CN107793484A - 一种重组肿瘤抗原其制备方法和编码核酸及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及到一种重组肿瘤抗原其制备方法和编码核酸及其在肿瘤治疗中的应用。该重组抗原包含有经过密码子优化后的人GP96基因的信号肽，人AKR1B10基因的编码序列，人LAMP1基因信号序列，以及A64的ployA结构区域。本发明将经过优化后的AKR1B10重组抗原mRNA转染到未成熟的DC细胞中，经细胞因子诱导成熟后，得到成熟的树突细胞肿瘤疫苗DC‑AKR1B10。以该肿瘤疫苗刺激机体，能够产生细胞毒性T细胞，在不引起自身免疫的情况下即可引起有效的抗肿瘤免疫反应。

Description

一种重组肿瘤抗原其制备方法和编码核酸及其应用
技术领域
本发明涉及含有抗原的医药制品领域，具体地，是一种重组肿瘤抗原其制备方法和编码核酸及其用途。
背景技术
癌症的传统治疗手段如：手术治疗、放射治疗和化疗等，均具有一定的局限性。手术治疗只适合早期肿瘤；而放疗和化疗由于靶向性较差，易损伤正常细胞，产生不良反应。恶性肿瘤具有易侵袭和易复发的生物学特征，因此需要靶向性更好、毒性更小的治疗方案。随着肿瘤学的发展，生物免疫疗法成为肿瘤治疗的第四种手段。有研究证明，肿瘤细胞具有特异性的肿瘤抗原，免疫系统能通过识别肿瘤抗原区别肿瘤细胞和正常细胞。在肿瘤患者中，免疫系统受到抑制，无法正常识别肿瘤细胞表面的肿瘤抗原，进而有效杀伤肿瘤细胞。树突细胞肿瘤疫苗通过特异性的、具有免疫原性的肿瘤抗原(如：多肽、RNA等)负载树突细胞，在各种细胞因子、趋化因子等佐剂的辅助下，激活或加强机体自身抗肿瘤免疫，进而杀伤和清除肿瘤细胞。目前，树突细胞肿瘤疫苗已成为肿瘤治疗领域的研究热点。
AKR1B10又叫做醛糖还原酶相似蛋白-1，小肠还原酶或醛糖还原酶相关蛋白，其基因位于ch7q33，转录的产物长为1376bp，含有10个外显子，AKR1B10蛋白一共有316个氨基酸，其分子量为36.02kDa。AKR1B10基因在人的大多数组织里面不表达，它主要在小肠，结肠和胃里面表达，在肝脏，胸腺，前列腺和睾丸中也有低水平存在。但是在人的肝癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等几种癌症中高表达，可以通过解毒细胞内的活性羰基促进肿瘤细胞生长。鉴于此，AKR1B10基因可以做为肿瘤免疫治疗的一个靶点，以之作为肿瘤抗原刺激机体，能够产生细胞毒性T细胞，在不引起自身免疫的情况下即可引起有效的抗肿瘤免疫反应。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种含有AKR1B10基因的肿瘤抗原、编码核酸及其制备方法，以及将该抗原用于负载树突细胞，用于主动免疫治疗高表达AKR1B10基因的癌症，包括但不限于肝癌，非小细胞肺癌，乳腺癌等。
本发明是按照以下技术方案实现的：
一种重组含有AKR1B10编码区的肿瘤抗原，所述的重组抗原包含有：人GP96基因的信号肽序列编码区，人AKR1B10基因的编码区，人LAMP1基因信号序列编码区，以及A64的ployA结构区域。
所述的重组抗原的制备方法，其包括以下步骤：
1)根据Genebank报道的人AKR1B10基因、人gp96基因、人LAMP1基因的编码序列，根据以下规则，进行密码子优化：1.选用高GC含量的密码子，使优化后的核酸序列GC含量在50％～75％；2.去掉稀有密码子，选用在人源细胞中使用频率高的密码子；3.优化去掉可能形成二级结构的核酸序列；4.优化去掉消极的顺式作用原件。
2)构建融合表达AKR1B10抗原以及促进抗原呈递的信号肽的重组质粒，含有AKR1B10基因的核酸序列如核酸序列表所示：
3)将合成的重组载体以限制性内切酶线性化后，采用T7体外转录酶体外转录合成包含重组AKR1B10基因序列的信使RNA。
附图说明
图1是本发明流式细胞仪检测DC细胞转染效率图
图2是本发明流式细胞仪检测DC细胞表型图
图3是本发明荧光定量PCR法检测AKR1B10抗原在转染后DC细胞负载情况图
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。
实施例一：重组抗原基因的合成以及制备
1.根据前文所述规则，对人AKR1B10基因，gp96基因和LAMP1基因进行密码子优化，合成优化后的基因，克隆合成后的重组基因到载体psp73上。
2.将合成的载体psp73-AKR1B10转化大肠杆菌感受态细胞stb13中，过夜培养扩增后，使用无内毒素质粒提取试剂盒提取重组质粒。
3.将提取的重组质粒按照如下体系进行酶切(以100ul体系为例)：10x cutsmartbuffer，10ul；重组质粒DNA(1000ng/ul)，50ul；超纯水，35ul；SpeI-HF限制性内切酶，5ul。充分混匀后于37℃反应2小时。
4.酶切产物中加入70ul异丙醇，充分混匀后放于-20℃沉淀30分钟。
