣＭ２培地を調製した。ＣＭ２は３７℃の水浴中に保温した。６×１０６ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２のアリコートを解凍した。ＣＭ２培地をＢＳＣに戻し、７０％ＥｔＯＨで拭き取った後、フードに置いた。試験するＰＢＭＣの各ロットについて、約６０ｍｌのＣＭ２を別個の滅菌ボトルに取り出した。解凍した６×１０６ＩＵ／ｍｌストック溶液からのＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌの最終濃度でこの培地に加えた。このボトルに「ＣＭ２／ＩＬ２」（又は類似）の表示を付して、それを無添加のＣＭ２と区別した。
ＯＫＴ３を調製する
[00636] ４℃の冷蔵庫から抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）のストック溶液を取り出し、ＢＳＣに置いた。ミニＲＥＰの培地中には３０ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ３の最終濃度を使用した。１ｍｇ／ｍｌストック溶液からの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）の１０μｇ／ｍｌ作業溶液を調製した。必要になるまで冷蔵庫に置いた。
[00637] 試験した各ＰＢＭＣロットにつき、１５０μｌの１：１００希釈の抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）ストックを調製する。例えば、１回に４つのＰＢＭＣロットを試験するために、３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を添加した５９４μｌのＣＭ２に６μｌの１ｍｇ／ｍｌストック溶液を加えることにより、６００μｌの１０μ／ｍｌ抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を調製する。
フラスコを調製する
[00638] ７．４．８ 表示を付したＴ２５フラスコに、フラスコ当たり１９ｍｌのＣＭ２／ＩＬ−２を加え、細胞を調製する間、フラスコを３７℃の加湿５％ＣＯ２インキュベーターに置いた。
照射ＰＢＭＣを調製する
[00639] 試験しようとするＰＢＭＣロットのバイアルをＬＮ２貯蔵庫から取り出した。それらのバイアルは解凍時まで−８０℃に置くか、又はドライアイス上に保った。解凍しようとする各ロットにつき３０ｍｌのＣＭ２（ＩＬ−２の添加なし）を５０ｍｌコニカルチューブに入れた。各チューブに解凍しようとするＰＢＭＣの異なるロット番号の表示を付した。使用時まで、チューブのキャップをしっかりと閉めて３７℃の水浴中に置いた。必要に応じて、５０ｍｌコニカルチューブをＢＳＣに戻し、７０％ＥｔＯＨで拭き取った後、フードに置いた。
[00640] 低温貯蔵庫からバイアルＰＢＭＣを取り出し、３７℃の水浴中のフローティングチューブラックに置いて解凍した。解凍は、バイアル内に少量の氷が残るまで進行させた。滅菌移送ピペットを使用して、バイアルの内容物を５０ｍｌコニカルチューブ内の３０ｍｌのＣＭ２中に直ちに移した。チューブから約１ｍｌの培地を取り出してバイアルをリンスした；リンス液を５０ｍｌコニカルチューブに戻した。キャップをしっかりと閉め、静かに回して細胞を洗浄した。
[00641] 室温において４００×ｇで５分間遠心した。上清を吸引し、１０００μｌピペットチップを使用して１ｍｌの温ＣＭ２／ＩＬ−２中に細胞ペレットを再懸濁した。或いは、培地を加える前に、キャップを閉めたチューブを空のチューブラックに沿って引きずることにより細胞ペレットを再懸濁した。細胞ペレットの再懸濁後、ＣＭ２／ＩＬ−２培地を使用して容積を４ｍｌにした。容積を記録した。
[00642] 少量のアリコート（例えば１００μｌ）を取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントは、詳細な自動セルカウンターＳＯＰに基づきデュプリケートで実施した。細胞カウントの実施前にＰＢＭＣの希釈を実施する必要がある可能性が最も高かった。推奨される出発希釈は１：１０であったが、これは使用するセルカウンターのタイプに応じて異なっていた。カウントを記録した。
[00643] ＣＭ２／ＩＬ−２培地を使用してＰＢＭＣの濃度を１．３×１０７細胞／ｍｌに調製した。静かに回すことによるか、又は血清用ピペットを使用して静かに上下に吸引することにより十分に混合した。
培養フラスコをセットアップした
[00644] ２つの表示を付したＴ２５フラスコを組織培養インキュベーターからＢＳＣに戻した。抗ＣＤ３／ＯＫＴ３の１０μｇ／ｍｌバイアルをＢＳＣに戻した。フラスコに１ｍｌの１．３×１０７ＰＢＭＣ細胞懸濁液を加えた。各フラスコに６０μｌの１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３／ＯＫＴ３を加えた。キャップを閉めたフラスコを組織培養インキュベーターに戻し、手を加えることなく１４日間成長させた。次のロットに必要になるまで抗ＣＤ３／ＯＫＴ３バイアルを冷蔵庫に入れ戻した。判定しようとするＰＢＭＣのロット毎に繰り返した。
１４日目、ＰＢＭＣの非拡大培養性の測定
[00645] 複製したＴ２５フラスコをＢＳＣに戻した。各フラスコについて、新鮮な１０ｍｌ血清用ピペットを使用してフラスコの各々から約１７ｍｌを取り出し、次に残りの培地を慎重に抜き取って、フラスコ内に残る容積を測定した。容積を記録した。
[00646] 同じ血清用ピペットを使用して上下にピペッティングすることによりサンプルを十分に混合した。
[00647] カウントのため各フラスコから２００μｌサンプルを取り出した。自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。判定しようとするＰＢＭＣのロット毎にステップ７．４．２６〜７．４．３１を繰り返した。
結果及び適合基準
結果
[00648] ガンマ線照射の線量はフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であると予想された。全てのロットが判定基準に適合するものと予想され、０日目と比較してＲＥＰ培養の１４日目に残る生存フィーダー細胞総数の減少が実証された。
[00649] 適合基準：試験した各照射ドナーＰＢＭＣロットについて、以下の適合基準が満たされた：「成長なし」−１４日目の総生細胞数が、ＲＥＰの０日目に培養を開始した初期生細胞数より少なかったことを意味した。
適合基準を満たさないＰＢＭＣロットのコンティンジェンシーテスト
[00650] 照射ドナーＰＢＭＣロットが上記の適合基準を満たさなかった場合、その不適合の原因として単純な実験者エラーを排除するため以下のステップを行ってロットを再試験した。ロットのサテライトのバイアルが２つ以上残っていた場合、そのロットは再試験した。ロットのサテライトのバイアルが１つ残っているか又は残っていない場合、上記の適合基準に基づきそのロットは不適合とした。
[00651] 適格とされるには、コンティンジェンシーテストを受けるＰＢＭＣロットが、適合基準を達成する対照ロットと問題のロットの両方の複製との両方を有していた。これらの基準に適合すると、そのロットはリリースされた。
実施例９：ＩＬ−２ストック溶液の調製（Cellgenix）
[00652] この実施例は、精製され凍結乾燥された組換えヒトインターロイキン−２を、ｒｈＩＬ−２の使用を含むものを含む本願及び実施例に記載されたものを全て含む更なる組織培養プロトコルでの使用に適したストックサンプルに溶解するプロセスを説明する。
手順
[00653] ０．２％酢酸溶液（ＨＡｃ）を調製した。２９ｍＬ滅菌水を５０ｍＬコニカルチューブに移した。１ｍＬの１Ｎ酢酸を５０ｍＬのコニカルチューブに加えた。チューブを２〜３回反転させることにより十分に混合した。Steriflipフィルターを使用してろ過することによりＨＡｃ溶液を滅菌した。
[00654] ＰＢＳ中で１％ＨＳＡを調製した。１５０ｍＬ滅菌フィルターユニット内の９６ｍＬ ＰＢＳに４ｍＬの２５％ＨＳＡストック溶液を加えた。溶液をろ過した。４℃で貯蔵。調製したｒｈＩＬ−２の各バイアルについて、書式に記入した。
[00655] ｒｈＩＬ−２ストック溶液（６×１０６ＩＵ／ｍＬ最終濃度）を調製した。ｒｈ１Ｌ−２はロット毎に異なり、製造者の分析証明書（ＣＯＡ）に掲載されている以下のような情報が必要であった：１）バイアル当たりのｒｈＩＬ−２の質量（ｍｇ）、２）ｒｈＩＬ−２の比活性（ＩＵ／ｍｇ）及び３）推奨０．２％ＨＡｃ再構成容量（ｍＬ）
[00656] ｒｈＩＬ−２ロットに必要な１％ＨＳＡの容積は、以下の式を用いて計算した：
Figure 2020522516
[00657] 例えば、CellGenixのｒｈＩＬ−２ロット１０２００１２１ ＣＯＡによれば、１ｍｇバイアルの比活性は２５×１０６ｌＵ／ｍｇである。２ｍＬの０．２％ＨＡｃ中にｒｈＩＬ−２を再構成することが推奨されている。
[00658] ＩＬ−２バイアルのゴム栓をアルコールワイプで拭き取った。３ｍＬシリンジに取り付けた１６Ｇ針を使用して、推奨容積の０．２％ＨＡｃをバイアルに注入した。針を引き抜くときに栓が外れないよう注意を払った。バイアルを３回反転させて、粉末が全て溶解するまで回した。栓を慎重に取り外し、アルコールワイプ上に置いておいた。計算した容積の１％ＨＳＡをバイアルに加えた。
[00659] ｒｈＩＬ−２溶液の貯蔵。短期貯蔵（＜７２時間）の場合、バイアルを４℃で貯蔵した。長期貯蔵（＞７２時間）については、バイアルを少量のアリコートに分け、使用直前まで−２０℃でクライオバイアルに貯蔵した。凍結／解凍サイクルを避けた。調製日から６ヵ月後に期限切れとした。ｒｈ−ＩＬ−２表示には、販売業者及びカタログ番号、ロット番号、有効期限、作業者イニシャル、アリコートの濃度及び容積が含まれた。
実施例１０：凍結保存プロセス
[00660] この実施例では、CryoMed Controlled Rate Freezer、Model 7454（Thermo Scientific）を使用して、上記の実施例８で説明した短縮閉鎖手順で調製したＴＩＬの凍結保存プロセス方法について説明する。
[00661] 使用した機器は、実施例９で説明したものに加え、アルミニウム製カセットホルダーラック（ＣＳ７５０冷凍バッグと互換性あり）、７５０ｍＬバッグ用の低温保存カセット、低圧（２２ｐｓｉ）液体窒素タンク、冷蔵庫、熱電対センサー（バッグ用のリボンタイプ）、及びCryoStore ＣＳ７５０凍結バッグ（OriGen Scientific）である。
[00662] 凍結プロセスは、核形成から−２０℃まで０．５℃の速度及び最終温度−８０℃まで１分間に１℃の冷却速度を提供する。プログラムパラメータ、ステップ１ー４℃で待機；ステップ２：１．０℃／分（サンプル温度）から−４℃；ステップ３：２０．０℃／分（チャンバ温度）から−４５℃；ステップ４：１０．０℃ ／分（チャンバ温度）から−１０．０℃；ステップ５：０．５℃／分（チャンバ温度）から−２０℃；及びステップ６：１．０℃／分（サンプル温度）−８０℃まで、である。
実施例１１：クローズドシステムを使用した凍結保存ＴＩＬ細胞療法の生産
[00663] この実施例では、Iovance Biotherapeutics、IncのｃＧＭＰ製造について説明する。現行ヒト細胞・組織医薬品の製造・品質管理基準及び現行医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理に関する基準に従ったG-RexフラスコでのＴＩＬ細胞療法プロセス。この資料は、米国ＦＤＡ医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理に関する基準（２１ ＣＦＲ Ｐａｒｔ ２１０、２１１、１２７０、及び１２７１）、並びにフェーズＩから商用資料まで適用されるＩＣＨ Ｑ７基準に基づいて製造される。
[00664] プロセスの概要を以下の表２３に示す。
Figure 2020522516
[00665] 指定がない限り、この実施例全般的に１．０ｍＬ／Ｌ＝１．０ｇ／ｋｇを前提としている。開封後、２℃〜８℃で次の期限が適用される：ヒト血清、タイプＡＢ（ＨＩ）ジェミニ、１か月；２−メルカプトエタノール、１か月。硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍｌ原料は、室温で１か月間保管し得る。１０ＬのAIM-V培地を含む袋は、使用前に最大２４時間、１度だけ室温で温め得る。２２日目の回収中に、G-Rex500MCSフラスコからＴＩＬを回収するために２つのGatherexTMを使用し得る。
０日目 ＣＭ１培地の調製
[00666] ＲＰＭＩ１６４０培地を調製した。ＢＳＣにて、適切なサイズのピペットを使用して、１０００ｍＬ ＲＰＭＩ１６４０培地から１００．０ｍＬを取り出し、「廃棄物」とラベル付けされた適切なサイズの容器に入れた。
[00667] ＢＳＣにて、ＲＰＭＩ１６４０培地ボトルに試薬を追加した。表に示すように、ＲＰＭＩ１６４０培地ボトルに次の試薬を追加した。追加された容積が記録された。ボトルごとの追加量：熱不活性化ヒトＡＢ血清（１００．０ｍＬ）；GlutaMax（１０．０ｍＬ）；硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍＬ（１．０ｍＬ）；２−メルカプトエタノール（１．０ｍＬ）。
[00668] 試薬が完全に混合されるように、ＲＰＭＩ１６４０培地ボトルにキャップを付け、ボトルを回転させた。ステップ８．１．６から１Ｌ ０．２２−ミクロンフィルターユニットを通してＲＰＭＩ１６４０培地をろ過した。ろ過された培地とラベル付けした。ろ過された培地に無菌的に蓋をし、以下の情報をラベル付けした。
[00669] 全ての氷が溶けるまで、１つの１．１ｍＬ ＩＬ−２アリコート（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）を解凍した。ＩＬ−２を記録した：ロット番号と有効期限。ＩＬ−２原料溶液を培地に移した。ＢＳＣにて、１．０ｍＬのＩＬ−２原料溶液を、ステップ８．１．８で調製したＣＭ１ ０日目培地ボトルに移した。ＣＭ１ ０日目培地１ボトル及びＩＬ−２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）１．０ｍＬを追加した。ＩＬ−２を含む培地を混合するために、ボトルに蓋をして回転させた。「完了ＣＭ１ ０日目培地（Complete CM1 Day 0 Media）」というラベルが付けられた。
[00670] 適切なサイズのピペットを使用して２０．０ｍＬの培地を取り出し、５０ｍＬのコニカルチューブに分注した。ＢＳＣにて、「完了ＣＭ１ ０日目培地」と表示された２５．０ｍＬ（ステップ８．１．１３で調製済）を５０ｍＬのコニカルチューブに移した。チューブに「組織片」とラベル付けした。G-Rex100MCS（Ｗ３０１３１３０）を無菌的にＢＳＣに入れた。ＢＳＣにて、ベントフィルタークランプを開いたままにしG-Rex100MCSの全てのクランプを閉じた。ルアー接続を介して、G-Rex100MCSフラスコの赤い線をリピーターポンプ流体移送セット（Ｗ３００９４９７）の長径端に接続した。ＢＳＣに隣接しているＢａｘａポンプを実行した。ＢＳＣからリピーターポンプ流体移送セットのポンプチューブセクションを取り外し、リピーターポンプに取り付けた。ＢＳＣ内で、ポンプ式溶液分注システム（ＰＬＤＳ）（Ｗ３０１２７２０）からシリンジを取り外し、廃棄した。
