CN106581668A - 一种抗原表位肽组合物及其应用 - Google Patents

一种抗原表位肽组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及基因工程与生物医学技术领域，尤其涉及一种抗原表位肽组合物及其应用。本发明提供的抗原表位肽组合物，包括四种抗原表位肽：抗原肽STEAP1、抗原肽PSM、抗原肽DKK1和抗原肽CD133。实验结果表明，采用本发明提供的抗原表位肽组合物能够有效诱导树突状细胞成熟，提高抗原递呈能力，能产生特异性细胞毒性杀伤细胞，提高杀瘤效率，可有效抑制肿瘤的生长，起到抗肿瘤的作用，为前列腺癌的临床治疗提供了新的选择。

Description

一种抗原表位肽组合物及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程与生物医学技术领域，尤其涉及一种抗原表位肽组合物及其应用。
背景技术
前列腺癌是全球第六大癌症，又是全球男性第二大癌症。欧美国家前列腺癌发病例高于亚洲国家，是男性最常见的恶性肿瘤之一，发病率在100/10万以上。在我国虽然前列腺癌的发病率远低于欧美国家，但随着人均寿命的增长，生活方式的西化，我国前列腺的发病率和死亡率呈现出逐年递增的趋势。根据2015年的中国癌症统计结果，我国男性前列腺癌发病率已达60.3/10万，有可能成为危害男性健康的第一肿瘤杀手。
树突状细胞(dendritic cell，DCs)是目前人体内已知功能最强大的专职抗原提呈细胞，其细胞表面具有高密度的抗原呈递分子(MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)以及共刺激分子CD40，CD80，CD86等。通过吞噬和加工机体内恶性肿瘤细胞，DCs细胞将肿瘤抗原表位肽呈递到细胞表面，与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)结合并将抗原信息呈递给T淋巴细胞，由该T淋巴细胞对肿瘤细胞产生细胞毒性作用。DC-CTL抗肿瘤效应的特异性，需要特异的肿瘤相关抗原致敏和DCs细胞协同作用。因此，筛选和找到相应的抗原肽是DC疫苗发挥作用的关键之一。
由于恶性肿瘤容易复发和转移，肿瘤患者的生存时间和生活质量始终较低。而恶性肿瘤之所以容易复发转移，与现有的治疗手段只能杀死肿瘤细胞，不能彻底清除肿瘤干细胞密切相关。肿瘤干细胞具有自我更新能力和分化潜能，是肿瘤生长、增殖和转移的根源。CD133作为肿瘤干细胞(cancer stem cell)表面特异标记分子，在前列腺癌、结直肠癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌等多种肿瘤中被发现。越来越多的研究表明，CD133极有可能成为治疗恶性肿瘤的一个有效靶点。
目前DC疫苗的制备多以靶向常规肿瘤标志物的单抗原表位肽负载为主，但单一抗原肽负载DC细胞靶向肿瘤细胞在肿瘤治疗中疗效不足。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗原表位肽组合物及其应用，本发明提供的抗原表位肽组合物能够有效诱导树突状细胞成熟，提高抗原递呈能力，产生特异性细胞毒性杀伤细胞，增强杀瘤效率，可有效抑制肿瘤的生长，起到抗肿瘤的作用。
本发明的目的在于提供一种抗原表位肽组合物，包括四种抗原表位肽：抗原肽STEAP1、抗原肽PSM、抗原肽DKK1和抗原肽CD133。
所述抗原肽STEAP1氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
所述抗原肽PSM氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
所述抗原肽DKK1氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。
