CN106880833A - 抗原肽racgap1‑1和racgap1‑2在制备治疗肝癌药物中的应用 - Google Patents

抗原肽racgap1‑1和racgap1‑2在制备治疗肝癌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是抗原肽RACGAP1‑1和RACGAP1‑2在制备预防和/或治疗肝癌药物中的应用，所述的抗原肽RACGAP1‑1和RACGAP1‑2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。本发明提供的可用于肝癌治疗的两条抗原肽RACGAP1‑1和RACGAP1‑2，可以负载树突状细胞诱导并获取大量具有特异性识别肝癌细胞的CTL，并可在体内显著杀伤肝癌实体瘤，可用于制备预防或治疗肝癌的药物。

Description

抗原肽RACGAP1-1和RACGAP1-2在制备治疗肝癌药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是抗原肽RACGAP1-1和RACGAP1-2在制备治疗肝癌药物中的应用。
背景技术
肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种起源于肝细胞的恶性肿瘤，是人类主要的恶性肿瘤之一，据世界卫生组织(WHO)报告，全世界每年有约100万人死于肝癌。肝癌死亡率很高，我国肝癌发病率居世界之首,肝癌是我国第2位癌症杀手，是全球第3位癌症死因。器官移植是治疗肝癌晚期唯一有效的手段，但仍存在供肝数量逐年减少以及急性、慢性排斥反应所导致的移植物存活时间短等诸多问题，放疗、化疗虽然一定程度上抑制肿瘤的生长和转移，但对正常肝细胞造成的损伤以及复发率高的问题仍未得到有效解决。
近年来针对实体瘤的免疫治疗逐渐成为肿瘤学研究的热点。生物体对肿瘤细胞识别杀伤过程中，细胞免疫、特别是细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)发挥着核心作用。在此过程中，肿瘤细胞被抗原递呈细胞(antigen-presenting cell，APC)吞噬后，其癌细胞特有的蛋白可以被蛋白酶水解形成肽段，并在内质网中与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)I类分子结合，形成复合物，后被运送到细胞表面进行抗原递呈，诱导特异性CTL增殖。CTL可以识别肿瘤细胞上的抗原肽与MHC的复合物，对肿瘤细胞进行杀伤。根据这一原理，可以通过选取肿瘤内特异性蛋白设计抗原肽，来诱导肿瘤特异性CTL。
随着大数据时代的到来，循证医学逐渐取代经验医学成为科学诊断和治疗的切入点，以大数据为背景，进行科研研究逐渐成为主流。Oncomine、TCGA等含有大量肿瘤临床样本数据的数据库得到国内外学者的广泛关注，并越来越多的运用到肿瘤的研究中来，2013-2016年多篇研究工作发表在Nature、Science等顶级杂志。但是目前，利用大数据进行肝癌研究的多关注于肝癌发生发展过程中分子机制，而较少关注肿瘤抗原肽的开发。
发明内容
本发明根据现有肝癌公开数据，设计了一套利用差异分析挖掘肝癌高表达分子、后用ENCODE数据库数据剔除可能引起自身免疫反应抗原的筛选方案。鉴于I型HLA中，位于HLA-A基因座0201型等位基因在人群中分布极为广泛，其表达产物HLA-A*0201在肿瘤的抗原递呈过程中起着非常重要的作用，且与HLA-A*0201发生结合的CTL表位长度被限制在9±1个氨基酸残基。因此，本发明利用网络软件在线计算出潜在的抗原九肽，鉴定出在以HLA-A*0201阳性肝癌细胞癌患者为对象的免疫疗法中有效的、与HLA-A*0201结合并递呈在人CTL上的肽段。在裸鼠移植瘤模型中回输负载后的肿瘤抗原肽后的树突状细胞(dendriticcell，DC)与T细胞，证明使用该肽有效。