[00671] ＰＬＤＳピペットを、ルアー接続を介してリピーターポンプ流体移送セットの小径端に接続し、吸引のために「完了ＣＭ１ ０日目培地」にピペットチップを取り付けた。培地とG-Rex100MCSの間の全てのクランプを開けた。完了ＣＭ１培地をG-Rex100MCSフラスコに送り込んだ。ポンプ速度を「高」及び「９」に設定し、全ての完了ＣＭ１ ０日目培地をG-Rex100MCSフラスコに送り込んだ。全ての培地が送り込まれた時点で、ラインをクリアにし、ポンプを停止した。
[00672] フラスコからポンプを取り外した。ベントフィルターを除き、フラスコの全てのクランプが閉じていることを確認した。赤い培地ラインからリピーターポンプ流体移送セットを取り外し、赤い培地ラインに赤いキャップ（Ｗ３０１２８４５）を取り付けた。ＢＳＣからG-Rex100MCSフラスコを取り除きターミナルルアー近くの赤いラインから赤いキャップをヒートシールした。ＱＡが用意したG-Rex100MCSフラスコにin-process「０日目」ラベルを付けた。下記に「０日目」ラベルのサンプルを添付した。インキュベーターパラメータ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％ＣＯ２。
[00673] ３０分以上の加温のために、インキュベーターに５０ｍＬコニカルチューブを設置した。
０日目 腫瘍洗浄培地の調製
[00674] ゲンタマイシンをＨＢＳＳに追加した。ＢＳＣにて、５．０ｍＬのゲンタマイシン（Ｗ３００９８３２又はＷ３０１２７３５）を１×５００ｍＬ ＨＢＳＳ培地（Ｗ３０１３１２８）ボトルに追加した。容積を記録した。ボトルごとの追加量：ＨＢＳＳ（５００．０ｍＬ）；硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍｌ（５．０ｍＬ）。試薬を完全に混合した。ステップ８．２．１で調製したゲンタマイシンを含むＨＢＳＳを１Ｌ ０．２２ミクロンフィルタユニット（Ｗ１２１８８１０）でろ過した。ろ過された培地に無菌的に蓋をし、以下の情報をラベル付けした。
０日目 腫瘍処置
[00675] 腫瘍標本を入手し、腫瘍情報を処理及び記録するために直ちに２〜８℃の部屋に移した。３本の５０ｍｌコニカルチューブにラベルを付けた：１つ目は「鉗子」、２つ目は「メス」、３つ目は「新鮮な腫瘍洗浄培地」。５×１００ｍｍのペトリ皿に「洗浄１（Wash 1）」、「洗浄２（Wash 2）」、「洗浄３（Wash 3）」、「保持（Holding）」、及び「良好でない（Unfavorable）」というラベルを付けた。１つの６ウェルプレートに「良好な中間断片」というラベルを付けた。
[00676] 適切なサイズのピペットを使用して、５．０ｍＬの「腫瘍洗浄培地」を１つの６ウェルプレートの各ウェルの良好な中間腫瘍断片を（合計３０．０ｍＬ）に移した。適切なサイズのピペットを使用して、ステップ８．２．４で調製した５０．０ｍＬの「腫瘍洗浄培地」を「洗浄１」、「洗浄２」、「洗浄３」、及び「保持」の各１００ｍｍペトリ皿に移した（合計２００．０ｍＬ）。適切なサイズのピペットを使用して、ステップ８．２．４で準備した２０．０ｍＬの「腫瘍洗浄培地」を各５０ｍＬコニカル（合計６０．０ｍＬ）に移した。２つの６ウェルプレートから蓋を無菌的に取り外した。蓋は、選択された腫瘍片に利用された。無菌的に腫瘍はＢＳＣに移された。処理開始時間が記録された。
[00677] 腫瘍洗浄１：鉗子を使用し、標本ボトルから腫瘍を取り出し、「洗浄１」に移した。鉗子を使用して、腫瘍を優しくそっと洗浄し、時間を記録した。サンプル計画ごとに、腫瘍標本ボトルから２０．０ｍＬ（又は利用可能な容積）の溶液を５０ｍＬのコニカルに移した。テスト用に提出するまで収集したバイオバーデンサンプルを２〜８℃でラベル付けし保存した。
[00678] 腫瘍洗浄２：新しい鉗子セットを使用し、「洗浄１」皿から腫瘍を取り出し、「洗浄２」皿に移した。鉗子を使用して、３分以上静かに攪拌して腫瘍標本を洗浄し、その後静置した。時間を記録した。
[00679] 移送ピペットを使用して、コニカルから腫瘍洗浄培地を４滴ずつ、６ウェルプレートの裏返した蓋のそれぞれの６つの円に入れた（２つの蓋）。２つの円に追加で滴下し、合計で５０滴入れた。
[00680] 腫瘍洗浄３：鉗子を使用し、「洗浄２」皿から腫瘍を取り出し、「洗浄３」皿に移した。鉗子を使用し、静かに攪拌して腫瘍標本を洗浄し、その後３分以上静置した。時間を記録した。
[00681] １５０ｍｍ皿の蓋の下に定規を置いた。鉗子を使用して、無菌的に腫瘍標本を１５０ｍｍ解剖皿の蓋に移した。腫瘍標本の全ての断片を端から端まで配置し、おおよその全長と断片の数を記録した。壊死／脂肪組織の腫瘍を評価した。腫瘍領域全体の３０％超が壊死及び／又は脂肪組織であることが観察されたかどうかを評価した。はいの場合、腫瘍が適切な大きさであることを確認し、その場合、続行した。腫瘍領域全体の３０％未満が壊死組織又は脂肪組織であることが観察されたかどうかを評価した。はいの場合、続行した。
[00682] 切離の処理。腫瘍が大きく、組織外部の３０％超が壊死／脂肪質であることが観察された場合、メス及び／又は鉗子の組み合わせを用いて、腫瘍の内部構造を維持しつつ、壊死／脂肪組織を取り除くことにより「切離の処理」が行われた。腫瘍の内部構造を維持するために、垂直切断圧のみを使用した。メスによる鋸引き運動での切断はしなかった。
[00683] メス及び／又は鉗子の組み合わせを使用して、腫瘍標本を均一で適切なサイズの断片（最大６個の中間断片）に切断する。腫瘍の内部構造を維持するために、垂直切断圧のみを使用する。メスによる鋸引き運動での切断はしなかった。解剖されていない中間断片を「腫瘍洗浄培地」に完全に浸したままにすること。各中間断片を「保持」皿に移した。
[00684] 一度に１つの中間断片を操作し、解剖皿の腫瘍中間断片をおよそ３×３×３ｍｍのサイズの断片に切離し、各断片の出血、壊死、及び／又は脂肪組織の量を最小限にした。腫瘍の内部構造を維持するために、垂直切断圧のみを使用した。メスによる鋸引き運動での切断はしなかった。
[00685] 出血、壊死、及び／又は脂肪組織のない最大８個の腫瘍片を選択した。参考として、定規を使用した。８個の良好な断片を得られるまで、又は中間断片全体が切離されるまで解剖を続けた。選択した各断片を「腫瘍洗浄培地」の１滴に移した。
[00686] 中間断片から最大８個を選択した後、中間断片の残りを「良好な中間断片」の６ウェルプレートの新しいシングルウェルに入れた。
[00687] 望ましい組織が残っている場合、最大５０断片を滴下で充填するために、「良好な中間断片」の６ウェルプレートから追加の好ましい腫瘍片を選択した。作成された切離断片の総数を記録した。
[00688] インキュベーターから「組織片」５０ｍＬコニカルチューブを取り出した。コニカルチューブを３０分以上温めること。「組織片」５０ｍＬコニカルをＢＳＣに入れ、オープン処理表面の無菌性を損なわないようにする。
[00689] 移送ピペット、メス、鉗子、又は組み合わせを使用して、良好な皿の蓋から選択された５０個の最良の腫瘍断片を「組織片」５０ｍＬコニカルチューブに移した。移動中に腫瘍片を落とし、望ましい組織が残っている場合、好ましい腫瘍中間断片ウェルから追加の断片が加えられた。断片数を記録した。
[00690] インキュベーターから培地を含むG-Rex100MCSを取り出した。G-Rex100MCSフラスコを無菌的にＢＳＣに入れた。フラスコを移す時、蓋又は容器の底から手に持たなかった。両サイドから手に持ち容器を移動した。ＢＳＣでは、G-Rex100MCSフラスコキャップを持ち上げて、チューブ内部の無菌性が維持されるようにした。懸濁するために腫瘍片の入ったコニカルチューブを攪拌し、内容物を素早くG-Rex100MCSフラスコに注いだ。腫瘍片がフラスコの膜全体に均一に分布するように確認した。必要に応じてフラスコを前後に静かに傾けて、腫瘍片を均等に分散させた。容器の底膜の腫瘍断片の数及び容器内に確認できる浮遊物の数を記録した。注記：播種された断片の数がステップ８．３．３６Ｈで収集された数と同等でない場合は、エリア管理に連絡し、セクション１０．０の文書を作成すること。
[00691] 以下のパラメータでG-Rex100MCSをインキュベートした：G-Rexフラスコをインキュベートした：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２ パーセンテージ：５．０±１．５％ ＣＯ２。インキュベーション１１日目にG-Rex100MCSを取り出す適切な時間を決定するための計算を実行した。計算：インキュベーション時間；下限＝インキュベーション時間＋２５２時間；上限＝インキュベーション時間＋２７６時間。
１１日目−培地の調製
[00692] インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセンテージ:５．０±１．５％ ＣＯ２。インキュベーターで３０分以上温めた１０００ｍＬ ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｗ３０１３１１２）ボトル３本及び１０００ｍＬ AIM-V（Ｗ３００９５０１）ボトル３本。時間を記録した。培地：ＲＰＭＩ１６４０及びAIM-V。後で使用するために、AIM-V培地（Ｗ３００９５０１）の追加の１×１０００ｍｌボトルを室温で配置した。
[00693] 時間に達した時にＲＰＭＩ１６４０培地を取り出した。ステップ８．４．４でインキュベーション終了時間を記録した。培地が３０分以上温められていることを確認する。ＢＳＣで、３本のあらかじめ温めておいた１０００ｍＬ ＲＰＭＩ１６４０培地ボトルのそれぞれから１００．０ｍＬを取り出し、「廃棄物」というラベルが付いた適切なサイズの容器に入れた。ＢＳＣで、３本のＲＰＭＩ１６４０培地ボトルそれぞれに以下の試薬を加え、各ボトルに加えた容積を記録した。GemCellヒト血清熱不活性化タイプAB（１００．０ｍＬ）、GlutaMax（１０．０ｍＬ）、硫酸ゲンタマイシン５０ｍｇ／ｍｌ（１．０ｍＬ）、２−メルカプトエタノール（１．０ｍＬ）。
[00694] 試薬が完全に混合されるように、ボトルに蓋をし、回転した。培地の各ボトルを個別の１Ｌ ０．２２ミクロンフィルターユニットでろ過した。ろ過した培地を、無菌的に蓋をし、各ボトルにＣＭ１ １１日目培地ラベル付けした。全ての氷が溶けるまでＩＬ−２の３×１．１ｍＬアリコート（６×１０６ ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）を解凍し、ＩＬ２ロット番号と有効期限を記録した。
[00695] インキュベーターから３本のAIM-V培地を取り出した。インキュベーション終了時間を記録した。３０分以上培地を温めたか確認した。マイクロピペットを使用して、解凍したＩＬ−２ ３．０ｍＬを事前に温めたAIM-V培地の１Ｌボトル１本に加えた。ＩＬ−２を分注した後、マイクロピペットチップを培地で洗浄する。各アリコートに新しい滅菌マイクロピペットチップを使用する。追加された総量を記録した。「ＩＬ−２を含むAIM-V」とボトルにラベルを付けた。１０ＬのLabtainerバッグとリピーターポンプ移送セットをＢＳＣに無菌的に移した。１０ＬのLabtainerバッグの全てのラインを閉じた。ルアーロック接続を介して、リピーターポンプ移送セットの長径のチューブの端を１０ＬのLabtainerバッグの中央メスポートに取り付けた。
[00696] ＢＳＣに隣接しているBaxaポンプを実行した。移送セットチュービングをBaxaポンプに通した。Baxaポンプを「高」及び「９」に設定する。Pumpmatic Liquid-Dispensing System（ＰＬＤＳ）からシリンジを取り外し、廃棄した。ＰＬＤＳピペットの無菌性を損なわないようにすること。
[00697] ルアー接続を介してＰＬＤＳピペットをリピーターポンプ流体移送セットの小径端に接続し、吸引のためＩＬ−２ボトル（ステップ８．４．１３で調製済）を含むAIM-V培地にピペットの先端を入れた。培地ボトルと１０ＬのLabtainer間の全てのクランプを開いた。
[00698] ＰＬＤＳを使用して、ステップ８．４．１３で調製したＩＬ−２を含むあらかじめ温めておいたAIM-V培地を２本の追加のAIM-Vボトルと同様に１０ＬのLabtainerバッグに移す。ステップ８．４．１０のろ過されたＣＭ１ １１日目培地の３本のボトルを追加した。最終ボトルの追加後、バッグのラインをクリアにした。注記：培地の各ボトルの追加の間にポンプを停止した。移送セットからＰＬＤＳを取り出し、ＢＳＣのラインのルアーに赤いキャップを取り付けた。バッグを優しく揉み混合した次に記載する情報で培地バックにラベル付けした。有効期限は調製日から２４時間であった。
[00699] 「完了ＣＭ２ １１日目培地（Complete CM2 Day 11 Media）」バッグの利用可能なメスポートに６０ｍＬシリンジを取り付けた。２０．０ｍＬの培地を取り出し、５０ｍＬのコニカルチューブに入れた。「完了ＣＭ２ １１日目培地」バッグのメスポートに赤いキャップを取り付けた。テスト用に提出するまで、培地参考サンプルを２〜８℃でラベル付けし保存した。移送セットラインの赤いキャップを、赤いキャップの近くでヒートシールした移送セットをバッグに接続したままにした。
[00700] ＢＳＣで、「細胞数希釈用」とロット番号でラベル付けされた４．５ｍＬのAIM-V培地を４本の１５ｍＬコニカルチューブに追加した。ロット番号とチューブ番号（１〜４）をチューブにラベル付けした。４つのクライオバイアル「フィーダー」とバイアル番号（１〜４）とラベル付けした。残りの２−メルカプトエタノール、GlutaMax、及びヒト血清をＢＳＣから２〜８℃に移した。
[00701] ＢＳＣの外側で、調製した「ＣＭ２ １１日目培地」バッグに取り付けられた移送セットに１Ｌ移送パックを溶接した。「フィーダー細胞ＣＭ２」及びロット番号を移送パックにラベル付けした。バッグから数インチ離れた場所に１Ｌの移送パックチューブのチューブに、マークを付けた。チューブがマークの位置までスケール上にあるように、空の移送パックをスケールの上に置いた。スケールを風袋引きし、スケールに空の移送パックを置いた。
[00702] Baxaポンプを「中」及び「４」に設定する。ステップ８．４．２２で調製した「完了ＣＭ２ １１日目」培地５００．０±５．０ｍＬを細胞ＣＭ２培地移送パックに注入した。重量で測定し、移送パックに追加された完了ＣＭ２培地の容積を記録した。
[00703] 充填したら、ラインをヒートシールした。フィーダーセル培地移送パックから移送セット付きのＣＭ２ １１日目の培地バッグを離し、１Ｌ移送パックに溶接したままにした。調製した「完了ＣＭ２ １１日目培地」を使用するまでインキュベーターに入れた。
１１日目−ＴＩＬ回収
[00704] インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％ ＣＯ２。G-Rex100MCSをインキュベーターから取り外す前に、インキュベーションパラメータが満たされていることを確認するためのチェックを実行した。下限は上記と同じである。
[00705] インキュベーターからの取り出し時間を記録した。インキュベーターからG-Rex100MCSを慎重に取り外し、大きなフィルターラインを除く全てのクランプを閉じた。処理開始時間が記録された。