所述抗原肽CD133氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。
优选的，所述抗原肽STEAP1在抗原表位肽组合物中的含量为5～12μg/mL。
优选的，所述抗原肽PSM在抗原表位肽组合物中的含量为5～12μg/mL。
优选的，所述抗原肽DKK1在抗原表位肽组合物中的含量为5～12μg/mL。
优选的，所述抗原肽CD133在抗原表位肽组合物中的含量为5～12μg/mL。
本发明提供一种抗原递呈细胞，将上述任意一项所述抗原表位肽组合物负载于树突状细胞，获得抗原表位肽组合物致敏的抗原递呈细胞。
本发明还提供一种以上所述抗原表位肽组合物和/或所述抗原递呈细胞在制备预防或治疗前列腺癌疫苗中的应用。
本发明提供一种疫苗，包含上述任意一项所述抗原表位肽组合物和/或所述抗原递呈细胞。
从以上技术方案可以看出，本发明具有以下有益效果：
1)本发明提供一种抗原表位肽组合物能特异性高效负载在DCs上，极大提高在抗原提呈细胞上的负载能力，作为DCs疫苗更高效刺激体内产生抗原特异性CTL，进而增强其诱导特异性免疫反应的能力；2)负载了本发明提供的抗原表位肽组合物的DCs与淋巴细胞共培养体外高效诱导和扩增抗原特异性CTL，这样的抗原表位肽组合物诱导的细胞毒性T淋巴细胞(DC-CTL)治疗前列腺癌细胞具有特异性杀伤作用，较未经负载抗原或单一负载抗原表位肽的DC在体内外刺激活化的CTL活性更强，杀伤效果更优；3)本发明提供的抗原表位肽组合物合成方便，不受材料限制，易于制备和纯化，能大量合成高纯度，具有高度可重复性；4)化学性质和热力学性质比蛋白质更稳定，便于运输和保存；5)没有毒性或感染性因子；6)下游加工处理简单易行且成本低。通过本发明提供的抗原表位肽组合物制备的疫苗有良好的特异性免疫原性，具有治疗前列腺癌所致疾病的药物的潜力，因此成为一种具有广阔应用前景的免疫制剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1示抗原表位肽负载的DC表型检测示意图；
图2示抗原表位肽负载的DC活化T细胞分泌IFN-γ检测示意图；
图3示抗原表位肽负载的DC-CTL体外杀瘤效率检测示意图；
图4抗原表位肽负载的DC-CTL治疗肿瘤模型鼠的肿瘤体积变化示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种抗原表位肽组合物，其特征在于，包括四种抗原表位肽：抗原肽STEAP1、抗原肽PSM、抗原肽DKK1和抗原肽CD133。
所述抗原肽STEAP1氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
所述抗原肽PSM氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
所述抗原肽DKK1氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。
所述抗原肽CD133氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。
所述的抗原表位肽组合物可以通过人工化学合成的方式制备，也可以通过本领域技术人员知悉的其它生物化学或者分子生物学的方法得到。
本发明提供的一个实施例中采用人工合成的方式制备。
所述人工合成的制备方法步骤为：
首先，所述抗原肽STEAP1(SEQ ID NO：1)选自STEAP1分子的等位基因HLA-A2位点292-300限制的多肽。所述抗原肽PSM(SEQ ID NO：2)选自PSMA分子的等位基因HLA-A24位点178-186限制的多肽。所述抗原肽DKK1(SEQ ID NO：3)选自DKK1分子的等位基因HLA-A2位点20-29限制的多肽。所述抗原肽CD133(SEQ ID NO：4)选自CD133分子的等位基因HLA-A2位点753-761所限制的多肽。