本发明提供一种鉴定发现肝癌抗原肽的方法，具体是指通过公开的肝癌测序或芯片数据分析，筛选出肝癌高表达的基因，并通过ENCODE数据库过滤表达于成年人其他组织中的分子，进而设计与HLA-A*0201发生结合的抗原九肽，负载DC诱导CTL后，通过体外杀伤实验与裸鼠移植瘤模型筛选获得有效的抗原肽。
本发明的主要技术方案如下：
本发明人通过调阅GEO数据库中一例含有220例肝癌癌旁组织与224例肝癌组织芯片结果的Dataset，分析鉴定出了人肝癌细胞中特异性过表达的分析，并取top20作为候选分子。又通过ENCODE数据库，剔除20个中表达于成年个体其他组织的分子，剩余SPINK1、GPC3、AKR1B10、RACGAP1、CCL20、PEG10、MDK和ENAH作为肿瘤抗原。通过在线软件设计候选分子的抗原九肽，合成后体外负载DC，并加入T细胞共培养诱导特异性识别抗原肽的CTL，同时在体外杀伤实验和PDTX模型中验证其抗瘤能力，由此鉴定出可以作为应用于免疫治疗的候选肝癌抗原肽。
即，本发明提供以下内容：
通过体外实验证实负载树突状细胞并递呈后可诱导特异性杀伤CTL的抗原肽：
通过体内实验证实负载树突状细胞并递呈后可诱导特异性杀伤CTL，并可在体内显著杀伤实体瘤的抗原肽：GPC3-1(编号2)、GPC3-3(编号4)、RACGAP1-1(编号7)和RACGAP1-2(编号8)。
本发明的第一方面，提供抗原肽RACGAP1-1在制备预防和/或治疗肝癌药物中的应用，所述的抗原肽RACGAP1-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的第二方面，提供抗原肽RACGAP1-2在制备预防和/或治疗肝癌药物中的应用，所述的抗原肽RACGAP1-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
所述的抗原肽RACGAP1-1或RACGAP1-2可诱导特异性杀伤CTL，并可在体内显著杀伤肝癌实体瘤。
本发明的第三方面，提供一种用于肝癌的预防和/或治疗的药物组合物，所述的药物组合物是以抗原肽RACGAP1-1作为活性成分，或者是含有抗原肽RACGAP1-1的药物组合物。
本发明的第四方面，提供一种用于肝癌的预防和/或治疗的药物组合物，所述的药物组合物是以抗原肽RACGAP1-2作为活性成分，或者是含有抗原肽RACGAP1-2的药物组合物。
本发明的第五方面，提供一种用于肝癌的预防和/或治疗的药物组合物，所述的药物组合物是以抗原肽RACGAP1-1和抗原肽RACGAP1-2作为活性成分，或者是含有抗原肽RACGAP1-1和抗原肽RACGAP1-2的药物组合物。
优选的，所述的药物组合物含有有效量的上述的抗原肽，以及药学上可接受的载体。
所述的“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
所述的“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
本发明建立了一整套基于肝癌二代测序数据挖掘肝癌抗原的方案，并基于挖掘出的肿瘤抗原设计抗原肽，同时将抗原肽负载树突状细胞后递呈CD8+T细胞，体外、体内实验筛选具有有效抗瘤能力的肽段。本发明提供可用于肝癌治疗的4条抗原肽，由以编号2、编号4、编号7和编号8中的任意一条由氨基酸形成的短肽，或者编号2和编号4两两组合、编号7和编号8两两组合可以负载树突状细胞诱导并获取大量具有特异性识别肝癌细胞的CTL。
附图说明
图1为GEO数据库中下载包含220例癌旁组织和224例肝癌组织的GSE14520数据集U133芯片数据，R语言中分析并输出的热图结果。调用函数包为DeSeq，参数设定为padj＜0.05，log2(foldchange)＞2。
图2为ENCODE数据库中下载127种primary cell的RNA-Seq数据以及44种tissue的RNA-Seq数据。将表达数据经过TPM算法(RPKM算法的优化版本)进行均一化处理，生成矩阵，并在矩阵中调用GPC3的表达数据。