[00706] ３００ｍＬ移送パックに「ＴＩＬ懸濁液」のラベルを付けた。重力血液フィルターのＴＩＬ懸濁液移送（単線）を滅菌溶接した。３００ｍＬ移送パックをはかりに置き、乾燥重量を記録した。１Ｌ移送パックに「上清（Supernatant）」とラベル付けした。
[00707] G-Rex100MCSからの赤い培地除去ラインを「上清」移送パックに滅菌溶接した。「ＴＩＬ懸濁液」移送パックに接続された血液フィルターの上部の２つのスパイクラインのうちの１つにG-Rex100MCSからの透明細胞除去ラインを滅菌溶接した。G-Rex100MCSをGatheRexの左側に配置し、「上清」及び「ＴＩＬ懸濁液」移送パックを右側に配置した。
[00708] G Rex100MCSから赤い培地除去ラインをGatheRexのクランプ上部（赤い線でマーク）及びチューブガイドに取り付けた。G-Rex100MCSからのクリアハーベストラインをGatheRexのクランプ底部（青い線でマーク）及びチューブガイドに取り付けた。GatheRexからG-Rex100MCSフラスコの滅菌フィルターにガスラインを取り付けた。G-Rex100MCSフラスコから上清を除去する前に、細胞除去ラインの全てのクランプが閉じていることを確認した。G-Rex100MCSから１Ｌ移送パックに約９００ｍＬの培地上清を移した。フラスコが水平であり、吸引ディップチューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex100MCSフラスコを目視で検査した。
[00709] 上清を取り除いた後、赤いラインへのクランプを全て閉じた。
[00710] フラスコを激しく叩いて細胞を遊離させるために培地を攪拌した。全ての細胞が離れたことを確認するためにフラスコの検査を実施した。注記：細胞が離れなかった場合は、エリア管理に連絡すること。収集チューブから離してフラスコを傾け、腫瘍片を縁に沿って沈降させた。断片がフラスコの反対側に残るように、収集チューブに向かってゆっくりとフラスコを傾けた。細胞収集ストローが壁面及び底膜の接合部にない場合、ストローを適切に配置するには、通常、４５°の角度でフラスコを傾けたまま軽く叩くだけで十分である。
[00711] ＴＩＬ懸濁液移送パックにつながる全てのクランプを解放した。GatheRexを使用して、血液フィルターから細胞懸濁液を３００ｍＬ移送パックに移した。全ての細胞と培地が収集されるまで、エッジを傾斜し続けた。付着した細胞について膜を検査した。G-Rex100MCSの底をすすいだ。ガス交換膜の約１／４をリンス培地で覆う。全てのクランプが閉じていることを確認した。チューブ全体の長さがほぼ同じになるように、できる限り溶接部の近くでＴＩＬ懸濁液移送パックをヒートシールした（プロセスノート５．１２に従う）。「上清」トランスファパックをヒートシールした。溶接のための十分なラインを維持した。ＴＩＬ懸濁液移送パックの質量記録し、細胞懸濁液の容積を計算した。
[00712] ４インチプラズマ移送セットを「上清」移送パックに溶接し、４インチプラズマ移送セットのルアー接続を保持し、ＢＳＣに移した。４インチプラズマ移送セットを３００ｍＬ「ＴＩＬ懸濁」移送パックに溶接し、４インチプラズマ移送セットのルアー接続を保持し、ＢＳＣに移した。
[00713] １Ｌの「上清」移送パックから約２０．０ｍＬの上清を吸い上げ、「Bac-T」とラベル付けした滅菌５０ｍＬコニカルチューブに分注した。適切なサイズのシリンジを使用して、BacTとラベル付けされた５０ｍＬのコニカルから１．０ｍＬのサンプルを取り出し、嫌気性ボトルに播種した。
[00714] バイアル番号（１〜４）と４つのクライオバイアルにラベル付けした。別の３ｍＬシリンジを使用して、ルアー接続を使用してＴＩＬ懸濁液移送パックから４×１．０ｍＬの細胞カウントサンプルを引き出し、それぞれのクライオバイアルに入れた。ラインに赤いキャップ（Ｗ３０１２８４５）を取り付けた。必要になるまで、ＴＩＬ移送パックをインキュベーターに入れた。細胞計数及び計算を実行した。希釈していない初期細胞計数を実行した。希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０。
[00715] 細胞計数とＴＩＬ数を記録した。総生存ＴＩＬ細胞が５×１０６未満の場合、「１１日目のG-Rexの充填及び播種（Fill and Seed）」に進めた。総生存ＴＩＬ細胞が５×１０６を超える場合は、「フローサイトメトリーで計算」に進む。
フローサイトメトリーで計算
[00716] 総生存ＴＩＬセル数が４．０×１０７以上の場合、フローサイトメトリーのサンプル用に１．０×１０７個の細胞を得るために容積を計算した。フローサイトメトリーに必要な総生細胞：１．０×１０７細胞。フローサイトメトリーに必要な細胞の容積：生細胞濃度を１．０×１０７細胞で割った値。
[00717] 該当する場合：総生細胞及び容積のフローを再計算した。以下のサイトメトリーのサンプルを除去した後の残りの総生細胞と残りの容積を計算した。
サンプルのＴＩＬ凍結保存
[00718] 該当する場合：凍結保存のための容積の計算。凍結保存用に１×１０７個の細胞を得るために必要な細胞の容積を計算した。
Figure 2020522516
[00719] 該当する場合：凍結保存用のサンプルを取り除いた。ＴＩＬ懸濁液移送パックから計算された容積を取り出した。適切なサイズのコニカルチューブに入れ、「凍結保存サンプル１×１０７細胞」、日付及びロット番号をラベル付けした。ＴＩＬ懸濁液移送パックに赤いキャップ（Ｗ３０１２８４５）を取り付けた。
[00720] 次のパラメータに従って「凍結保存サンプル１×１０７細胞」を遠心分離した。速度：３５０×ｇ、時間：１０：００分、温度：外気温度、ブレーキ：フル（９）；加速：フル（９）。
[00721] ＣＳ−１０を追加した。ＢＳＣにて、無菌的に上清を吸引した。チューブの底を軽く叩き、残った液体に細胞を再懸濁した。ＣＳ−１０を追加した。０．５ｍＬのＣＳ１０をゆっくりと添加した。追加された容積を記録した。凍結保存サンプルバイアルは、約０．５ｍＬで満たされた。
１１日目−フィーダー細胞
[00722] ＬＮ２フリーザーから少なくとも２つの異なるロット番号を持つフィーダー細胞のバッグを３つ入手した。解凍の準備ができるまで、ドライアイス上に細胞を置いた。フィーダー細胞情報を記録した。少なくとも２つの異なるロット番号のフィーダー細胞が得られたことを確認した。フィーダー細胞バッグをロット番号に基づいて個々のジップトップバッグに入れ、３７．０±２．０℃の水浴若しくはサイトサーモを約３〜５分又は氷が消えるまで解凍した。
[00723] フィーダー細胞ハーネスの準備。４Ｓ−４Ｍ６０をＣＣ２セルコネクト（Ｗ３０１２８２０）に溶接し、セルコネクト装置の単一スパイクを４Ｓ−４Ｍ６０マニホールドの４スパイク端に置き換えた。必要に応じて溶接した。
[00724] 「フィーダー細胞ＣＭ２ 培地（Feeder Cell CM2 Media）」移送パックに溶接された培地移送パックをＣＣ２ルアーに接続した。バッグは、ニードレスインジェクションポートでハーネスの側面に取り付けられた。完了ＣＭ２ １１日目培地を含む部品をＢＳＣに移した。
[00725] 解凍したフィーダー細胞を貯めるＢＳＣ内で、１００ｍＬシリンジに１０ｍＬの空気を引き込んだ。これを使用して、ＣＣ２の６０ｍＬシリンジを交換した。カバーを取り外す前に、アルコールパッドでフィーダー細胞バックのポートを拭いた。ＣＣ２の３つのスパイクを使用して、３つのフィーダーバッグをスパイクする。スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持した。ポートの側面に穴を開けないようにすること。フィーダー細胞バッグからのラインが開き、ニードレスインジェクションポートへのラインが閉じるように、活栓を開いた。フィーダー細胞バッグの内容物をシリンジに入れた。３つのバッグは全て一度に排水された。シリンジの圧力を維持しながら、フィーダー細胞バッグから排水した時点で、フィーダー細胞バッグのラインを遮断した。下のシリンジ、シリンジからハーネスを取り外さなかった。シリンジ内のフィーダー細胞の総量を記録した。
[00726] 移送パックにフィーダー細胞が追加された。活栓を回し、フィーダー細胞バッグのラインを閉じ、培地移送パックのラインを開けた。培地移送パックへのラインがクランプ解除されていることを確認した。フィーダー細胞をシリンジから「フィーダー細胞ＣＭ２培地」移送パックに分注した。フィーダー細胞を含む移送パックのラインのクランプを開放し、シリンジはハーネスに取り付けたままにした。移送パックの貯められたフィーダー細胞を混合するためにバッグをマッサージした。「フィーダー細胞懸濁液」とバッグにラベル付けした。
[00727] フィーダー細胞懸濁液の総量を計算した。細胞計数サンプルを取り除いた。各サンプルに個別の３ｍＬシリンジを使用し、ニードレスインジェクションポートを使用してフィーダー細胞懸濁液移送パックから４×１．０ｍＬの細胞数サンプルを引き出した。各サンプルをラベル付きクライオバイアルに分注した。
[00728] ＮＣ−２００及びプロセスノート５．１４を使用して、細胞数及び計算を実行した。０．５ｍＬの細胞懸濁液を、ロット番号及び「細胞数希釈用（For Cell Count Dilutions）」でラベル付けされた４．５ｍＬのAIM-V培地に加えることにより、細胞数サンプルを希釈した。これにより１：１０希釈となる。
[00729] 細胞数及びサンプル量を記録した。総生細胞が５×１０９未満の場合は、続行する。総生細胞が５×１０９以上の場合、細胞数を増やすために上記のように進めた。必要に応じて追加のフィーダー細胞を得て、先に述べたように移送パックに追加した。生存可能な５×１０９のフィーダー細胞を得るために必要なフィーダー細胞懸濁液の容積を計算した。除去する過剰分のフィーダー細胞の容積を計算した。最も近い整数に切り捨て。
[00730] 余分なフィーダー細胞を除去した。新しい１００ｍＬシリンジで、１０ｍＬの空気を吸い上げ、シリンジをハーネスに取り付けた。「フィーダー細胞懸濁液（Feeder Cell Suspension）」移送パックへのラインを開いた。シリンジを使用して、ステップ８．６．７１Ｃで計算されたフィーダー細胞の容積と移送パックからの追加の１０．０ｍＬを１００ｍＬシリンジに入れた。フィーダー細胞の容積を取り除いたら、フィーダー細胞懸濁液移送パックのラインを閉じた。最終シリンジは取り外さなかった。シリンジが満たされたら、新しいシリンジと交換した。複数のシリンジを使用して、総量を取り除いた。新しいシリンジごとに、１０ｍＬの空気を引き込んだ。除去されたフィーダー細胞の総量（追加の１０ｍＬを含む）を記録した。
[00731] ＯＫＴ３を加えたＢＳＣで、１．０ｍＬシリンジと１６Ｇ針を使用して、０．１５ｍＬのＯＫＴ３を吸い上げた。シリンジから針を無菌的に取り外し、シリンジをニードルレスインジェクションポートに取り付ける。ＯＫＴ３を注入した「フィーダー細胞懸濁液（Feeder Cell Suspension）」移送パックの活栓を開き、ステップ８．６．７３で取り出したフィーダー細胞１０ｍＬを追加して、ラインを通してＯＫＴ３を洗い流した。シリンジを逆さまにして、空気を押し通してフィーダー細胞懸濁液移送パックへのラインをクリアにした。残りのフィーダー細胞懸濁液をシリンジに残した。全てのクランプを閉じ、ハーネスをＢＳＣから取り外した。溶接に十分なチューブを残し、フィーダー細胞懸濁液移送パックをヒートシールした。
１１日目 G-Rexの充填及び播種
[00732] G-Rex500MCSのセットアップ。梱包からG-Rex500MCSを取り出し、フラスコに亀裂やチューブにねじれがないか検査した。全てのルアー接続と閉鎖がしっかりしていることを確認した。ベントフィルターラインを除くG-Rex500MCSラインの全てのクランプを閉じた。マーカーを使用して、４．５Ｌグラデーションで線を引いた。インキュベーターから「完了ＣＭ２ １１日目培地」を取り出した。
[00733] 培地を汲み上げる準備。G-Rex500MCSの赤い線を、完了ＣＭ２ １１日目培地に接続されたリピーターポンプ移送セットに溶接した。「完了ＣＭ２ １１日目培地」バッグをIVポールに掛けた。ポンプチュービングをBaxaポンプに通した。G-Rex500MCSに培地を注入した。Baxaポンプを「高」及び「９」に設定する。G-Rex500MCSに４．５Ｌの培地を注入し、４．５Ｌグラデーションでフラスコに印を付けた線まで満たした。溶接部の近くでG-Rex500MCSの赤い線をヒートシールした。フラスコに「１１日目」とラベル付けをした。フィーダー細胞の溶接：懸濁液移送パックをフラスコへ。G-Rex500MCSの赤い線を「フィーダー細胞懸濁液（Feeder Cell Suspension）」移送パックに滅菌溶接した。
[00734] フィーダー細胞をG-Rex500MCSに加えた。フィーダー細胞懸濁液とG-Rex500MCSの間の全てのクランプを開き、重力供給方式によりフラスコにフィーダー細胞懸濁液を追加した。溶接部近くの赤い線をヒートシールした。ＴＩＬ懸濁液移送パックをフラスコに溶接した。G-Rex500MCSの赤い線を「ＴＩＬ懸濁液」移送パックに滅菌溶接した。
[00735] ＴＩＬをG-Rex500MCSに追加した。ＴＩＬ懸濁液とG-Rex500MCSの間の全てのクランプを開き、重力供給方式によりフラスコにＴＩＬ懸濁液を追加した。ＴＩＬ懸濁液バッグを取り外すために、溶接部近くの赤い線をヒートシールした。
[00736] G-Rex500MCSをインキュベートした。大きなフィルターラインを除き、G-Rex500MCSの全てのクランプが閉じていることを確認し、インキュベーターに置いた。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセント：５．０±１．５％ ＣＯ２。
[00737] インキュベーションウィンドウを計算したインキュベーション１６日目にG-Rex500MCSを取り出す適切な時間を決定するための計算を実行した。下限：インキュベーション時間＋１０８時間。上限：インキュベーション時間＋１３２時間。
１１日目、過剰ＴＩＬ凍結保存
[00738] 過剰なＴＩＬバイアルを冷凍した。制御速度冷凍庫（Control Rate Freezer（ＣＲＦ））に入れられたバイアルの総数を記録及び検証した。冷却が完了したら、バイアルをＣＲＦから適切な保管容器に移す。
１６日目 培地の調製
[00739] 事前に温められたAIM-V培地使用の少なくとも１２時間前までに２〜８℃から３つのＣＴＳ AIM V １０Ｌ培地バッグを取り外し、遮光して室温に置いた。各バッグにラベルを付けた。温め開始時刻と日付の記録。全てのバッグが１２〜２４時間温められていることを確認した。
[00740] ルアー接続を使用して、１０ＬのLabtainerバッグのメスポートの１つに、リピーターポンプ流体移送セットの長径端を接続した。「上清」として上清のラベルを１０ＬのLabtainerに準備した。上清用に１０ＬのLabtainerを準備した。ＢＳＣから取り外す前に、全てのクランプが閉じられていることを確認すること。
[00741] 全ての氷が溶けるまで、ＣＴＳ AIM V培地の１袋当たりＩＬ−２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）の５×１．１ｍＬアリコートを解凍した。Glutamax１００．０ｍＬを適切なサイズのレシーバーに分注した。各Glutamaxレシーバーに追加された容積を記録し、各レシーバーに「GlutaMax」とラベル付けした。