本发明委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成实施例中所述抗原肽STEAP1(SEQID NO：1)、抗原肽PSM(SEQ ID NO:2)、抗原肽DKK1(SEQ ID NO：3)以及所述抗原肽CD133(SEQ ID NO：4)，并经高效液相色谱和质谱分析鉴定其序列和分子量。所述抗原肽STEAP1(SEQ ID NO：1)浓度优选为99％以上。所述抗原肽PSM(SEQ ID NO:2)浓度优选为99％以上。所述抗原肽DKK1(SEQ ID NO：3)浓度优选为99％以上。所述抗原肽CD133(SEQ ID NO：4)浓度优选为99％以上。
其次，将上述四种合成得到的抗原表位肽进行溶解，经过过滤、除菌后，进行分装保存。所述溶解使用的储存液优选为水或者DMSO(二甲基亚砜)，储存液浓度优选为8～12mg/ml，更优选为10mg/ml。所述过滤的器具优选为0.22μm的针筒滤器。所述储存的温度优选为-18℃～-22℃，更优选为-20℃。经高效液相色谱和质谱分析鉴定证明合成的表位肽的序列和分子量均正确，且纯度达到99％以上，得到符合实施例使用要求的四种抗原表位肽。
将上述四种抗原肽STEAP1(SEQ ID NO：1)、抗原肽PSM(SEQ ID NO:2)、抗原肽DKK1(SEQ ID NO：3)以及所述抗原肽CD133(SEQ ID NO：4)混合得到抗原表位肽组合物。
优选的，所述抗原肽STEAP1(SEQ ID NO：1)在抗原表位肽组合物中的含量为5～12μg/mL；所述抗原肽抗原肽PSM(SEQ ID NO:2)在抗原表位肽组合物中的含量为5～12μg/mL；所述抗原肽DKK1(SEQ ID NO：3)在抗原表位肽组合物中的含量为5～12μg/mL；所述抗原肽CD133(SEQ ID NO：4)在抗原表位肽组合物中的含量为5～12μg/mL。
本发明提供一种抗原递呈细胞，将上述抗原表位肽组合物负载于树突状细胞(DCs)，得到抗原表位肽组合物致敏的抗原提呈细胞。所述抗原表位肽组合物浓度优选为20～50μg/ml，更优选为40μg/ml。所述DCs优选为淋巴细胞或骨髓细胞，更优选为淋巴细胞。
所述DC优选按照下述方法获取：首先，将外周血进行离心、洗涤。所述离心前加入肝素抗凝。所述离心的方法为，加入ficoll(聚蔗糖)后进行密度梯度离心，ficoll浓度优选为1～2g/ml，更优选为l.077g/ml。所述梯度离心的条件优选为18℃～20℃，1300～1700r/min，13～17min，更优选为20℃，1500r/min，15min。离心结束后收集细胞进行培养。所述培养方法为，将细胞收集于6孔板中，置于进行二氧化碳培养箱中进行培养。所述培养基为AIM-V培养基。所述培养的孵育时间优选为1.5-2.0h，更有选为90min。培养结束后，轻轻取出6孔板，将6孔板中的上清液及悬浮细胞吸出于另一培养皿中，得到待用细胞悬液。其次，向所述待用细胞悬液中加入培养基及细胞因子，置于二氧化碳培养箱中进行培养。所述细胞因子为rhGM-CSF和IL-4，浓度优选为rhGM-CSF750～850IU/ml，IL-4 450～550IU/ml，更优选为rhGM-CSF 800IU/ml，IL-4 500IU/ml。所述培养过程中，48h后加一次细胞因子，培养第五天加入TNF-α，继续培养到第7天后，得到成熟的DCs。所述TNF-α的浓度优选为200～300IU/ml，更优选为250IU/ml。
所述负载方法为，将抗原表位肽组合物与成熟的DCs进行培养，培养过程中，每三天半量换液，同时加入细胞因子进行培养。所述细胞因子优选为GM-CSF、rhIL-4和rhIL-2。所述培养的条件优选为于35℃～39℃，3～7％CO2培养箱中进行培养，更优选为37℃，5％CO2。在培养箱中培养7天后，得到抗原表位肽特异性的DC。