图3为ENCODE数据库中下载127种primary cell的RNA-Seq数据以及44种tissue的RNA-Seq数据。将表达数据经过TPM算法(RPKM算法的优化版本)进行均一化处理，生成矩阵，并在矩阵中调用TOP2A的表达数据。
图4为体外诱导人树突状细胞并负载不同的抗原肽，后使用树突状细胞提成抗原给T细胞，在肝癌细胞系中验证肿瘤抗原肽的杀伤效果，此处仅展示有效的抗原肽结果。A为编号1-6的抗原肽诱导T细胞后杀伤Hep3B的结果，B为编号1-6的抗原肽诱导T细胞后杀伤MHCC9H的结果，C为编号7-12的抗原肽诱导T细胞后杀伤Hep3B的结果，D为编号7-12的抗原肽诱导T细胞后杀伤MHCC9H的结果。
图5为体外诱导人树突状细胞并负载不同的抗原肽，后使用树突状细胞提成抗原给T细胞，在PDTX模型中验证CTL杀伤实体瘤的效果，此处仅展示有效的抗原肽结果。A为编号2(GPC3-1)的抗原肽诱导T细胞后杀伤实体瘤的结果，B为编号4(GPC3-3)的抗原肽诱导T细胞后杀伤实体瘤的结果，C为编号7(RACGAP1-1)的抗原肽诱导T细胞后杀伤实体瘤的结果，D为编号8(RACGAP1-2)的抗原肽诱导T细胞后杀伤实体瘤的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：基于肝癌芯片数据分析发现肝癌抗原候选分子。
本专利数据来源于GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中样本数最多的一例肝癌dataset(GSE14520)，包含220例癌旁组织和224例肝癌组织的U133芯片检测结果。
实验方法：
数据下载后进行差异分析分析，分析软件使用R语言，差异分析调用函数包DeSeq(参考文献：Anders S,Huber W:Differential expression analysis for sequencecount data.Genome Biol.2010,11(10):R106-10.1186/gb-2010-11-10-r106.)，参数设定为padj＜0.05，log2(foldchange)＞2。并生成热图，后输出TOP20高表达基因。
实验结果：
通过差异分析发现了肝癌组织中相对于癌旁组织有大量的差异基因，并通过热图(Heatmap)展示(图1)。并选取TOP20(表1)，作为候选基因。
表1.肝癌中高表达基因Top20
实施例2：利用ENCODE数据库过滤实施例1中候选基因中的自身抗原。
ENCODE，即DNA元件百科全书(Encyclopedia of DNA Elements)，旨在描述人类基因组中所编码的全部功能性序列元件。ENCODE计划于2003年9月正式启动，由来自美国、英国、西班牙、日本和新加坡五国的32个研究机构参与，目前所有数据均全部公开(http://genome.ucsc.edu/ENCODE/)。在发明人所提供的肿瘤抗原挖掘方案中，ENCODE数据库中人各组织中的RNA-Seq数据被调用，用以过滤实施例1中候选基因中的自身抗原。
实验方法：
1、ENCODE数据库中下载127种primary cell的RNA-Seq数据以及44种tissue的RNA-Seq数据。将表达数据经过TPM算法(RPKM算法的优化版本)进行均一化处理，生成矩阵。
2、将实施例1中候选基因在矩阵中逐一查找TPM值，筛选仅表达于肝癌而不表达/低表达于成人其他组织的分子作为候选肿瘤抗原。
实验结果：
阐明了实施例1所获得的20个候选基因在正常成年人中的表达模式，主要分为两种模式：一种如图2所示GPC3的表达模式，仅表达于肝癌或/和胚胎细胞中；一种如图3所示TOP2A的表达模式，不仅表达于肝癌或/和胚胎细胞中，同时在成体其他细胞中或/和造血干细胞中也有表达。剔除达于成年个体其他组织的分子后，保留SPINK1、GPC3、AKR1B10、RACGAP1、CCL20、PEG10、MDK和ENAH作为肿瘤抗原。