[00742] ＩＬ−２をGlutaMaxに追加した。マイクロピペットを使用して、各GlutaMaxレシーバーに５．０ｍＬのＩＬ−２を追加した。プロセスノート５．１８ごとにチップをすすぐことを確認し、追加した各ｍＬに新しいピペットチップを使用した。各レシーバーに追加された容積を記録し、各レシーバーに「GlutaMax＋ＩＬ−２」とレシーバー番号をラベル付けした。
[00743] 製剤用にＣＴＳ AIM V培地バッグを準備した。ＣＴＳ AIM V １０Ｌ培地バッグ（Ｗ３０１２７１７）が室温で温められ、使用前に１２〜２４時間遮光されていることを確認した。インキュベーション終了時間を記録した。ＢＳＣで、４インチプラズマ移送セットのクランプを閉じ、スパイクポートを使用しバッグと接続した。スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持した。ポートの側面に穴を開けないようにすること。ルアーを通じて、リピーターポンプ流体移送セットの長径端を４インチプラズマ移送セットに接続した。
[00744] ＢＳＣに隣接しているBaxaポンプを実行した。ＢＳＣからリピーターポンプ流体移送セットのポンプチューブセクションを取り外し、リピーターポンプに取り付けた。
[00745] 製剤用培地を準備した。ＢＳＣ内で、ポンプ式溶液分注システム（ＰＬＤＳ）からシリンジを取り外し、廃棄した。ＰＬＤＳピペットの無菌性を損なわないようにすること。ＰＬＤＳピペットを、ルアー接続を介してリピーターポンプ流体移送セットの小径端に接続し、吸引のために「GlutaMax＋ＩＬ−２」にピペットチップを取付けた。レシーバー及び１０Ｌバッグの間の全てのクランプを開く。
[00746] GlutaMax＋ＩＬ−２をバッグに注入した。ポンプ速度を「中」と「３」に設定し、全ての「GlutaMax＋ＩＬ−２」を１０Ｌ ＣＴＳ AIM V培地バッグに送った。溶液が残っていない場合、ラインをクリアにし、ポンプを停止する。以下の各Aim Vバッグに追加されたＩＬ−２を含むGlutaMaxの容積を記録した。
[00747] ＰＬＤＳを取り外した全てのクランプが閉じていることを確認し、リピーターポンプ流体移送セットからＰＬＤＳピペットを取り外した。リピーターポンプ流体移送セットを取り外し、４インチのプラズマ移送セットに赤いキャップを付けた。
[00748] 調製済み「完全ＣＭ４ １６日目培地（Complete CM4 Day 16 media）」と各バッグにラベル付けした。
[00749] サンプルプランごとの培地参考品を除去した。３０ｍＬシリンジを使用して、シリンジを４インチプラズマ移送セットに取り付けて２０．０ｍＬの「完全ＣＭ４ １６日目培地」取り出し、５０ｍＬコニカルチューブにサンプルを分注した。シリンジを取り外した後、４インチプラズマ移送セットが固定されているか又は赤いキャップが付いているか確認する。
[00750] 新しいリピーターポンプ流体移送セットを取り付けた。「完全ＣＭ４ １６日目培地」バッグに接続された４インチプラズマ移送セットに新しいリ流体ポンプ移送セットの長径端を取り付けた。サンプルプラン在庫ラベルとラベル付けし、テスト用に提出するまで、培地参考品サンプルを２〜８℃で保存した。
[00751] インキュベーターをモニターした。該当する場合、準備された追加のバッグを監視する。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセント：５．０±１．５％ ＣＯ２。
[00752] 完全ＣＭ４ １６日目培地を温めた。インキュベーター内の完全ＣＭ４ １６日目培地の最初のバッグを、使用準備が整うまで３０分以上温めた。該当する場合、追加のバッグを温めた。
[00753] 希釈の準備をした。ＢＳＣで、「細胞数希釈用」とラベル付けされたAIM-V培地の４．５ｍＬを各４×１５ｍＬコニカルチューブに加えた。コニカルチューブにラベルを付けた。４つのクライオバイアルにラベルを付けた。
１６日目 ＲＥＰ流出
[00754] インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０ ℃；ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％ ＣＯ２。
[00755] インキュベーターからG-Rex500MCSを取り出した。G-Rex500MCSをインキュベーターから取り外す前に、インキュベーションパラメータ上限、下限、除去時間が満たされていることを確認するためのチェックを実行した。インキュベーターからG-Rex500MCSを取り出した。
[00756] 約１２インチのラインを残し、１Ｌの移送パック（Ｗ３００６６４５）をヒートシールした。１Ｌ移送パックに「ＴＩＬ懸濁液」のラベルを付けた。ライン全体を含む１Ｌの移送パックをはかりの上に置き、乾燥重量を記録した。
[00757] GatheRexのセットアップ。G-Rex500MCSからの赤色の培地除去ラインを、上記で調製した１０ＬのLabtainerバッグ「上清」のリピーターポンプ移送セットに滅菌溶接した。G-Rex500MCSからクリア細胞除去ラインを、上記で準備したＴＩＬ懸濁液移送パックに滅菌溶接した。G-Rex500MCSフラスコをGatheRexの左側に配置した。上清Labtainerバッグを置き、その右側にＴＩＬ懸濁液移送パックを配置した。G-Rex500MCSからの赤い培地除去ラインをGatheRexのクランプ上部（赤い線でマーク）及びチューブガイドに取り付けた。G-Rex500MCSからのクリアハーベストラインをクランプ底部（青い線でマーク）及びGatheRexのチューブガイドに取り付けた。GatheRexからガスラインをG-Rex500MCSの滅菌フィルターに取り付けた。注記：G-Rex500MCSから上清を除去する前に、細胞除去ラインの全てのクランプが閉じていることを確認した。
[00758] G-Rex500MCSの容積削減。ＳＯＰ−０１７７７に従って、G-Rex500MCSから１０ＬのLabtainerに約４．５Ｌの培養上清を移した。フラスコが水平であり、吸引ディップチューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex500MCSフラスコを目視で検査した。
[00759] ＴＩＬ回収用にフラスコを準備した。上清を取り除いた後、赤いラインへのクランプを全て閉じた。
[00760] ＴＩＬ回収の開始。ＴＩＬ回収開始時間を記録した。フラスコを激しく叩き細胞を遊離させるために培地を攪拌した。全ての細胞が離れたことを確認するためにフラスコの検査を実施した。フラスコを傾けて、ホースがフラスコの端にくるようにした。細胞収集ストローが壁面及び底膜の接合部にない場合、ストローを適切に配置するには、通常、４５°の角度でフラスコを傾けたまま軽く叩くだけで十分である。
[00761] ＴＩＬの回収。ＴＩＬ懸濁液移送パックにつながる全てのクランプを解放した。GatheRexを使用して、細胞懸濁液をＴＩＬ懸濁液移送パックに移した。注記：全ての細胞と培地が収集されるまで、エッジを傾斜し続けることを確認する。付着した細胞について膜を検査した。
[00762] フラスコ膜をすすいだ。G-Rex500MCSの底をすすいだ。ガス交換膜の約１／４をリンス培地で覆う。G-Rex500MCSのクランプを閉じた。G-Rex500MCSの全てのクランプが閉じていることを確認した。
[00763] ヒートシールした。チューブ全体の長さがほぼ同じになるように、できる限り溶接部の近くでＴＩＬ懸濁液移送パックをヒートシールした。上清を含む１０ＬのLabtainerをヒートシールし、サンプル収集のためにＢＳＣに通した。
[00764] 細胞懸濁液を含む移送パックの質量を記録し、細胞懸濁液の容積を計算した。サンプル除去用の移送パックを準備した。４インチプラズマ移送セットを上からＴＩＬ懸濁液移送パックに溶接し、できるだけバッグの近くにメスルアーの端に取り付けたままにした。
[00765] 細胞上清からテストサンプルを取り除いた。ＢＳＣで、メスのルアーポートと適切なサイズのシリンジを使用して、１０ＬのLabtainerから１０．０ｍＬの上清を取り除く。１５ｍＬのコニカルチューブに入れて「BacT」とラベルを付け、BacTサンプル用にチューブを保持した。別のシリンジを使用して、１０．０ｍＬの上清を取り出し、１５ｍＬコニカルチューブに入れた。テスト用にマイコプラズマサンプル用のチューブを保持した。「マイコプラズマ希釈剤」としてチューブにラベル付けした。上清バッグを閉じた。ルアーポートに赤いキャップを付けてバッグを閉じ、ＢＳＣから外した。
[00766] 細胞カウントサンプルを取り出した。ＢＳＣで、各サンプルに個別の３ｍＬシリンジを使用して、ルアー接続を使用し「ＴＩＬ懸濁液」移送パックから４×１．０ｍＬ細胞カウントサンプルを取り出した。上記で準備したクライオバイアルにサンプルを入れた。
[00767] マイコプラズマサンプルを取り出した。３ｍＬシリンジを使用し、ＴＩＬ懸濁液移送パックから１．０ｍＬ取り出し、上記で調製した「マイコプラズマ希釈液」とラベル付けした１５ｍＬコニカルに入れた。テスト用に提出するまで、マイコプラズマサンプルを２〜８℃でラベル付けし保存した。
[00768] 播種用の移送パックを準備した。ＢＳＣで、リピーターポンプ流体移送セットの長径チューブ端を、ＴＩＬを含む移送パックのルアーアダプターに取り付けた。止血鉗子を使用して、移送パックの近くのラインを遮断した。移送セットの端に赤いキャップをした。
[00769] ＴＩＬをインキュベーターに入れた。ＢＳＣから細胞懸濁液を取り除き、必要になるまでインキュベーターに入れた。時間を記録した。
[00770] セルカウントを実行した。ＮＣ−２００使用して、細胞カウント及び計算を実行した。０．５ｍＬの細胞懸濁液を上記で調製した４．５ｍＬのAIM-V培地に加えて、最初に細胞カウントサンプルを希釈した。これにより、１：１０希釈になった。
[00771] 継代培養用のフラスコを計算した。播種に必要なフラスコの総数を計算した。注記：G-Rex500MCSフラスコの数を四捨五入して、近い整数に表示した。
Figure 2020522516
[00772] 播種のためのG-Rex500MCSフラスコの最大数は５であった。播種するフラスコの計算数が５個を超えた場合は、利用可能な全量の細胞懸濁液を使用して、５個だけを播種した。
[00773] 必要とする追加の培地バッグの数を決定した。上記で準備したバッグに加えて必要とする培地バッグの数を計算した。必要な培地バッグの数を次の整数に切り上げた。
Figure 2020522516
[00774] 必要に応じて追加の培地を調製した。ステップ８．１０．５９Ｄで計算したG-Rex-500Mフラスコが２つ必要なたびに、「ＣＭ４ １６日目培地」の１０Ｌバッグを１つ準備した。ステップ８．１０．６２に進み、追加の培地を準備し温めながら、最初のGREX-500Mフラスコに播種した。
[00775] 必要に応じて追加の培地バッグを調製した。上記で決定した追加の培地バッグの計算された数を準備し、温めた。
[00776] G-Rex500MCSを満たした。ベンチトップでG-Rex500MCSを開き、容器の亀裂やチューブのねじれを検査した。全てのルアー接続と閉鎖がしっかりしていることを確認した。フラスコの外側の４５００ｍＬラインにマーカーでマークを付けた。大きなフィルターラインを除いて、G-Rex500MCSの全てのクランプを閉じた。G-Rex500MCSの赤い培地ラインを、上記で準備した培地バッグの流体移送セットに滅菌溶接した。
[00777] 培地を汲み上げる準備。IVポールに「ＣＭ４ １６日目培地」を掛けた。ポンプチュービングをBaxaポンプに通した。
[00778] G-Rex500MCSに培地を注入した。Baxaポンプを「高」及び「９」に設定し、４５００ｍＬの培地をフラスコに注入する。４．５Ｌの「ＣＭ４ １６日目培地」をG-Rex500MCSに注入し、上記のようにフラスコにマークされた線まで満たした。４．５Ｌの培地が移されたらすぐに、ポンプを停止した。
[00779] ヒートシールした。G-Rex500MCSの赤い培地ラインを、作成された溶接部の近くでヒートシールし、培地バッグを取り外した。
[00780] 充填の繰り返し。培地が温められ、使用の準備ができたら、上記で計算された各フラスコについて、充填とシーリングの手順を繰り返す。重力充填又は複数のポンプを使用して、複数のフラスコに同時に充填し得る。培地１バッグにつき２つのフラスコのみを充填する。
[00781] 満たされたフラスコを記録しラベル付けした。各フラスコにアルファベット順に「１６日目」のラベル付けした。
[00782] 必要に応じてフラスコをインキュベートした。ＴＩＬを播種するのを待つ間、フラスコをインキュベーターで保存した。充填されたフラスコの総数を記録した。
[00783] 追加する細胞懸濁液の容積を計算した。新しいG-Rex500MCSフラスコに追加するＴＩＬ懸濁液の目標容積を計算した。
Figure 2020522516
[00784] フラスコの数が５個を超える場合は、５個だけが播種され、細胞懸濁液の全量が使用される。
[00785] 播種のためにフラスコを準備した。インキュベーターからステップ８．１０．７０よりG-Rex500MCSを取り出した。
[00786] ポンピングの準備。大きなフィルターライン以外のG-Rex500MCSの全てのクランプを閉じた。ポンプチュービングをBaxaポンプに通した。
[00787] インキュベーターからＴＩＬを取り出した。インキュベーターから「ＴＩＬ懸濁液」移送パックを取り出し、インキュベーション終了時間を記録した。
[00788] 播種のために細胞懸濁液を調製した。「ＴＩＬ懸濁液」移送パックを上からポンプインレットラインまで滅菌溶接した。
[00789] スケール上にＴＩＬ懸濁液バッグを置いた。「低」及び「２」に設定されたBaxaポンプを使用して、ＴＩＬ懸濁液バッグから溶接までのラインをプライミングした。スケールを風袋引きした。
[00790] ＴＩＬ懸濁液をフラスコに播種した。Baxaポンプを「中」及び「５」と設定する。上記で計算したＴＩＬ懸濁液の容積をフラスコに注入する。各フラスコに加えたＴＩＬ懸濁液の容積を記録する。
[00791] ヒートシールした。次のフラスコを溶接するのに十分なチューブを残し、「ＴＩＬ懸濁液」移送パックをヒートシールした。
[00792] 残りのフラスコを充填した。播種した各フラスコの間で、「ＴＩＬ懸濁液」移送パックを混合したことを確認し、残りの全てのフラスコ（flak）に播種するために充填とシーリングのステップを繰り返した。
[00793] インキュベーターをモニターした。フラスコが２つのインキュベーターに分けて入れられた場合、両方をモニターすること。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセント：５．０±１．５％ ＣＯ２。各フラスコがインキュベーターに置かれた時間を記録した。
[00794] インキュベーションウィンドウを計算したインキュベーション２２日目にG-Rex500MCSを取り出す時間範囲を決定するために以下の計算を実行した。下限：時間＋１３２時間；上限：時間＋１５６時間。
２２日目 洗浄バッファーの調製