5.以14000RPM，4℃离心10分钟，沉淀DNA。去上清，以1ml 75％乙醇洗沉淀两次。
6.加入30ul超纯水溶解沉淀，以核酸定量仪检测DNA浓度，用超纯水将浓度稀释到1000ng/ul，得到speI酶线性化的重组质粒。
7.以线性化的重组质粒为模板，进行体外转录(以20ul反应体系为例)：2x NTP/ARCA，10ul；10xbuffer，2ul；线性化的重组质粒模板(1ug/ul)，1ul；超纯水，5ul；T7体外转录酶，2ul。充分混匀后于37℃反应3小时。
8.加入30ul LiCl(7.5M)，充分混匀后，于-20℃静置30分钟沉淀mRNA。
9.以14000RPM，4℃离心10～15分钟，沉淀mRNA。去上清，以1ml 75％乙醇洗沉淀两次。
10.加入20ul无核酸酶的超纯水，充分溶解RNA后，以核酸定量仪检测mRNA浓度。
11.以2100生物分析仪检测合成的信使RNA完整性。
实施例二：DC-AKR1B10肿瘤疫苗的制备及表型鉴定
1.未成熟DC细胞的体外诱导培养
无菌抽取健康人静脉血50ml，在超净工作台内用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，将单核细胞加入AIM-V培养基中，放入37℃，5％C02培养箱中温育，使单核细胞贴壁。1～2h后，去掉未贴壁细胞，贴壁细胞加入iDC培养基(AIM-V培养基中加入终浓度为800U/mL的GM-CSF，500U/mL的IL-4)，放入37℃，5％C02培养箱中培养7天，每2～3天半量换液。
2.重组肿瘤抗原转染未成熟DC细胞
转染当天，用非酶类的细胞消化试剂把未成熟DC细胞消化成细胞悬液，离心后以opti-MEM培养基重悬细胞，调整细胞密度在25-30×106iDCs/ml。按照每106iDC细胞转染4～8ug重组肿瘤抗原mRNA的比例，混合iDC细胞和重组抗原mRNA，将细胞-mRNA混合物加入电转杯，使用ECM630电转仪，将抗原mRNA转染到iDC细胞中。电转后的细胞，以50％原来的培养基，50％新鲜mDC培养基(mDC新鲜培养基的配置：800U/mL GM-CSF和500U/mL IL-4，TNF-a(5ng/ml)，IL-1β(5ng/ml)，IL-6(150ng/ml)和prostaglandin E2(PGE2)(1ug/ml))，放入37℃，5％C02细胞培养箱中继续培养8-18h。以同样的条件转染GFP mRNA到iDC细胞中，作为对照组。
3.转染效率的测定
转染24小时后，以流式细胞仪分析绿色荧光细胞占所有细胞的比例，如图1所示，转染24小时后DC细胞转染效率大于50％。
4.DC细胞表型的鉴定
应用直接免疫荧光标记法，将转染DC细胞离心，用FACS buffer(含2％FBS的PBS溶液)重悬DC细胞，细胞浓度为1×106cells/ml，取100ul转染DC细胞悬液加入流式细胞管，分别加入1ul相应的抗体PElabled-CD11c、CD14、CD80、CD83、CD86、HLA-ABC、CCR7、HLA-DR，以及相应的同型对照。4℃避光染色30min。每管加入3ml FACS Buffer洗细胞，弃上清，加入500ul FACS buffer，流式分析检测CD11c、CD14、CD80、CD83、CD86、HLA-ABC、CCR7、HLA-DR的表达。如图2所示，DC-AKR1B10细胞表面分子CD11c、CD14、CD80、CD83、CD86、HLA-ABC、CCR7、HLA-DR稳定表达，与未成熟DC比，显示为成熟的DC细胞。
5.AKR1B10mRNA在DC细胞中负载情况检测
收集转染AKR1B10mRNA后24h的DC细胞，以Trizol提取细胞总RNA，以0ligo(dT)为引物，进行反转录反应。以荧光定量PCR法分析DC细胞中AKR1B10mRNA负载情况。如图3所示，DC细胞中可以检测到高浓度的AKR1B10mRNA。

Claims (7)

1.一种重组肿瘤抗原，其特征在于：所述重组肿瘤抗原包含人GP96基因的信号肽序列编码区，人AKR1B10基因的编码区，人LAMP1基因信号序列编码区，，以及A64的ployA结构区域。
2.权利要求1所述的重组肿瘤抗原，其特征在于：编码核酸3’端包含64个腺苷酸的polyA结构。
3.权利要求1所述的重组肿瘤抗原，其特征在于：重组抗原包含编码人AKR1B10基因的全长蛋白的核酸序列。
4.权利要求1所述的重组肿瘤抗原，其特征在于：肿瘤抗原AKR1B10的5’端融合表达人GP96蛋白的信号肽。
5.权利要求1所述的重组肿瘤抗原，其特征在于：肿瘤抗原AKR1B10的3’端融合表达人LAMP1基因的信号序列。
6.权利要求1所述的重组肿瘤抗原，其特征在于：重组肿瘤抗原信使RNA包含ARCA帽子结构。
7.权利要求1～6中所述重组肿瘤抗原在制备肝癌免疫性治疗药物中的应用。
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