实施例3：利用BIMAS软件设计抗原肽
I型HLA中，位于HLA-A基因座0201型等位基因在人群中分布极为广泛，其表达产物HLA-A*0201在肿瘤的抗原递呈过程中起着非常重要的作用，且与HLA-A*0201发生结合的CTL表位长度被限制在9±1个氨基酸残基。因此，发明人利用软件BIMAS(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)在线计算出潜在的抗原九肽，从而获得以HLA-A*0201阳性肝癌细胞癌患者为对象的免疫疗法中有效的、与HLA-A*0201结合并递呈在人CTL上的肽段。
实验方法：
登录BIMAS(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)网站，分别输入SPINK1、GPC3、AKR1B10、RACGAP1、CCL20、PEG10、MDK和ENAH的氨基酸序列。参数设定为：HLA molecule＝A_0201，n-mers＝9。筛选Score≥100的序列作为候选序列。
实验结果：
经过计算，一共获得了来自于8个基因的27条抗原肽(表2)。
表2.BIMAS预测候选肿瘤抗原HLA_A_02*01九肽
实施例4：体外肿瘤细胞杀伤实验验证抗原肽效率
实验方法：
1、多肽合成：抗原九肽合成使用氨基酸的羧内酸酐法，具体来说是在碱性条件下，氨基酸阴离子攻击氨基酸的羧内酸酐形成稳定的氨基甲酸根离子，后在酸化时该离子失去二氧化碳生成二肽，生成的二肽又进攻其它的氨基酸的羧内酸酐，如此进行八个循环，获得九肽。
2、人PBMC分离：健康人肝素抗凝静脉血加入等体积HBSS缓冲液进行稀释，用滴管轻轻加到稀释血50％体积的FICOLL上，25℃、2000rpm 20分钟，离心后吸取中间的白色云雾状狭窄带，置于另一离心中，加入尽可能多的HBSS液洗涤吸取的细胞，1000rpm 5分钟，洗2次，获得PBMC。
3、人树突状细胞培养与抗原肽负载：人PBMC计数后重悬于1640培养基中，后按每孔4x106加入6孔板，37℃、5％CO2浓度孵育4小时，使单核细胞贴壁，悬浮细胞收集至另一10cm培养皿中。贴壁细胞每孔加入2mL含GM-CSF 50ng/ml、IL-4 10ng/ml的1640(10％FBS)培养基诱导DC。前四天每隔一天半量换液，同时补加细胞因子。第四天加入抗原肽10mg/孔。第五天补加1mL含GM-CSF 50ng/ml、IL-4 10ng/ml的1640(10％FBS)培养基。第6天时加入细胞因子TNF-α(200U/mL)培养到第8天，即为具有抗原递呈能力的成熟的DC。
4、人T细胞分离：步骤3中所获得悬浮细胞用磁珠分选法分选CD3+T细胞，1x105/孔接种24孔板，加入含有1000u/ml IFN-γ、500U/ml IL-2、anti-CD310ng/ml 1640(FBS10％)培养基500μL，隔一天换液一次。培养直第8天。
5、DC与T细胞混合培养：负载抗原肽后的成熟DC与T细胞按细胞数1：2混合。使用含有1000u/ml IFN-γ、500U/ml IL-2、anti-CD3 10ng/ml 1640(FBS10％)培养基500μL连续培养5天，每隔两天换液一次，第六日磁珠分选法收集CD3+T细胞。
6、细胞杀伤效率测定：使用HLA_A_02*01阳性的肝癌细胞系Hep3B与MHCC97H作为靶细胞，培养处理后调制成1×105/ml铺96孔板，细胞加入MTT液(5mg/ml)10-20μL/孔。效应T细胞和靶细胞等体积培养4小时(Tumor∶T-cell＝1∶1，3∶1，5∶1，10∶1)，每孔加入酸化异丙醇100μL，振荡10min，测OD值(波长570nm，参考波长630nm)，并计算细胞活力。
实验结果：
通过体外杀伤实验我们共获得了12条具有显著杀伤活力的九肽，其体外杀伤实验结果如图4所示，肽段序列如表3所示。
表3.12条具有显著杀伤活力的九肽序列
肽段名称 序列 SEQ ID NO.