[00795] １０ＬのLabtainerバッグを準備した。ＢＳＣで、ルアー接続を介して４インチプラズマ移送セットを１０ＬのLabtainerバッグに取り付ける。「上清」、ロット番号、及び初期／日付として１０ＬLabtainerバッグラベルを調製した。ＢＳＣから取り出し移す前に、全てのクランプを閉じた。注記：回収するG-Rex500MCSフラスコ２本ごとに１つの１０ＬのLabtainerバッグを準備した。
[00796] 流体移送セットを溶接した。ＢＳＣの外側で、４Ｓ−４Ｍ６０の全てのクランプを閉じた。４Ｓ−４Ｍ６０のオスルアーの端の１つにセットされたリピーター流体移送セットを溶接した。
[00797] Plasmalyte-A及びヒトアルブミンを２５％ＢＳＣに移した。４Ｓ−４Ｍ６０及びリピーター流体移送セットの部品をＢＳＣに移した。
Figure 2020522516
Figure 2020522516
Figure 2020522516
[00798] Plasmalyteを３０００ｍＬバッグに注入した。Plasmalyte-Aの３袋を４Ｓ−４Ｍ６０コネクタセットにスパイクした。注記：取り外す前にアルコール綿棒（Ｗ３００９４８８）でポートカバーを拭いた。注記：スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持する。ポートの側面に穴を開けないようにすること。Origen ３０００ｍＬ収集バッグを、ルアー接続を介して、リピーターポンプ移送セットの長径端に接続した。３０００ｍＬのOrigenバッグの未使用ラインのクランプを閉じた。ＢＳＣに隣接しているBaxaポンプを実行した。ＢＳＣの外側に位置するBaxaポンプに移送セットチュービングを通した。ポンプを「高」及び「９」に設定した。Plasmalyte-Aから３０００ｍＬ Origenバッグまでの全てのクランプを開いた。Plasmalyte-Aから３０００ｍＬ Origenバッグまでの全てのクランプを開いた。全てのPlasmalyte-Aが移されたらすぐに、ポンプを停止した。必要に応じて、ポンプを逆転させてバッグの位置を操作することにより、３０００ｍＬ Origenバッグから空気を取り除いた。全てのクランプを閉じた。
[00799] ルアー接続を介してリピーターポンプ流体移送セットから３０００ｍＬバッグを取り外し、バッグへのラインに赤いキャップ（Ｗ３０１２８４５）を取り付けた。
[00800] ３０００ｍＬバッグにヒトアルブミン２５％を追加した。ベント付きミニスパイクを開いた。スパイクの無菌性を損なうことなく、青いキャップを確実に締めた。ベント付きのミニスパイクで、ヒトアルブミン２５％ボトルのセプタムをスパイクした。注記：スパイクの無菌性を損なわないようにすること。合計３回スパイクされたヒトアルブミン２５％ボトルで２回繰り返された。１つのベント付きミニスパイクから青いキャップを取り外し、６０ｍＬシリンジをヒト血清アルブミン２５％ボトルに取り付けた。２５％のヒト血清アルブミン６０ｍＬを調製する。２５％ヒト血清アルブミンを１本以上使用する必要があり得る。必要に応じて、ベント付きミニスパイクからシリンジを外し、ヒト血清アルブミン２５％ボトルの次のベント付きミニスパイクに接続する。６０ｍＬが得られたらすぐに、ベント付きミニスパイクからシリンジを取り外す。Plasmalyte-Aで満たされた３０００ｍＬ Origenバッグのニードルレスインジェクションポートにシリンジを取り付ける。全ての２５％ヒトアルブミンを分注した。最終容積の２５％ヒトアルブミン１２０．０ｍＬを取得するために繰り返した。全ての２５％ヒトアルブミンを追加した後、バッグを静かに混合した。「LOVO洗浄バッファー」とラベル付けされ、２４時間の有効期限を割り当てた。
[00801] ＩＬ−２希釈液を調製した。１０ｍＬシリンジを使用し、LOVO洗浄緩衝液バッグのニードルレスインジェクションポートを使用して、５．０ｍＬのLOVO洗浄バッファーを除去した。LOVO洗浄バッファーを５０ｍＬコニカルチューブに分注し、「ＩＬ−２希釈液（ＩＬ−２ Diluent）」とラベル付けした。
[00802] ＣＲＦブランクバッグLOVO洗浄バッファーを分注。１００ｍＬシリンジを使用して、ニードレスインジェクションポートから７０．０ｍＬのLOVO洗浄バッファーを吸い上げた。注記：使用する前に、毎回アルコールパッドでニードレスインジェクションポートを拭いた。シリンジに赤いキャップをし、「ブランククライオバッグ（blank cryo bag）」及びロット番号とラベル付けした。注記：ステップ８．１４．３で必要になるまで、シリンジを室温で保持した。
[00803] 洗浄バッファーの準備完了。LOVO洗浄バッファーバッグの全てのクランプを閉じた。
[00804] ＩＬ−２の解凍。全ての氷が溶けるまで、１つの１．１ｍＬのＩＬ−２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）を解凍した。ＩＬ−２のロット番号と有効期限を記録した。注記：ＩＬ−２ラベルが添付されていることを確認した。
[00805] ＩＬ−２調製。「ＩＬ−２希釈液」とラベル付けされた５０ｍＬコニカルチューブに５０μＬ ＩＬ−２ストック（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）を追加した。
[00806] ＩＬ−２調製。「ＩＬ−２ ６×１０４」、日付、ロット番号、及び２４時間の有効期限としてコニカルのラベルを変更した。２〜８℃で蓋をして保管する。
[00807] 凍結保存の準備。最終産物の凍結保存のために、２〜８℃で５個の凍結カセットを置き、事前調製した。
[00808] 細胞カウント希釈を準備した。ＢＳＣで、ロット番号及び「細胞カウント希釈用」とラベル付けされた４．５ｍＬのAIM-V培地を４本の１５ｍＬコニカルチューブに追加し、チューブにラベル付けした。
[00809] 細胞カウントの準備。バイアル番号（１〜４）と４つのクライオバイアルにラベル付けした。
２２日目 ＴＩＬ回収
[00810] インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ温度ＬＥＤディスプレイ：３７±２．０℃、ＣＯ２パーセンテージ：５％±１．５％。
[00811] インキュベーターからG-Rex500MCSを取り出した。G-Rex500MCSをインキュベーターから取り外す前に、フラスコをチェックし、インキュベーションパラメータが満たされていることを確認した（インキュベーション時間）。
[00812] ３０００ｍＬ収集バッグに「ＴＩＬ懸濁液」、ロット番号、及び初期／日付のラベル付けされたＴＩＬ収集バッグを準備した。
[00813] 余分な接続を封鎖した。各接続の端近くにある収集バッグの２つのルアー接続をヒートシールした。
[00814] GatheRexのセットアップ。G-Rex500MCSからの赤い培地除去ラインを上記で準備した１０ＬのLabtainerバッグに滅菌溶接した（プロセスノート５．１１に従う）。注記：複数のGatheRexデバイスの使用についてはプロセスノート５．１６を参照。G-Rex500MCSからのクリア細胞除去ラインを、上記で準備したＴＩＬ懸濁液収集バッグに滅菌溶接した（プロセスノート５．１１に従う）。G-Rex500MCSフラスコをGatheRexの左側に配置した。上清Labtainerバッグ及びその右側にプールされたＴＩＬ懸濁液収集バッグを配置した。G-Rex500MCSからの赤い培地除去ラインをGatheRexのクランプ上部（赤い線でマーク）及びチューブガイドに取り付けた。G-Rex500MCSからのクリアハーベストラインをクランプ底部（青い線でマーク）及びGatheRexのチューブガイドに取り付けた。GatheRexからのガスラインとG-Rex500MCSの滅菌フィルターを接続した。G-Rex500MCSから上清を除去する前に、細胞除去ラインの全てのクランプが閉じていることを確認した。
[00815] 容積削減。G-Rex500MCSから約４．５Ｌの上清を上清バッグに移した。フラスコが水平であり、吸引ディップチューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex500MCSを目視で検査した。必要に応じて手順を繰り返す。
[00816] ＴＩＬ回収用にフラスコを準備した。上清を取り除いた後、赤いラインへのクランプを全て閉じた。
[00817] ＴＩＬの収集を開始した。ＴＩＬ回収開始時間を記録した。フラスコを激しく叩き細胞を遊離させるために培地を攪拌した。全ての細胞が離れたことを確認するためにフラスコの検査を実施した。「ＴＩＬ懸濁液」３０００ｍＬ収集バッグを平らな表面の乾いたワイプの上に置いた。フラスコを傾けて、ホースがフラスコの端にくるようにした。注記：細胞収集ホースが壁面及び底膜の接合部にない場合、ホースを適切に配置するには、通常、４５°の角度でフラスコを傾けたまま軽く叩くだけで十分であった。
[00818] ＴＩＬの回収。ＴＩＬ懸濁液収集バッグにつながる全てのクランプを解放した。GatheRexを使用して、ＴＩＬ懸濁液を３０００ｍＬ収集バッグに移した。注記：全ての細胞と培地が収集されるまで、エッジを傾斜し続けた。付着した細胞について膜を検査した。
[00819] フラスコ膜をすすいだ。G-Rex500MCSの底をすすいだ。ガス交換膜の約１／４をリンス培地で覆った。
[00820] G-Rex500MCSのクランプを閉じた。全てのクランプが閉じていることを確認する。
[00821] ヒートシールした。チューブ全体の長さがほぼ同じになるように、できる限り溶接部の近くでＴＩＬを含む収集バッグをヒートシールする。上清バッグをヒートシールした。
[00822] 残りのG-Rex 500 MCSフラスコの収穫が完了した。上記の手順を繰り返し、全てのＴＩＬを同じ収集バッグにプールする。２番目のフラスコごとに、必要に応じて１０Ｌの上清バッグを交換する必要があった。
[00823] LOVO Source Bagを準備した。新しい３０００ｍＬ収集バッグを入手した。「LOVO Source Bag」、ロット番号、及び初期／日付としてラベル付けされた。「LOVO Source Bag」のチューブをヒートシールし、メスルアーを取り外して、溶接に十分なラインを残した。
[00824] LOVO Source Bagと表示を付した。適切なサイズのプラスチック容器をスケールの上に置き風袋引きした。ポートとラインを含むLOVO Source Bagを容器に入れ、乾燥重量を記録する。
[00825] 細胞懸濁液をLOVO Source Bagに移した。１７０μｍの重量血液フィルターの全てのクランプを閉じた。
[00826] 細胞懸濁液をLOVO Source Bagに移した。重量血液フィルターの長い終末端をLOVO Source Bagに滅菌溶接した。「プールされたＴＩＬ懸濁液」収集バッグに滅菌溶フィルターの２つの供給源ラインのうちの一つを溶接した。溶接が完了したらすぐに、取り去るためにフィルターの未使用ラインをヒートシールした。必要なクランプを全て開き、IVポールに収集バッグをぶら下げてＴＩＬ懸濁液を引き上げ、血液フィルターを介してLOVO Source BagにＴＩＬの重力フロー移行を開始する。排出中、ＴＩＬを均一な懸濁液に保つために、ＴＩＬ懸濁液バッグを優しく回転又はこねた。
[00827] 全てのクランプを閉じた。全てのＴＩＬがLOVO source bagに移されたら、全てのクランプを閉じた。
[00828] ヒートシールした。重力血液フィルターを取り除くために、できる限り溶接の近くでヒートシールした（プロセスノート５．１２に従って）。
[00829] 細胞カウントサンプルを取り出した。ＢＳＣで、各サンプルに個別の３ｍＬシリンジを使用して、ニードルレスインジェクトンポートを使用しLOVO source bagから４×１．０ｍＬ細胞カウントサンプルを取り出した。ステップ８．１１．３６で準備したクライオバイアルにサンプルを入れた。
[00830] 細胞カウントを実行した。ＮＣ−２００使用して、細胞カウント及び計算を実行した。０．５ｍＬの細胞懸濁液を上記で調製した４．５ｍＬのAIM-V培地に加えて、最初に細胞カウントサンプルを希釈した。これにより、１：１０希釈になった。
[00831] 細胞カウント及びサンプル量を記録した。総生存ＴＩＬ細胞を計算した。総生細胞が１．５×１０９以上の場合は、続行した。総有核細胞の計算。
[00832] マイコプラズマ希釈剤を準備した。ＢＳＣでは、ルアーサンプルポートを介して１つの上清バッグから１０．０ｍＬを取り出し、１５ｍＬコニカルに入れた。１５ｍＬのコニカル「マイコプラズマ希釈液」にラベルを付ける。
LOVO
[00833] LOVOをオンにして、「ＴＩＬ G-Rex収集（ＴＩＬ G-Rex Harvest）」プロトコルを開始し、画面のプロンプトに従った。バッファータイプはPlasmaLyteであった。LOVOタッチスクリーンプロンプトに従った。
[00834] 最終産物の目標容積の決定。総有核細胞（ＴＮＣ）値（Total Nucleated Cell （ＴＮＣ） Value）及び以下の表を使用して、最終産物の目標容積（ｍＬ）を決定し記録した。
Figure 2020522516
[00835] LOVOタッチスクリーンプロンプトに従った。
[00836] 使い捨てキットをロードした。使い捨てキットをロードする前に、アルコールワイプ、その後糸くずの出ないワイプで圧力センサーポートを拭く。使い捨てキットをロードする。使い捨てキットのロードに関する画面の指示に従う。
[00837] ろ液バッグを取り外した。標準のLOVO使い捨てキットがロードされたら、次へ（Next）ボタンに触れた。容器情報（Container Information）及び場所情報画面（Location Screen）が表示された。スケールからろ液バッグを取り外した。
[00838] ろ液（Filtrate）容器は新しいこと、及び測定限界（Off Scale）の確認をした。
[00839] 入力されたろ液容量。入力した既存のろ液バッグのオスルアーにLOVO Ancillary Bagを滅菌溶接した。全てのクランプが開いており、流路が開いていることを確認した。ろ液容器容量（Filtrate Container Capacity）入力欄に触れる。テンキーが表示される。新規合計ろ液容量（５，０００ｍＬ）を入力する。ボタンに触れ、入力を受諾する。注記：推定ろ液量は５０００ｍＬを超えてはならない。
[00840] ベンチトップにろ液容器を置いた。注記：溶接中にチューブがＦクランプから外れた場合、チューブをクランプに戻した。ベンチトップに新規ろ液（Filtrate）容器を置いた。重量計＃３にろ液（Filtrate）バッグを掛けなかった。手順中に計量計＃３は空になる。
[00841] ろ液容器の変更後、LOVOタッチスクリーンのプロンプトに従った。
[00842] キットが正しくロードされたことを確認した。使い捨てキットドライチェック（Disposable Kit Dry Check）オーバーレイが表示された。キットが適切にロードされ、全てのクランプが開いていることを確認した。全てのチューブにねじれやその他の障害物がないか確認し、可能であれば直す。キットが正しく取り付けられていることを確認し、全てのロバートクランプを確認した。はい（Yes）ボタンを押した。全てのLOVO mechanical clampsが自動的に閉じ、使い捨てキットの取付確認画面（Checking Disposable Kit Installation Screen）が表示される。LOVOには、キットを確認するために一連の加圧手順が実施された。