将所述抗原表位肽特异性的DC与淋巴细胞共培养，得到抗原表位肽组合物诱导的细胞毒性T淋巴细胞(DC-CTL)。所述抗原递呈细胞为抗原表位肽特异性的DC。所述CTL为悬浮细胞培养得到，所述CTL细胞浓度优选为107/ml。
本发明还提供一种以上所述抗原表位肽组合物和/或所述抗原递呈细胞在制备预防或治疗前列腺癌疫苗中的应用。
本发明还提供一种疫苗，包含以上任意一项所述抗原表位肽组合物和/或所述抗原递呈细胞。
本发明提供一种治疗前列腺癌的疫苗的制备方法，步骤如下：
首先，将所述抗原表位肽组合物负载于DC制成抗原递呈细胞。
所述的抗原表位肽组合物可以通过人工化学合成的方式制备，也可以通过本领域技术人员知悉的其它生物化学或者分子生物学的方法得到。
本发明提供的一个实施例中采用人工合成的方式制备。所述抗原表位肽组合物的人工合成制备方法步骤为：
所述抗原肽STEAP1(SEQ ID NO：1)选自STEAP1分子的等位基因HLA-A2位点292-300限制的多肽。所述抗原肽PSM(SEQ ID NO：2)选自PSMA分子的等位基因HLA-A24位点178-186限制的多肽。所述抗原肽DKK1(SEQ ID NO：3)选自DKK1分子的等位基因HLA-A2位点20-29限制的多肽。所述抗原肽CD133(SEQ ID NO：4)选自CD133分子的等位基因HLA-A2位点753-761所限制的多肽。
本发明委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成实施例中所述抗原肽STEAP1(SEQID NO：1)、抗原肽PSM(SEQ ID NO:2)、抗原肽DKK1(SEQ ID NO：3)以及所述抗原肽CD133(SEQ ID NO：4)，并经高效液相色谱和质谱分析鉴定其序列和分子量。所述抗原肽STEAP1(SEQ ID NO：1)浓度优选为99％以上。所述抗原肽PSM(SEQ ID NO:2)浓度优选为99％以上。所述抗原肽DKK1(SEQ ID NO：3)浓度优选为99％以上。所述抗原肽CD133(SEQ ID NO：4)浓度优选为99％以上。
将上述四种合成得到的抗原表位肽进行溶解，经过过滤、除菌后，进行分装保存。所述溶解使用的储存液优选为水或者DMSO(二甲基亚砜)，储存液浓度优选为8～12mg/ml，更优选为10mg/ml。所述过滤的器具优选为0.22μm的针筒滤器。所述储存的温度优选为-18℃～-22℃，更优选为-20℃。经高效液相色谱和质谱分析鉴定证明合成的表位肽的序列和分子量均正确，且纯度达到99％以上，得到符合实施例使用要求的四种抗原表位肽。
将上述四种抗原肽STEAP1(SEQ ID NO：1)、抗原肽PSM(SEQ ID NO:2)、抗原肽DKK1(SEQ ID NO：3)以及所述抗原肽CD133(SEQ ID NO：4)混合得到抗原表位肽组合物。
优选的，所述抗原肽STEAP1(SEQ ID NO：1)在抗原表位肽组合物中的含量为5～12μg/mL；所述抗原肽抗原肽PSM(SEQ ID NO:2)在抗原表位肽组合物中的含量为5～12μg/mL；所述抗原肽DKK1(SEQ ID NO：3)在抗原表位肽组合物中的含量为5～12μg/mL；所述抗原肽CD133(SEQ ID NO：4)在抗原表位肽组合物中的含量为5～12μg/mL。
其次，将上述抗原表位肽组合物负载于树突状细胞(DCs)，得到抗原表位肽组合物致敏的抗原提呈细胞。所述抗原表位肽组合物浓度优选为20～50μg/ml，更优选为40μg/ml。所述DCs优选为淋巴细胞或骨髓细胞，更优选为淋巴细胞。