SPINK1 FLLSALALL 1
GPC3-1 RMLTRMWYC 2
GPC3-2 ELFDSLFPV 3
GPC3-3 RLQPGLKWV 4
GPC3-4 FVGEFFTDV 5
AKR1B10 KLSYLDVYL 6
RACGAP1-1 FLMIHLQRV 7
RACGAP1-2 MLADFVSQT 8
CCL20 LLLAALMSV 9
PEG10 KLTEENTTL 10
MDK FLLLTLLAL 11
ENAH GLMEEMSAL 12
实施例5：抗原肽特异性T细胞回输PDTX小鼠评估疗效
实验方法：
1、多肽合成：抗原九肽合成使用氨基酸的羧内酸酐法，具体来说是在碱性条件下，氨基酸阴离子攻击氨基酸的羧内酸酐形成稳定的氨基甲酸根离子，后在酸化时该离子失去二氧化碳生成二肽，生成的二肽又进攻其它的氨基酸的羧内酸酐，如此进行八个循环，获得九肽。
2、人PBMC分离：健康人肝素抗凝静脉血加入等体积HBSS缓冲液进行稀释，用滴管轻轻加到稀释血50％体积的FICOLL上，25℃、2000rpm 20分钟，离心后吸取中间的白色云雾状狭窄带，置于另一离心中，加入尽可能多的HBSS液洗涤吸取的细胞，1000rpm 5分钟，洗2次，获得PBMC。
3、人树突状细胞培养与抗原肽负载：人PBMC计数后重悬于1640培养基中，后按每孔4x106加入6孔板，37℃、5％CO2浓度孵育4小时，使单核细胞贴壁，悬浮细胞收集至另一10cm培养皿中。贴壁细胞每孔加入2mL含GM-CSF 50ng/ml、IL-4 10ng/ml的1640(10％FBS)培养基诱导DC。前四天每隔一天半量换液，同时补加细胞因子。第四天加入抗原肽10mg/孔。第五天补加1mL含GM-CSF 50ng/ml、IL-4 10ng/ml的1640(10％FBS)培养基。第6天时加入细胞因子TNF-α(200U/mL)培养到第8天，即为具有抗原递呈能力的成熟的DC。
4、人T细胞分离：步骤3中所获得悬浮细胞用磁珠分选法分选CD3+T细胞，1x105/孔接种24孔板，加入含有1000u/ml IFN-γ、500U/ml IL-2、anti-CD310ng/ml 1640(FBS10％)培养基500μL，隔一天换液一次。培养直第8天。
5、DC与T细胞混合培养：负载抗原肽后的成熟DC与T细胞按细胞数1：2混合。使用含有1000u/ml IFN-γ、500U/ml IL-2、anti-CD3 10ng/ml 1640(FBS10％)培养基500μL连续培养5天，每隔两天换液一次，第六日磁珠分选法收集CD3+T细胞，1x105每份重悬于300μLHBSS。
6、肝癌PDTX小鼠制备：1x106肝癌细胞Hep3B或MHCC97H重悬于200μL HBSS缓冲液中，用胰岛素注射器注入裸鼠背部皮肤。约3周，肿瘤可生长至1cm3。
7、T细胞回输PDTX小鼠评估治疗效果：PDTX小鼠肿瘤生长至≥1cm3后，尾静脉回输步骤5中T细胞悬液。连续观察两周，评估疗效。
实验结果：
通过这一方案，我们共筛选到了体内模型中具有显著疗效的4条抗原肽：GPC3-1、GPC3-3、RACGAP1-1和RACGAP1-2。根据体内实验结果，所有经过T细胞回输治疗的小鼠均发生了肿瘤消退或肿瘤缩小(图5)。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军第二军医大学
<120> 抗原肽RACGAP1-1和RACGAP1-2在制备治疗肝癌药物中的应用
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<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
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Lys Leu Thr Glu Glu Asn Thr Thr Leu
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
Phe Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ala Leu
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Gly Leu Met Glu Glu Met Ser Ala Leu
1 5

Claims (9)

1.抗原肽RACGAP1-1在制备预防和/或治疗肝癌药物中的应用，所述的抗原肽RACGAP1-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
2.根据权利要求1所述的抗原肽RACGAP1-1在制备预防和/或治疗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述的抗原肽RACGAP1-1诱导特异性杀伤CTL，并可在体内显著杀伤肝癌实体瘤。
3.一种用于肝癌的预防和/或治疗的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物是以抗原肽RACGAP1-1作为活性成分，或者是含有抗原肽RACGAP1-1的药物组合物。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有有效量的抗原肽RACGAP1-1，以及药学上可接受的载体。
5.抗原肽RACGAP1-2在制备预防和/或治疗肝癌药物中的应用，所述的抗原肽RACGAP1-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
6.根据权利要求5所述的抗原肽RACGAP1-2在制备预防和/或治疗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述的抗原肽RACGAP1-2诱导特异性杀伤CTL，并可在体内显著杀伤肝癌实体瘤。
7.一种用于肝癌的预防和/或治疗的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物是以抗原肽RACGAP1-2作为活性成分，或者是含有抗原肽RACGAP1-2的药物组合物。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有有效量的抗原肽RACGAP1-2，以及药学上可接受的载体。
9.一种用于肝癌的预防和/或治疗的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物是以抗原肽RACGAP1-1和抗原肽RACGAP1-2作为活性成分，或者是含有抗原肽RACGAP1-1和抗原肽RACGAP1-2的药物组合物。
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