[00843] キットチェック結果。キットチェックに合格した場合、次の手順に進んだ。＊いいえの場合、チェック完了後に２回目のキットチェックを実行し得る。＊いいえの場合、全てのチューブのねじれやその他の障害物をチェックして直した。＊いいえの場合、キットが適切に取り付けられていることを確認し、全てのロバートクランプを確認した。２回目のキットチェックに失敗した場合：エリア管理に連絡し、セクション１０．０の新しいキットのインストールの準備をする。必要なステップ８．１３．２３〜ステップ８．１３．３０を繰り返す。
[00844] PlasmaLyteの接続解決画面（Connect Solutions screen）が表示された。洗浄値は常に３０００ｍＬであるはずである。画面にこの値を入力した。
[00845] PlasmaLyteの３０００ｍＬバッグを、クランプ１を通過するチューブに滅菌溶接した。IVポールにPlasmaLyteのバッグをぶら下げ、バッグの両角のループをフックに取り付けた。
[00846] PlasmaLyteが接続されていることを確認した。全てのプラスチック製クランプを開けた。溶液量（Solution Volume）の入力が３０００ｍＬであったことを確認した。次へ（Next）ボタンに触れた。使い捨てキット準備（Disposable Kit Prime）オーバーレイが表示された。PlasmaLyteが取り付けられ、PlasmaLyteバッグにつながるチューブの全ての溶接部及びプラスチック製のクランプが開いていることを確認し、その後はい（Yes）ボタンに触れた。
[00847] PlasmaLyteが動いていることが観察された。使い捨てキット準備が開始され、使い捨てキット準備中画面（Priming Disposable Kit Screen）が表示される。PlasmaLyteバッグに接続されたチューブを介して、PlasmaLyteが移動することを視覚的に観察した。流体が動いていない場合は、画面上の一時停止ボタンを押して、クランプ又は溶接がまだ閉じているか否かを確認した。問題が解決したら、画面の再開（Resume）ボタンを押し、使い捨てキット準備を再開した。LOVOタッチスクリーンプロンプトに従った。
[00848] チューブにソース容器（Source container）を接続した。ステップ８．１２．３１で準備したLOVO Source Bagを、プロセスノート５．１１に従ってクランプＳを通過するチューブに滅菌溶接する。クランプからチューブを取り外す必要がある場合があり得た。注記：取り外す場合、ソースチューブ（source tubing）をＳクランプに取り変えることを確認する。
[00849] ソース容器（Source container）をぶら下げた。ソース容器（Source container）をIVポールにぶら下げ、バッグの両角のループをフックに取り付けた。ソース（Source）を重量計＃１にぶら下げなかった。ソースバッグ（source bag）への全てのクランプを開いた。
[00850] ソース容器（Source container）が取り付けられていることを検証した。次へ（Next）ボタンに触れた。原料準備（Source Prime）オーバーレイが表示された。原料（Source）が使い捨てキットに取り付けられ、原料（Source）につながるチューブの全ての溶接部及びプラスチック製のクランプが開いていることを確認した。はい（Yes）ボタンに触れた。
[00851] Plasmalyteが動いていたことを確認する。原料（Source）準備が開始され、原料準備中画面（Priming Source Screen）が表示された。原料（Source）バッグに取り付けられたチューブを介して、PlasmaLyteが移動しているのを視覚的に観察した。流体が動いていない場合は、画面上の一時停止ボタンを押して、クランプ又は溶接部がまだ閉じているか否かを確認する。問題が解決したら、画面上の再開（Resume）ボタンを押し、原料（Source）準備を再開した。
[00852] 手順画面を開始した。原料（Source）の準備が正常に終了すると、手順開始画面（Start Procedure Screen）が表示される。スタートを押した。スタートを押すとすぐに「プレウォッシュサイクル１（Pre-Wash Cycle 1）」一時停止画面が表示された。
[00853] プロセスバッグ（Process Bag）内で反転した重量計＃２からプロセスバッグ（Process Bag）を取り外し（プロセストップポートチューブガイドからチューブを取り外すこともできる）、それを手動で反転させ、使い捨てキットの準備ステップ中に加えた洗浄バッファーがバッグの全内部表面に塗布されるようにした。重量計＃２のプロセスバッグ（Process Bag）を再びぶら下げた（バックのラベルは左側を向いていた）。チューブガイドのトップポートチューブが外れた場合は交換する。
[00854] ソースバッグ（Source bag）を反転した。スタートボタンを押す前に、バッグの角をマッサージし、細胞を静かに撹拌して均質な細胞懸濁液を作成することにより、IVポールからそれを取り外すことなくソースバッグ（Source bag）を混合した。再開（Resume）ボタンを押した。LOVOは原料（Source）バッグからの流動を開始し、洗浄サイクル１画面（Wash Cycle 1 Screen）が表示される。
[00855] 原料洗滌一時停止。ソース容器（source container）が空になり、LOVOがソースバッグ（Source bag）に洗浄バッファーを追加すると、Rinse Source Pause画面が表示された。ソースバッグ（Source bag）をIVポールから取り外すことなく、角をマッサージしてよく混ぜた。再開（Resume）を押した。
[00856] プロセスバッグポーズ（Process Bag Pause）内で混合した。スピナを通過させる別の細胞を準備するため、インプロセスバッグ（In Process Bag）を洗浄バッファーで希釈した。インプロセスバッグに洗浄バッファーを加えた後、LOVOを自動的に一時停止し、「Mix In Process Bag」一時停止画面が表示された。重量計からバッグを取り出さずに、バッグを優しく絞って産物をよく混ぜた。再開を押した。
[00857] インプロセスコーナーポーズ（In Process Corners Pause）をマッサージした。インプロセスバッグが空になったら、洗浄バッファーをインプロセスバッグの底部ポートに加え、バッグをすすいだ。洗滌液を追加した後、LOVOは自動的に一時停止し、「Massage IP corners（IPバッグの角を揉む）」一時停止画面（Pause Screen）が表示された。「Massage IP corners（IPバッグの角を揉む）」一時停止画面が表示されたら、重量計＃２からバッグを取り外さないこと。インプロセスバッグを重量計＃２に掛けたまま、バッグの角を揉み、残っている細胞を懸濁液にした。バッグが重量計の上で揺れていないことを確認し、再開ボタンを押した。
[00858] 製品除去画面（Remove Products Screen）を待った。LOVO手順の最後に、産物除去画面（Remove Products Screen）が表示された。この画面が表示されると、LOVOキットの全てのバッグが操作でき得た。注記：産物除去（Remove Products）が表示されるまで、バッグに触れないこと。
[00859] 保持液バッグを取り外した。未透過液バッグのポートに非常に近いチューブに止血剤を入れ、細胞懸濁液がチューブに落ちないようにした。ステップ８．１３．４８で溶接するのに十分なラインを維持するように、止血剤の下にヒートシールした（プロセスノート５．１２に従う）。未透過液バッグを取り外した。
[00860] 製剤用の未透過液バッグを準備した。４インチプラズマ移送セットのメスルアーロックエンドを未透過液バッグに溶接した。未透過液バッグを移した。
[00861] 産物を取り出した。産物除去画面（Remove Products Screen）の指示に従った。液体の移動を防ぐため、LOVOキットの全てのクランプを閉じた。
[00862] 産物を取り出した。次へ（Next）ボタンに触れた。全てのLOVO臨床クランプが開放され、キット取外画面（Remove Kit Screen）が表示された。
[00863] データを記録した。キット除去画面（Remove Kit Screen）の指示に従った。次へ（Next）ボタンに触れた。全てのLOVO臨床クランプが閉鎖され、結果概要画面（Results Summary Screen）が表示される。結果概要画面のデータを記録した。全てのポンプを閉じ、支持剤をろ過した。LOVOから要求されたときにキットを取り外した。記録された時間は全て、LOVOから直接記録された。
最終製剤及び充填
[00864] 目標容積／バッグ計算。下の表３１から、充填するＣＳ７５０バッグの数、バッグごとの目標充填量、バッグごとに参考品として取り除く量、及び上記のLOVO保持液の量に対応するバッグごとの最終目標量を選択した。
Figure 2020522516
[00865] ＣＲＦブランクの準備。空のバッグを作成するためＣＳ−１０及びLOVO洗浄バッファーの量を計算した。
Figure 2020522516
[00866] ＣＲＦブランクの準備。ＢＳＣの外側で、上記で準備したLOVO洗浄バッファーのシリンジを使用して、計算された容積を、ルアー接続を介して空のＣＳ７５０バッグに追加した。注記：ブランクＣＳ７５０バッグ製剤は、無菌で行う必要はない。適切なサイズのシリンジを使用して、計算したＣＳ−１０の容積を上記で準備した同じＣＳ７５０バッグに追加した。ＣＳ７５０バッグに赤いキャップを付けた。ＣＳー７５０バッグから可能な限り多くの空気を取り除いた。ＣＳ７５０バッグをできる限りバッグに近づけてヒートシールし、チューブを取り外した。ＣＳ７５０バッグに「ＣＲＦブランク（CRF Blank）」、ロット番号、及び初期／日付のラベルを付ける。ＣＲＦに置くまで、ＣＲＦブランクをコールドパックの上に置いた。
[00867] ＩＬ−２の必要量を計算した。最終産物に追加するＩＬ−２の量を計算した。
Figure 2020522516
[00868] 接続装置を組み立てた。４Ｓ−４Ｍ６０をＣＣ２セルコネクトに滅菌溶接し、セルコネクト装置の単一スパイクを４Ｓ−４Ｍ６０マニホールドの４スパイク端に置き換えた。
[00869] 接続された装置を組み立てた。ＣＳ７５０クライオバッグを上記で準備したハーネスに滅菌溶接し、４つのオスルアーエンド（Ｅ）の１つを各バッグに交換した。４Ｓ−４Ｍ６０のスパイクにＣＳ−１０バッグを溶接した（プロセスノート５．１１に従う）。２〜８°Ｃに調製された２つのコールドパックの間にバッグを置くことによりＣＳ−１０を低温に保った。
[00870] ＩＬ−２を保持するＴＩＬを準備した。適切なサイズのシリンジを使用して、「ＩＬ−２ ６×１０４」アリコートから上記で決定した量のＩＬ−２を取り除いた。ルアー接続を介して上記で準備した未透過液バッグにシリンジを接続し、ＩＬ−２を注入する。シリンジからラインを通して空気を押してラインをクリアする。
[00871] 製剤化されたＴＩＬバッグをラベル付けした。移送セットのクランプを閉じ、「製剤化ＴＩＬ（Formulated ＴＩＬ）」としてバッグにラベルを付け、バッグをＢＳＣから取り出した。
[00872] 製剤化されたＴＩＬバッグを装置に追加した。ＩＬ−２を追加したらすぐに、「製剤化ＴＩＬ」バッグを装置の残りのスパイクに溶接した。
[00873] ＣＳ−１０を追加した。組み立てられた装置を、付属の製剤化ＴＩＬ、ＣＳ−７５０バッグ、及びＣＳ−１０とともにＢＳＣに移した。注記：ＣＳ−１０バッグ及び全てのＣＳ−７５０バッグは、２〜８℃で事前調製された２つのコールドパックの間に置かれた。製剤化ＴＩＬバッグをコールドパック上に置かなかった。装置の全てのクランプが閉じていることを確認した。活栓を回し、シリンジを閉じた。
[00874] シリンジの交換。約１０ｍＬの空気を１００ｍＬシリンジに引き込み、装置の６０ｍＬシリンジと交換した。
[00875] ＣＳ−１０を追加した。ＣＳ７５０バッグへのラインが閉じるように活栓を回した。ＣＳ−１０バッグのクランプを開き、上記で計算した容積をシリンジに引いた。注記：適切な容積のＣＳ−１０を追加するには、複数のシリンジが使用される。ＣＳ−１０のクランプを閉じ、製剤化ＴＩＬバッグのクランプを開いて、ＣＳ−１０を追加する。およそ１０．０ｍＬ／分で最初の１０．０ｍＬのＣＳ１０を追加する。残りのＣＳ−１０をおよそ１．０ｍＬ／秒の速度で追加する。注記：複数のシリンジを使用して、ＣＳ−１０の適切な量を追加した。時間を記録した。注記：ＣＳ−１０の最初の追加から凍結の開始までの目標時間は３０分である。各ＣＳ１０追加の容積と追加された合計容積を記録した。ＣＳ１０バッグの全てのクランプを閉じた。
[00876] ＣＳ−７５０バッグを準備した。活栓を回し、シリンジを開けた。製剤化ＴＩＬバッグのクランプを開き、懸濁液が活栓に達する直前に懸濁液を引いた。製剤化ＴＩＬバッグのクランプを閉じた。空のＣＳ７５０最終産物バッグが開くように活栓を回した。新しいシリンジを使用して、空気を抜いてＣＳ７５０最終産物バッグから可能な限り多くの空気を取り除いた。シリンジのプランジャーに圧力をかけながら、バッグを締めて閉じた。約２０ｍＬの空気を新しい１００ｍＬシリンジに引き込み、装置に接続する。注記：製剤化ＴＩＬ懸濁液を低温に保つために、各ＣＳ−７５０最終産物バッグは２つのコールドパックの間にある必要がある。
[00877] 細胞を分注した。最終産物バッグへのラインが閉じられるように活栓を回した。上記で計算された量を、製剤化ＴＩＬバッグからシリンジに引き込んだ。注記：複数のシリンジを使用して、正しい量を得た。製剤化されたＴＩＬバッグへのラインが閉じられるように活栓を回した。一度に１つの最終産物バッグで作業し、細胞を最終産物バッグに分注した。上記の各ＣＳ７５０バッグに追加された細胞の量を記録した。細胞がスパイクポートの上部に均一であるようにシリンジから空気でラインをクリアした。満たされたバッグのクランプを閉じた。最終産物バッグごとに手順を繰り返し、それぞれの間に製剤化ＴＩＬバッグを静かに混合した。以下の各最終産物バッグに入れられたＴＩＬの量を記録した。
[00878] 最終産物バッグから空気を取り除き、参考品を保持した。最後の最終産物バッグが満たされたすぐ後で、全てのクランプを閉じた。１０ｍＬの空気を新しい１００ｍＬシリンジに引き込み、装置のシリンジと交換する。一度に１つのバッグを操作し、各産物バッグから全ての空気と、上記で決定した参考用の製品の容積を引き出した。注記：サンプル量を取り除いたら、シリンジを逆さにした空気を利用して、産物バッグの上部ポートのラインをクリアにした。保持容積と空気が除去された後すぐに、ラインをバッグにクランプした。
[00879] 各バッグからの参考品の容積を記録した。
[00880] 分配された参考品。５０ｍＬのコニカルチューブに参考品を分配し、チューブに「参考品（retain）」及びロット番号を表示した。バッグ毎に繰り返す。
[00881] 凍結保存用の最終産物を準備した。止血剤を使用して、バッグの近くでラインをクランプした。シリンジ及びシリンジが装着されていた装置の赤いキャップのルアー接続を取り除いた。ＢＳＣから装置を移した。Ｆでヒートシール（プロセスノート５．１２に従って）し、空の未透過液バッグ及びＣＳ−１０バッグを取り外した。注記：装置上のシリンジのルアー接続を保持した。空の未透過液及びＣＳ−１０バッグを廃棄した。