所述DC优选按照下述方法获取：首先，将外周血进行离心、洗涤。所述离心前加入肝素抗凝。所述离心的方法为，加入ficoll(聚蔗糖)后进行密度梯度离心，ficoll浓度优选为1～2g/ml，更优选为l.077g/ml。所述梯度离心的条件优选为18℃～20℃，1300～1700r/min，13～17min，更优选为20℃，1500r/min，15min。离心结束后收集细胞进行培养。所述培养方法为，将细胞收集于6孔板中，置于进行二氧化碳培养箱中进行培养。所述培养基为AIM-V培养基。所述培养的孵育时间优选为1.5-2.0h，更有选为90min。培养结束后，轻轻取出6孔板，将6孔板中的上清液及悬浮细胞吸出于另一培养皿中，得到待用细胞悬液。其次，向所述待用细胞悬液中加入培养基及细胞因子，置于二氧化碳培养箱中进行培养。所述细胞因子为rhGM-CSF和IL-4，浓度优选为rhGM-CSF 750～850IU/ml，IL-4 450～550IU/ml，更优选为rhGM-CSF 800IU/ml，IL-4 500IU/ml。所述培养过程中，48h后加一次细胞因子，培养第五天加入TNF-α，继续培养到第7天后，得到成熟的DCs。所述TNF-α的浓度优选为200～300IU/ml，更优选为250IU/ml。
所述负载方法为，将抗原表位肽组合物与成熟的DCs进行培养，培养过程中，每三天半量换液，同时加入细胞因子进行培养。所述细胞因子优选为GM-CSF、rhIL-4和rhIL-2。所述培养的条件优选为于35℃～39℃，3～7％CO2培养箱中进行培养，更优选为37℃，5％CO2。在培养箱中培养7天后，得到抗原表位肽特异性的DC。
最后，将所述抗原表位肽特异性的DC与淋巴细胞共培养，得到抗原表位肽组合物诱导的细胞毒性T淋巴细胞(DC-CTL)。所述抗原递呈细胞为抗原表位肽特异性的DC。所述CTL为悬浮细胞培养得到，所述CTL细胞浓度优选为107/ml。
将所述抗原表位肽组合物和/或所述抗原递呈细胞和/或DC-CTL与载体或辅料混合后制得治疗前列腺癌所致疾病的疫苗。
本发明提供的一种抗原表位肽组合物能使特异性抗原表位肽高效负载于DCs上，极大提高其在抗原提呈细胞上的负载能力，进而增强其诱导特异性免疫反应的能力，因此成为一种具有广阔应用前景的免疫制剂。本发明提供的抗原表位肽组合物具有良好的特异性免疫原性，具有治疗和/或预防前列腺癌的潜力；抗原表位肽合成方便，不受材料限制；易于制备和纯化，能大量合成高纯度、具有高度可重复性的多肽；化学性质和热力学性质比蛋白质更稳定，便于运输和保存；没有毒性或感染性因子下游加工处理简单易行且成为更清楚起见，下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 DC细胞获取
1)采集50ml外周血，加入ficoll(聚蔗糖)后进行密度梯度离心，获得单个核细胞。
2)将细胞收集于6孔板中，计数后用AIM-V培养基稀释到3-5×106/ml，置于进行二氧化碳培养箱中进行培养。
3)在37℃、5％CO2培养箱中孵育90min后，轻轻取出6孔板，将6孔板中的上清液及悬浮细胞吸出于另一培养皿中，用于诱导培养T淋巴细胞。
4)贴壁细胞加入AIM-V培养基，rhGM-CSF 800IU/ml，IL-4 500IU/ml，48h后加一次细胞因子。
5)第五天收获未成熟DCS细胞，在培养第五天加入TNF-α250IU/ml，继续培养到第八天，得到成熟的DCs。将抗原表位肽组合物与成熟的DCs进行培养，培养过程中，每三天半量换液，同时加入细胞因子进行培养。
实施例2抗原表位肽负载DC及表型鉴定
1)收集培养至第五天的未成熟DC 3×106个，用本发明提供的抗原表位肽组合物以及组合物中的单一表位肽(抗原肽STEAP1、抗原肽PSM、抗原肽DKK1和抗原肽CD133)在37℃、5％CO2培养箱中负载2h。
2)完全培养基继续培养至第八天，收集成熟的抗原肽组合物负载的DC。
3)生理盐水重悬至浓度为5×106个/ml，加入人血白蛋白至终浓度为2％，制备成抗原表位肽组合物负载的DC疫苗。
4)流式细胞术检测负载后DC表型变化。
5)抗原表位肽组合物负载DC细胞通过CD86-PE、CD80-PE、CD40-FITC、CD83-PE、CD11c-FITC和HLA-DR-PerCP(BD公司)染色，流式细胞仪检测负载后DC表型变化(图1所示)。