[00882] 最終産物バッグをレベル付けした。以下の最終産物ラベルのサンプルを添付した。
[00883] 凍結保存用の最終産物を準備した。凍結保存するまで、コールドパック又は２〜８℃でクライオバッグを保持した。
[00884] 細胞カウントサンプルを取り出した。適切なサイズのピペットを使用して、上記で取り出された参考品２．０ｍＬを取り出し、１５ｍＬコニカルチューブに入れて細胞数を測定した。
[00885] セルカウントを実行した。ＮＣ−２００使用して、細胞カウント及び計算を実行した。注記：１つのサンプルのみを適切な希釈に希釈して、希釈が十分であることを確認する。追加のサンプルを適切な希釈係数に希釈し、カウントを続行する。細胞カウントサンプル容積を記録した。注記：希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０。生細胞濃度の平均と実行された細胞カウントの生存率を決定した。
[00886] フローサイトメトリーのサンプルを計算した。フローサイトメトリーのサンプリングに十分な細胞濃度を確保するために計算を実行した。
Figure 2020522516
[00887] ＩＦＮ−γを計算した。ＩＦＮ−γサンプリングに十分な細胞濃度を確保するためにサンプルの計算を実行した。
[00888] ヒートシールした。サンプル量が決定されたら、最終産物バッグを可能な限りバッグの近くにヒートシールして、装置から取り出す。
Figure 2020522516
[00889] マイコプラズマサンプルについては、上から「マイコプラズマ希釈液」とラベル付けされた１５ｍＬのコニカルに、製剤化細胞懸濁液量を追加する。無菌及びBacTサンプリングのテストＢＳＣで、適切なサイズのシリンジを使用して上記で参考品として収集した細胞懸濁液から１．０ｍＬのサンプルを取り出し、嫌気性ボトルに播種する。好気性ボトルについて上記を繰り返す。
[00890] サンプルのラベルを付け及び保存した。サンプルプラン在庫ラベル（sample plan inventory labels）と全てのサンプルにラベルを付け、移すまで適切に保管する。最終産物及びサンプルの凍結保存の次のステップに進んだ。
最終産物の凍結保存
[00891] 制御速度冷凍庫（Controlled Rate Freezer）を準備した。凍結する前にＣＲＦがセットアップされたことを確認した。ＣＲＦ機器を記録した。凍結保存が実行される。
[00892] ＣＲＦプローブをセットアップする。ＣＲＦブランクバッグのセプタムに穴を開けた。６ｍＬバイアル温度プローブを挿入した。
[00893] 最終産物とサンプルをＣＲＦに入れた。ブランクバッグを事前調製済みカセットに入れ、ＣＲＦラックのおよそ中央に移した。最終産物カセットをＣＲＦラックに移し、バイアルをＣＲＦバイアルラックに移した。製品ラック及びバイアルラックをＣＲＦに移した。産物がＣＲＦに移された時間及びチャンバ温度を記録した。
[00894] ４℃±１．５℃に達し、ＣＲＦの実行を続行するのに必要な時間を決定した。チャンバの温度が４℃±１．５℃に達したら、分析を開始した。時間を記録した。
[00895] 完了し、保存した。実施完了後にＣＲＦを停止した。ＣＲＦからカセット及びバイアルを取り出す。カセット及びバイアルを保管のために気相ＬＮ２に移した。
実施例１２：転移性黒色腫患者に投与された新規凍結保存腫瘍浸潤リンパ球（ＬＮ−１４４）は、多施設第２相臨床試験で有効性と忍容性を実証した
背景
[00896] 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を利用した養子細胞療法（ＡＣＴ）の安全性及び有効性は、何百人もの転移性黒色腫患者で研究され、有意且つ永続的な客観的応答率（ＯＲＲ）を実証している。１進行中のフェーズ２試用では、ＴＩＬの集中ＧＭＰ製造を利用するＣ−１４４−０１が、非凍結保存ジェネレーション１（Ｇｅｎ １）及び凍結保存ジェネレーション２（Ｇｅｎ ２）ＴＩＬ製造プロセスの両方を評価した。
[00897] Ｇｅｎ １は、製造期間が約５〜６週間（Ｃ−１４４−０１研究のコホート１で投与）であるのに対し、Ｇｅｎ ２は、製造期間が２２日間である（プロセス２Ａ、Ｃ−１４４−０１研究のコホート２で投与）。Ｇｅｎ １のＬＮ−１４４製造製品を注入したコホート１患者からの予備データは、ＴＩＬ療法が応答を生じたため、ポストＰＤ−１の転移性黒色腫患者の処置に有望であった２。Ｇｅｎ ２の利点は以下の通りである。（Ａ）患者にＴＩＬを注入するのを待つ患者及び医師の時間の短縮；（Ｂ）凍結保存により、スケジューリング、販売、及び配送の柔軟性が得られる；及び（Ｃ）製造コストの削減。コホート２からの予備データを以下に示す。図２５は、Ｇｅｎ ２凍結保存ＬＮ−１４４製造プロセス（プロセス２Ａ）の実施形態を示す。
研究設計：Ｃ−１４４−０１転移性黒色腫へのフェーズ２試用
[00898] 転移性黒色腫患者の処置のための自己腫瘍浸潤リンパ球（ＬＮ−１４４）の有効性及び安全性を評価するフェーズ２、多施設共同３コホート研究。
[00899] 主要選択基準：（１）測定可能な転移性黒色腫及びＴＩＬ生成のために切除可能な病変が≧１；（２）全身療法の少なくとも１つの前の段階までの進歩；（３）年齢≧１８歳；及び（４）ＥＣＯＧ ＰＳ０〜１。
[00900] 処置コホート：（１）非凍結保存ＬＮ−１４４産物；（２）凍結保存ＬＮ−１４４産物；（３）応答のない患者又は初期応答後に進行した患者に対するＬＮ−１４４による再処置。図２６に研究設計を示す。
[00901] エンドポイント：（１）初代：ＯＲＲとして定義された有効性、及び（２）二次：安全性及び有効性。
方法
[00902] コホート２安全性セット：ＴＩＬ生成の目的で切除を受け、試験処置のなんらかの成分を投与された１３人の患者。
[00903] コホート２の有効性セット：ＮＭＡ−ＬＤプレコンディショニング、ＬＮ−１４４注入、及び少なくとも１回のＩＬ−２投与を受け、少なくとも１回の有効性評価を受けた９人の患者。４人の患者は、データカットの時点で有効性評価を受けていなかった。
[00904] データカットの日付までに読み取られた全ての利用可能なデータのバイオマーカーデータが表示されていた。
結果
[00905] 図２７は、コホート１（ＡＳＣＯ２０１７）とコホート２の患者特性の比較を示す表を提供する。コホート２には以下のようなものがある：療法前の４つの中央値；全ての患者は、事前に抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４を受けていた；及び、標的病変の直径の合計（ＳＯＤ）が大きいことと、ベースラインでの平均ＬＤＨが高いことにより、腫瘍量が増加した。図２８は、処置による有害事象（≧３０％）を示す表である。
[00906] コホート２（凍結保存ＬＮ−１４４）の場合、注入産物及びＴＩＬ療法の特性は、（１）注入されたＴＩＬ細胞の平均数：３７×１０９、及び（２）ＩＬ−２投与回数の中央値は４．５であった。図２９は、患者＃１〜＃８に対する注入産物及びＴＩＬ療法の有効性を示す。
[00907] 図３０は、症状が安定した疾病（ＳＤ）又はより良い応答を示す評価可能な患者の応答の臨床状態を示す。患者６の部分奏効（ＰＲ）は、患者がまだ第２の有効性評価に達していないため確認しなかった。１人の患者（患者９）は、第１の評価の前に死亡した（まだ有効性セットで考慮されている）。
[00908] 有効性セットの９人の患者のうち、１人の患者（患者９）は、図３０に示さない最初の腫瘍評価の前に黒色腫関連で死亡したため評価できなかった（ＮＥ）。応答は、Ｇｅｎ ２で処置された患者で見られた。疾病制御率（ＤＣＲ）は７８％であった。応答までの時間はコホート１に類似していた。最良の反応として進行性疾患（ＰＤ）を有する１人の患者（患者３）は、スイムレーンプロットに含まれていなかった。
[00909] 図３１は、直径の合計の変化率を示す。患者９は、４２日目の前の黒色腫に関連する死亡によりポストＬＮ−１４４の疾患評価がなかった。−１４日目：スクリーニングからベースラインへの直径の合計の％変化（−１４日目）。−１４日目から１２６日目：ベースラインからのＳＯＤの％変化。−１４日目＝ベースライン。０日目＝ＬＮ−１４４注入。
[00910] ＴＩＬ処置を行うと、ＨＭＧＢ１の増加が観察された（図３２）。HMGB1 ELISA kit（Tecan US, Inc）を使用して、血漿ＨＭＧＢ１レベルを測定した。示されているデータは、コホート１及びコホート２の患者におけるＬＮ−１４４注入前（７日目）及び後（４日目及び１４日目）のＨＭＧＢ１レベルの倍数変化を表す（ｐ値は、対数変換データに基づいた両側対応ｔ検定を使用して計算された）。サンプルサイズ（太字及び斜体）及び平均値（斜体）は、各時点の括弧内に示されている。ＨＭＧＢ１は、活性化された免疫細胞から分泌され、損傷した腫瘍細胞から遊離する。したがって、ＬＮ−１４４での処置後に観察されたＨＭＧＢ１レベルの増加は、抗腫瘍活性の免疫媒介メカニズムを示唆している。
[00911] Luminexアッセイを使用して、血漿ＩＰ−１０レベルを測定した。図３３に示されているデータは、コホート１及びコホート２の患者におけるＬＮ−１４４注入前（−７日目）及び後（４日目及び１４日目）のＩＰ−１０レベルの倍数変化を表す（ｐ値は、対数変換データに基づいた両側対応ｔ検定を使用して計算された）。サンプルサイズ（太字及び斜体）及び平均値（斜体）は、各時点の括弧内に示されている。ＩＰ−１０でのＬＮ−１４４注入後の増加は、ＴＩＬ持続性との可能な相関を理解するために監視されている。
[00912] コホート２（ｎ＝１７患者）からの更新データは、図３４から図３９に報告されている。コホート１と、６４％のＤＣＲ及び２９％（Ｎ＝１４）の全体的な応答率（ＯＲＲ）を示したＧｅｎ １プロセスの実施形態に対し、コホート２及びＧｅｎ ２プロセスの実施形態は、ＤＣＲ８０％及びＯＲＲ４０％（Ｎ＝１０）を示した。
結論
[00913] 既存データからの予備的結果は、Ｇｅｎ １及びＧｅｎ ２のＬＮ−１４４のＴＩＬ産物間で同等の安全性を示す。Ｇｅｎ ２プロセス（本明細書に記載する、プロセス２Ａ）で製造されたＴＩＬを投与すると、進行転移性黒色腫患者で見られる臨床反応が驚くほど増加し、療法前の抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４について全てが進行した。コホート２のＤＣＲは７８％であった。
[00914] 予備的なバイオマーカーデータは、ＴＩＬ療法に提案されている細胞溶解作用のメカニズムを裏付けるものである。
[00915] 本明細書に記載されているＧｅｎ ２製造プロセスの実施形態には２２日を要す。このプロセスは、患者がＴＩＬを受けるまでに待機する時間を大幅に短縮し、患者に投与するタイミングの柔軟性を提供し、製造コストの削減につながる一方で、商業化及び健康規制機関への登録を可能にする従来のアプローチに勝る他の利点を提供している。Ｇｅｎ ２製造プロセスの実施形態を使用した転移性黒色腫の予備的な臨床データは、Ｇｅｎ １プロセスを使用して製造されたＴＩＬに比較して、同様の応答時間及び安全性プロファイルと共に、ＤＣＲ、ＯＲＲ、及び他の臨床反応によって測定されるＴＩＬの臨床効果の驚くべき改善を示す 。
参照資料
[00917] 1Goff, et al.Randomized, Prospective Evaluation Comparing Intensity of Lymphodepletion Before Adoptive Transfer of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Melanoma.J Clin Oncol.2016 Jul 10;34(20):2389-97。
[00918] 2Sarnaik A, Kluger H, Chesney J, et al.Efficacy of single administration of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) in heavily pretreated patients with metastatic melanoma following checkpoint therapy.J Clin Oncol.2017; 35 [suppl; abstr 3045]。
実施例１３：歴史的対照研究
[00919] 歴史的対照研究は、二重抵抗性転移性黒色腫の患者の治療結果と、本明細書に開示されるＴＩＬ療法の結果、例えば実施例２及び実施例３に記載されている療法との比較に使用でき得る。一実施形態において、本明細書に開示されるＴＩＬ療法で処置される患者は、過去の対照から予想される応答に対する改善された応答を示す。一実施形態において、本明細書に開示されるＴＩＬ療法で処置される患者は、過去の対照から期待される応答に対する改善された応答を示し、改善された応答は全体的な応答率として決定される。一実施形態において、本明細書に開示されるＴＩＬ療法で処置される患者は、過去の対照から期待される応答に対して改善された応答を示し、改善された応答は全体的な応答率として決定され、全体的な応答率の改善は少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、又は少なくとも５０％である。一実施形態において、本明細書に開示されるＴＩＬ療法で処置される患者は、過去の対照から期待される応答に対する改善された応答を示し、改善された応答は応答の持続時間として決定される。一実施形態において、本明細書に開示されるＴＩＬ療法で処置される患者は、過去の対照から期待される応答に対して改善された応答を示し、改善された応答は全体的な応答率として決定され、全体的な応答率の改善は少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、又は少なくとも５０％である。
[00920] 転移性黒色腫患者の治療記録から得られたデータを使用して、他の治療に対する二重抵抗性患者の応答を決定するための歴史的対照研究を実施することができ得る。黒色腫の最初の診断後、患者は黒色腫の３つ又はそれ以上の治療ラインを受けなくてはならない。全身療法のラインは、次のルールに従うことを重要視され、各療法の開始日と終了日が考慮される。
最初のライン（１Ｌ）開始から２８日以内に受けた全ての薬剤は１Ｌレジメンを構成し、単一の薬剤を含めることも、複数の薬剤を組み合わせることもできる。１Ｌ終了は、１Ｌ薬剤の９０日を超える最初のギャップ、又は１Ｌの一部ではなかった新しい薬剤の開始（つまり、新しいラインへの切り替え）どちらにも対応した。
その後の治療ラインは、（ａ）前の治療レジメンにはない薬剤の開始（１Ｌレジメンを識別するための最初の２８日間後）、又は（ｂ）以前の治療で９０日以上のギャップ後、あらゆる薬剤の開始の最も早いものとして特定される。後続のラインで使用されるレジメンは、各治療ラインの開始から２８日以内に受けた全ての薬剤に基づいて特定された。
一般的に、併用療法として投与されるイピリミマブとニボルマブは１つの治療法と見なされ、ＢＲＡＦとＭＥＫ阻害剤の併用療法（例えば、ダブラフェニブとトラメチニブ）は１つの療法と見なされる。
全ての患者は、少なくとも１つの抗ＰＤ−１（又は抗ＰＤ−Ｌ１）療法で処置され、失敗した（つまり、抵抗性又は再発）はずである。治療ラインに抗ＰＤ−１療法が含まれている場合、疾患の進行につながったスキャン日の入手可能性が好ましい。記録されている最後の治療（３回目又はそれ以降）では、訪問ごとの全体的な応答及び、疾患の進行日又は死亡日（該当する場合）のいずれか一つが必要である。
記録されている治療の最後のラインでは、ｉ）各評価の標的病変及び非標的病変の測定、又はｉｉ）ＲＥＣＩＳＴによる訪問ごとの全体的な応答のいずれか一つが必要である。
記録中の最後の治療開始前に特定の疾患状態のベースライン及び特性のベースラインが必要であり、ここに記載されている他の研究の同様の資格基準にこれらの患者が満たしているかどうかの評価を可能にさせる（実施例２及び実施例３を含む）。

Claims (51)

  1. 二重抵抗性転移性黒色腫の処置が必要な患者の二重抵抗性転移性黒色腫を処置する方法であって、前記患者に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療有効集団を投与することを含む、方法。
  2. 前記二重抵抗性転移性黒色腫が、皮膚の二重抵抗性転移性黒色腫である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記二重抵抗性転移性黒色腫が、ネオアジュバント療法又はアジュバント療法を含まない、少なくとも２つの以前の全身処置過程に対して抵抗性である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記二重抵抗性転移性黒色腫が、アルデスロイキン又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記二重抵抗性転移性黒色腫が、ペンブロリズマブ又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記二重抵抗性転移性黒色腫が、ニボルマブ又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記二重抵抗性転移性黒色腫が、イピリムマブ又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記二重抵抗性転移性黒色腫が、イピリムマブ又はそのバイオシミラー及びペンブロリズマブ又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記二重抵抗性転移性黒色腫が、イピリムマブ又はそのバイオシミラー及びニボルマブ又はそのバイオシミラーに対して抵抗性である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記二重抵抗性転移性黒色腫が、ＢＲＡＦ阻害剤に対して抵抗性である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記二重抵抗性転移性黒色腫が、ＰＤ−Ｌ１阻害剤に対して抵抗性である、請求項１に記載の方法。
  12. 前記ＰＤ−Ｌ１阻害剤が、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、及びそれらのバイオシミラーからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記二重抵抗性転移性黒色腫が、ＰＤ−１阻害剤とＣＴＬＡ−４阻害剤の組み合わせに対して抵抗性である、請求項１に記載の方法。
  14. 前記ＰＤ−１阻害剤が、ニボルマブ又はそのバイオシミラーであり、前記ＣＴＬＡ−４阻害剤が、イピルムマブ、トレメリムマブ、及びそれらのバイオシミラーからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記二重抵抗性転移性黒色腫が、ＢＲＡＦ阻害剤とＭＥＫ阻害剤の組み合わせに対して抵抗性である、請求項１に記載の方法。
  16. 前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ダブラフェニブ又はその薬学的に許容される塩であり、前記ＭＥＫ阻害剤が、トラメチニブ又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記転移性黒色腫が、ＰＤ−１阻害剤又はＰＤ−Ｌ１阻害剤に耐性である、請求項１に記載の方法。
  18. 前記ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、及びそれらのバイオシミラーからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記患者がＢＲＡＦ変異を有しない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記患者が、ＴＩＬの前記治療有効集団を投与される前に、最大で４用量のニボルマブ又はそのバイオシミラーを投与されている、請求項１に記載の方法。
  21. 前記患者が、悪化しているか、又は少なくとも２つの以前の全身処置過程に対する応答を有しなかった、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  22. 二重抵抗性転移性黒色腫の処置が必要な患者の二重抵抗性転移性黒色腫を処置する方法であって、前記方法が、
    （ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
    （ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に加えること；
    （ｃ）ＩＬ−２、及び任意選択によりＯＫＴ−３、を含む細胞培養培地で前記第１のＴＩＬ集団を培養し第２のＴＩＬ集団を生じさせることにより第１の拡大培養を実施することであって、前記第１の拡大培養は、第１ガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第１の拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るため約３〜１４日間行われ、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍も数が多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は系を開放せずに発生すること；
    （ｄ）前記第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加的なＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加することにより第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、前記第３のＴＩＬ集団を入手するために前記第２の拡大培養が約７〜１４日間実施され、前記第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡大培養は第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器で行われ、及びステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は系を開放せずに発生すること；
    （ｅ）ステップ（ｄ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収したＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放せずに発生すること；
    （ｆ）ステップ（ｅ）で回収したＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放せずに発生すること、及び任意選択により前記回収したＴＩＬ集団を凍結保存すること；並びに
    （ｇ）治療有効量の前記回収したＴＩＬ集団を、二重抵抗性転移性黒色腫を有する患者に投与すること
    を含む、方法。
  23. 前記患者が、以前にＰＤ−１阻害剤又はそのバイオシミラーで処置されている、請求項２０に記載の方法。
  24. 前記ＰＤ−１阻害剤が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらのバイオシミラーからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記患者が、以前にＰＤ−Ｌ１阻害剤又はそのバイオシミラーで処置されている、請求項２０に記載の方法。
  26. 前記ＰＤ−Ｌ１阻害剤が、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、及びそれらのバイオシミラーからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ＰＤ−１阻害剤又はそのバイオシミラーが、ＣＴＬＡ−４阻害剤又はそのバイオシミラーと共投与された、請求項２３〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記ＰＤ−Ｌ１阻害剤又はそのバイオシミラーが、ＣＴＬＡ−４阻害剤又はそのバイオシミラーと共投与された、請求項２５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記患者が、１つの更なる優先選択の全身療法で以前に処置されている、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記１つの更なる優先選択の全身療法が、ＢＲＡＦ阻害剤又はその薬学的に許容される塩である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、及びそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記１つの更なる優先選択の全身療法が、ＭＥＫ阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物である、請求項２９に記載の方法。
  33. 前記ＭＥＫ阻害剤が、トラメチニブ、コビメチニブ、及びそれらの薬学的に許容される塩又は溶媒和物からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記１つの更なる優先選択の全身療法が、ＢＲＡＦ阻害剤又はその薬学的に許容される塩とＭＥＫ阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物との組み合わせである、請求項２９に記載の方法。
  35. 前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、及びそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択され、前記ＭＥＫ阻害剤が、トラメチニブ、コビメチニブ、及びそれらの薬学的に許容される塩又は溶媒和物からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記１つの更なる優先選択の全身療法が、ＣＴＬＡ−４阻害剤又はそのバイオシミラーである、請求項２９に記載の方法。
  37. 前記ＣＴＬＡ−４阻害剤が、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びそれらのバイオシミラーからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記１つの更なる優先選択の全身療法が、化学療法レジメンである、請求項２９に記載の方法。
  39. 前記化学療法レジメンが、ダカルバジン又はテモゾリミドを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記第１の拡大培養が、約１１日の期間にわたって行われる、請求項２２に記載の方法。
  41. 前記第１の拡大培養ステップ（ｃ）において、前記ＩＬ−２が、前記細胞培養培地中に１０００ＩＵ／ｍＬ〜６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在する、請求項２２〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記第２の拡大培養ステップ（ｄ）において、前記ＩＬ−２が１０００ＩＵ／ｍＬ〜６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、前記ＯＫＴ−３抗体が約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する、請求項２２〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記第１の拡大培養が、ガス透過性容器を使用して行われる、請求項２２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記第２の拡大培養が、ガス透過性容器を使用して行われる、請求項２２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記第１の拡大培養ステップ（ｃ）における前記細胞培養培地が、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインを更に含む、請求項２２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記第２の拡大培養ステップ（ｄ）における前記細胞培養培地が、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるサイトカインを更に含む、請求項２２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記ＴＩＬを前記患者に投与する前に、前記患者を骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンで処置するステップを更に含む、請求項２２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間シクロホスファミドを投与し、続いて２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間フルダラビンを投与するステップを含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記患者への前記ＴＩＬの投与の翌日に開始する、ＩＬ−２レジメンで前記患者を処置するステップを更に含む、請求項２２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記ＩＬ−２レジメンが、許容量まで８時間ごとに１５分のボーラス静脈内注入として投与される、６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン、又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む高用量ＩＬ−２レジメンである、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記ＴＩＬの治療有効集団が、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個のＴＩＬを含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
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