检测结果显示(图1)所制备的DC表型符合DC细胞特异表型。抗原表位肽组合物负载的效果(p<0.01)要明显优于抗原表位肽单独负载的效果(p<0.05)。
实施例3酶联免疫斑点(ELISPOT)检测细胞毒性T淋巴细胞分泌IFN-γ
1)取5ml PBS，加入1mg/ml的抗人IFN-γ抗体R4-6A2(Phamingen公司)25μl，使其终浓度为5μg/ml，每孔加入50μl，4℃包被过夜。
2)弃包被液，用含10％胎牛血清的完全培养基(RPMI-10)洗涤一次，每孔加入200μl完全培养基，室温封闭2h，弃培养基。
3)将制备的DC细胞与T淋巴细胞以1:5的比例，在37℃、5％CO2培养箱中共培养48小时。
4)取共培养48h的T淋巴细胞，用R-5无酚红培养基稀释成2x105、1x105和0.5x105/ml。
5)分别加入到IFN-γ抗体包被的ELISPOT96孔板中，使每孔体积为100μl。实验组每孔加入100μl前列腺癌细胞PC3，使其效靶比分别为20:1、10:1和5:1。对照组每孔加入100μl对应的未激活的T淋巴细胞，阴性对照加入100μl培养基。混匀后置于37℃、5％CO2培养箱中共培养24小时。
6)共培养24h后，用无菌水洗板2次，用1X洗涤缓冲液或PBST洗涤6次，每次洗涤时浸洗1～2min。
7)将抗体(biotinylated mAb for IFN-gamma)加至12ml(10组量)的稀释缓冲液1中，终浓度为2μg/ml。
8)每孔加入50ul上步混合液。4℃过夜或室温2小时。
9)用1X洗涤缓冲液或PBST洗涤3次。
10)将Streptavidin-HRP concentrate A(BD公司)加至稀释缓冲液比值为1：100。
11)每孔加入50μl混合液，室温培养2小时或4C过夜。
12)用PBST洗涤4次，用PBS洗涤2次。
13)每孔加50μl elispot染色液，避光室温放置5-60分钟。
14)弃去染色液，用蒸馏水洗涤，室温空气干燥2小时或过夜干燥。
15)酶联斑点图像自动分析仪检测斑点数。
16)在效靶比为10:1时酶联斑点图像自动分析仪检测斑点计数结果，对照组为无负载的DCS激活的T淋巴细胞，实验组为抗原肽STEAP1、抗原肽PSMA、抗原肽DKK1和抗原肽CD133以及组合物。
结果如图2显示，抗原肽STEAP1、抗原肽PSMA和抗原肽DKK1三者组合的效果(p<0.01)要好于各自单独负载的效果(p<0.05)，而抗原肽STEAP1、抗原肽PSMA、抗原肽DKK1和抗原肽CD133四个抗原肽同时负载的效果又要好于抗原肽STEAP1、抗原肽PSMA、抗原肽DKK1、抗原肽CD133和抗原肽DKK1三者组合的效果(P<0.01)。
实施例4抗原表位肽负载的DC疫苗体外杀瘤实验
1)将抗原表位肽组合物以及单一表位肽(抗原肽STEAP1、抗原肽PSM、抗原肽DKK1和抗原肽CD133)负载的成熟DCS细胞与T细胞按效靶比为5:1的比例混合共培养3天，得到CTL细胞。
2)以侵袭力强的CD133阳性前列腺癌细胞PC3为靶细胞，用培养基重悬为2X105/ml,按每孔100μl(2×104个)添加到96孔板中。
3)将上述产生的CTL细胞分别以5:1、10:1和20:1的效靶比加入对应的96孔板中，37℃共孵育4h。
4)加入WST1细胞计数试剂盒中应用液继续培养2小时，96孔细胞培养板放入酶联仪检测在450nm处吸光度OD值，按公式计算细胞杀伤率：
杀伤率(％)＝[1-(实验组OD值-NK对照OD值)/靶细胞对照OD值]×100％。
5)以DC-CTL为效应细胞，PC3为靶细胞，采用MTT法检测抗原表位肽组合物负载的DC-CTL的细胞毒性。
结果表明(图3)，在不同效靶比的条件下，抗原表位单肽或抗原表位肽组合物均可有效增强DC-CTL细胞对PC3的细胞毒作用，且抗原表位肽组合负载的效果(p<0.01)要明显优于抗原表位肽单独负载的效果(p<0.05)。
实施例5抗原表位肽负载的DC疫苗体内抗肿瘤实验
1)取6周龄裸鼠24只，每只裸鼠右腋下皮下注射1×107人PC3细胞。
2)5天后肿瘤长到40mm2大小，随机分成9组。
3)对照组尾静脉注射PBS 200ul/次，每周2次，CTL组、DC-CTL组、单一表位肽(抗原肽STEAP1、抗原肽PSM、抗原肽DKK1和抗原肽CD133)负载的DC-CTL组以及抗原表位肽负载的DC-CTL组注射细胞1×106个/次，每周2次，连续治疗2周。游标卡尺测量瘤长度a mm，宽度为b mm，瘤体积计算公式＝0.5×a×b2，统计各组生存率。
4)构建PC3皮下移植瘤裸鼠模型，2天一次连续治疗2周。
结果如图4所示，相比于阴性对照组，CTL组和DC-CTL组的肿瘤体积增长明显变缓，而抗原表位肽组合物负载组比CTL组和DC-CTL组的肿瘤增长速度又要进一步变缓，且抗原表位肽组合负载的效果(p<0.01)要明显优于抗原表位肽单独负载的效果(p<0.05)。
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州姿生生物科技有限公司
<120> 一种抗原多肽组合物
<130> MP1620220
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ile Ala Val Phe Leu Pro Ile Val
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe
1 5
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ala Leu Gly Gly His Pro Leu Leu Gly Val
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Tyr Leu Gln Trp Ile Glu Phe Ser Ile
1 5

Claims (10)

1.一种抗原表位肽组合物，其特征在于，包括四种抗原表位肽：抗原肽STEAP1、抗原肽PSM、抗原肽DKK1和抗原肽CD133。
2.根据权利要求1所述抗原表位肽组合物，其特征在于，所述抗原肽STEAP1氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述抗原表位肽组合物，其特征在于，所述抗原肽PSM氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求1所述抗原表位肽组合物，其特征在于，所述抗原肽DKK1氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。
5.根据权利要求1所述抗原表位肽组合物，其特征在于，所述抗原肽CD133氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。
6.根据权利要求1所述的抗原表位肽组合物，其特征在于，所述抗原肽STEAP1、所述抗原肽PSM、所述抗原肽DKK1和所述抗原肽CD133分别在抗原表位肽组合物中的含量为5～12μg/mL。
7.一种抗原递呈细胞，其特征在于，将权利要求1至6任意一项所述抗原表位肽组合物负载于树突状细胞，获得抗原表位肽组合物致敏的抗原递呈细胞。
8.根据权利要求7所述的抗原递呈细胞在诱导细胞毒性T淋巴细胞中的应用。
9.根据权利要求1至6任意一项所述抗原表位肽组合物和/或权利要求7所述抗原递呈细胞在制备预防或治疗前列腺癌药物中的应用。
10.一种疫苗，其特征在于，包含权利要求1至6任意一项所述抗原表位肽组合物和/或权利要求7所述抗原递呈细胞。
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